Doç. Dr. Mutlu YÜKSEK Bülent Ecevit Üniversitesi Tıp Fakültesi

Doç. Dr. Mutlu YÜKSEK
Bülent Ecevit Üniversitesi Tıp Fakültesi-Zonguldak
Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları AD
Çocuk İmmünolojisi ve Alerji Hastalıkları BD
DNA ONARIM DEFEKTLERİYLE SEYREDEN PRİMER İMMÜN YETMEZLİKLER
Evrimin temelini oluşturan genetik çeşitlilik (diversity) kısmen üreme ve gamet oluşumu
sırasındaki rekombinasyonlar sonucu meydana gelir. Bu çeşitliliğe DNA tamiri sırasında oluşan
hatalar katkıda bulunur. Ancak unutulmamalıdır ki genetik varyasyonu oluşumu ile DNA
replikasyonunun aslına uygunluğu hücresel yaşam ve normal ontogenez için büyük öneme sahiptir.
Genomik bütünlüğün korunması hücre ölümünün ve tümör oluşumunun önlenmesi için yaşamsal
değerdedir. Kromozomal kırıklar iyonize veya ultraviyole radyasyonu, kimyasallar, endojen
metabolizmalar sonucu oluşan serbest radikaller gibi ürünler ve mayoz bölünme sırasındaki hatalar
sonucu oluşur. Ek olarak antikor ve lenfosit reseptör çeşitliğinin sağlanması için fizyolojik olarak
programlanmış özel hücre gelişimi de kromazomal kırıklara neden olur.
Sağlıklı bir immün sistemin temelini genetik çeşitlilik oluşturur. Mikroorganizmalarla savaş
evrimsel bir yarıştır. B ve T hücreleri kazanılmış (adaptive) immün sistemin hücresel öğelerini
oluşturur, spesifite ve bellek oluşturma özelliklerine sahiptir. Lenfositler antijen bağlayan
reseptörlerinin somatik rekombinasyonu ile çok çeşitli antijen tanıma özelliği kazanırlar. T ve B
hücre reseptör (sırasıyla THR ve BHR ) bölgeleri DNA onarım ve yıkım yanıt protein
komplekslerinin yardımıyla genetik yeniden düzenlemelerle (rearrangement) modifiye edilmektedir.
DNA ÇİFT SARMAL KIRIK (ÇSK) ONARIM PROTEİNLERİ
DNA kırığı oluştuğunda hücresel yanıt ataxi-telangiectasia mutated (ATM) proteini tarafından
aktive edilir. DNA kırığı sonrası ATM aktivasyonu kısa sürede oluşmasına karşın, kırık oluşur
oluşmaz uçlarda nibrin (NBS1)-MRE11-RAD50 (MRN kompleks) bulunur. MRN kompleksi
ÇSK’ların ilk algılayıcısıdır. ATM aktivasyonunun ardından H2AX ve NBS1 gibi hücre döngü
proteinleri aktive olur ve döngü durur böylece onarım gerçekleşir. NBS1 aynı zamanda fosforile
olacak proteinleri taşıyarak ATM’nin hücre içi işlevinde de rol alır. Hücre döngüsü durduğunda
oluşan DNA onarım nonhomolog end joining (NHEJ) olarak adlandırılır ve bu işlem sırasında hata
oluşmaz. NHEJ yolağında7 adet protein rol oynar. DNA bağlayan KU70 ve KU80 subüniteleri ile
birleşen DNA bağımlı protein kinaz katalitik subünit (DNA-PKc) DNA-PK holoenzimini oluşturur
ve bu enzim DNA çift sarmal kırıklarını erken dönemde tanıma görevini yerine getirir. Aktive DNAPK holoenzimi NHEJ’de rol alan XRCC4, DNA ligaz IV, DNA polimeraz µ gibi moleküllerinin kırık
bölgesine göçüne yardım eder. DNA-PKc’lerin aktive olmasıyla endonükleaz fonksiyonu olan
Artemis aktive olur ve kompleks DNA uçları çift sarmal DNA’ya komşu tek sarmal DNA uçları
haline dönüştürülür. DNA polimeraz µ ile birleşen KU, DNA ligaz IV, XRCC4 ve CernunnosXRCC4 benzeri faktör (C-XLF) DNA kırıklarının birleştirme reaksiyonun katılır. NHEJ proteinleri,
Artemis dışında, ATM’den bağımsızdır.
