Fungal Ksilanaz Enziminin E. coli`de Rekombinant Olarak Üretilmesi
advertisement
Fungal Ksilanaz Enziminin E. coli’de Rekombinant Olarak Üretilmesi Hümeyra SALTIK Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Prof. Dr. Necmettin Yılmaz 2014 Her hakkı saklıdır T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ FUNGAL KSİLANAZ ENZİMİNİN E.coli’de REKOMBİNANT OLARAK ÜRETİLMESİ Hümeyra SALTIK TOKAT 2014 Her hakkı saklıdır ÖZET Yüksek Lisans Tezi FUNGAL KSİLANAZ ENZİMİNİN E.coli’de REKOMBİNANT OLARAK ÜRETİLMESİ Hümeyra SALTIK Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Necmettin YILMAZ Ksilan, polisakkarit yapıya sahip olup bitkilerde selülozdan sonra en fazla bulunan hemiselülozdur. Ksilan, ksilozların glikozid bağlarıyla bağlanması sonucu oluşur. Ksilanı hidroliz eden enzimlerin tamamına ksilanolitik enzim sistemi adı verilir. Bu gurupta β-1,4-Endoksilanaz, β-Ksilozidaz, β-Laraninofuranozidaz, β-Glukuronidaz, Asetil ksilan esteraz ve Fenolik asit (Ferulik ve p- Kumarik asit) esteraz yer almaktadır. Ksilanaz enzimi, ksilanın β-1,4 glikozid bağlarını hidrolize ederek hemiselülozik maddelerin biyo yararlılığını artırır. Ksilanaz kağıt ve kağıt hamuru başta olmak üzere gıda ve hayvan yemi endüstrisi gibi alanlarda temel endüstriyel enzim olarak çok büyük öneme sahiptir. Bu enzimin hayvanların et ağırlığı üzerine verim ve performansını olumlu yönde değiştirdiği belirtilmektedir. Ksilanaz enzimi bakteri, maya ve fungus grubunda yer alan çeşitli mikroorganizmalar tarafından doğal olarak dışarıdan karbon kaynağını karşılamak için üretilebilmektedir. Bu çalışmada Aspergillus niger mikroorganizmasının (Fungus) ürettiği ksilanaz (endo-1,4-β-ksilanaz) enzimini kodlayan xynB geni pET28b vektör sistemine klonlanmış ve ekspresyon amacıyla E.coli BL21(DE3) pLysE hücrelerine transfer edilmiştir. Böylece ksilanaz enzimi rekombinant olarak üretilmiştir. Üretilen enzimin DNS yöntemiyle: pH’nın etkisi, sıcaklığın etkisi, sıcaklık stabilitesinin belirlenmesi, substrat konsantrasyonunun enzim aktivitesi üzerine etkisi testleri yapılmış ve optimum sıcaklığı 50°C, optimum pH’sı ise 5,0 olarak bulunmuştur. Elde edilen bu sonuçlara göre enzimin aktivite gösterdiği anlaşılmıştır. Yapılan literatür taraması ve sonuçlar değerlendirildiğinde üretilen enzimin yem endüstrisinde kullanılabilir nitelikte olduğu belirlenmiştir. 2014, 54 sayfa Anahtar kelimeler: Ksilan, Ksilanaz, Aspergillus niger, E.coli, Endüstriyel enzim i ABSTRACT M.Sc. THESIS Expression of recombinant Fungal Xylanase enzyme in E. Coli. Hümeyra SALTIK Gaziosmanpasa University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. Necmettin YILMAZ Xylan is a hemicellulose that consist of polysaccharide structure and is second of the most abundant components in the plant. Xylan is formed by binding xyloses with glycoside bonds. All of the enzymes which hydrolyse xylan is called xylanolytic enzyme system. In this group there are endo-1,4- β -xylanase, β- xylosidase, β- L arabinofuranosidase, β- glucuronidase, acetylxylan esterase and Fenolic acid esterase. Xylanase hydrolyse β-1,4- glycoside bonds of xylan and increase biobenefit of hemicellulosic components. Xylanase plays an important role as a essential enzyme in animal feed and food industry and also in pulp and paper industry. It is suggested that this enzyme improve yield and performance of weight gaining of animals. Xylanase naturally is produced by various microorganisms such as bacteria, yeast and fungus to use xylan as carbon source from outside. In this study, xynB gene encoding Xylanase (endo-1,4- β –xylanase) from Aspergillus niger is clonned to pET28b vector system and transfered to E.coli BL21(DE3) pLysE cells for expression. Tests of effect of pH, effect of temperature, determine of temperature stabilization, effect of substrat concentration on enzyme activation was performed with DNS method. Optimum temperature was found as 50 ˚C and optimum pH was found as 5. Acording to this results, it is determined that enzym work. When literature search and results are evaluated it is determined that produced enzyme can be use in feed industry. 2014, 54 pages Keywords: Xylan, Xylanase, Aspergillus niger, E. coli, Industrial enzyme. ii ÖNSÖZ Bu çalışmada bana araştırma ve kendimi geliştirme olanağı sağlayan, tez konumun belirlenmesinde, çalışmam süresince yakın ilgi ve önerileriyle bana yol gösterip beni yönlendiren danışmanım Sayın Prof. Dr. Necmettin YILMAZ’a, çalışmanın yürütülmesi çalışma sürem boyunca laboratuarlarının tüm imkanlarını kullanmama izin veren ve tez yazım aşamasında beni yönlendiren değerli hocam Sayın Prof. Dr. İsa GÖKÇE’ye, çalışmalarım sırasında bilgi ve deneyimleriyle bana yardımcı olan Arş. Görv. Hülya KUDUĞ’a, tezimin enzim aktivitesinin belirlenmesi konusunda bana bilgi ve deneyimleriyle yol gösteren ve yardımlarını esirgemeyen Arş. Görv. Sema BİLGİN ŞENTÜRK’e çok teşekkür ederim. Her zaman yanımda olan ve benden maddi manevi desteklerini esirgemeyen aileme sonsuz teşekkürler. iii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET..................................................................................................................................i ABSTRACT......................................................................................................................ii ÖNSÖZ.............................................................................................................................iii İÇİNDEKİLER.................................................................................................................iv SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ.............................................................................vii SEKİLLER DİZİNİ........................................................................................................viii ÇİZELGELER DİZİNİ.....................................................................................................ix 1. GİRİŞ ...........................................................................................................................1 2. KAYNAK ÖZETLERİ (KURAMSAL TEMELLER / GENEL BİLGİLER .......2 .1. Enzim Üretiminde Rekombinant DNA Teknolojisi………………………………….2 2.2. Enzim Üretiminde Mikroorganizmalar’ın Kullanılması……………………………4 2.3. Endüstriyel Enzimler………………………………………………………………..5 2.4. Ksiloz ve Ksilan……………………………………………………………………..8 2.5. Ksilanazlar…………………………………………………………………………10 2.6. Ksilanolitik Enzimler ve Ksilanın Enzimatik Hidrolizi…………………………...11 2.7. Ksilanazların Bazı Uygulama Alanları…………………………………………….13 2.8. Ksilanaz Gen Kaynakları………………………………………………………......15 2.9. Ksilanazla İlgili Yapılan Daha Önceki Çalışmalar………………………………...15 3. MATERYAL VE YÖNTEM………………………………………………………17 3.1. Materyal……………………………………………………………………………17 3.1.1. Kullanılan Cihazlar………………………………………………………………17 3.1.2. Kullanılan Kimyasallar………………………………………………………......18 3.1.3. Kullanılan Enzimler……………………………………………………………...20 3.1.4. Primerler…………………………………………………………………………20 3.1.5. Klonlama ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Mikroorganizmalar……........21 3.1.6. Klonlama ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Plazmitler…………………...21 3.1.7. Kullanılan Çözeltiler……………………………………………………………..23 3.1.7.1. Tampon Çözeltiler ve Hazırlanışları…………………………………………...23 3.1.7.2. Sıvı ve Katı Besiyerleri………………………………………………………...23 iv 3.1.7.3. Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) Poliakrilamid Jel Elektroforezinde Kullanılan Çözeltiler……………………………………………………………………………….24 3.1.7.4. Agaroz Jel Elektroforezinde Kullanılan Çözeltiler……………………………24 3.1.7.5. Enzim Saflaştırmada Kullanılan Çözeltiler…………………………………....25 3.1.7.6. Enzim Aktivite Tayininde Kullanılan Çözeltiler………………………………25 3.1.7.7. Diğer Çözeltiler………………………………………………………………..25 3.2. Yöntem…………………………………………………………………………….26 3.2.1. Ksilanaz Gen Kaynağı…………………………………………………………...26 3.2.2. PCR İşlemi için Primerlerin Tasarımı…………………………………………...26 3.2.3. PCR İle Ksilanaz DNA’sının Amplifikasyonu…………………………………..26 3.2.4. PCR Ürünlerinin Saflaştırılması…………………………………………………28 3.2.5. Restriksiyon Enzimleri ile Kesim………………………………………………..28 3.2.6. DNA Ligasyonu………………………………………………………………….29 3.2.7. Kompotent Hücre Hazırlanması…………………………………………………30 3.2.7.1. PİPES’li Kompotent Hücre Hazırlanması……………………………………..30 3.2.7.2. FSB’li Kompotent Hücre Hazırlanması……………………………………….30 3.2.8. Transformasyon………………………………………………………………….31 3.2.9. Plazmit DNA Saflaştırılması…………………………………………………….31 3.2.10. Doğrulama Restriksiyon Kesimi……………………………………………….32 3.2.11. DNA Dizileme………………………………………………………………….33 3.2.12. E. coli BL21(DE3) pLysE Hücresinin pET28b(+)-xynB Plazmidi ile. Transformasyonu ve Ksilanaz’ın Ekspresyonu………………………………………...33 3.2.13. SDS-PAGE ile E. coli Ksilanaz Proteininin Üretilip Üretilmediğinin Analizi...34 3.2.14. E. coli BL21 pLysE Hücrelerinin Parçalanması………………………………..35 3.2.15.E.coli BL21(DE3) pLysE’de Ekspres Edilen Ksilanaz Enziminin Afinite Kromatografisi ile Saflaştırılması……………………………………………………....35 3.2.16. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrillamit Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) İle Ksilanaz Proteininin Analizi……………………………………………………………35 3.2.17.Saflaştırılan Proteinin Kantitatif Analizi…………………………………….….36 3.2.18. DNS Yöntemi İle Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi…………………………..37 3.2.19. Bazı Parametrelerin Ksilanaz Aktivitesi Üzerine Etkisi………………………..37 3.2.19.1. pH’nın Etkisi………………………………………………………………….37 v 3.2.19.2. Sıcaklığın Etkisi…………………………………………………………..…..38 3.2.19.3. Sıcaklık Stabilitesinin Belirlenmesi…………………………………………..38 3.2.19.4. Substrat Konsantrasyonunun Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi………………38 4.BULGULAR VE TARTIŞMA……………………………………………………..39 4.1. PCR ile Ksilanaz DNA’sının Amplifikasyonu…………………………………….39 4.2. Klonlama Sonrası Plazmid DNA’ların Restriksiyon Enzimleri ile Analizi……….39 4.3. DNA Dizileme……………………………………………………………………..40 4.4. SDS-PAGE İle Ksilanaz Proteininin Üretilip Üretilmediğinin Analizi……...........42 4.5. Saflaştırılan pET-xynB Proteininin Kantitatif Analizi…………………………….44 4.6. Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi…………………………………………………45 4.6.1. Bazı Parametrelerin Ksilanaz Aktivitesi Üzerine Etkisi ………………………...45 4.6.1.1. pH’nın Etkisi…………………………………………………………………...45 4.6.1.2. Sıcaklığın Etkisi………………………………………………………………..45 4.6.1.3. Sıcaklık Stabilitesinin Belirlenmesi……………………………………………46 4.6.1.4. Substrat Konsantrasyonunun Enzim Aktiviesi Üzerine Etkisi………………...47 5. SONUÇ……………………………………………………………………………...48 KAYNAKLAR………………………………………………………………………...50 ÖZGEÇMİŞ…………………………………………………………………………...54 vi SİMGE VE KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama bç baz çifti μl mikro litre µM mikro molar M Molar mM mili molar nm nano metre P Fosfat rpm Dakikadaki devir sayısı (rotatory per minute) Kısaltmalar Açıklama Amp Ampisilin APS Amonyumpersülfat BSA Sığır (Bovine) Serum Albümini dH2O distile su DMSO Dimetil sülfoksit DNA Deoksiribonükleikasit dNTP Deoksiribonükleosit trifosfat E. coli Escherichia coli FSB “Frozen Storage Buffer” IPTG İzopropil β-D-1 tiyogalaktopiranozid LB Luria-Bertani OD Optik dansite PCR Polimeraz zincir (chain) reaksiyonu PMSF Fenil metil sülfonil florit SDS Sodyum dodesil sülfat SDS-PAGE SDS poliakrilamid jel elektroforezi TAE Tris-asetat-EDTA TEMED N,N,N’,N’-Tetrametilenetilendiamin Tris 2-Amino-2-hidroksimetil-propan-1,3-diol vii ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Ksilan’ın Diyagramatik Yapısı………………………………………………..8 Şekil 2.2. Ksilanaz Enziminin Etki Spesifitesi…………………………………………..9 Şekil 2.3. Ksilanolitik Enzim Sistemi…………………………………………………..11 Şekil 2.4. Ksilan’ın Tam Hidrolizinde Gerekli Enzimler Ve Etki Bölgeleri…………...12 Şekil 3.1. pET-28a (+) Vektörünün Dairesel Haritası Ve Poli-linker Bölgesinin Detaylı Restriksiyon Enzimleri İle Birlikte Verilen DNA Dizisi……………………………….22 Şekil 3.2. Ksilanaz Genini Çoğaltmak Amacıyla Kullanılan İleri Ve Geri Primerlerin Nükleotit Sıraları……………………………………………………………………….26 Şekil 4.1. pET-28b Vektör Sistemi İçin Koloni PCR sonucunun %1’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü………………………………………………………………………………39 Şekil 4.2. pET-28b Vektör Sistemi İçin Doğrulama Kesim Sonucunun %1’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü……………………………………………………………………....40 Şekil 4.3. NEBcutter V2.0 Programı Kullanılarak Elde Edilen pET-28b Klonlama Bölgesinin xyn Genine Ait Restriksiyon Enzim Haritası………………………………40 Şekil 4.4 Dizi Analizi Sonucu Elde Edilen Kromotogram……………………………..41 Şekil 4.5. SDS-PAGE Analiz Görüntüsü………………………………………………43 Şekil 4.6. Saflaştırma Sonrası SDS-PAGE Analiz Görüntüsü…………………………43 Şekil 4.7. Ksilanaz Enziminin pH Bağımlılık Eğrisi……………………………….......45 Şekil 4.8. Ksilanaz Enziminin Sıcaklık Bağımlılık Eğrisi………………………….......46 Şekil 4.9. Ksilanaz Enziminin Isıl Kararlılık Eğrisi……………………………………46 Şekil 4.10. Ksilanaz Enziminin Linewear-Burk Eğrisi………………………………...47 viii ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. Ksilanazların Potansiyel Uygulama Alanları ……………………………...7 Çizelge 3.1. Kullanılan Cihazlar………………………………………………………..17 Çizelge 3.2. Kullanılan Kitler Ve Kimyasal Malzemeler ……………………………...18 Çizelge 3.3. Kullanılan Enzimler……...