Bakterilerde mutasyon ve gen aktarım mekanizmaları

BAKTERİLERDE MUTASYON VE
GEN AKTARIM MEKANİZMALARI
DIS213 Mikrobiyoloji Ders 10
Doç.Dr. Evrim GÜNEŞ ALTUNTAŞ
MUTASYON ve REKOMBİNASYON
• Mutasyon: Genomun mükleotit baz diziliminde
meydana gelen kalıtsal değişiklik,
• Rekombinasyon: İki farklı genomda bulunan
genlerin tek bir molekülde bir araya gelmesidir.
MUTASYON + REKOMBİNASYON = EVRİMİN İTİCİ GÜÇLERİ
YATAY GEN TRANSFERİ
• Yatay gen transferi:
genler verici
hücreden alıcı
hücreye aktarılır
(horizontal gen akışı)
• Vertikal gen akışında
ise jenerasyonlar
arasında gen akışı
sözkonusudur.
Mutasyon sırasında bir veya birkaç baz çifti üzerinden olay
gerçekleşebileceği gibi bütün bir gen üzerinden de gidebilir.
Mutant organizma
• Ebeveyninden farklı bir genotipe sahip
organizmalardır. Mutant organizmanın fenotipi
de ebeveyninden farklı olabilir.
ÖR: E.coli’de Histidin aminoasit sentezi:
hisC: gen
HisC: protein
His+: histidin üretimi pozitif
His-: histidin üretimi negatif
Mutant İzolasyonu
• TARAMA: pigment oluşturmayan suşun
besiyerinde taranması
• SEÇME: Antibiyotikli besiyerinde antibiyotiğe
dirençli suş seçimi
Kendiliğinden ve Teşvik ile gerçekleşen
mutasyonlar
Kendiliğinden
• Doğal
radyasyon(kozmik
ışınlar) ile
• Oksijen radikalleri
ile
• DNA
replikasyonunda
hatalı eşleşme ile
Teşvik ile
• Kimyasal
mutajenler ile
(nükleotit baz
analogları,
alkilleyici ajanlar)
• İyonize olan ve
olmayan ışınlar
Tablo: mutant tipleri
Fenotip
Değişikliğin niteliği
Mutantın belirlenmesi
Oksotrof
Biyosentetik yolda enzim kaybı
Gereksinim duyulan besini
içermeyen ortamda
çoğalamama
Soğuğa duyarlı
Temel bir proteinin düşük
sıcaklıkta inaktive olacak şekilde
değişikliğe uğraması
Normalde üreyebileceği
düşük sıcaklıkta çoğalamama
İlaca dirençli
İlaca karşı geçirgenlikte, ilacın
detoksifikasyonunda değişiklik
Üremeyi engelleyici
konsantrasyonda gelişebilme
Hareketsiz
Flagella kaybı
Düz geniş koloniler yerine,
kompakt koloniler görülmesi
Virüse dirençli
Virüs reseptörü kaybı
Çok miktarda virüs içeren
ortamda üreyebilme
Nokta mutasyonları
• Bir baz çiftinde oluşan mutasyon; fenotipik
değişiklik ile hangi bölgede olduğu tespit edilebilir.
5’…TAC…3’
3’…ATG…5’
DNA
Normal DNA
replikasyonu
AAC
TTG
TAG
ATC
TAT
ATA
AAC
UAG
UAU
Asparajin Dur
Tirozin
kodonu kodonu kodonu
Hatalı protein Eksik protein
(yanlış anlamlı (anlamsız
mutasyon)
mutasyon)
Normal protein
(sessiz
mutasyon)
TAC
ATG
UAC
Tirozin
kodonu
Normal protein
(yabani tip)
transkripsiyon
translasyon
Delesyon ve insersiyon
Her iki
durumda
da
çerçeve
kayması
gözlenir!
!!
• Şekiller!
Çerçeve kayması
Nokta mutasyonları yeni bir mutasyonla düzelebilir ancak
delesyonlar düzelemez!!!
Translokasyon ve inversiyon
Geri mutasyonlar (Reversiyonlar)
• Gerçek revertant: mutasyonun olduğu
bölgede geri dönüşümü sağlayan ikinci bir
mutasyon olması.
İkinci bölge revertantlarda, ikinci mutasyon
ilk mutasyondan farklı bölgede gerçekleşir ve
kaybedilen özellik yeniden kazanılır.
Delesyon ile gerçekleşen mutasyonların geriye
dönüşü zordur ve genetik çalışmalarda bunlar
daha stabil mutantlar vereceğinden tercih
edilir.