DNA
ÇİFT
SARMAL
İMMÜNİTEDEKİ ROLÜ:
KIRIK
ONARIM
PROTEİNLERİNİN
ADAPTİF
Sağlıklı bir bağışıklık sistemi çok sayıda değişik antijeni tanıyan bir mekanizmayla
oluşturulmaktadır. İnsanlarda bu mekanizma, 1018 farklı antijen/doku uygunluk kompleksine (MHC)
özgü reseptör taşıyan, genetik olarak farklı yapılandırılmış hücrelerin üretilmesiyle olanaklı
kılınmaktadır. Evrim olarak yüksek organizmalarda bu farklı hücrelerin oluşumu antijen
reseptörlerini kodlayan DNA sekanslarının kırılıp, yeniden dizilmesi, bağlanması (variable, junction
ve diversity –VDJ rekombinasyonu) ve ardından genomik dengenin sürekliliği için DNA onarım
mekanizmalarının devreye girmesiyle sağlanır (şekil 1).
VDJ rekombinasyonu bölgeye özgüdür ve 6 lokusta meydana gelir: THR α,β,γ,δ lokusları, Ig
ağır zincir ve λ ve κ hafif zincir lokusu. Rekombinasyon variable (V – değişken), junction (Jbirleşme) ve bazen de diversity (D - çeşitlilik) gen parçalarında oluşur. Ardından yeni oluşan VJ
veya VDJ kombinasyonları sabit (C – constant) bölgeye bağlanır. Hücrenin G1 fazında, yeniden
düzenlemeye gidilecek bölgeye özgü 2 adet rekombinasyon aktivasyon geni (RAG1/2) DNA kırığını
başlatır. Her VDJ gen bölgesi rekombinasyon sinyal sekansı (RSS) ile komşudur, RAG1/RAG2
kompleksi DNA kırıklarını bu RSS’ler ile kodlayan ekzonlar arasından yapar.
Kırma işlemi sonrasında DNA üzerinde 2 kırık ucu oluşur:
• THR ve Ig genlerini yeniden oluşturacak olan saç tokası şeklindeki kodlayıcı uçlar
• Kodlama işleminde yer almayan kör sinyal uçları.
Kırılma olayından sonra KU70/KU80 heterodimeri RAG1/2 tarafından parçalanan kodlama
uçlarına bağlanır ve DNA-protein kinaz katalitik subünitini (DNA-PKc) çeker. Bu olaylar sonucu
Artemis fosforilize olur ve kodlama uçlarını işler. Kırılma işlemi sonrasında hem kodlama hem de
sinyal uçları XRCC4/DNA ligaz IV/Cernunnos-XLF komplexi tarafından bağlanır. Sinyal uçların
yeniden bağlanması için Artemis ve DNA-PKc gerekli değildir. Çeşitlilik, saç tokası şeklindeki
kodlanan uçların, delesyon, mutasyon ve nontemplate nükleotidlerin terminal deoksinukleotidil
transferaz (TdT) ve DNA polimeraz-µ aracığıyla eklenmesi sonucu, asimetrik kırpılması nedeniyle
oluşur.
Artemis aracılı kırılmada ATM veya MRN kompleksi kullanılmaz, bu yüzden VDJ
rekombinasyonda ATM kritik öneme sahip değildir. Bu durum iyonize radyasyonla oluşan kırıkların
onarımındaki ATM aracılı bir işlem olan, Artemis’in de rol aldığı süreçten farklılık gösterir. Bununla
birlikte, ATM VDJ rekombinasyonu sırasında hücre döngüsünün durdurulması basamağında önemli
rol oynuyor olabilir.