……………………………………………….20 Çizelge 3.4. Ksilanaz Genini Çoğaltmak Amacıyla PCR’da Kullanılan Primerler……20 Çizelge 3.5. Klonlama Ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Mikroorganizmalar….21 Çizelge 3.6. Klonlama Ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Plazmitler……………21 Çizelge 3.7. Kesim İşlemi İçin Gereken Madde Miktarları……………………………28 Çizelge 3.8. pET-28b Vektör Sistemi Ligasyon İçin Gereken Madde Miktarları……...29 Çizelge 3.9. pET-28b Doğrulama Kesimi İçin Gereken Madde Miktarları……………33 Çizelge 3.10. SDS-PAGE Elektroforezinde Kullanılan Bileşenler Ve Oranları……….36 Çizelge 4.1. pET-xynB Proteinine Ait Amino Asit Dizisi……………………………..44 ix 1.GİRİŞ Enzimlerin hücrelerde oldukça önemli metabolik görevleri vardır, biyokimyasal reaksiyonları katalize eden protein yapısında moleküllerdir ve çeşitli amaçlarla kullanılmak üzere gündelik ve ekonomik hayata girmişlerdir. Endüstride kullanılan enzimler genellikle mikroorganizmalardan elde edilmektedir. Çünkü mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya hayvansal kaynaklı enzimlere göre katalitik aktivitelerinin çok yüksek olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları, fazla miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır. Ürünlerin kullanım alanlarının çeşitliliği ve ekonomik değerlerinin çok yüksek olması gibi nedenlerle enzim teknolojisi giderek gelişmektedir ve biyoteknolojinin endüstriyel enzimler ile ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar daha da önem kazanmaktadır (Wiseman, 1987). Özellikle son yıllarda rekombinant DNA teknolojisinden yararlanılarak enzim üretimi büyük boyutlara ulaşmış ve kullanımı giderek yaygınlaşmıştır (Gessese, 1998). Türkiye büyük bir biyoteknoloji ürünleri tüketicisidir. Tüketicisi olduğumuz bu pazarın en önemli alanlarından birisini “endüstriyel enzimler” oluşturmaktadır. Türkiye’nin yerli enzim üretimi hemen hemen yok gibidir. Enzimler farklı kategorilerde farklı isimler, sektörler ve kalemler altında yerli pazara girdikleri ve tüketildikleri için pazar hacminin bütününün tek bir rakam halinde tespiti de mümkün değildir fakat bilinen kadarıyla bile tüketimimiz milyar dolarlar seviyesindedir. Enzimlerin endüstriyel kullanım alanları incelendiğinde ne kadar yaygın, yüksek hacimli ve ticari fırsatlarla dolu bir pazar oluşturduğu görülmektedir (Özer, 1999). Enzimler genellikle endüstride; ilaç, gıda, tekstil, deri, kâğıt, yem ve deterjan sanayilerinde ve moleküler biyolojide kullanılmaktadır (Anonim, 2013a). Bu çalışmayla literatürde var olan rekombinant enzim üretim sistemlerini kullanmak ya da bu sistemler üzerinde ihtiyaca yönelik değişiklikleri yapmak suretiyle enzim üretimine katkıda bulunulması hedeflenmiştir. Bu hedefe ulaşabilmek için gıda, yem, kağıt sanayisinde kullanılan ksilanaz enzimi (Fungal; A. niger) pET28b vektörü ile rekombinant olarak Escherichia coli’de üretimi yapılmış, üretilen enzim saflaştırılmış, enzimin optimum çalışma sıcaklık ve pH’sı belirlenmiştir. 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ (KURAMSAL TEMELLER / GENEL BİLGİLER) 2.1. Enzim Üretiminde Rekombinant DNA Teknolojisi Biyoteknoloji, çok çeşitli alanlarda gelişme gösteren ve günümüzde moleküler biyolojik yöntemlerinde yaygın şekilde kullanımıyla birlikte, giderek moleküler biyoteknoloji şeklinde transformasyona uğrayan ve çağımıza damgasını vuran bir alandır. Rekombinant DNA teknolojisi; Hamilton Smith tarafından 1970’de Heamophilius influenzae’den elde edilen restriksiyon endonükleaz enzimlerin keşfi ile başlamıştır. Bu enzimler özgün DNA bölgelerini tanıyıp DNA’yı bu özgün bölgelerden kesen enzimlerdir (Sultuybek ve ark., 1995). Rekombinant DNA teknolojisinin ve destekleyen gelişmelerin tarihçesi; 1871: Spermde DNA’nın keşfi. 1944: Avery, Macleod ve Mc Carty genetik materyalin DNA olduğunu gösterdi. 1953: Watson ve Crick DNA’nın yapısını belirledi. 1958: DNA replikasyonunun çift sarmalın komplementer ipliklerinin ayrılmasını kapsadığı kanıtlandı. 1960: Haberci RNA’nın keşfi. 1965: Bakteride antibiyotiğe dirençli genleri içeren ve hücre duvarı içinde otonom olarak replike edilen ekstrakromozomal yapılara plazmid denildi. 1966: Tüm genetik kodun çıkarılması. 1970: İn vitro koşullarda genlerin sentezlenmesi ve ilk restriksiyon endonükleaz enziminin Hamilton Smith tarafından izole edilmesi. 1972: İlk rekombinant DNA molekülünün hazırlanması. 1972: Khurana ve arkadaşları bütün bir tRNA genini sentezlediler. 1973: Gen klonlanması için plazmid vektörlerinin kullanımı. 1973: Boyer ve Cohen rekombinant DNA teknolojisini yarattılar. 1974: İlk rekombinant DNA Dünya kongresi yapıldı. 1977: Gilbert ve Sangers tarafından DNA dizileri için yeni metotların kullanımı. 1977: İlk genetik mühendislik şirketi olan “Genentech” kuruldu. 1978: E.coli bakterisi kullanılarak insan insülini üretildi. 1979: Viral antijen hepatit B’nin klonlanması. 2 1981: Orak hücreli anemi DNA’sı restriksiyon enzimi analiziyle teşhis edilen ilk hastalık oldu. 1982: İnsan tümör genlerinin karakterizasyonu. 1983: Bakteriyofaj λ’nın DNA dizisi 48 502 baz çifti olarak saptandı. 1983: Genetik olarak değiştirilmiş plazmidler, bitkilerin transformasyonu için kullanıldı. 1986: Kary B. Mullis tarafından polimeraz zincir reaksiyonu tekniği geliştirildi. 1989: AIDS virüsü dizilendi. 1990: İnsan genom projesi resmen başlatıldı. 1997: Koyun (Dolly) klonlandı. 2001: İnsan gen haritası tamamlandı. 2002: Fare genomu aydınlatıldı. 2004: Rat genomu aydınlatıldı, (Sultuybek ve ark, 1995; Tarım, 2004). Rekombinant DNA teknolojisi, genetik rekombinasyon olaylarının yapay olarak gerçekleştirilmesi esasına dayanan ve bugün dev adımlarla ilerlemekte olan bir gen mühendisliği konusudur. Bu teknoloji ile çeşitli amaçlar için adeta ısmarlama genler ve proteinlerin üretimi mümkün olmaktadır. Bu iş için istenen gen orijinal kromozomdan restriksiyon endonüklez enzimleri ile kesilip alınmata ve sonra bir vektöre takılıp konak hücre içine sokularak çoğaltılmaktadır. Yerine göre ya doğrudan çoğaltılmış olan bu genler kullanılmakta ya da bunların ekspresyonu ile elde edilen proteinler kullanılmaktadır. (Watson JD, Tooze, Kurtz DT, 1983). Rekombinant DNA teknolojisi, günümüzde genetik hastalıklarda tanı, rekombinant aşı yapımı, başka canlılardan gen transferi yoluyla transgenik bitki ve hayvan soyları elde edilmesinde sıklıkla kullanılmaktadır (Alper, 2003; Alper, 2004). Rekombinant DNA teknolojisinin temelini gen klonlama süreci oluşturur. Bu sürecin temel basamaklarını Klug ve Cummings asağıdaki gibi açıklamıştır: 1. Doku ya da hücrelerden DNA izole edilir. 2. DNA moleküllerini özgül dizilerden tanıyıp kesen restriksiyon endonükleazlar ya da restriksiyon enzimleri denilen enzimlerle DNA parçaları oluşturulur. 3. Restriksiyon enzimleri ile oluşturulan DNA parçaları, vektör ya da taşıyıcı molekül adı verilen diğer DNA molekülleri ile birleştirilir. İçine bir DNA parçası sokulmuş olan vektör, bir rekombinant DNA molekülüdür. 3 4. Kendi DNA’sı ile birlikte, üzerinde yabancı DNA molekülünü taşıyan vektörün oluşturduğu rekombinant molekül konakçı içerisinde kendini esler ve klon olarak bilinen birbirine özdeş düzinelerce kopyasını oluşturur. 5. Konakçı hücre kendini eşlerken, rekombinant DNA molekülleri de yavru hücrelere geçer ve her biri klonlanmış DNA dizisinin kopyalarını taşıyan konakçı hücre topluluğu oluşur. 6. Klonlanmış DNA konakçı hücrelerden izole edilebilir ve incelenebilir. 7. Potansiyel olarak klonlanmış DNA transkripsiyona uğrayabilir, mRNA’sı translasyona yönlendirilebilir, gen ürünü izole edilebilir ve araştırma için ya da ticari amaçlarla satılmak için kullanılabilir. Bu çalışmada rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak endüstriyel bir enzim olan ksilanaz üretilmiş ve üretilen ksilanaz çeşitli karakterizasyon çalışmalarında kullanılmıştır. 2.2. Enzim Üretiminde Mikroorganizmalar’ın Kullanılması Tarihsel gelişim açısından bakıldığında enzimlerin çok farklı kaynaklardan elde edildiği görülmektedir. Bunlar bitkisel, hayvansal ya da endüstriyel anlamda ihtiyacı karşılayabilen mikrobiyal kaynaklı enzimlerdir (Gupta ve ark, 2003). Bugüne kadar yaklaşık 2500 farklı enzim tanımlanmış ve bunların ancak %10’u ticari alanda kullanım için kendilerine yer bulmuşlardır. Bu %10 içinde 25 tanesi nişasta sanayi ile deterjan katkı maddesi olarak kullanılmış olup, ticari alanda yararlanılan bütün enzimlerin %80 ini oluşturmaktadırlar (Woodley, 2000). Bitkisel ve hayvansal enzimlerin endüstriyel ihtiyacı karşılayamaması, bu alandaki ilginin giderek artan bir şekilde mikrobiyal enzimlere yönelmesini sağlamıştır. Mikroorganizmalar, biyokimyasal çeşitlilikleri ve genetik manipülasyonlara uygunluğu gibi sebeplerden dolayı mükemmel bir enzim kaynağı olarak değerlendirilmektedir (Rao ve ark.,1998). Günümüzde endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %90’ı mikroorganizmaların fermentasyonu ile üretilmektedir (Godfrey ve West, 1996). Günümüzde endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %90’ı mikroorganizmalardan üretilmektedir (Wolfgang, 2004). 4 Mikroorganizma kökenli enzimlerin biyoteknolojik işlemlerle daha ekonomik biçimde üretimi ve suda çözünmeyen matrikslerle immobilize edilerek daha uzun süre kullanılabilmesi, mikrobiyal enzimlerin endüstriyel alanlarda kullanılmasındaki artış nedenleridir (Gümüşel, 2002). Enzim kaynağı olarak mikroorganizmaların tercih edilmesinin nedenleri; yan ürün oluşturmalarının az olması aktivitelerinin yüksek olması daha ekonomik olması stabiliteye sahip olması yüksek oranlarda ve saflıkta üretilebilmeleridir (Wiseman, 1987; Horikoshi, 1999). Mikroorganizmalardan elde edilen enzimlerin tüm dünya genelinde yıllık kullanım oranlarına bakıldığında %25 alkalin proteaz, %21 diğer proteazlar, %18 amilaz, %10 renin, %3 tripsin, %3 lipaz ve %10 diğer karbonhidrat parçalayan enzimler (selülaz ve ksilanaz gibi), %10 kadar ise analitik ve farmasötik enzimlerin olduğu şeklinde bir dağılım belirlenmiştir (Rao ve ark., 1998). 2.3. Endüstriyel Enzimler Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi ürünlerin kullanım alanlarının çeşitliliği ve ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle biyoteknolojinin endüstriyel enzimler ile ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar daha da önem kazanmaktadır. Özellikle son yıllarda stratejik alan şeklinde değerlendirilen rekombinant DNA teknolojisinden yararlanılarak enzim üretimi büyük boyutlara ulaşmış ve kullanımı giderek yaygınlaşmıştır (Gessese, 1998). Dünya geneli incelendiğinde endüstriyel enzimlerin ticari pazar payının yaklaşık 1,6 milyar dolar olduğu tahmin edilmektedir (Schallmey ve ark., 2004). Bu enzimlerin kullanım alanlarına göre dağılımına bakıldığında; %29’unun gıda endüstrisinde %15’inin hayvan yemi sektöründe %56’sının ise genel amaçlı teknik alanlarda yer aldığı görülmektedir (Outtrup ve Jorgensen, 2002). 