Hücre Kültürü Ekipmanları - Erzurum Teknik Üniversitesi
advertisement
HücreKültürüEkipmanları HücreKültürüEkipmanları • Hücrekültürüyapılırkenkullanılacakekipmanlartemel olarakyapılançalışmayagörebelirlenir. • Fakatbütünhücrekültürülaboratuvarlarınıntemel olarakpatojenikmikroorganizmabarındırmamavede birkısımortakekipmanlarıbulundurmagibiözellikleri olmalıdır. HücreKültürüEkipmanları TemelEkipmanlar YaygınEkipmanlar • LaminarKabin • İnkübatör • SuBanyosu • Santrifüj • Buzdolabı(+4°C)ve dondurucu(-20°C) • Hücresayacı (otomoPkveya hemasitometre) • İnvertMikroskop • Sıvıazot • Otoklav • Aspirasyonpompası (peristalPkveya vakum) • pHmetre • KonfokalMikroskop • FlowSitometre EkMalzemeler • Hücrebüyüme kapları(flask,petri kabı,çokkuyulu plate) • Pipetvepipetör • Şırıngaveşırıngaucu • AYkkapları • Medyum,serumve ajanlar • Hücreler HücreKültürüEkipmanları HücreKültürüEkipmanları LaminarKabin • Hücre kültürü laminar kabinlerin en büyük avantajı çalışma çevresini kontaminasyon ve tozdan koruyarak asepPk bir çalışmaalanısağlamasıdır. • AraşYrmanın Ppine ve klinik ihPyaçlara göre üç Pp laminar labinvardır; • ClassI • ClassIIA • ClassIIB LaminarKabin ClassI • Class I biyogüvenlik kabinlerinde ön açıklıktan doğruca çalışma alanınagirenhavaüstkısımdayeralanHEPAfiltredengeçerekaYlır; buözelliğiileçalışanıveçevreyimikrobiyalbulaştankorurlarancak hücre kültürü gibi çalışılan materyalin de korunması gereken durumlariçinönerilmezler. LaminarKabin ClassIIA • Class II biyogüvenlik kabinlerinde de ön açıklıktan hava girişi olmasına rağmen, sistem bu havanın çalışma alanında dolaşıma girmedenönceHEPAfiltredengeçmesinisağlayacakşekildedizayn edilmişPr. • Kabinin üst kısmında yeralan HEPA filtreden geçerek çalışma alanınagirenhava,çalışmaalanındasabitbirakışhızı(velocity)ile düşey bir hava perdesi (laminar akım) oluşturur ve herhangi bir türbülans olmadığında yaklaşık 10 dakika sonra kabin içi dolaşan havapraPkolarakparPkülsüz(steril)kabuledilebilir. LaminarKabin ClassIIB • Class IIB (3. ayrı alt Pp olarak) toksik veya karsinojenik ajanlarla yapılanyadadüşükyoğunluklunükleermaddekullanılançalışmalar içindizaynedilmişlerdir. • Butürçalışmalarınniteliğigereği,ClassIIBkabinlerdeürePlenaYk havadatümüilebinadışınayönlendirilir. CO2İnkübatör • Hücreler hem kültür çözelPsinin pH’ının kontrol edilebilmesi, hem de çoğalmak için bikarbonata (HCO3-) gereksinim gösterirler. Bu nedenle, içindeki CO2 düzeyi ayarlanabilen inkübatörlerkullanılmalıdır. • Havaceketliinkübatör • Suceketliinkübatör • Isıceketliinkübatör InvertMikroskop • Hücrelerin içerisinde bulundukları hücre kültür kaplarında görüntülenmesindekullanılır. Santrifuj • Hücreler pasajlanırken hücrelerin pellet olarak toplanıp, kullanılmışbesiyerininuzaklaşYrılmasındakullanılır. DepolamaveBuzdolapları • Birhücrekültürülaboratuvarı,medyum,anPbiyoPkve ilaçgibikimyasallariçin,aYlabilirpipet,kültürkapları, eldiven, medyum şişeleri ve cam pipetler gibi cam malzemelerin saklanması için depolama alanına sahip olmalıdır. +4°C • CammalzemelerveplasPkler-odasıcaklığındasaklanır. • Medyum, ajanlar, kimyasallar ePketlerinin üstünde yazan sıcaklıkta saklanmalıdır. (medyum: +4°C, anPbiyoPkveserum;-20°C) • Bazı medyum, ajanlar ve reakPfler ışığa duyarlıdır, bu yüzdenkullanılmadıklarıdurumdakapalıortamdaveya alüminyumasarılışekildesaklanmalıdır. -20°C KriyojenikDepolama • Sonsuz hücre hatlarının pasaj numaraları arckça genePk stabiliteleriazalmaktadır,buyüzdenhücrelerileçalışırkenstok hazırlamak ve bu stokları