Oluşmakta olan lenfositlerde ATM, NBS1 ve γH2AX RAG proteininin indüklediği DNA
ÇSK’larda birlikte rol oynarlar. ATM’nin buradaki rolü hücre döngü kontrol proteinlerini aktive
ederek, VDJ rekombinasyonunun daha verimli yapılmasını sağlamak olabilir. ATM yokluğunda
hücre S fazına girer ve bu durum hücrede VDJ rekombinasyonunun azalmasına ve Ig ve THR
lokuslarında anormal translokasyonlara neden olur (kromozom 7/14 translokasyonu).
DNA ONARIM
YETMEZLİKLER
DEFEKTLERİYLE
BİRLİKTE
OLAN
PRİMER
İMMÜN
Çift sarmal kırık başlatma defektleri
RAG yetmezliği
Tam olarak DNA onarımı ile ilişkili olmasa da, RAG1 ve RAG2, THR ve BHR gelişiminde rol
oynayan VDJ rekombinasyonu için gereklidir. RAG1 ve RAG2 lenfosite özgü, DNA’ya
rekombinasyon sinyal sekanslarının birleşme yerlerinden bağlanan, bir endonukleazdır.
RAG1 veya RAG2’in nonsense mutasyonları T-B-NK+ ağır kombine immün yetmezliğe neden
olur. Missens mutasyonlar ise hafif (leaky) formlar veya Omenn sendromu ile sonuçlanır.
Çift sarmal kırık algılama ve hücre döngü durdurulma defektleri
Ataksia Telanjiektazia
Ataksia telanjiektazia (AT) Türkiye’de nadir görülmeyen sistemik, otozomal resesif bir
hastalıktır. Kendisini ilerleyen serebellar ataksi, okulokutanöz telanjiektazia, gonadal kısırlık,
büyüme geriliği ve özellikle lenfoid olmak üzere sekonder malignitelerle karakterizedir. Ataksi
genellikle telanjiektaziden önce görülür. Başvuru bulgusu yineleyen sinopulmoner enfeksiyonlar
olabilir ve laboratuvarda IgM yüksek, IgG, IgA ve IgE düşük saptanabilir. Timik doku hipoplaziktir
ya da yoktur. Enfeksiyon sıklığı değişkendir ve mutasyon ile ilişkilidir. Bakteriyel özellikle
polisakkarid antijenlere immünolojik yanıt baskılanmıştır. Median yaşam 22 yıldır. T hücrelerinin
timik çıkışı (THR excision circle –TREC- pozitif hücreler sayılarak değerlendirilir) ve T hücre
repertuvarı azalmıştır. B hücre repertuvarı da etkilenmiştir. Kromazomal inversiyonlar ve
translokasyonlar, özellikle 7. İle 14. kromazomlar arasındaki translokasyonlar (t7;14) nadir değildir.
Nijmegan Breakage sendromu
Karakteristik yüz görünümü vardır: basık alın, geri yerleşimli mandibula, belirgin orta yüz (Kuş
benzeri yüz). Ayrıca epikantal katlantılar, büyük kulaklar, mikrosefali, ince ve seyrek saçlar, ve hafif
mental retardasyon. Sinopulmoner enfeksiyonlar sıktır. B hücreli lenfomaya yatkınlık vardır. Selüler
immünite baskılanmıştır. Lenfositopeni ve CD3+ ve CD4+ T hücre sayılarının düşüklüğü
karakteristiktir. Hastaların %30’unda agamammaglobulinemi saptanır, diğer olgularda humoral
bulgular değişkendir. IgA ve IgG4 eksikliği nispeten daha sık görülür ancak hastaların bir bölümünde
serum immünoglobulin düzeyleri normal saptanır. Hem VDJ rekombinasyonu hem de sınıf değişim
rekombinasyonu etkilenmiştir.