5 Endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %75’ini hidrolitik enzimler oluşturmaktadır. Proteaz grubundaki enzimler kullanımda ilk sırayı alırken, karbohidratları parçalayan enzimler ikinci sırada yer almaktadır (Harwood, 1992; Bhat, 2000). Karbonhidrat parçalayan enzimlerden amilazlar, enzim piyasasında yaklaşık %25’lik bir paya sahiptir (Sidhu ve ark., 1997; Rao ve ark., 1998). Son zamanlardaki en etkin uygulamaları kağıt hamurunun beyazlatılması için ksilanazların endüstride kullanılması Viikari ve arkadaşlarının (1986) buluşu ile artışa geçmiştir. Endüstride faydalı olan ve ticari olarak kullanılan enzimlerin, bir ürünün üretilmesinde bazı avantajlara sahip olması gerekmektedir. Buna göre, bir enzimin herhangi bir endüstri alanında kullanılabilmesi maliyet bakımından ucuz olması, çok farklı alanlarda kullanılabilme özelliğinde olması ve en önemlisi de enzimin alerjik ya da toksik etkiye sahip olmaması, yani güvenilir olmasına bağlıdır (Wisema, 1987; Sarıkaya, 1995). Bu çalışmada üretilen ksilanaz enziminin endüstrideki kullanım alanları Çizelge 2.1’ de verilmiştir: 6 Çizelge 2.1. Ksilanazların Potansiyel Uygulama Alanları (Collins ve ark., 2005) ENDÜSTRİSİ UYGULAMA ALANI FONKSİYONU Çöp arıtımı, fermente edilebilen Biyodönüşüm Tekstil Endüstriyel,evsel ve tarımsal ürünlerin üretimi, yenilenebilir atıkların çevreye karşı zararlarının bioetanol ve zararsız kimyasalların önlenmesi. üretimi Keten, kendir, jüt ve rami işlenmesi Enzimatik yüzey düzleştirimi Nişasta ihtiva etmeyen polisakkaritlerin Hayvan beslemesi Monogastrik (domuz ve kümes içeriğini azaltır, intestinal vizkoziteyi hayvanları) ve geviş getirenlerin azaltarak hayvanın protein ve nişastadan yemleri maksimum ölçüde faydalanmasını sağlar. Kağıt imalatı esnasında klorin ve toksik Kağıt hamurunun ağartılması disakkaritlerin kullanımlarının azaltılması Kağıt ve kağıt hamuru üretimi Alkali kullanımının azaltılması ve biyoleke çıkarılması süreçlerinin Biyoleke yok edilmesi kolaylaştırılması Pasta hamuru viskozitesinin azaltılması Nişasta Nişasta gluten ayırımı Fırıncılık Hamur ve pastacılık ürünleri Meyve ve sebze işleme Meyve ve sebze suyu, nektar ve yanında yumuşatma özelliği ile kaliteyi püre eldesi ile bitkisel yağ, şarap artırır. ve gluten topaklanmasının artırılması. Hamur elastikiyetini ve dayanıklılığını artırır. Meyve suları viskozitesini azaltıcı etkisi süreçleri, demleme, şarap imalatı imalatı 7 2.4. Ksiloz ve Ksilan Ksiloz, yenilebilir birçok bitkinin tohumunda bulunan bir şeker olup, odun veya saman gibi bitkisel yapılarda bulunan bir maddedir. Hayvansal tıpta ksiloz, bağırsaktaki emilim sorununun teşhisi için suyla karışık olarak aç karnına verilmektedir. Eğer kanda bir süre sonra ksilozla karşılaşılırsa bu bağırsakta bir sorun olmadığını gösterir. Katalitik hidrojenasyon ile ksiloz, bir tür tatlandırıcı olan ksilitole dönüşür. Ksiloz ve ksilitolün her ikisi de indirgeyici şeker olup sanayide tatlandırıcı olarak kullanılmaktadır. Ksiloz ayrıca serin veya treonin, proteoglikan tip O-glikozilasyonda eklenen ilk polisakkarittir. Bu nedenle heparan sülfat ve kondroitin sülfat gibi çoğu anyonik polisakkaritlerin biyosentetik yolundaki ilk polisakkarittir. Ksilan, ksilozların glikozid bağlarıyla bağlanması sonucu oluşur. Bitkilerin hücre duvarında, selülozdan sonra en fazla bulunan hemiselülozik bir polisakkarittir. Şekil 2.1. Ksilanın diyagramatik yapısı (Anonim, 2008d) Ksilanlar, doğada yaygın olarak bulunan ve hemiselülozların yapısını oluşturan temel polisakkaritlerdendir. Karasal bitkilerin hücre duvarlarındaki, lignin ve selüloz ara yüzeyinde bir başka deyişle, bitki hücrelerinin ikincil hücre duvarında yer almaktadırlar (Wong ve ark,1988, Seyis,1997). Ksilan bazı bitkilerde toplam kuru maddenin % 35’kadarını meydana getirmektedir. (Coughlan, 1985). Ksilan tahıl danelerinin lif içeriklerinin önemli bir kısmını oluşturur. (Cowan, 1996). Ksilan, selüloz ve lignin birbirlerine kovalent ya da non-kovalent bağlarla bağlanmış olup birlikte bitki hücre duvarının ana yapısını oluştururlar (Beg ve ark., 2001). Ksilanlar, ksilanazlar (β-1,4-D-endoksilanaz (EC 3.2.1.8)) tarafından β-1,4 bağlarının hidrolizi ile D-ksiloz ünitelerine parçalanır ( Biely, 1985) (Şekil 2.1). 8 Şekil 2.2. Ksilanaz Enziminin Etki Spesifitesi Arabinoksilanlar, pangola çayırları, bambu filizleri ve çavdar çayırları gibi bazı diğer bitkilerde tanımlanmasının yanında arpada, buğdayda, çavdarda, pirinçte, yulafta da tanımlanmıştır (Izydorczyk ve Biliaderis, 1995). Bu polisakkaritler tüm tahılların minör bileşenleri olsa da onlar bitki hücre duvarlarının önemli bir parçasını oluşturur. Glukuronoksilanlar ve glukuronoarabinoksilanlar hücre duvarının bütünlüğü için temel olan lignin selüloz ve diğer polimerlerle kovalent ve non-kovalent bağlar oluşturarak yapıştırıcı olarak işlev görür. Ksilanlar hemiselülozların en önemli sınıfıdır. Angiospermlerde toplam kuru ağırlığın %15-30 unu oluştururlar fakat gymnspermlerde daha az bulunurlar (%7-12 ksilan) (Haltrich ve ark., 1996). Glukuronoksilanlar, ksiloz ile bağlı β-D-ksilopiranosil ünitelerinin lineer polimerleridir. Bu polisakkarit iskeleti 4-O-metil-α-D-glukuranopiranosil ünitelerine, 4 pozisyonunda metilenmiş D-glukuronosil ünitelerinden ve 2 veya 3 pozisyonuna dahil olmuş ve β-Dksilopiranosil’e sahiptir (Coughlan ve Hazlewood, 1993). Angiosperm glukuronoksilanlar, β-ksilopiranosil’in 2 veya 3 pozisyonunda asetil gruplarıyla yüksek değişim oranına sahiptir bu durum ksilana sudaki kısmi çözünürlüğünü verir. Tipik olarak yumuşak ağaçlarda bulunan Glukuronoarabino ksilanlar aynı ksilan iskelete sahiptir fakat her birinde 10 tane β-D-ksilopiranosil ünitesi α-L-arabinofuranosil ile yerine konulmaktadır. Yumuşak odunlar sert odunlardan daha yüksek 4-O-metil-α-Dglucuronopiranosil üniteleri içeriğine sahiptir. Bu ksilanlar asetillenmemiştir ve onların furanosit yapısından dolayı arabinoz yan grupları asit tarafından hidrolizlenmektedir (Ferreira-Filho 1994; Sunna ve Antranikian, 1997). 9 2.5. Ksilanazlar Ksilanazlar ksilanların hidrolizini katalizler. Bu enzimler temelde mikroorganizmalar tarafından üretilmektedir ve polisakkaritleri hidrolizleyen diğer enzimlerle birlikte bitki hücre duvarının yıkımında rol alır ayrıca ksilanazlar bazı tohumların çimlenmesi sürecinde ksilanı da sindirir (örneğin arpa tanelerinin malt haline dönüştürülmesinde). Ksilanazlar ayrıca marina alglerinde, protozoalarda, kabuklu hayvanlarda, böceklerde, salyangozlarda ve toprak bitkilerinin tohumlarında da bulunabilir (Sunna ve Antranikian,1997). Mikrobiyal kaynaklar arasında özellikle de flamentli mantarlar bu enzimleri ortama salgıladığı için ve onların ksilanaz seviyeleri mayalarda ve bakterilerde olandan çok çok daha yüksek olduğu için ilginçtir. Bakterilerde ksilanazlar mantarlarda olduğundan daha düşük aktivite seviyelerinde üretilmemekte intrasellüler veya periplazmik miktarlarla sınırlı kalmaktadır. Dahası bakteride eksprese edilen enzimler glikozilasyon gibi posttranslasyonel modifikasyonlara maruz kalmamaktadır. Ksilanazlar, katalitik domainlerinde ki aminoasit dizi benzerliklerine bakılarak iki glikanaz ailesine ayrılmıştır. İki ksilanaz ailesi, enzim hareket metodu, moleküler ağırlık, net elektrik yükü vb özellikler bakımından birbirinden ayrılır (Gregory, A. C. E, O’Connell, A. P, Paul, B. G, 1998) Günümüze kadar pek çok çeşit ksilanaz klonlandı. Farklı özellikteki ksilanazlar farklı uygulamalarda kullanılmaya uygundur. Örneğin alkali ksilanazlar kağıt endüstrisinde asidik ksilanazlar ise yem endüstrisinde kullanılır. Bunlara ek olarak, spesifik aktivite, termal stabilite, katyon ve kimyasallara direnç gibi ksilanazların bazı temel özellikleri de uygulamalar için önemli faktörlerdir ( Prade, R. A, 1995). Günümüzde giderek popülarite kazanan ksilanazların, bitki hücre duvarının hemiselüloz kısmını parçaladığı; ot yiyen hayvanların ve bazı bitki patojenlerinin bitkileri parçalamak için ksilanaz içerdikleri saptanmıştır. Pek çok bakteri ve küf mantarının, hemiselüloz-ksilan içeren ortamlarda heterotrofik olarak gelişmesini sağlayan ve ortamda son ürün olarak serbest ksiloz oluşturan hücre dışı ksilanazlar oluşturduğu anlaşılmıştır (Kulkarni ve ark.,1999). Birçok mikroorganizmaya ek olarak, bazı otçul böcekler, kabuklular ve bazı alglerin üretebildiği ksilanazı, memeliler üretememektedirler (http://www.nature.nps.gov/benefitssharing/xylanase.htm..2004). 10 2.6. Ksilanolitik Enzimler ve Ksilanın Enzimatik Hidrolizi Ksilan çok karmaşık bir moleküldür. Bu nedenle ksilanın hidrolizi için farklı enzimlere ihtiyaç duyulur. Ksilan molekülünün hidrolizini gerçekleştiren enzimlerin tamamına ksilanolitik enzim sistemi denir (Şekil 1. 7.). β-1,4-endoksilanaz, β- ksilozidaz, α-Larabinofuranosidaz, α-glukuronidaz, asetil ksilan esteraz ve fenolik asit (Ferulik ve pKumarik asit) esteraz enzimleri bu bahsedilen enzim sistemi içinde yer almaktadır (Subramaniyan ve Prema, 2000). Şekil 2.3. . Ksilanolitik Enzim Sistemi (Anonim, 2009e) Ksilanın, heterojen ve karmaşık yapısı nedeni ile tamamen hidrolizi için işbirliği içerisinde çalışan bir grup mikrobiyal enzimi gerektirmektedir. Bu grubu oluşturan enzimler şunlardır (Gilbert ve Hazlewood 1993, Collins ve ark., 2004); Ksilan iskeletindeki iç glikozid bağları rast gele kıran β-1,4-endoksilanazlar (β-1,4–D-ksilanazlar; β-1,4-D-ksilan ksilanohidrolazlar; E.C. 3.2.1.8). Ksilobiyozu ksiloza hidrolize eden, başka bir deyişle ksilooligosakkaritleri İndirgen olmayan uçlarından kıran β-D-ksilosidazlar (β-1,4-D-ksilozid ksilohidrolazlar; E.C.3.2.1.37 ). Ksilandaki arabinoz yan zincirlerini hidrolize eden α-L-arabinofuranosidazlar (E.C. 3.2.1.55). 11 Ksiloz gruplarından glukuronik asit yan zincirlerini ayıran α-D-glukuronidazlar (E.C. 3.2.1.139 ). Asetat gruplarını serbestleştiren asetil-ksilan esterazlar (E.C.3.1.1.72 ). Ferulik asit esterazlar (E.C. 3.1.1.73 ). p-kumarik asit esterazlar (E.C. 3.1.1.- ). Ekzo-β-1,4-ksilanazlar (α - 1,4-D-ksilan ksilohidrolazlar ). Bunlardan en önemlisi 1.gruptaki 1,4- β - endoksilanazlar’dır. Endoksilanazlar, ksilan omurgasındaki iç glikozid bağları, ekzoksilanazlar ise endoksilanazların etkisi sonucu oluşan ksilooligosakkaritleri hidrolize ederler; ve bu yolla ksilanın hidroliz oranı yükseltilmiş olur (Wong ve ark.,1988). Şekil 2.4’de ksilanaz enzimlerinin ksilan omurgasındaki etki noktaları şematik olarak gösterilmektedir (Beg ve ark., 2001). Şekil 2.4. Ksilanın tam hidrolizinde gerekli enzimler ve etki bölgeleri (Beg ve ark., 2001) 12 2.7. Ksilanazların Bazı Uygulama Alanları Ksilanazlar, gıdaların fiziksel özelliklerini geliştirmede, sıvı ya da gaz yakıtların üretimi, çözücüler ve şeker gruplarının üretimi gibi genel uygulamalarda, tek hücre proteini üretmede, lignoselülozik materyallerin dönüşümü, tarımsal atıkların fermentatif ürünlere parçalanarak dönüşümü, meyve sularının berraklaştırılması, biranın kıvamının düzenlenmesi, kağıt endüstrisinde ağartmayı iyileştirici olarak kullanılırlar ve biyoteknolojik uygulamalar için yaygın potansiyelleri vardır (Beg ve ark., 2001; Subramaniyan ve Prema, 2002). Ayrıca ksilanaz enzimi, özellikle öncelikli alan olan hayvan besleme işleminde; kanatlı kümes hayvanlarında (Bedford ve Classen, 1992), domuzlarda (Thacker ve Baas, 1996) ve sığırlarda (Beachemin ve ark., 1999b) verim ve performansı artırmada etkin bir şekilde kullanılmaktadır ve ksilanaz kullanımı hayvanlardaki kütle artışında önemli bir rol oynamaktadır. Yemlere enzim ilavesi yapılmasıyla hayvanların yeterince veya hiç salgılayamadıkları enzimlerin salgılanması, istenilmeyen bazı maddelerin etkisiz hale getirilmesi, yemlerdeki sindirimi güç olan karbonhidratlarla diğer organik ve inorganik unsurlardan daha fazla yararlanılması amaçlanmaktadır (Güçlü ve Kara, 2009). Collins ve arkadaşları (2004) ksilanaz enzimlerinin endüstriyel kullanım alanlarını temel olarak 4 grupta toplamışlar ve bu alanları: Kağıt ve kağıt hamuru endüstrisi Hayvan besleme (Yem endüstrisi) Gıda endüstrisi Diğerleri olarak ifade etmişlerdir. Ksilanazların en ümit verici uygulamalarından birisi, kağıt hamuru hazırlamada beyazlastırma ajanı olarak klor kullanımınının azaltılması ve kağıt hamurundan lignini ayırma özelliğidir. Enzim uygulaması kağıt hamurunun fibrilasyonunu ve su tutusunu artırır, islenmemiş kağıt hamurunda dövme sayısını düşürür, hurda kağıt hamurunda bağları onarır, çözünen hamurdan ksilanların selektif giderimini sağlar. Ksilanazlardan ayrıca odun hamurunda biobeyazlatma, sentetik ipek üretiminde ise hamurdan selüloz eldesinde faydalanılır (Viikari ve ark., 1986; Beg ve ark., 2001). 