Mutasyon Oranları
• Mutasyonların bazıları oldukça sık, bazıları nadiren gözlenir.
• Bir DNA replikasyon döngüsünde replikasyon hatası görülme sıklığı
baz çifti başına 10-7-10-11’dir.
• 1 gen=1000 baz çifti
• 1 gende mutasyon görülme oranı = 10-4-10-8
• 108 bakteri içeren kültürde mutasyon görülen suş sayısı= birkaç
adet
Bir kodonda tek baz değişikliği ile 27 kodondan her hangi birine dönüşüm
gerçekleşir.
27 kodon
2 sessiz
1 anlamsız
24 yanlış anlamlı
RNA mutasyonları
• Bazı virüslerde RNA bulunur.
• RNA DNA’ya oranla mutasyona 1000 kat daha
açıktır (RNA’da tamir mekanizması yok!!!)
Kimyasal Mutajenler
Nükleotit baz analogları
(Bromourasil, 2aminopürin
Alkilleyici ajanlar
(nitroguanidin)
İnterkalasyon yapanlar
(Etidyum bromid)
Işınlar
• İyonize ışınlar (X, gama)
• İyonize olmayan ışınlar (UV)
• İyonize ışınlar zararlı ve kolay sağlanamadığından
UV daha çok tercih edilir.
• 260 nm’de UV DNA’da primidin çifti (T veya C)
oluşturur, DNA replikasyonunda hatalar gözlenir.
DNA Tamiri Kaynaklı Mutasyonlar
DNA hasarı
LexA proteini ile
SOS’un
baskılanması, RecA
ile LexA’nın
baskılanması
Mutagenez!
Tamir mekanizması
(SOS sistemi)
Hasarın giderilmesi
sırasında kalıp
bilgisi yok!
Mutasyon oranındaki değişiklikler
Mutasyon olmalı mı, olmamalı mı???
• Mutasyonlar tamamen ortadan kaldırılamaz!
• Mutasyon yoksa EVRİM de yok!
Avantaj ve
dezavantaj
ları?
Aşırı doğru fenotipli organizmalar
X
Mutasyona yatkın mikroorganizmalar
Mutagenez ve Karsinogenez
• AMES testi
Prokaryotlarda Genetik Madde
Değişimi
Transformasyon
• Bir hücreden ortama salınan
DNA’nın başka hücre tarafından
alınması
Transdüksiyon
• Verici hücreye ait DNA’nın virüs
aracığı ile aktarılması
Konjugasyon
• Hücrelerarası temas ile verici
hücreden alıcı hücreye DNA ve
konjugatif plazmit aktarılması
TRANSFORMASYON
• Transformasyon şekil!
TRANSFORMASYON
• Gr (-)’ler, Gr (+)’ler, Arkeler transforme olabilen
organizmalardır.
• Liziz sonucu DNA kırılmış halde ortama salınır.
• ÖR: Bacillus subtilis DNA’sı 1700μm
uzunluğunda (4.2 Mbç), kırılma sırasında en az
10 parçaya (10 kbç’lik) parçaya bölünür.
1 gen=1000 nükleotit
10 kbç DNA parçası=10 gen
Transformasyon için uygun büyüklük!!!
Kompetans (Yeterlilik)
• KOMPETANT: Transforme
olabilen ve DNA alabilen hücreler
• Yüksek verimli doğal
transformasyon yapan bakteriler:
Acinetobacter, Azotobacter,
Bacillus, Streptococcus,
Haemophilus, Neisseria,
Thermus
• Doğal koşullar altında çoğu
mikroorganizma ya zayıf
kompetanttır ya da kompetant
değildir.
Escherichia coli!!!
Yüksek Ca iyonu içeren ortamda
bekletildikten sonra birkaç
dakika soğutulursa transforme
olabilir forma dönüşür. Bu
durumda çift zincirli DNA
moleküllerini içine alabilir ve
plazmit DNA ile
transformasyonda oldukça
başarılıdır.
E. coli genetik
mühendisliğinde ve
biyoteknolojide en çok
çalışılan
mikroorganizmadır!!!
Transformasyonda DNA alınması ve
entegrasyonu
• Kompetant bakteri DNA molekülüne geri dönüşümlü olarak bağlanır, kısa
süre sonra bu bağlanma geri dönüşümsüz hale gelir.
• Bağlanma sırasında DNA bağlanma proteinleri etkilidir.
• Bağlanan DNA ya çift zincir halinde ya da tek zincir halinde hücre içine
alınır.
• Hücre içinde «kompetans spesifik» proteinler DNA’yı kromozoma kadar
nükleaz saldırısından korur.