Kromozomal inversiyonlar ve translokasyonlar (t7;14) karakteristiktir. NBS hastaları mitomisin,
dieoksibütan gibi DNA çapraz bağlanan (crosslinking) ajanlara ve iyonize radyasyona duyarlıdır.
Ataksi telanjiektazia benzeri hastalıklar
Çok nadirdir. MRE11A mutasyonları sonucu gelişir ve klinik bulgular AT’ye benzer ancak
ataksi daha geç başlar ve daha yavaş ilerler. Telanjiektazi görülmez. Antijen spesifik antikor oluşumu
bozuk olmasına karşın serum İg düzeyleri genellikle normaldir. Mikrosefali görülebilir ancak mental
etkilenim olmaz.
MRE11A MRN kompleksi içindeki bir proteini kodlar bu yüzden NBS ve AT bulguları bir
aradadır.
RAD50 eksikliği
RAD50 MRN kompleksinin bir üyesidir. İntrauterin ve postnatal gelişme geriliği, mikrosefali,
kuş benzeri yüz ile NBS’ye benzeyen klinik bulgular vardır. Tanılanan hasta sayısı çok azdır.
Radyosensitivite, immün yetmezlik, dismorfik bulgular ve öğrenme (learning) zorluğu
(RIDDLE) sendromu görülebilir. Bu hastalık orta yüz dismorfizmi, kısa boy, öğrenme güçlüğü ve
hafif motor anormalliklerle karakterizedir. Okulokutanöz telanjiektazi görülmez. B hücre sayısı
normaldir. IgG düşükken IgM ve IgA normal saptanabilir.
Çift sarmal kırık tanıma defektleri
DNA-PK yetmezliği
Yineleyen oral kandida ve yineleyen akciğer enfeksiyonlarla karakterize bir Türk hasta
tanımlanmıştır. T-B-NK+ağır kombine yetmezlik (AKİY) fenotipindedir. Mikrosefali ve gelişme
geriliği yoktur.
Çift sarmal kırık tanıma işleme defektleri
Artemis yetmezliği
Artemis VDJ rekombinasyonu için çok kritik bir moleküldür. Null mutasyonu T-B-NK+ ağır
kombine immün yetmezliğe neden olur. Klasik olarak durdurulamayan ishaller, viral veya
pneumocystis jirovecii pnömonileri, gelişme geriliği gibi AKİY bulguları vardır. Hastaların kemik
iliği hücreleri ve fibroblastları iyonize radyasyona (RS-AKİY) duyarlıdır.
Artemis’in bu mutasyonu dışında 2 adet hipomorfik mutasyonu tanımlanmıştır.
İlk tanımlanan mutasyonda hastalarda organomegali, lenfadenopati, eritrodermi, alopesi, IgE
dışında agammaglobulinemi, T hücre lenfositozu, B hücre yokluğuna eşlik eden respiratuvar ve
gastrointestinal semptomlar ve gelişme geriliği mevcuttur. Bu belirti demeti, hipomorfik RAG
defektlerinde görülenlere benzer şekilde Omenn Sendromu olarak tanımlanır. T hücre repertuavarı
çok sınırlıdır. Deri biyopsileri, T hücreleri otolog olmasına karşın, greft versus host hastalığı
bulgularını gösterir.
İkinci mutasyonu taşıyan hastalar, geç bebeklikten itibaren kombine immün yetmezlik bulguları
gösterirler. Karakteristik olarak yineleyen sinopulmoner, gastrointestinal enfeksiyonlar, T ve B
lenfopeni, hipogammaglobulinemi ve otoimmün sitopeniler mevcuttur. Lenfoma görülebilir.
Kromozom 7:14 inversiyonu ve translokasyonlar tanımlanmıştır. Spesifik dismorfik bir bulgu yoktur.