13 Ksilan tarım ve gıda endüstrisi atıklarında bol miktarda bulunmaktadır. Ksilanaz uygulamaları ile atık sulardaki ksilan ksiloza dönüştürülür (Rani ve Nand,1996). Yemlere ksilanaz eklenmesinin sindirimi kolaylaştırarak gelişme hızını arttırdığı, bir başka deyişle, ksilanın kısmi hidrolizi ile ruminal sindirimde selüloza erişilebilirliğin geliştiği ve bu yolla hayvan yemlerinin besinsel değerinin arttığı, ancak yemden ksilanın tamamen uzaklaştırılmasının istenmediği çünkü hemiselülozların besinsel liflerin önemli bir bileşeni olduğu ve bunların uzaklaştırılması ile bağırsak hastalıklarının artabileceği anlaşılmıştır (Wong ve ark.,1988). Hayvan beslenmesinde kullanılan ksilanazların esas kaynağının fungal olduğu, en çok kullanılanlar arasında da Trichoderma ve Aspergillus türlerinden elde edilen ksilanazların yer aldığı açıklanmıştır (Aehle, 2004). Yemlerde doğal olarak bulunan ve besinsel değeri olmayan bazı faktörleri yıkarak besi hayvanlarında daha çok ağırlık artışı sağlamak, ya da yemden daha iyi yararlanarak hayvanın performansını arttırmak; protein, nişasta ve minerallerin kullanılabilir olmayan kaynaklardan, elde edilebilirliklerini arttırmak gibi amaçlarla hayvan beslemede ticari enzim preparatlarının kullanıldığı ve ksilanazlar veya endo-1,4-βksilanazlar (E.C.3.2.1.8)’ ın bu amaçla en çok kullanılan enzimler olduğu belirtilmiştir (Aehle, 2004). Meyve ve sebzelerin suyunun çıkarılması ve meyve sularının berraklaştırılması amacıyla pektinaz ve selülaz ile birlikte kullanılır. Ayrıca ruminantların beslenmesinde sindirimi artırmak amacıyla yem bitkilerinin ön işleminde kullanılmaktadır (Gilbert ve Hazlewood, 1993). Bazı ksilanazlar bitki hücrelerinden protoplast üretimi için hücre duvarının yumusatılmasında da kullanılır (Wong ve ark., 1988). Ksilanazlar gıda endüstrisinde de kullanılmaktadır, bu alanda en çok fırıncılıkta kullanıldığı ve unda bulunan, suda çözünmeyen hemiselülozu çözünür hemiselüloza dönüştürdüğü; çözünür hemiselülozun ise hamurda ağırlığının yaklaşık 10 katı su bağladığı ve bu yolla hamurun sağlamlığını arttırdığı, makineye yapışmasını önlediği bilinmektedir. Ksilanaz ilave edilmiş hamurla yapılan ekmeklerin somun hacminin arttığı, daha iyi daha uniform kırıntı, daha yumuşak ekmek elde edilebildiği, tazeliğin de uzun süre korunduğu saptanmıştır (Kulkarni ve ark.,1999i; Beg ve ark., 2001). 14 2.8.Ksilanaz Gen Kaynakları Ksilanazlar, genellikle saf ksilan veya ksilanca zengin ortamlarda gelişen mikroorganizmalarda bulunan indüktif enzimlerdir. Bakteriler, fungiler, protozoalar, algler, karındanbacaklılar ve antropodları da içine alan bir grup organizma tarafından üretildikleri bildirilmiştir (Beg ve ark.,2001). Bazı genel özelliklerine göre, ksilanaz üreten mikroorganizmaları aşağıdaki gibi gruplandırmak mümkündür (Köksal, 1998). 1. Bakteriler; Bacillus sp., Cellulumonas fimi, Micrococcus sp. AR-135, Staphylococcus sp. SG-1, Thermotoga maritima MSB8 vb. 2. Küf mantarları; Aspergillus niger ve Aspergilius nidulans gibi Aspergilli, Aureobasidium pullulans vb. 3. Funguslar; Trichoderma, Fusarium, Penicillium, Thermomyces vb. 4. Actinomycetes; Streptomyces sp., Thermomonospora curvata vb. 5. Rekombinant mikroorganizmalar. Ayrıca genetik mühendisliği, moleküler biyoloji ve rekombinant DNA teknolojileri ile üretilip endüstride kullanılan çok sayıda ticari ksilanaz da bulunmaktadır. Ksilanazların ticari üretiminde kullanılan suşlar Trichoderma reesei, Thermomyces lanuginosus, Aureobasidium pullulans, Bacillus subtilis ve Streptomyces lividans’ dır (Beg ve ark., 2001). 2.9. Ksilanazla İlgili Yapılan Daha Önceki Çalışmalar Lowe ve ark. (1987a), ksilanaz üretimini en çok etkileyen ksilan olsada ksilanazların buğday samanı, selüloz, sellobiyoz, glukoz ya da ksilozda büyümüş anaerobik funguslar tarafından da üretileceğini bildirmişlerdir. Bunun, anaerobik funguslar tarafından sürekli olarak üretilen ksilanazın temel seviyesi olduğunu ve üretimi ksilanın varlığını artırdığını da eklemişlerdir. Lowe ve ark. (1987c) ve Mountfort ve Asher (1989) yaptıkları çalışmalarında ksilanlı ortamda, ksilanaz ve ksilobiaz enzimlerinin her ikisinin de kültür sıvısında ksilanın parçalanarak; ksiloz, ksilobioz ve ksilo-oligosakkaritlerin oluşması süresine dek görev aldığını belirtmişlerdir. 15 Mountfort ve Asher (1989), ksilanazın esasen ekstraselüler ya da kısmen hücre bağlantılı olarak salgılanabildiğini ve enzimin optimum pH’sının 5.5–6.0 arası, optimum sıcaklığının ise 50ºC olduğunu bildirmişlerdir. Gilbert ve ark. (1992), rekombinant bir ksilanazı (xynA), Neocallimastix patriciarum’un mRNA’sından elde edilen bir E. coli’nin barındırdığı xylA’dan saflaştırmış, bu enzimin çavdar ksilanından ksilobioza kadar etkin olduğunu saptamışlardır. Ancak bu enzimin katalitik etki alanının farklı olması sebebiyle selülotik substratlara ve bu yapıların birimlerine etkili olmadığını eklemişlerdir. Gilbert ve Hazlewood (1993) çalışmalarında selülaz celB geni gibi, Neocallimastix patriciarum ve bazı bakteriyel ksilanaz enzimlerinin sekanslarının karşılaştırmış ve bu enzimler arasındaki belirgin homolojiyi açığa çıkarıp, rumen prokaryotları ve düşük ökaryotlar arasında horizontal gen transferinin olabilirliğini ve ortak bir evrimsel orijininin olabileceğini rapor etmişlerdir. Garcia-Campayo ve Wood (1993), Neocallimastix frontalis’ten B-D-ksilosidazı saflaştırmışlardır. Enzimin 2 polipeptit alt ünitesinin moleküler ağırlığının 83 kDa ve 53 kDa olduğunu belirtmişlerdir. İzole edilen enzimin optimum sıcaklığı 37ºC, optimum pH’sı 6,4 olup, enzim, ksilo-oligosakkaritler ve ksilobioz üzerinde tipik bir ekzoaktiviteye sahiptir ve D-ksiloz varlığında enzim aktivitesi ciddi miktarda azalır. Katalitik aktivitelerin polipeptit alt ünitelerinin biri ya da her ikisine bağlı olup olmadığı net değildir ancak enzimin Cu2+, Ag2+, Zn2+, EDTA ve SDS tarafından yavaşlatıldığını ve Ca2+, Mg2+ varlığında uyarıldığını da eklemişlerdir. 16 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal 3.1.1. Kullanılan Cihazlar Çalısmada kullanılan cihazlar Çizelge 3.1’de verilmiştir. Çizelge 3.1 Kullanılan cihazlar Cihaz Adı Firma Model Mikrodalga Fırın Arçelik MD500 Sonikatör Bandelin Sonopuls HD3100 Mikrotüpler İçin Termal Biosan TS-100 Sallayıcı Spin Cihazı Thermo Shaker Biosan Combi Spin FVL 2400N Thermal cycler BioRad Agaroz Jel Elektroforezi BioRad PAGE Elektroforezi BioRad Güç Kaynağı BioRad Power PAC 300 PCR makinesi BioRad DNA Engine Santrifüj Hettich Vision 300.000 I MIKRO 22R Dondurucu (-80°C) Hettich Mikrosantrifüj Hitachi Otoklav Hiclave İnkübatör Memmert, Biosan Jel Görüntüleme Sistemi Syngene and Kodak pH Metre Sartorius Professional meter pp 15 Dikey Soğutucu +4oC Uğur UV/VIS Spektrofotometresi Varian carry 50 Vorteks VVR, Biosan 17 Buzdolabı Vestel Isıtıcı-Magnetik karıştırıcı Velp Scientifica ARE Terazi Vibra Buz Makinesi VISION Yüksek Hızlı Santrifüj VISION Kar makinesi VISION Saf Su Cihazı Younglın ınstrument Orbital GTP 455A VS 30 000i Çalkalayıcılı Zcheng ZHWY-111C inkübatör 3.1.2. Kullanılan Kimyasallar Çalısmada kullanılan kitler ve kimyasal malzemeler Çizelge 3.2’de verilmiştir. Çizelge 3.2 Kullanılan kitler ve kimyasal malzemeler Kimyasal Madde/Malzeme Firma LB Broth Base Invitrogen- lennox L Broth Base Agar BD BactoTM Agar Dekstroz Merck Pepton BD Tripton BD- BactoTM D-Glukoz monohidrat Alfa Aesar Gliserol Euromedex KCH3COO Merck KCl Sigma NaCl Carlo Erba MgSO4.7H2O Riedel de Haën CaCl2.2H2O Carlo Erba Kanamisin Sigma Aldrich Kloramfenikol Sigma IPTG Amresco DMSO Merck 18 Agaroz Bioron Etidyum bromür ICN Akrilamid Amresco SDS Serva APS Biorad TEMED Biorad PiPES Alfa Aesar Trisma baz Sigma Aldrich HCl Merck PMSF Sigma Aldrich Bezamidin Merck İmidazol Merck Etanol Merck Metanol Merck C6H5Na3O7 Sigma-Aldrich Tampon D Promega Tampon K Takara Tampon E Promega T4 DNA ligaz tamponu Promega Triton X100 Takara BSA Promega/Takara DNS Alfa Aesar Na-K-tartarat Carlo Erba 19 Ksilan TCl Plazmid DNA saflastırma kiti Promega PCR ürünleri temizleme kiti Bio Basic 3.1.3. Kullanılan Enzimler Çalısmada kullanılan enzimler Çizelge 3.3’de verilmistir. Çizelge 3.3 Kullanılan enzimler Enzim Firma Taq DNA Polimeraz Fermentas/Promega T4 DNA ligaz Promega/Takara XhoI Promega NcoI Takara XbaI Takara 3.1.4. Primerler Çizelge 3.4 Ksilanaz genini çoğaltmak amacıyla PCR’de kullanılan primerler Primer Primer dizisi Tm pET28xynBNcoISense TTTTTCCATGGGTTCTACCCCTAGTTCTACT 60.4 pET28xynBXhoIReverse TTTTTTCTCGAGTTAGTGATGGTGGTGATGATGTT 60.7 20 3.1.5. Klonlama ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Mikroorganizmalar Klonlama ve ekspresyon işlemlerini gerçekleştirmek amacıyla kullanılan mikroorganizmalar Çizelge 3.5’de verilmiştir. Çizelge 3.5. Klonlama ve ekspresyon işlemlerinde kullanılan mikroorganizmalar Tür Suş Kullanım amacı Escherichia coli DH5α Klonlama Escherichia coli BL21(DE3) pLysE Ekspresyon 3.1.6. Klonlama ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Plazmitler Klonlama ve ekspresyon işlemlerini gerçekleştirmek amacıyla kullanılan plazmitler Çizelge 3.6’da verilmiştir. Çizelge 3.6. Klonlamada ve ekspresyonda kullanılan plazmitler Plazmit Firma Kullanım amacı pET28b(+) Novagen Klonlama ve ekspresyon vektörü Şekil 3.1’de pET-28a(+) vektörüne ait dairesel harita ve poli-linker bölgesinin detaylı dairesel restriksiyon enzimleri ile birlikte DNA dizisi verilmiştir. 21 Şekil 3.1. pET-28a(+) vektörünün dairesel haritası ve poli-linker bölgesinin detaylı dairesel restriksiyon enzimleri ile birlikte verilen DNA dizisi (Novagen) 22 3.1.7. Kullanılan Çözeltiler 3.1.7.1. Tampon Çözeltiler ve Hazırlanışları FSB çözeltisi: 7,4 g KCl, 7,5 g CaCl2.2H2O, 100g gliserol, 10 ml 1M (pH=7,5) KCH3COO alınarak pH=6,2’ye ayarlandı ve hacim 1 L’ye tamamlandı. Otoklavlandı. PİPES’li tampon çözeltisi: 0,5 M, 50 ml PiPES çözeltisi hazırlandı. KOH ile pH 6,7’e getirildi. Ardından 6,92 g MnCl2, 1,66 g CaCl2 ve 18,64 g KCl 980 ml suda çözüldü. Üzerine 20 ml PiPES çözeltisi eklendi ve hacim 1 L’ye tamamlandı. 0,45 μm’lik filtreden geçirildi ve steril şişelere bölünerek, -20˚C’de saklandı. Sitrik asit-Na2HPO4 (Mcllvaine) tamponu (pH 4): 61,45 ml 0,1 M sitrik asit ve 38,55ml 0,2 M Na2HPO4 çözeltisi karıştırılarak hazırlandı. Sitrik asit-Na2HPO4 (Mcllvaine) tamponu (pH 5): 48,50 ml 0,1 M sitrik asit ve 51,50 ml 0,2 M Na2HPO4 çözeltisi karıştırılarak hazırlandı. Sitrik asit-Na2HPO4 (Mcllvaine) tamponu (pH 6): 39,85 ml 0,1 M sitrik asit ve 63,15 ml 0,2 M Na2HPO4 çözeltisi karıştırılarak hazırlandı. Sitrik asit-Na2HPO4 (Mcllvaine) tamponu (pH 7): 17,65 ml 0,1 M sitrik asit ve 82,35 ml 0,2 M Na2HPO4 çözeltisi karıştırılarak hazırlandı. Tris-HCl tamponu (100 mM pH 8): 1,21 g Tris yaklasık 90 ml saf suda çözüldükten sonra pH’sı 1M HCl ile 8’e ayarlanarak toplam hacmi saf suyla 100 ml’ye tamamlandı. 