kriyojenik olarak depolamak gereklidir. • Hücreler -20°C veya -80°C dondurucuda saklandıklarında canlılıkları hızla düşmektedir, bu nedenle depolamak amaçlı azottanklarıkullanılmaktadır(-196°C). KriyojenikDepolama • Hücreler sıvı azot içinde -196°C’ de, bu düşük sıcaklığa dayanacak özelplasPktüpleryadacamvialleriçindesaklanır. • Hücreler, büyüme çözelPleri %10-20 serum ve %5-10 gliserol yada DMSOiçerenbirçözelPalınarakdondurulurlar. PetriveFlasklar • Flasklar, plateler ve petriler hücrelerin beslenip çoğalYlmasında ve deneylerin gerçekleşPrilmesindekullanılır. • Flasklar, plateler ve petriler nemli inkübatörden alındığında dış yüzeyleri kontaminasyona eğilimlidir, bu nedenle her zamanalkolilesilinmelidir. PipetvePipetör • AYlabilirplasPkpipetlerkullanılmalıdır. • Çapraz kontaminasyonu engellemek için herpipetyalnızbirkerekullanılmalıdır. • S ı v ı l a r i l e ç a l ı ş ı r k e n p i p e t ö r kullanılmalıdır. BesiYeri(medium) • Hücre kültürü besi yerleri (medyum) laboratuvar ortamında hücrelerin normal metabolik akPvitelerini sürdürebilmeleri için gerekli olan mikroçevreyisağlayanbesleyicisolüsyonlardır. • Hücre kültürü besi yerleri içeriklerindeki aminoasit, karbonhidrat, vitamin ve iyonlarla hücrelerin gelişimini desteklerler. Laboratuvar ortamında hücrelerin çoğalYlabilmesi için uygun pH, sıcaklık ve nemin sağlanması çok önemlidir. Hücre kültürü besi yerleri içeriklerindeki iyonlarlagerekliozmolaritevepH’ıdasağlarlar. BesiYeri(medium) • Besi yeri ihPyacı hücrelerin Ppine, adaptasyon kabiliyePne ve hücre kaynağıorganizmanıntürünegörefarklılıkgösterir.Hücrelerfarklıbesi yerlerinde farklı davranabilirler. Bu yüzden çalışmanın amacına göre hücreninbesiyeriihPyaçlarınınbelirlenmesigerekir. BesiYeri(medium) • Besi yeri Pcari destekleyicilerden sağlanır ve sterillik durumları sıkı kontrolalYndadır. • Bununlabirlikteşişelerindışyüzeyisterilolmaz. • Bu nedenle şişeler %70 alkol ile çalışma alanına alınmadan önce silinmelidir. • Earle’sBalancedSaltSoluPon(EBSS) • Earle’s Minimum EssenPal Medium (EMEM) • Hank’sBalancedSaltSoluPon(HBSS) • ZenginleşPrilmişformları; • DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) • F12 1:1 karışımı olan DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: NutrientMixtureF-12) • RPMI 1640 (Roswell Park Memorial InsPtute) • M199 (Medium 199 with Earle's Salts) ensıkkullanılançözelPlerdir. • Bu çözelPlere eklenen diğer moleküller esansiyel aminoasitler,vitaminler (özellikle B vitaminleri), hormonlar (insülin,hidrokorPzon)veglikozdur. Serum • Serum hücrelerin tutunabilmeleri ve çoğalmaları için kullanılan ve içeriği tam olarak tanımlanmamış zengin bir protein çözelPsidir. Bu protein çözelPsinin içinde hormonlar, enzimler, hücrenin büyümesi ve çoğalmasını sağlayan büyüme faktörleri, yüzeylere tutunabilmesinisağlayanhücrelerarasımatrisproteinleribulunur. • Hücre çeşidine ve uygulamalara göre besi yerindeki serum oranı değişebilir. Standart bir somaPk hücre kültüründe serum oranı %10‘dur. FetalCalfSerum FetalBovineSerum Serum • Serum ürePmi pahalı ve zahmetli bir süreçPr. Sığır embriyolarının kanlarının toplanmasıyla hazırlanan serumların ürePminde bir standart yoktur. Farklı hayvanlardan elde edilen serumlar birbirlerinden farklılık gösterirler. Bu da deneylerin sonuçlarını etkilemektedir. Bu dezavantajlarından dolayı bazı laboratuvarlar serumsuz besi yerlerini kullanmaktadırlar. • Serum kullanılmayan bir besi yerinin çeşitli büyüme ve tutunma faktörleriyledesteklenmesigerekir. FetalCalfSerum