DNA ligaz IV yetmezliği
Değişik klinik bulgularla karşımıza gelir. İlk tanımlanan hasta ALL olup kemo ve radyoterapi
alıncaya kadar sağlıklı seyretmiş. Sonrasında radyoterapiye bağlı ensefalopati nedeniyle
kaybedilmiştir.
Mikrosefali, büyüme ve gelişme geriliği, lenfopeni, hipogammaglobulinemi ve yineleyen
enfeksiyonları olan hastalar tanımlanmıştır. Başka bir hasta grubunda mikrosefali ve büyüme geriliği
ile seyreden T-B-NK+ RS-AKİY vardır. Son olarak diğer hastalarda mikrosefali ve kombine immün
yetmezlik bulguları olmuş ardından EBV’nin indüklediği non-Hodgkin lenfoma ve T hücreli ALL
gelişmiştir.
Bu hastalarda inversiyon ve translokasyonlar görülmemiştir
Cernunnos-XLF yetmezliği
Çok sayıda hasta mevcut değildir. Tanımlanan hastalar diğer defektler gibi T-B-NK+ RS-AKİY
kliniğinde başvurabildiği gibi kombine immün yetmezlik tablosunda da gelebilmektedir. Hastalarda
IgA ve IgG düşük bazı hastalarda IgM yüksek saptanmaktadır. Bu durum C-XLF’nin
immünoglobulinlerin sınıf değişiminde rol aldığını düşündürmektedir. Tanımlanan hastaların 2
tanesinde mikrosefali ve kuş benzeri kafa saptanmıştır.
Bugüne kadar lenfoma ve kromazomal 7:14 translokasyonu tanımlanmamıştır.
DNA ONARIM DEFEKTLERİNİN TANISI
Radyosensivitenin tanısı oldukça zordur.
Tanısal klinik ipuçları (telanjiektazia veya mikrosefali vb.) ile laboratuvar ipuçlarını (IgM
yüksekliği, lenfositopeni vb.) bir araya getirip kuşkulanmak tanı için en önemli basamaktır.
Kromazomal translokasyonun (t7;14) gösterildiği sitogenetik çalışmalara AT, NBS ve diğer iyonize
radyasyon duyarlılığı olan hastalıkların tanısına destek olabilir. Gelişmiş laboratuvarlarda klonogenik
yaşam analizi ile artan dozlarda radyasyonla karşılaşmış fibroblastlarda yaşam oranın
değerlendirilmesi olanaklıdır. Benzer şekilde hücreler artan miktarlarda radyasyona maruz
bırakılarak, kırılan DNA uçlarında bulunan γH2AX odağının boyanması ve boyanın zaman içinde
kaybolması temeline dayanan testler de mevcuttur. Odağın boyanmasının kaybolmaması DNA
tamirinde defekt olduğunun göstergesidir.
Hastalarda mutasyon analizleri kesin tanıyı koydurabilir.
DNA ONARIM DEFEKTLERİNİN TEDAVİSİ
B hücre defektleri olanlar profilaktik antibiyotik ve düzenli immünoglobulin replasmanı ile
tedavi edilirken T hücre yetmezlikleri daha saldırgan olarak tedavi edilmelidir. Bu hastalarda kök
hücre nakli küratif olabilmektedir. Kök hücre nakillerinin hazırlama rejimlerinde, zararlı olabileceği
için, radyoterapiden uzak durmalıdır.
Lenfoid malignitelerin tedavisi, klasik tedavi rejimleri büyük oranda toksisite riski taşıdığı için,
modifiye edilmelidir.
Gen tedavisi, henüz umut verici çalışmalar çok olmasa da, alternatif bir tedavi olabilir
Son dönemde umut veren bir tedavi rejimi de splicing, frameshift ve missense mutasyonların
antisense oligonukleotidlerle onarılması ve bunun sonucu olmayan veya fonksiyonsuz proteini, kısmi
veya tam fonksiyonlu protein haline çevirmektir.