3.1.7.2. Sıvı ve Katı Besiyerleri LB Agar: 20 g LB (Luria-Bertani) Broth Base (10 g pepton, 5 g maya özütü, 5 g NaCl)1 L suda çözüldü. Hazırlanan 1 L’lik çözelti 400’er ml olacak şekilde 2 tane stok şişesine alındı ve üzerlerine 6’şar g agar ilave edilip karıştırıldı, otoklavlandı. Artan LB çözeltisi yaklaşık 5’er ml olacak şekilde deney tüplerine konuldu ve ağız kısımları alüminyum folyo ile kapatıldı, otoklavlandı. (LB: 10 g yeast ekstrakt, 10 g tripton, 5 g NaCl). SOB: (Super Optimal Broth): 20 g tripton, 5 g maya özütü, 2 ml 5 M NaCl, 2,5 ml 1 M KCl, 10 ml 1 M MgCl2 ve 10 ml 1 M MgSO4.7H2O büyük bir behere alınarak üzeri deiyonize su ile 1 L’ye tamamlandı, iyice karıştırıldı ve otoklavlandı. 23 3.1.7.3. Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) Poliakrilamid Jel Elektroforezinde Kullanılan Çözeltiler Ayırma jeli tamponu: 18,2 g Tris (1,5 M) ve 0,4 g SDS (%0,4 w/v) yaklasık 90 ml saf suda çözüldükten sonra pH’sı 1 M HCl ile 8,8’e ayarlanıp toplam hacmi saf suyla 100 ml’ye tamamlandı. Yükleme jeli tamponu (4xTris-HCl/SDS): 6,05 g Tris (0,5 M) yaklasık 90 ml saf suda çözüldükten sonra pH’sı 1 M HCl ile 6,8’ ayarlanıp toplam hacmi saf suyla 100 ml’ye tamamlandı. 0,4 g SDS (%0,4 w/v) ilave edildi. +4°C’de muhafaza edildi. Numune tamponu (2x): 25 ml 4x Tris-HCl/SDS (pH6,8), 20 ml gliserol (%20 w/v), 4 g SDS (%4 w/v), 2 ml β-merkaptoetanol, 1 mg bromfenol mavisi ve 53 ml suyun karıstırılmasıyla hazırlandı. Küçük kısımlara ayrılarak -20°C’de muhafaza edildi. Amonyum persülfat (APS) çözeltisi (%10w/v): 0,1 g APS 1 ml saf suda çözüldü. Running Buffer (5X): 15 g Tris, 72 g glisin ve 5 g SDS yaklasık 900 ml suda çözüldükten sonra toplam hacmi saf suyla 1000 ml’ye tamamlandı. Stain çözeltisi: 0,5 g Coomassie brillant blue 250 ml metanol, 50 ml glasiyel asetik asitte çözüldükten sonra toplam hacim saf suyla 500 ml’ye tamamlandı. Destain çözeltisi: 250 ml metanol ve 50 ml glasiyel asatik asit karıstırılarak toplam hacim saf suyla 500 ml’ye tamamlandı. 3.1.7.4. Agaroz Jel Elektroforezinde Kullanılan Çözeltiler Etilendiamin tetra asetik asit (0,5 M pH 8 EDTA): 186,1 g Na2EDTA.2H2O 700 ml saf suda çözüldükten sonra pH’sı 1 M NaOH ile 8,0’e ayarlanarak toplam hacim saf suyla 1000 ml’ye tamamlandı. Tris Asetat EDTA (50xTAE) tamponu: 242 gr Tris, 57,1 ml glasiyel asetik asit, 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) bir miktar suda çözüldükten sonra pH’sı glasiyel asetik asitle 8,5’e ayarlanarak toplam hacim saf suyla 1000 ml’ye tamamlandı. Örnek yükleme boyası (6x): 25 mg bromfenol mavisi ve 3 ml gliserol saf su ile iyice karıştırılarak toplam hacmi 10 ml’ye tamamlandı. 24 3.1.7.5. Enzim Saflaştırmada Kullanılan Çözeltiler: NaH2PO4-Na2HPO4 tamponu (100 mM pH 7,6): 65 ml 0,2 M NaH2PO4 ve 0,2 M 435 ml Na2HPO4 karıştırıldıktan sonra toplam hacim saf su ile 1000 ml’ye tamamlandı. Yükleme tamponu (Loading Buffer)(100 mM NaCl-100 mM NaH2PO4-Na2HPO4 pH 7,6): 2,92 g NaCl 500 ml NaH2PO4-Na2HPO4 tamponunda (100 mM pH 7,6) çözüldü. Yıkama tamponu (Wash Buffer)(25 mM imidazol 100 mM NaCl-100 mM NaH2PO4Na2HPO4 pH 7,6): 0,85 g imidazol, 2,92 g NaCl 500 ml NaH2PO4-Na2HPO4 tamponunda (100 mM pH 7,6) çözüldü. Elüsyon tamponu (Elution Buffer)(300 mM imidazol 100 mM NaCl-100 mM NaH2PO4-Na2HPO4 pH 7,6): 10,21 g imidazol, 2,92 g NaCl 500 ml NaH2PO4Na2HPO4 tamponunda (100 mM pH 7,6) çözüldü. 3.1.7.6. Enzim Aktivite Tayininde Kullanılan Çözeltiler Dinitrosalisilik asit (DNS): 1 g DNS 50 ml saf suda çözüldü, üzerine 30 g K-NaTartarat ve 20 ml 2N NaOH ilave edilerek toplam hacim saf suyla 100 ml’ye tamamlandı. +4°C’de muhafaza edildi. Ksilan substratı (%1’lik(w/v)): Çözelti konsantrasyonu %1’lik (w/v) olacak sekilde beechwood xylan tartıldı ve üzerine çalışılacak tampon çözeltiden ilave edildi. Birkaç dakika kaynatıldıktan sonra bir gece boyunca magnetik karıştırıcıda karıştırıldı. Ksiloz standart çözelti: Konsantrasyonu 10 mg/ml olacak şekilde, hesaplanan miktarda ksiloz saf suda çözülerek ana stok çözelti hazırlandı. Hazırlanan bu stok çözeltiden saf suyla seyreltmeler yapılarak çalışılacak farklı konsantrasyonlarda strandart çözeltiler hazırlandı. 3.1.7.7. Diğer Çözeltiler IPTG: 1 g IPTG, 10 ml steril suda çözüldü ve nitro selüloz membrandan süzüldü. 1’er ml olacak şekilde ependorflara bölündü ve dondurucuya (-20 ˚C) kaldırıldı. PMSF çözeltisi: 200 μg PMSF %99’luk 1 ml etanol ile çözüldü. -20°C’de muhafaza edildi. 25 Benzamidine çözeltisi: 15,66 mg benzamidin hidroklorür 1 ml suda çözüldü. -20°C’de muhafaza edildi. İmidazol çözeltisi: (300 mM) 2,045 g imidazol, bir miktar tris tamponunda çözüldü. Son hacim tris tamponuyla 100 ml’ye getirildi. Kloramfenikol Çözeltisi: Kloramfeikol 34 mg/ml olacak sekilde mutlak etanolde çözüldü ve 0,2 μm’lik filtreden geçirilerek steril edildi. -20°C’de saklandı. Kanamisin çözeltisi: 0,25 g kanamisin 5 ml otoklavlanmıs ultra saf suda çözüldü ve 0,2 μm’lik filtreden geçirilerek steril edildi. Ardından küçük hacimler halinde steril ependorf tüplerine dağıtılarak -20°C’de muhafaza edildi. 3.2. Yöntem 3.2.1. Ksilanaz Gen Kaynağı Ksilanaz geninin eldesi (Plazmid DNA şeklinde Prof. Dr. Mehmet İNAN tarafından: Akdeniz Üniversitesi Mühendislik fakültesi Gıda Mühendisliği) bölümünden temin edildi. 3.2.2. PCR İşlemleri için Primerlerin Tasarımı Ksilanaz enziminin üretimi için gerekli olan DNA dizisi, DNA kütüphanelerinden belirlendi. Aspergillus niger xynB geninin DNA dizisinin çoğaltılması için PCR işleminde gerekli olan primerler pET28b plazmit sistemi için dizayn edildi. Primerler pET28xynBNcoISense pET28xynBXhoIReverse DNA Dizisi TTTTTCCATGGGTTCTACCCCTAGTTCTACT TTTTTTCTCGAGTTAGTGATGGTGGTGATGATGTT Şekil 3.2. Ksilanaz genini çoğaltmak amacıyla kullanılan ileri ve geri primerlerin nükleotit sıraları 3.2.3. PCR ile Ksilanaz DNA’sının Amplifikasyonu PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) islemleri için satın alınan primerler 5 μM olacak sekilde, yüksek saflıktaki oligonükleotidler ise PCR islemlerinde kullanılacak konsantrasyonda hazırlanarak asağıda içeriği ve koşulları verilen PCR gerçekleştirildi. 26 50 μl’lik PCR karısımı: 27,5 μl H2O (DNAz & RNAz free) 5 μl 10x tamponu 4 μl MgCl2 4 μl dNTP karışımı (25 mM) 4 μl primer “sense” 4 μl primer “reverse” 1 μl Kalıp DNA 0,5 μl Taq DNA polimeraz Şeklinde toplam 50 µl olan PCR tüpleri hazırlandı. PCR işleminde; sıcaklık değerleri her bir döngü için aşağıda gibi ayarlanmış ve toplamda 30–35 döngüyle PCR işlemi tamamlanmıştır. PCR koşulu: 4°C 10 dk 95°C 2 dk 94°C 1 dk 55°C 1 dk 72°C 1 dk 72°C 5 dk 4°C ∞ 35 döngü 1. Denatürasyon: 94 C 2. Primer Annealing: 55C 3. Ekstensiyon: 72 C PCR işlemleri gerçekleştirildikten sonra 10 μl PCR karışımından alınarak %1‘lik agaroz jelinde analiz edildi ve jelin fotoğrafı alındı. 27 3.2.4. PCR ürünlerinin Saflaştırılması PCR işlemi gerçekleştirildikten sonra, DNA PCR karışım çözeltisinden “Biobasic Gel and PCR Clean-Up” kiti kullanılarak üreticinin tavsiye ettiği protokole uygun olarak saflaştırıldı. Protokol aşağıdaki gibidir: DNA karışımı 1.5 ml Eppendorf tüpüne transfer edilir ve karışımın hacminin 3 katı kadar “Cleanup Solution” eklenir. Karışım EZ-10 Spin kolona eklenir ve 2 dk oda sıcaklığında bekletilir. Ardından 2 dk 10000 rpm (8000xg)‘de santrifüj yapılır. Alttaki sıvı atılır. Kolona 750 μl “Wash Solution” eklenir ve 2 dk 10000 rpm (8000xg)‘de santrifüj yapılır. Alttaki sıvı atılır ve kolon aynı toplama tüpüne geri koyulur. Kolona 750 μl “Wash Solution” eklenir ve2 dk 10000 rpm (8000xg)‘de santrifüj yapılır. Alttaki sıvı atılır ve Wash Solution’ın kalan miktarını çıkarmak için 10000 rpm de 1dk santrifüj yapılır. Kolon 1.5 ml temiz Eppendorf tüpüne transfer edilir. Kolonun merkezine 30-50 μl “Elution Buffer” ya da su eklenir ve 50 °C’de 2 dk bekletilir. 10000 rpm (8000xg)‘de 2 dk santrifüj yapılır. 3.2.5. Restiriksiyon Enzimleri ile Kesim Çizelge 3.7 Kesim işlemi için gereken madde miktarları: xynB Geni İçin Kesim pET28b Vektörü İçin Kesim 28 µl DNA 20 µl Vektör DNA 4 µl 10x Buffer K 3 µl 10x Buffer K 4 µl BSA 3 µl BSA 2 µl NcoI 2 µl NcoI 2 µl XhoI 2 µl XhoI 28 Çizelge 3.7’deki gibi olmak üzere, PCR ürünü için toplam hacmi 40 μl, vektör için 30 μl olan tüpler hazırlandı ve vortekslendi. Ardından mikrosantrifüjle 3-5 saniye hızlıca döndürülerek 37˚C’de inkübasyona bırakıldı. 4 saat boyunca her saat başı tüpler mikrosantrifüjde hızlıca döndürüldü ve 37˚C’de inkübasyona devam edildi. 2 saat sonra tüpler alınarak; sadece vektörün kesildiği tüplere 1’er μl XhoI ve NcoI 0,2 μl 10x Buffer K eklendi. Ardından tüm tüpler hızlıca döndürülerek tekrar 37˚C’de inkübasyona bırakıldı. 4. saatin sonunda tüpler hızlıca döndürülerek kesim işlemi sonlandırıldı. Şeklinde sıralanan işlemlerle kesim 4 saatte tamamlandı ve “Biobasic Gel and PCR Clean-Up” kiti ile saflaştırıldı. 3.2.6. DNA Ligasyonu NcoI ve XhoI ile kesilen plazmid DNA’lar ve PCR ürünleri Promega T4 DNA Ligaz kullanılarak birleştirildi. Ligasyon karışımı için işlemler Çizelge 3.8’de verildiği şekilde yapıldı: Çizelge 3.8. pET28b vektör sistemi ligasyon için gereken madde miktarları: Ligasyon Karışımı I Ligasyon Karışımı II 1 µl kesilmiş pET28b plazmiti 2,5 µl kesilmiş pET28b plazmiti 3 µl T4 DNA Ligaz Tamponu (10x) 3µl T4 DNA Ligaz Tamponu (10x) 20 µl kesilmiş xynB Geni 18,5 µl kesilmiş xynB Geni 1 µl T4 DNA Ligaz 1 µl T4 DNA Ligaz Çizelge 3.8’de verilen miktarlarda yapılan pipetlemenin ardından, hazırlanan ligasyon karışımı mikrosantrifüjde hızlıca döndürüldü ve +16 ˚C’de gece boyu inkübasyona bırakıldı. İnkübasyonun ardından transformasyon işlemlerinde kullanılıncaya kadar +4˚C’de muhafaza edildi. 29 3.2.7. Kompotent Hücre Hazırlanması 3.2.7.1. PİPES’li Kompotent Hücre Hazırlanması Petriye DH5α ekildi ve 16 saat inkübe edildi. 16 saatlik inkübasyonun ardından alınan petriden 1 koloni alınarak; içinde 25 ml SOB bulunan 250 ml‘lik erlene inoküle edilerek, 250 rpm ve 37˚C de 6 saat inkübe edildi. 6 saatin ardından kültür için içinde 250 ml SOB bulunan 3 tane erlen hazırlandı ve bir önceki DH5α‘dan; 10 ml, 4 ml ve 2 ml inoküle edildi. Hazırlanan erlenler 1822˚C arası 14 saat boyunca 150 rpm‘de inkübe edildi. Kültürlerin 600 nm‘deki OD‘leri her 45 dakikada bir okundu ve değer 0,55‘e ulaştığında kültür çalkalayıcıdan alındı. 10 dakika buzlu-su banyosunda bekletildi. Ardından hücreler +4˚C‘de 2500 g (3900 rpm)‘de 10 dakika santrifüjlendi. Besiyeri boşaltıldı ve santrifüj şişesinin içinde kalan besiyeri temizlendi. Hücrelere 0˚C’deki 80 ml PiPES‘li tampon ilave edilerek, hassas olarak yeniden süspansiyon haline getirildi. Hücreler, +4˚C 2500 g (3900 rpm)‘de 10 dakika santrifüjlendi. Tüpün içindeki tampon boşaltıldı ve temizlendi. Hücrelere 0˚C‘de 20 ml PiPES‘li tampon ilave edildi ve hassasça yeniden süspansiyon hale getirildi. 1,5 ml DMSO eklendi, hafifçe karıştırıldı. Buz banyosuna alındı ve 10 dakika beklendi. Hızlı bir şekilde hücreler steril ependorf tüplere bölündü ve hızlıca donması için sıvı azota atıldı. Ardından hücreler -80˚C‘de saklandı (Inoue ve ark., 1990). 3.2.7.2. FSB’li Kompotent Hücre Hazırlanması 1 gece önce inoküle edilen kültürden 1 ml ve 0,5 ml alınarak 2 tane steril erlene eklendi. Üzerine 50 ml LB (Luria Bertani) eklenerek; 370C ve 250 rpm’de inkübasyona bırakıldı. 30 Optik dansite, 600 nm’de absorbans yaklaşık olarak 0,7 olduğunda erlenler inkübatörden alındı ve +40C 5000 rpm’de 10 dakika santrifüjlendi. Süpernatant atıldı. Pelet üzerine 50 ml soğuk FSB (dondurulmuş saklama tamponu) çözeltisi eklendi çok iyi vortekslendi. Ardından 1 saat buz banyosunda inkübe edildi. 1 saatin ardından; +40C, 4000 rpm’de 10 dakika santrifüjlendi. Süpernatant atıldı. Pelet üzerine 8 ml soğuk FSB çözeltisi eklendi ve tüpe vurarak çözünme sağlandı. Peletin tamamı çözününce üzerine 560 μl DMSO eklendi ve 3 saat buza gömüldü. saatin ardından kompotent hücre hazır hale geldi (Hanahan, 1983). 