• Kromozoma ulaşınca RecA proteini ile DNA kromozoma rekombinasyon
ile entegre olur.
Transfeksiyon
• Bakterilerin transformasyonunda genellikle bir
bakteriyofaj DNA’sı kullanılır.
• Bakteri DNA’sı parçalara ayrıldığından
yönlendirmek/kontrol oldukça zordur.
• Ancak virüs DNA’ları bir bütün halinde hücre
içine dahil olabilir.
TRANSDÜKSİYON
TRANSDÜKSİYON
Konak genleri
Genelleşmiş transdüksiyon
Konak DNA’sının bir kısmı virüs DNA’sına katılır.
Özelleşmiş transdüksiyon
Konak DNA’sının bir kısmı virüs DNA’sının bir
kısmı çıkarılarak virüs DNA’sına katılır.
• Her iki durumda da oluşan VİRONLAR virüsler gibi enfektif değildirler;
genomlarının bir kısmında bakteriyel DNA bulunur.
• Tüm bakteriler transdüksiyon için uygun olmadığı gibi tüm virüsler de
transdüksiyon yapamaz.
• Yine de bu olay doğada gen aktarımında yaygın olarak
kullanılır!!!
• Escherichia, Pseudomonas, Rhodococcus, Rhodobacter,
Salmonella,Staphylococcus vb. transdüksiyon yapan bakterilerdir.
Genelleşmiş ve özelleşmiş transdüksiyon
Plazmit aktarım mekanizması
Plazmit
Benziyor mu?
Virüs
• Plazmitlerde yaşamsal faaliyetler için önemli olmayan ama hücreye
oldukça önemli fonksiyon kazandıran bilgiler bulunur.
• E.coli’de tanımlanmış 300 kadar plazmit sözkonusudur.
Plazmitlerin genel özellikleri
• Çoğu çift zincirli halkasal formdadır.
• Büyüklükleri 1 kb ile 1 mb arasında değişir (kromozomun %5’i kadar
büyüklüktedir.)
• Her plazmitin hücre içindeki kopya sayısı farklıdır (1-100)
• Kromozomal DNA ile benzer şekilde replike olurlar.
• Episome olarak adlandırılan bazı plazmitler, virüslere
benzer şekilde kromozomal DNA ile birleşebilirler!
• Plazmitler bazı durumlarda hücreden elemine edilebilirler.
Hücreler arası Plazmit aktarımı
• Konjugasyon esastır!!!
Plazmitlerin prokaryotlara kazandırdığı özellikler
Fenotip sınıfı
organizmalar
Antibiyotik üretimi
Streptomyces
konjugasyon
Esherichia, Pseudomonas,
Staphylococcus, Streptococcus
Herbisit yıkımı
Alcaligenes
Bütanol ve aseton oluşumu
Clostridium
Pigment üretimi
Erwinia, Staphylococcus
Antibiyotik direnci
Campylobacter, Staphylococcus,
Listeria, Neisseria vb.
Kadmiyum, Kobalt, Civa vb. direnci
Acidocella, Alcaligenes, Listeria vb.
Bakteriyosin direnci ve üretimi
Bacillus, Lactococcus,
Propionibacterium
Enterotoksin üretimi
Staphylococcus, Escherichia
Plazmit çeşitleri
Direnç plazmitleri
Toksin ve virülans
özellikleri
kodlayan
plazmitler
Bakteriyosinler
• Tıp alanında önemli sorun
• Konjugatif olanları hızla türler arasında yayılmaktadır
• Bir gen veya birkaç antibiyotik direnç geni taşıyabilirler.
• Patojenin hücreleri istila etmesi ve toksin üretiminden bazı durumlarda
plazmitler sorumludur.
• E.coli’de hemolisin (kırmızı kan hücrelerinin parçalanması ve enterotoksin
(bağırsak içine aşırı tuz ve su salınmasını sağlayan toksin) plazmitlerde kodludur.
• Bakterilerin yakın türleri üzerine etki gösteren protein yapısında bileşikler
• Kolisin (E.coli), Subtilin (B.subtilis), Nisin (Laktik asit bakterileri)
KONJUGASYON
Konjugasyon
• Hücrelerarası temas esastır.
• Plazmit temelli bir mekanizmadır.
• Bazen diğer genetik materyal de konjugasyon sırasında
aktarılabilir.
• Konjugatif plazmit içeren hücre verici hücre konumundadır.
• Plazmitin tra bölgesi hem konjugasyon olayından hem de bu
olayda görev alan eşey piluslarının üretiminden sorumludur.