YARARLANILAN KAYNAKLAR
Lieber, M. R., Ma, Y., Pannicke, U., & Schwarz, K. (2003). Mechanism and regulation of human
non-homologous DNA end-joining. Nature Reviews. Molecular Cell Biology, 4(9), 712–720.
Gennery, A. R. (2006). Primary immunodeficiency syndromes associated with defective DNA
double-strand break repair. British Medical Bulletin, 77-78(1), 71–85.
Slatter, M. A., & Gennery, A. R. (2010). Primary immunodeficiencies associated with DNArepair disorders. Expert Rev Mol Med, 12, e9.
Nahas, S. a, & Gatti, R. a. (2009). DNA double strand break repair defects, primary
immunodeficiency disorders, and “radiosensitivity”. Current Opinion in Allergy and Clinical
Immunology, 9(6), 510–516.
Blundred, R. M., & Stewart, G. S. (2011). DNA double-strand break repair, immunodeficiency
and the RIDDLE syndrome. Expert Review of Clinical Immunology, 7(2), 169–85.
McKinnon, P. J. (2009). DNA repair deficiency and neurological disease. Nature Reviews.
Neuroscience, 10(2), 100–12.
O’Driscoll, M. (2012). Diseases associated with defective responses to DNA damage. Cold
Spring Harbor Perspectives in Biology, 4(12).
Şekil 1 – Memelilerde VDJ rekombinasyonu ve NHEJ
V
Ku
J
v
RSS
RSS
v
Ku
i
RAG1
RAG2
RAD50
V
v
J
v
Kodlama
Sinyal
Uçları
Uçları
MRE11
Artemis
ii
ATM
NBS1
γH2AX
Ku
DNA Ligaz IV
53BP1
RNF168
Artemis
XRCC4
DNA-PKC
C-XLF
+
V
DNA Polimeraz µ
v
J
v
TdT
DNA Ligaz IV
XRCC4
V
v
iii
Pol µ
C-XLF
NNNN
J
v
VDJ rekombinasyonu
Lenfosit spesifik rekombinaz aktive edici gen 1 ve 2 (RAG1/2)
rekombinasyon sinyal sekanslarını, VDJ gen segment uçlarından
tanır ve bağlar.
Memelilerde non homolog uç bağlama (end joining )
RAG1/2 kompleksi kör sinyal uçları ile, yapıştırılmış kodlama
uçlarını fosforilize eder ve birleştirir.
İ - Ku70/Ku80 DNA çift sarmal kırıklarına bağlanır ve DNAPKC holoenzimi oluşturma üzere taşır.
MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) kompleksi kırık DNA uçlarına
bağlanır ve ATM (Ataxia telangiectasia mutated) proteini aktive
eder. Böylece hücre siklusu durur ve yıkıma uğramış kromatini
stabilize etmek için, γH2AX, 53BP1,RNF168 vb onarım proteinleri
bölgeye çekilir.
İİ – DNA-PK enzimi Artemisi çeker ve fosforile eder, böylece
yıkıma uğramış uçlar işlenir.
Ku70/Ku80 heterodimeri kodlama uçlarına bağlanır ve bu uçların
açılabilmesi için DNA bağımlı protein kinaz katalitik subünitini
(DNA-PKC) ve Artemis’i çağırır. Bu kompleks yapıştırılmış uçları
rastgele kırpar, böylece 3’ ve 5’ uçlarda tek sarmal kırıklar oluşur.
XRCC4,DNA-ligaz 4 ve Cernunnos –XLF (C-XLF) birleşir ve
uçlara gider vr bu kodlama uçlarını bağlar.
iii – XRCC4,DNA-ligaz 4 ve C –XLF bağlanarak yıkım olan
uca göçer ve iki ucun bağlanma işlemi gerçekleşir.