3.2.8. Transformasyon Buz banyosunda bulunan kompotent hücrelerden 200 μl’lik kısımlar alındı. Gerekli sayıda ependorfa pipetleme yapıldı. Üzerine 5 μl ligasyon ürünü eklendi ve karıştırılarak 1 saat buz banyosuna gömüldü. 1 saatin ardından 2 dakika 42oC’de ısı şokuna maruz bırakıldı. Tekrar buza gömülerek 5 dakika inkübe edildi. Üzerine 300 μl (veya kullanılan kompotente göre SOB) LB eklendi ve yarım 0 saat 37 C ve 250 rpm’de inkübasyona bırakıldı. Yarım saatin ardından her bir ependorf içeriği seçici besiyerine pET28b sistemi için kanamisinli petriye sprader ile yayıldı. 370C’de 1 gece inkübasyona bırakıldı (Hanahan,1985). 3.2.9. Plazmid DNA Saflaştırılması Petri tabaklarından elde edilen koloniler kanamisin ihtiva eden 4 ml’lik steril sıvı LB içerisine tek koloni olarak inoküle edildikten sonra 37 °C de gece boyu inkübe edilerek yetistirildiler. Santrifüjle ependorf tüplerine toplanan hücrelerden plazmit DNA 31 “Biobasic Plasmid DNA Purification” kiti kullanarak aşağıdaki protokole göre saflaştırıldı. Protokol aşağıdaki gibidir: Kültürden 1.5-5 ml tüpe transfer edilir, 2 dk 12000 rpm ‘de santrifüj yapılır ve sıvı tamamen dökülür. 100 μl Solution 1 eklenir ve iyi bir şekilde karıştırılır (vorteksle) ve 1dk beklenir. Karışıma 200 μl Solution 2 eklenir ve nazikçe 4-6 kez alt üst edildikten sonra 1dk oda sıcaklığında bekletilir. (Genomik DNA kontaminasyonlarını engellemek için vorteksleme yapılmamalıdır). Karışıma 350 μl Solution 3 eklenir ve nazikçe karıştırılıp oda sıcaklığında 1 dk bekletilir. 12000 rpm’de 5 dk santrifüj yapılır. Süpernatant EZ-10 Spin kolona eklenir ve 2 dk 10000 rpm ‘de santrifüj yapılır. Alttaki sıvı atılır. Kolona 750 μl “Wash Solution” eklenir ve 2 dk 10000 rpm ‘de santrifüj yapılır. Alttaki sıvı atılır ve kolon aynı toplama tüpüne geri koyulur. Kolona 750 μl “Wash Solution” eklenir ve 2 dk 10000 rpm (8000xg)‘de santrifüj yapılır. Alttaki sıvı atılır ve Wash Solution’ın kalan miktarını çıkarmak için ekstradan 1dk daha santrifüj yapılır. Kolon 1.5 ml temiz Eppendorf tüpüne transfer edilir. Kolonun merkezine 50 μl steril distile su eklenir ve 50 ˚C’de 2 dk bekletilir. 10000 rpm‘de 2 dk santrifüj yapılarak plazmit DNA’lar saflaştırılır. Saflaştırılan plazmid DNA’lar restiriksiyon enzim analizinde kullanılmak üzere -20 ˚C’de muhafaza edilir. 3.2.10. Doğrulama Restriksiyon Kesimi Saflaştırılan plazmid DNA (pET28b-xynB), XbaI ve XhoI ile kesildikten sonra bu plazmidin istenilen uzunlukta DNA parçalarını (insertleri) (564 bç) ihtiva edip etmedikleri %1’lik agaroz jel üzerinde analiz edildi. 32 Çizelge 3.9. pET28b vektör sistemi doğrulama kesimi için gereken madde miktarları: pET28b Vektör Sistemi İçin Kesim 18 µl Plazmit DNA (pET-XynB ) 2,5 µl 10x Buffer D 2,5 µl BSA 1µl XbaI 1µl XhoI Olmak üzere tüpler hazırlandı, vortekslendi. Mikrosantrifüjle 3-5 saniye hızlıca döndürüldü ve 37˚C’ye ayarlanmış bir ısıtıcı blok üzerinde 2,5 saatlik inkübasyona bırakıldı. 2,5 saatlik inkübasyon süresince her 45 dakikada tüpler alınarak hızlıca döndürüldü ve inkübasyona devam edildi. 2,5 saat sonra tüpler alınarak hızlıca döndürüldü. Alınan belirli miktardaki numunelerin üzerine DNA boyası eklenerek agaroz jele yaklasık olarak 15 μl yükleme yapıldı. Yürütme tamamlandıktan sonra jelin fotoğrafı alındı., 3.2.11. DNA Dizileme Restriksiyon enzim analizi sonucu pozitif olduğu düşünülen 1,3,9,10 nolu plazmit DNA’lardan 30 μl alındı ve T7 promotor primeri ile dizi analizi yapılmak üzere DNA dizilemeye gönderildi. 3.2.12. E. coli BL21(DE3) pLysE Hücresinin pET28b(+)-xynB Plazmidi ile Transformasyonu ve Ksilanaz’ın Ekspresyonu Protein ekspresyon çalışmaları için E. coli BL21 pLysE suşu kullanıldı. -80 0C derin dondurucudan çıkarılan stok hücreler 4 µl kloramfenikol içeren 4 ml’lik LB besiyerine inoküle edilerek bir gece 37 0C’de 250 rpm çalkalama hızında yetiştirildi. 33 Daha sonra FSB’li kompetant hücre hazırlama protokolüne uygun şekilde hücreler kompetent hale getirildi (Bkz 3.2.7.2). Kompetent hücrelere pozitif plazmitler başlık 3.2.8’de anlatılan protokole göre transfer edildi. Transformasyonun ardından hücreler pET28b sistemi için içerisinde kloramfenikol ve kanamisin bulunan LB Agar besiyerine yayma yöntemiyle ekildi ve 1 gece 37 0C’de inkübasyona bırakıldı. Üreyen hücrelerden birer koloni alarak pET28b sistemi için içerisinde 4 µl kloramfenikol ve 2 µl kanamisin bulunan 4 ml’lik LB besiyerine inoküle edilerek bir gece 37 0C’de 240 rpm de inkübe edildi. Hücreler kanamisin ve kloramfenikol içeren ve içinde 600 ml LB bulunan 2 L’lik steril erlenlere inoküle edildi. Her saat 600 nm’deki absorbanslarına bakıldı. OD 0,7 olduğunda 500 μl 1 M IPTG ilave edilerek indüklendi. IPTG ile indüklenmeden önce 1ml örnek alındı. IPTG’li 3 saatlik inkübasyonun ardından erlenler alınarak; 1ml örnek alındı ve 250 ml’lik santrifüj kaplarında, 6000 rpm’de 4˚C’de 10 dakika santrifüjlendi. Süpernatant tamamen uzaklaştırılarak toplanan E. coli BL21 pLysE hücreleri parçalama işlemi yapılıncaya kadar -20˚C’de muhafaza edildi (Guda ve ark., 1995). Alınan 1 ml’lik örnekler 12000 rpm de 4 dk santrifüj edildi. İndüklemeden önceki örnekler için 950 μl süpernatant atılarak pelet üzerine 50 μl Tris-HCL tampon çözeltisi ilave edilerek vortekslendi ve 100μl SDS-Sample Buffer eklendi.95 ˚C’de 5 dk kaynatıldı. İndüklendikten sonraki örnekler için de aynı şekilde 950 μl süpernatant atılarak pelet üzerine 50 μl Tris-HCL tampon çözeltisi ilave edilerek vortekslendi ve 100 μl SDS-Sample Buffer eklendi. Tüpler 95 ᵒC’ de 5 dk kaynatıldı. Örnekler oda sıcaklığında soğumaya bırakıldı ve SDS-PAGE analizi için hazır hale geldi. 3.2.13. SDS-PAGE ile E. coli Ksilanaz Proteininin Üretilip Üretilmediğinin Analizi Hazırlanan SDS PAGE jelinin kuyucuklarına indüklemeden önceki örneklerden 20’şer μl, indüklendikten sonraki örneklerden 30’ar μl yüklendi. SDS-PAGE tamamlandıktan sonra distile su ile yıkanan jel sonrasında stain çözeltisi ile boyandı. Boyanan jel destain çözeltisi ile iyice temizlendikten sonra analiz edildi. 34 3.2.14. E. coli BL21 pLysE Hücrelerinin Parçalanması İndüklemenin ardından -20˚C’de saklanan hücreler çıkarılarak buza gömüldü. Üzerine 100 mM Tris tamponundan (pH = 7,5) 40 ml eklenerek süspansiyon haline getirildi. Süspansiyona 50 μl 100 mM benzamidin ve 50 μl 100 mM PMSF ilave edildi ve buz üzerine alındı. Buz üzerindeki hücreler 3 mm ucu olan sonikatörle 1 saat süresince parçalandı. +4°C ve 6000 rpm’de 10 dakika santrifüjlendi. Peletin renginden (kahverengi) parçalama işleminin istenen düzeyde gerçeklestiği sonucuna varıldı. Süpernatantlar ayrı bir tüpe alındı, +4˚C’de 30000 rpm 1 saat ultrasantrifüj cihazında santrifüjlenerek karısımdaki hidrofobik proteinler ve diğer hidrofobik hücre materyalleri çöktürüldü. 3.2.15. E.coli BL21(DE3) pLysE’de Ekspres Edilen Ksilanaz Enziminin Afinite Kromatografisi ile Saflaştırılması Önce küçük bir polikarbonat kolon içerisine 3 ml kadar rezin konulduktan sonra kolon 100 mM 40 ml kadar Tris/HCl (pH = 7,5) tamponuyla yıkandı. Santrifüj sonrasında alınan süpernatant (protein karışımı) kolona tatbik edildi ve kolondan gelen bütün fraksiyonlar toplandı (Load). Protein yüklenmis kolon, öncelikle 40 ml 100 mM Tris/HCl (pH = 7,5) tamponuyla yıkanarak kolonda tutunmuş diğer proteinlerin ayrılması sağlandı (Wash). Ardından 300 mM imidazol içeren, 100 mM Tris/HCl (pH = 7,5) tamponuyla kolona tutunmuş olan protein 4 ayrı fraksiyon olarak elüe edildi. Protein aktivite testlerinde kullanılmak üzere +4 ˚C‘de saklandı. 3.2.16. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrillamit Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) İle Ksilanaz Proteininin Analizi SDS-PAGE Sambrook ve arkadaşlarına (1989) göre %4’lük yükleme jeli ve %12’lik ayırma jeli kullanılarak gerçekleştirildi (Çizelge 3.10). 35 Çizelge 3.10 SDS-PAGE elektroforezinde kullanılan bileşenler ve oranları: Bileşenler Yükleme Jeli (ml) Ayırma Jeli (ml) %40 akrilamid 0,35 2,7 Ayırma jeli tamponu - 2,25 Yükleme jeli tamponu 1 - Saf su 2,59 4 %10 Amonyum persülfat 0,05 0,05 TEMED 0,01 0,02 Hazırlanan jel karışımı plakalar arasına yüklendikten sonra tanka yerleştirildi ve tank SDS-PAGE yürütme tamponu ile dolduruldu. Saflaştırma aşamasında toplanan her fraksiyondan alınan 100 μl’lik numuneler 100 μl numune tamponuyla karıştırılıp 100°C’de 5 dakika denatüre edilerek SDS-PAGE jelinin kuyucuklarına 20’şer μl yüklendi. Proteinler, boya ayırma jelinden uzaklaşıncaya kadar 46 mA’de yürütüldü. Yürütme işlemi tamamlanınca tanktan çıkarılan jel üzerine jel boyama çözeltisi ilave edildi ve yavaş bir şekilde 15 dk çalkalanarak bekletildi. Boyanan jel, boyanın fazlasını uzaklaştırarak protein bantlarını görünür hale getirmek amacıyla boya uzaklaştırma çözeltisi ile yıkandı. Jel görüntüsü, protein bantları görünür hale geldikten sonra jel bir tarayıcı ile taranarak dijital ortama alındı. 3.2.17. Saflaştırılan Proteinin Kantitatif Analizi Proteinin kantitatif analizi için önce 2 adet kuartz mikro küvete (1 ml kapasiteli) proteinin içinde bulunduğu tampon çözeltiden (Tris/HCl pH = 7,5) konularak sıfırlandı. Sonra küvetlerden birisine konulan protein numunesinin 280 nm de absorbansı okundu. Bulunan absorbans değeri yüksek olduğundan protein numunesi seyreltilerek absorbans ölçüldü (1 in altında bir değere indirlidi). Seyreltmeden dolayı belli bir katsayıyla çarpıldıktan sonra toplam protein numunesinin absorbansı hesaplandı. pET-xynB proteininin DNA dizisi alınarak önce Expasy Translate tool‘ u (Anonim, 2012j) kullanılarak füzyonun amino asit dizisi belirlendi. 36 pET-xynB füzyon proteininin belirlenen amino asit dizisi daha sonra Expasy ProtParam tool’u (Anonim, 2012ı) kulanılarak teorik moleküler ağırlığı ve 280 nm deki extinction coefficient (ekstinksiyon katsayısı) hesaplandı. Sonrasında absorbsiyon, moleküler ağırlığı ve ekstinksiyon katsayısı değerleri alınarak Lambert-Beer yasasına göre proteinin konsantrasyonu mg/ml olarak hesaplandı (9,06 mg/ml). 3.2.18. DNS Yöntemi İle Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi Enzim aktivitesini durdurmak ve indirgen şeker miktarının saptanması amacı ile kullanılmıştır (Aiba ve ark., 1983). 1 g DNS (50 mL de-iyonize su içinde çözüldükten sonra), 30 g K-Na-Tartarat ve 20 mL 2N NaOH ilave edilerek, son hacim distile su ile 100 mL’ye tamamlanır (Aiba ve ark.,1983). DNS bazik şartlar altında indirgeyici şekerin serbest karbonil grubu ile reaksiyona girer. Reaksiyon sonucu 3,5-dinitrosalisilik asit (DNS) 3-amino-5-nitrosalisilik asite dönüsür. Aromatik bir bileşik olan 3-amino-5-nitrosalisilik asit oluşumu 540 nm dalga boyunda absorblanan ışık miktarında değişikliğe yol açar. Spektrofotometre kullanılarak ölçülen absorbans değeri, indirgeyici şeker miktarıyla doğru orantılıdır (Negrulescu ve ark., 2012). pH’sı 5 olan mcllvaine tamponunda çözünen beech-wood xylan (kayın kerestesi ksilanı) ve saflaştırılmış enzimden oluşan reaksiyon karışımı 50°C’de 10 dk inkübe edildi. İnkübasyonun ardından 1:1 oranında DNS ilave edilip 5 dk kaynatıldı, rengin stabilizasyonu için soğutulup 540 nm’de absorbans ölçüldü. Ksilanaz aktivitesi, standart olarak farklı konsantrasyonlarda hazırlanan xylose (ksiloz) çözeltisi kullanılarak çizilen kalibrasyon grafiğinden hesaplandı. 3.2.19. Bazı Parametrelerin Ksilanaz Aktivitesi Üzerine Etkisi 3.2.19.1.pH’nın Etkisi Enzimin optimum aktivite gösterdiği pH değerinin belirlenmesi için, pH 4-7 arasında Mcllvaine tamponu, pH 8’de Tris-HCl tamponu kullanılarak farklı pH değerlerine sahip (pH 4-8) %1’lik ksilan içeren substrat çözeltileri hazırlandı. 37 Aktivite tayini için, enzim ve substrat karısımı 37°C’de 10 dk inkübe edildi. İnkübasyon sonrası karışıma eşit hacimde DNS ilave edilerek 5 dk kaynatıldı, soğutma işleminden sonra 540 nm dalga boyunda köre karsı absorbans değerleri kaydedildi. Kör, eşit hacimde substrat ve DNS çözeltisi kullanılarak hazırlandı. En yüksek absorbans değerinin elde edildiği pH değeri baz alınarak % bağıl enzim aktivitesi bulundu. 