FetalBovineSerum PhosphateBufferedSaline(PBS) • Hücre içi ve dışındaki ozmoPk basıncı dengede tutan bir tuz solüsyonudur. • İçeriğindeki inorganik tuzlar ve su, hücre metabolizmasını destekler. • pHtamponlayarakhücreleriçinuygunbirortamsağlar. • Kalsiyumvemagnezyumiyonlarıiçermez. Tripsin/EDTA • Tripsinhücrepasajlamalarındakullanılantemelenzimdir.Tripsin,bir serin proteaz Ppi enzimdir, lizin ve arjinin aminoasitleri içeren pepPdleri yıkar. Laboratuvarlarda genellikle %0,25 EDTA’lı tripsin solüsyonukullanılmaktadır. • -20°C’de saklanır, daha yüksek sıcaklıklarda bekleyen tripsinin akPvitesidüşer,buyüzdenalikotlanaraksaklanmasıenuygunudur. Tripsin/EDTA • Serumtripsininhibitörleriniiçerir,hücreleretripsinuygulanmadan öncemutlakabirkereCa+2veMg+2içermeyenPBSileyıkanmalıve yüzeylerindekiserumuzaklaşYrılmalıdır. • Tripsinhücrelerinyüzeyiniörtecekkadaruygulanır. • Tripsinsıcaklıkarckçadahaetkiliçalışır.Tripsinuygulananhücreler inkübatöre konduklarında daha çabuk yüzeylerden ayrılırlar, oda sıcaklığındaysadahayavaşayrılırlar. FenolRed • Hücre kültüründe iyon bileşimi bakımından ekstraselülerortamayakınolan,bununyanısırahücre çoğalmasıiçinserumiçerençözelPlerkullanılır. • pH 7.4 civarında olmalıdır, çoğunda pH indikatörü olarakfenolredkullanılır. • Yapılan çalışmalar fenol kırmızısının östrojeni taklit etmeözelliğiolduğunuilerisürmektedir. HEPES,SodyumBikarbonat • ÇözelPlere tampon olarak eklenen bikarbonat, CO2 ile dengededir. • Bu yolla oluşan karbondioksit çözelPden havaya karışarakpH’yıyükselPr. • Hücrelerin oluşturduğu lakPk asit pH’yı düşürür. Bu değişimleri tamponlamak için içlerine 20mM HEPES eklenmelidir. GÜVENLİKveÇALIŞMA KOŞULLARI Güvenlik • Hücrekültürülaboratuvarıinsanveyahayvanhücrevedokularıileilişkili olduğu gibi toksik, korosif veya mutajenik bileşikler ve ajanlar ile oluşabilenspesifiktehliketürlerinesahipPr. Bukazalargenellikle; • Şırıngaucununveyadiğerkeskinkontaminealetlerinderiyebatması • Derivemukozmembranüstünekimyasaldökülmesi • Ağızyoluylapipetleme • İnfeksiyöz aerosollere inhalasyon yoluyla maruz kalma şeklinde görülmektedir. Birhücrekültürülaboratuvarındagüvenlikiçindikkatedilmesigereken en önemli faktör standart mikrobiyolojik tekniklerin kaY şekilde uygulanmasıdır. Asep[kTeknik • Hücre kültüründe karşılaşılan en büyük problemlerden biri mikroorganizmakontaminasyonudur. • Bakteri,mikoplazma,mayavemantarsporlarıkişi,hava,çalışma yüzeyi,solüsyonlarvediğerbirçokkaynaklataşınabilir. • DoğruuygulananasepPktekniklerilekontaminasyonlarıelimine etmek mümkündür. Bu nedenle doğru praPk uygulamaları yerleşPripuygulamakçokönemlidir. • Kontaminasyon, birkaç kültür arasında veya sadece deneyi enfekte edecek kadar küçük veya yayılıp tüm laboratuvarı enfekteedecekkadarbüyükolabilir. BAKTERİKONTAMİNASYONU MİKOPLAZMAKONTAMİNASYONU ÇalışmaYüzeyi • Çalışmaya başlamadan önce ve sonra yüzey %70’likalkolileiyicesilinmelidir. • Çalışılacak alana yalnızca ilgili ekipman gePrilmelidir. • Çalışma tezgahının merkezi geniş ve temiz olmalıdır. • Görüş alanı içinde çalışılmalı, çalışma alanının dışınaçıkılmamalıdır. • Yüzeye dökülen herhangi bir kimyasal derhal silinmelidir. • Silme işlemi alkol ile yapıldığından işaret ve yazılarısilerbunedenlealkoledirençlimarkerlar kullanılmalıdır. KişiselHijyen • Çalışmadan önce ve sonra mutlaka elleriniziyıkayınız. • Cerrahi pudrasız eldiven giyilmeli ve %70’likalkolilesıklıklasilinmelidir. • Hastalık durumlarında yüz maskesi kullanılmalıdır. • Çalışma esnasında konuşulmaktan kaçınmalıdır.