3.2.19.2. Sıcaklığın Etkisi Enzim aktivitesi üzerine sıcaklığın etkisini belirleyebilmek amacıyla, 30, 40, 50, 60, 70°C’lik sıcaklık değerlerinde ölçümler yapıldı. Enzim ve substrat karışımı belirlenen optimum pH değerinde, belirtilen sıcaklık aralığında 10 dk inkübe edildi. İnkübasyon sonrası karışıma eşit hacimde DNS ilave edilerek 5 dk kaynatıldı, soğutma işleminden sonra 540 nm dalga boyunda köre karşı absorbans değerleri kaydedildi. Kör, eşit hacimde substrat ve DNS çözeltisi kullanılarak hazırlandı. En yüksek absorbansdeğerinin elde edildiği pH değeri baz alınarak % bağıl enzim aktivitesi bulundu. 3.2.19.3. Sıcaklık Stabilitesinin Belirlenmesi Sıcaklık stabilitesinin belirlenmesi için enzimler 4, 22, 37, 50°C’lik sıcaklıklarda 30 dakikalık aralıklarla 180 dk boyunca inkübe edildi. Ön inkübasyon uygulamasından sonra optimum şartlarda aktivite tayini yapıldı. 3.2.19.4 Substrat Konsantrasyonunun Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi Substrat konsantrasyonunun enzim aktivitesi üzerine etkisini belirlemek amacıyla optimum şartlarda enzim aktivitesi değişen substrat miktarına (1-10 mg/ml) karşı belirlendi. 38 4. BULGULAR ve TARTIŞMA 4.1. PCR ile Ksilanaz DNA’sının Amplifikasyonu Başlık 3.2.3. anlatılan PCR reaksiyonu sonucunda Aspergillus niger’e ait ksilanaz geninin amplifiye edildiği %1 lik agaroz jelinde gözlemlenmiştir. ~ 560 bç Şekil 4.1. pET28b vektör sistemi için koloni PCR sonucunun %1’lik agaroz jeldeki görüntüsü 4.2. Klonlama Sonrası Plazmid DNA’ların Restriksiyon Enzimleri ile Analizi Plazmit E. coli DH5α’dan saflaştırıldıktan sonra genin pilazmite klonlanıp klonlanmadığını anlamak amacıyla doğrulama restriksiyon kesimi gerçekleştirildi. Jel görüntüsü incelendiğinde, 9 numunenin kesim sonrası beklenildiği gibi 5200 bp ve 600 bp olmak üzere iki farklı uzunlukta DNA’ya parçalandığı görüldü (Şekil 4.2). 39 ~ 5200 bç ~ 600 bç Şekil 4.2. pET28b vektör sistemi için doğrulama kesim sonucunun %1 lik agaroz jeldeki görüntüsü. 7. DNA standardı (l / EcoR I+Hind III), 1-11. Kesim sonrası elde edilen 5200 bp ve 600 bp uzunluklarındaki DNA parçaları Şekil 4.3. NEBcutter V2.0 programı kullanılarak elde edilen pET28b klonlama bölgesi xyn genine ait restriksiyon enzim haritası (Anonim, 2013) 4.3. DNA Dizileme Dizi analizi sonucu elde edilen kromotogramlar şekil 4.4’de verilmiştir. 40 Şekil 4.4. Pet28b-xynB vektörünün DNA dizileme sonucunun kromotogram şeklindeki görüntüsü 41 Kromotogramlar FinchTV programı kullanılarak okunmuştur. Şekilde de görüldüğü üzere elde edilen pikler oldukça temizdir. Analiz sonucu elde edilen DNA dizisi, klonlama işleminin başarıyla gerçekleştirildiğini göstermektedir. DNA dizisi, Expasy translate programı kullanılarak amino asit dizisine çevrilerek aşağıda verilmiştir. 1 1 61 21 121 41 181 61 241 81 301 101 361 121 421 141 481 161 541 181 GAATTCTCTACCCCTAGTTCTACTGGTGAAAACAACGGATTCTATTACTCATTCTGGACC S T P S S T G E N N G F Y Y S F W T GATGGTGGTGGAGATGTTACCTACACAAACGGAGATGCTGGTTCATACACAGTTGAATGG D G G G D V T Y T N G D A G S Y T V E W AGTAACGTTGGAAATTTTGTCGGTGGAAAGGGTTGGAACCCAGGAAGTGCCCAAGACATT S N V G N F V G G K G W N P G S A Q D I ACTTATTCTGGTACATTCACCCCTTCCGGTAATGGATACTTGTCAGTTTATGGATGGACT T Y S G T F T P S G N G Y L S V Y G W T ACAGATCCACTTATTGAATACTATATCGTCGAGAGTTACGGTGACTATAACCCTGGATCT T D P L I E Y Y I V E S Y G D Y N P G S GGTGGAACTTACAAAGGTACTGTTACATCTGATGGATCCGTCTACGACATCTACACCGCC G G T Y K G T V T S D G S V Y D I Y T A ACTAGAACAAACGCTGCCTCCATCCAAGGTACCGCAACTTTTACACAATATTGGTCAGTT T R T N A A S I Q G T A T F T Q Y W S V AGACAGAATAAGAGAGTTGGTGGAACTGTCACCACTTCTAACCATTTCAATGCATGGGCT R Q N K R V G G T V T T S N H F N A W A AAATTGGGTATGAACCTTGGAACCCACAATTACCAGATCGTTGCTACTGAGGGTTACCAA K L G M N L G T H N Y Q I V A T E G Y Q AGTTCAGGTTCCAGTTCCATTACCGTTCAACATCATCACCACCATCACTAATCTAGA S S G S S S I T V Q H H H H H H 4.4. SDS-PAGE İle Ksilanaz Proteininin Üretilip Üretilmediğinin Analizi Saflaştırma öncesinde ve sonrasında SDS-PAGE yapıldı. Elektroforez jelinin Coomassie Brilliant Blue ile boyanıp fazla boyanın uzaklaştırılması sonucunda xynB geninin E.coli’de üretildiği ve saflaştırıldığı görüldü.(Şekil 4.5 ve Şekil 4.6). 42 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Şekil 4.5. SDS-PAGE analiz görüntüsü: 1. İndüklenmeden önce pET28b-xynB-1 plazmitini içeren hücre örneği, 2. İndüklenmeden önce pET28b-xynB-2 plazmitini içeren hücre örneği, 3. İndüklenmeden önce pET28b-xynB-3 plazmitini içeren hücre örneği, 4. İndüklenmeden önce pET28b-xynB-4 plazmitini içeren hücre örneği, 5. E.coli BL21 pLySE hücre örneği (kontrol), 6. Protein markörü, 7. İndüklendikten sonra pET28b-xynB-1 plazmitini içeren hücre örneği, 8. İndüklendikten sonra pET28b-xynB-2 plazmitini içeren hücre örneği, 9. İndüklendikten sonra pET28b-xynB-3 plazmitini içeren hücre örneği, 10. İndüklendikten sonra pET28b-xynB-4 plazmitini içeren hücre örneği 1 2 3 4 43 5 6 Şekil 4.6. Saflaştırma sonrası SDS-PAGE analiz görüntüsü. 1. Load (Santrifüj sonrasında-alınan süpernatantın kolona tatbik edilmesi sonrasında kolondan alınan fraksiyon), 2. Wash (Protein yüklü kolonun 100 mM Tris/HCl (pH = 7,5) tamponuyla yıkanması sonucu kolondan alınan fraksiyon), 3. Elüat-1 (300 mM imidazol içeren, 100 mM Tris/HCl (pH = 7,5) tamponuyla kolona tutunmuş olan proteinin elüe edilmesiyle elde edilen fraksiyon), 4. Protein marker, 5. Elüat-2 (300 mM imidazol içeren, 100 mM Tris/HCl (pH = 7,5) tamponuyla kolona tutunmuş olan proteinin elüe edilmesiyle elde edilen fraksiyon),6. Elüat-3 (300 mM imidazol içeren, 100 mM Tris/HCl (pH = 7,5) tamponuyla kolona tutunmuş olan proteinin elüe edilmesiyle elde edilen fraksiyon) Afinite kromatografisi ile saflaştırma işlemi sonunda, Şekil 4.7.‘de görüldüğü gibi pETxynB füzyon proteini saflaştırılmıştır. Füzyonun amino ucuna eklenen histidinlerin (6 adet) nikele olan afinitesi ile füzyon kolona bağlanmış, diğer proteinler kolondan ayrılmış ve böylece saflaştırma gerçekleştirilmiştir. 4.5. Saflaştırılan pET-xynB Proteininin Kantitatif Analizi “Expasy tools” sitesinde bulunan “ProtParam tool” una girilerek alınan verilerden pETxynB proteininin amino asit dizisi ve sayısı bulundu ayrıca teorik moleküler ağırlığı 21.190,60 Dalton ve molar absorbsiyon katsayısı (extinction coefficient) ise 58330 M-1.cm-1 olarak hesaplandı. Şekil 4.6’da ki jel incelendiğinde üretilen ksilanaz enziminin moleküler ağırlığının teorik olarak hesaplanan değere oldukça yakın olduğu görülmektedir. Daha sonra saflaştırılan pET-xynB proteininin absorbansı 280 nm‘ de UV ölçülerek, spektrofotometresinde gerekli hesaplamalar yapıldıktan saflaştırılan proteinin miktarı (mg/ml) olarak hesaplandı ve 9,06 mg/ml bulundu. Çizelge 4.1. pET-xynB proteinine ait amino asit dizisi 10 20 30 40 50 MEFSTPSSTG ENNGFYYSFW TDGGGDVTYT NGDAGSYTVE WSNVGNFVGG 60 70 80 90 100 KGWNPGSAQD ITYSGTFTPS GNGYLSVYGW TTDPLIEYYI VESYGDYNPG 110 120 130 140 150 SGGTYKGTVT SDGSVYDIYT ATRTNAASIQ GTATFTQYWS VRQNKRVGGT 160 170 180 190 VTTSNHFNAW AKLGMNLGTH NYQIVATEGY QSSGSSSITV QHHHHHH 44 sonra 4.6. Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi 4.6.1. Bazı Parametrelerin Ksilanaz Aktivitesi Üzerine Etkisi 4.6.1.1. pH’nın Etkisi Ksilanaz enziminin en yüksek aktiviteyi gösterdiği pH değerini belirleyebilmek amacıyla, beech-wood ksilan substratı varlığında farklı pH değerlerindeki tamponlar kullanılarak enzim aktivite tayinleri yapıldı. Elde edilen aktivite değerleri kullanılarak pH-%bağıl aktivite eğrisi çizildi (Şekil 4.7). Çizilen eğriye göre, optimum pH’nın 5,0 olduğu görülmektedir. Şekil 4.7. Ksilanaz enziminin pH bağımlık eğrisi 4.6.1.2. Sıcaklığın Etkisi Enzim aktivitesi üzerine sıcaklığın etkisini belirleyebilmek amacıyla, 30, 40, 50, 60, 70°C’lik sıcaklık değerlerinde ölçümler yapıldı. Elde edilen aktivite değerleri kullanılarak sıcaklık-%bağıl aktivite eğrisi çizildi (Şekil 4.8). Çizilen eğriye göre optimum sıcaklık 50°C olarak bulundu. 45 Şekil 4.8. Ksilanaz enziminin sıcaklık bağımlık eğrisi 4.6.1.3. Sıcaklık Stabilitesinin Belirlenmesi Sıcaklık stabilitesinin belirlenmesi için enzimler 4, 22, 37, 50°C’lik sıcaklıklarda 30 dakikalık aralıklarla 180 dk boyunca inkübe edildi. Ön inkübasyon uygulamasından sonra optimum şartlarda aktivite tayini yapıldı. Elde edilen aktivite değerleri kullanılarak zaman-kalan aktivite (%) eğrisi çizildi (Şekil 4.9). Eğriye göre enzim 4˚C’de ki sıcaklıkta genel olarak aktivitesini koruduğu % 20’lik bir kayıp olduğu belirlendi. Sırasıyla yaklaşık olarak 22 ˚C’de %50, 37˚C’de %60 ve 50˚C’de ise %90 oranında aktivitesini kaybettiği belirlendi. Şekil 4.9. Ksilanaz enziminin ısıl kararlılık eğrisi 46 4.6.1.4. Substrat Konsantrasyonunun Enzim Aktiviesi Üzerine Etkisi Substrat konsantrasyonunun enzim aktivitesi üzerine etkisini belirlemek amacıyla enzim konsantrasyonu sabit tutularak optimum sartlarda değişen substrat miktarlarında (1-10 mg/ml) enzim aktivite tayinleri gerçekleştirildi. Elde edilen veriler kullanılarak Linewear-Burk eğrisi çizildi. Km değeri 10,752 mg/ml ve Vmax değeri ise 33,22 mg/ml olarak belirlendi (Şekil 4.10). Şekil 4.10. Ksilanaz enzimi için Linewear-Burk eğrisi 47 5.SONUÇ Bugüne kadar 2000’den fazla enzim tanımlanmış ve bunlardan yaklaşık 100 tanesi ticari olarak kullanıma uygun bulunmuştur. Fakat günümüzde bunlardan sadece 18 tanesi endüstriyel amaçla üretilmektedir (Zeman ve McCrea., 1985). Endüstride faydalı olan ve ticari olarak kullanılan enzimlerin bazı avantajlara sahip olması gerekmektedir. Buna göre bir enzimin herhangi bir endüstri alanında kullanılabilmesi için, işlem maliyeti bakımından ucuz olması, fiziksel ve kimyasal koşullara bağlı olmadan aktivitesini en yüksek düzeyde koruması ve mümkün olan en uzun süreyle sürdürmesi, çok farklı alanlarda kullanılabilme özelliğinde olması, allerjik ya da toksik etkiye sahip olmaması yani güvenilir olması gerekir (Sarıkaya, 1995). Bu çalışmada rekombinant olarak üretilen ksilanazın substratı olan ksilan,hemiselülozun baslıca bileşenidir ve hemiselülozlar doğada toplam biyokütlenin % 30-35’ini oluşturmaktadır (Kulkarni ve ark.,1999). Ksilanazlardan bugün gıda ve yem sanayisinde çeşitli şekillerde yararlanırken (Biely,1985; Berovic ve ark., 1997), kağıt sanayi (Haarhoff ve ark., 1999) ve ayrıca atık arıtım ve değerlendirme proseslerinde de (Biely, 1985; Carmona ve ark., 1997; Duarte ve ark., 1994) ksilana yönelik uygulamalar bulunmaktadır. Bu çalışmada fungal kaynaklı ksilanaz rekombinant olarak üretilmiştir. Bunun için Aspergillus niger gen kaynağı olarak kullanılmıştır. Aspergillus niger büyük miktarlarda protein üretip ortama salgılama yeteneğinden dolayı homolog ve heterolog gen ekspresyonu için uygunp bir organizmadır. A.niger’den izole edilen ksilanaz geni pET28b vektörüne klonlanarak E.coli BL21(DE3) pLysE hücresinde ekspresyon işlemi başarıyla gerçekleştirilmiştir. Ürettiğimiz fungal ksilanaz enzimin verimi litrede yaklaşık 80 mg şeklinde hesaplanmıştır ve bu E coli de ürettiğimiz enzim için over expresyon (yüksek miktarda) şeklinde ifade edilebilir. Üretilen enzim afinite kromatografisi ile saflaştırılmış karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Yapılan karakterizasyon çalışmaları sonucu enzimin optimum pH’sı 5,0, optimum sıcaklığı 50°C, Km değeri, 10,752 mg/ml olarak belirlenmiştir. 48 Ayrıca sıcaklık stabilitesinin belirlenmesi için enzimler 4, 22, 37, 50°C’lik sıcaklıklarda 30 dakikalık aralıklarla 180 dk boyunca inkübe edildi. Ön inkübasyon uygulamasından sonra optimum şartlarda aktivite tayini yapıldı. Sonuç olarak enzimin 4˚C’de ki sıcaklıkta genel olarak aktivitesini koruduğu belirlendi. Hayvan beslemesinde kullanılan ksilanazların esas kaynağının fungal olduğu, en çok kullanılanlar arasında da Trichoderma ve Aspergillus türlerinden elde edilen ksilanazların yer aldığı açıklanmıştır (Aehle 2004).Bu çalışmada da fungal kaynaklı ksilanaz enzimi yem endüstrisi hedef alınarak üretilmiştir. Literatür incelendiğinde yem endüstrisinde kullanılan ksilanaz enziminin pH’sının 4,8 olduğu görülmüştür. Üretilen enzimi aktivite gösterdiği sıcaklık ve pH profili açısından değerlendirdiğimizde yem endüstrisinde kullanılabilir nitelikte olduğu görülmektedir. Ancak enzimin endüstride kullanıma uygun hale gelmesi için daha fazla miktarda üretiminin yapılması gerekmektedir bu nedenle optimizasyon çalışmaları yapılmalıdır. 49 KAYNAKLAR Aehle, W., 2004. Enzymes in Industry; Production and Applications. Wiley-Vch Verlag. GwbH & Co. Kga A. Weinhelm., 484 p, Netherlands. Akman, M., 1983. Bakteri Genetiği. Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Yayını No:8,1-12, 337-371 s, Sivas. Alper, J., 2003 Biotechnology. Hatching the golden egg; a new way to make drugs. Science, 300, 729-730. Alper, J., 2004. Bioengineering. Biology and inkjets. Science, 305, 1895. Anonim., 2008d. http://class.fst.ohio-state.edu/fst605/lectures/lect20.html. Anonim.,2009e.http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Wood14.html (15.12.2009). Anonim., 2004. Xylanase enzyme discovered in Yellowstone Xylanase from Acidothermus cellulolyticus. http://www1.nature.nps.gov/benefitssharing/xyla nase.m Anonim., 2012ı. ExPASy Proteomics Server ProtParam tool. http://expasy.org/cgibin/protparam. (15.07.2012). Anonim, 2012j. http://web.expasy.org/translate/ Anonim 2013a. http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme Aıba, S., Kılal, K., ve Imana, T., 1983. Cloning and expression of thermostable αamilase gene from Bacillus stearotermophilus, Bacillus subtilis. Appl. And Environm. Microbiol. 46 (5),1059-1065. Beg, Q.K., Kapoor, M., Mahajan, L., and Hoondal, G.S., 2001. Microbial xylanases and their industrial applications: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56,326- 338. Bedford, M.R., Classen, H.L., 1992. Theinfluence of dietaryxylanase on intestinalviscosityandmolecularweightdistribution of carbohydrates in rye-fed broilerchick, In: Visser J., Beldman G., Van Someren MAK., Voragen AGJ., editors. Xylansandxylanases; 361–70 p, Amsterdam: Elsevier. Beauchemin, K.A., Yang, W.Z., and Rode, L.M., 1999b. Effects of grainsourceandenzymeadditive on site andextent of nutrientdigestion in dairycows. J. Dairy Sci. 82,378-390. Berovic, M., and Ostroversnik, H., 1997, Production of Aspergillus niger pectolytic enzymes by solid state bioprocessing of apple pomace. Journal of Biotechnology, 53, 47-53. Bhat, M.K., 2000. Cellulase and related enzymes in biotechnology. Biotechnolgy Advances, 18(5), 355-383. Biely, P., 1985. Microbialxylanolyticsystems. TrendsBiotechnol, 3, 286–90. Carmona, E.C., Pizzironi, A.A., Monterio, R.T.R., and Jorge, J.A., 1997, Xylanase production by Aspergillus versicolor. Journal of Basic Microbiology, 38 (6), 387-394. Collins, T., Gerday, C., and Feller, G., 2005. Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases. FEMS Microbiology Reviews, 29 (1), 3-23. Coughlan, M.P., 1985. Theproperties of fungal and bacterial cellulases with comment on their production and application. In Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. Intercept Ltd. NewcastleuponTyne, 3, 39-109. Coughlan MP., Hazlewood GP., 1993. β-1,4-D-Xylan-degrading enzyme systems, biochemistry, molecular biology and applications. Biotechnol Appl Biochem 17, 259–289. 50 Cowan, W.O., 1996. AnimalFeed. Industrial Enzymology. Second edition. McMillanPress Ltd. 69 p, London. Ed. by T. Duarte, J.C., and Ferreira, M. C., 1994. Aspergilli and lignocellulosics: Enzymology and biotechnological applications, FEMS Microbiology Reviews, 13, 377-386. Ferreira-Filho, EX., 1994. The xylan-degrading enzyme system. Braz J Med Biol Res 27, 1093–1109. Garcıa-Campayo, V., Wood, T.M., 1993. Purification and characterization of a β-D xylozidase from the anaerobic rumen fungus Neocallimastix frontalis. Carbohydrate Res. 242, 229-245. Gessesse, A., 1998. Purification and Properties of TwoThermostable Alkaline XylanasesFromanAlkaliphilicBacillussp.ApplıedandEnvıromentalMicrobiology, 3533-3535. Gılbert, H.J., and Hazlewood, G.P.,1993. Bacterial cellulases and Xylanases. J.Gen. Microbiol.139, 187-194. Gılbert, H.J., Hazlewood, G.P., Laurie, J.I., Orpin, C.G., Xue, G.P., 1992. Homologous catalytic domains in a rumen fungal xylanase: evidence for gene duplicationand prokaryotic origin. Moleculer Microbiology, 6, 2065-2072. Gılbert, H.J., Hazlewood, G.P., 1993. Bacterial cellulases and xylanases. Journal of General Microbiology, 139,187-194. Godfrey, T., and West, S., 1996. Introduction to Industrial Enzymology. (T.Godfrey and S. West editör) Industrial Enzymology, 2nd Edition, Stockton Pres, New York. Godfrey ve S, West., Beg, Q.K., Kapoor, M., Mahajan, L., Hoondal, G.S., 2001.Microbial xylanases and their industria applications. areview, Appl Microbio Biotechnol, 56,326–38. Gregory, A. C. E., O’Connell, A. P., Paul, B. G., 1998. Xylans, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews,15(4), 439 455. Guda, C., Zhang, X., McPherson, D.T., Xu, J., Cherry, J.H., Urry, D.W., Daniell, H., 1995. Hyper expression of an environmentally friendly synthetic polymer gene. Biotechnol. Lett., 17,745–750. Gupta, R., Gıgras, P., Mohapatra, H., Goswamı, V.K. ,Chauhan, B., 2003. Microbial aamylases: a biotechnological perspective. Process Biochem.1-18. Gümüşel, F., 2002. Biyoteknoloji, genetik ve saglık sektörü. Kocaeli Sanayii için teknolojik uzgörü ortak projesi.73-135. Güçlü, B.K. Kara, K., 2009. Ruminant Beslenmede Alternatif Yem Katkı Maddelerinin Kullanımı, Erciyes Üniv. Vet. Fak. Derg. 6 (1), 65-75. Hanahan, D., 1985. Techniques for transformation of E. coli. In DNA cloning: A Practical Approach (ed. D.M. Glover), 1, 109-135. IRL Press, Oxford, United Kingdom. Hanahan, D., 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J. Mol Biol., 166, 557–580. Haarhoff, J., Moes, C.J., Cerff, C., Wyk, W.J.,Gerischer, G., and Janse, B.J.H., 1999. Characterization and biobleaching effect of hemicellulases produced thermophilic fungi, Biotechnology Letters, 21, 415-420. Harwood, C.R., 1992. Bacillus subtilis and its relatives: Molecular Biological and Industrial Workhorses. Elsevier Science Publishers Ltd (U.K.), 10, 247-256. Haltrich, D., Nidetzky, B., Kulbe, KD., Steiner, W., Zupancic, S.,1996. Production of fungal xylanases. Bioresour Technol 58:137–161. 51 Horıkoshı, K., 1999. Alkaliphiles: some Applications of Their Products for Biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 735-750. Izydorczyk, MS. Biliaderis, CG., 1995. Cereal arabinoxylans: advances in structure and physiochemical properties. Carbohydr Polym 28, 33–48. Inoue, H. Nojima, H. Okayama, H., 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96, 23-28. Köksal, G., 1998. İki fazlı sistemde süspande ve tutuklanmış mikroorganizmalarla ksilanaz üretimi. Hacettepe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloj Anabilim Dalı Bilim Uzmanlığı Tezi, Ankara. Klug, W. Cummings, M., 2003. Genetik Kavramlar. Palme ayıncılık, 500, Türkiye. Kulkarni, N. Shendye, A. and Rao, M., 1999. Molecular and biotechnological aspects of xylanases. FEMS Microbiology Reviews, 23; 411-456. Lowe, S.E., Theodorou, M.K., Trıncı, A.P.J., 1987a. Growth and fermentation of an anaerobic rumen fungus on various carbon sources and effect of temperature on development. Applied and Environmental Microbiology, 53, 1210-1215. Lowe, S.E., Theodorou, M.K., Trıncı, A.P.J., 1987c. Cellulases and xylanases of an anaerobic rumen fungus grown on wheat straw, wheat straw holocellulose, cellulose and xylan. Applied and Environmental Microbiology. 53, 1216-1223. Mounford, D.O. Asher, R.A., 1989. Production of xylanase by the ruminal anaerobic fungus Neocallimastix frontalis. Applied and Environmental Microbiology. 55, 1016-1022. Negrulescu,a,b A., Patrulea,a,b V., Mincea,#,a,b M.M., Ionascu,a,b C., Vlad-Oros#,a,b B.A.,and Ostafe*,a,b , V., 2012. Adapting the Reducing Sugars Method with Dinitrosalicylic Acid to Microtiter Plates and Microwave Heating. J. Braz. Chem. Soc., 23 (12), 2176-2182. Outtrup, H. and Jorgensen,S.T., 2002. The Importance of Bacillus species in the production of industrial enzymes. (R.Berkley editör) Applications and systems of Bacillus and relatives. Blackwell Science Inc. Malden, Mass. 206-218. Özer, E., 1999. http://www.cilginbiyologlar.com/deterjandan-kozmetige-tekstildengidaya-enzimler-yatirimcilarini-ariyor-a183.html. Prade, R. A., Xylanases From biology to biotechnology. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 1995, 13(12), 101-131. Rao, M.B.,Tanksale, A.M., Gathe, M.S., Deshpande, W., 1998. Molecular and Biotechnological aspect of Microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62(3), 597-635. Rao, M.B., Tanksale, A.M., Gathe, M.S.,Deshpande, W., 1998. Molecular and Biotechnological aspect of Microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62(3), 597-635. Rao, M.B., Tanksale, A.M., Gathe, M.S., Deshpande, W., 1998. Molecular and Biotechnological aspect of Microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62(3), 597-635. Ranı, S. and Nand, K., 1996. Development of cellulase-free xylanase producing anaerobic consotria for the ıse of lignocellulosic wastes. Enzyme. Microb. Technol.18, 23-28. Sarıkaya, E., 1995. α-amilaz üreten bazı Bacillus suşlarının gelişme parametreleri, enzim özellik ve üretim koşullarının optimizasyonu. Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Doktora Tezi. 52 Schallmey, M., Sıngh, A., and Ward, O.P., 2004. Developments in the Use of Bacillus Species for Industrial Production. Canadian Journal of Microbiology, 50,1-17. Seyis, I., 1997. Fungal kaynaklardan ksilanaz eldesi. Hacettepe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Bilim Uzmanlığı Tezi, Ankara. Sıdhu, G.S., Sharma, P., Chakrabartı, T., Gupta, J.K., 1997. Strain improvement for the production of a thermostable a-amylase. Enzyme. Microb. Technol.21, 525-530. Subramanıyan, S. and Prema, P., 2000. Cellulase-free xylanases from Bacillus and other microorganisms. FEMS Microbiology Letters, 183,1-7. Sunna, A., Antranikian G., 1997. Xylanolytic enzymes from fungi and bacteria. Crit Rev Biotechnol 17(1), 39–67. Sultuybek, G., Ulutin, T., Sayhan, N., 1995. Rekombinant DNA Teknolojisi ve Tıpta Kullanımı. İstanbul. Tarım,Ö., 2004. Moleküler Biyoteknoloji Devrimi. Güncel Pediatri. 2, 101-102 Thacker, P.A., 1996. Baas T.C. Effect of gastricpH on theactivity of exogenouspentosanaseandtheeffect of pentosanasesupplementation of thediet on theperformance of growing-finishingpigs, Anim FeedSciTechnol 63, 187–200. Vııkarı, L., Ranva, M., Kantelınen, A., Sandquist, J., Lınko,M., 1986. Bleecing with Enzymes. Third International Conference in biotechnology in pulp and paper industry.16-19 June, Stockholm, 67-69. Watson, JD., Tooze, J.,Kurtz DT (eds)., 1983. Recombinant DNA, A Short Course. P. 58-90, 231-247, Scientific American Books, W.H. Freeman and Company, New York. Woodley, J.M., 2000. Advances in Enzyme Technology-UK Contributions. (Th.scheperi editör). Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 94 s. Wong, K.K.Y., Tan, L.U.L., and Saddler, J.N., 1988. Multiplicity of β-1,4-xylanase in microorganisms: Functions and applications. Microbiological Reviews, 52, No: 3, 305-317. Wolfgang, A., 2004. Enzymes in ındustry: Productıon ad applications. Wıleyvch Verlag GmbH&Co. Kga, Weinheim. Wiseman, A., 1987. Handbook of Enzymes Biotechnology. Second Edition. Chapter 3. The Application of Enzymes in Industry 274-373, New York. Zeman, N.W., and McCREA, J.M., 1985. Alpha-amylase Production Using a Recombinant DNA Organism. Cereal Foods World. 30 (1), 777-780. 53 ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler Adı Soyadı: Hümeyra SALTIK Doğum Tarihi Ve Yeri: 20.04.1988- SAKARYA Telefon: 05362804349 e-mail: [email protected] Eğitim Derece Eğitim Birimi Yüksek Lisans Gaziosmanpaşa Üniversitesi 2014 Lisans Gaziosmanpaşa Üniversitesi 2012 Mezuniyet Tarihi 54
