Anti-D IgG +IgM
advertisement
Anti-D IgG +IgM 0843 İnsanda kırmızı kan hücrelerinde D antijenin belirlenmesi için kalitatif test IVD 2-8ºC’de sakla METHOD PRENSİBİ Reaktifler, D antijeni taşıyan test eritrosit hücrelerinin direkt aglütinasyona (pıhtılaşma) ve test edilirken antiglobulin aşamasında Kategori DVI test kırmızı hücrelerinin dolaylı aglütinasyona neden olacaktır. Aglütinasyon olmaması genellikle D antijeninin yokluğunu gösterir (Sınırlamalara bkz). KLİNİK ÖNEM 1940 yılında Levine and Stetson Rh kan grup sistemini keşfetti. D antijen, ABO olmayan eritrosit antijeninde klinik olarak en önemlidir ve ilgili antikor hem transfüzyon reaksiyonları hem de yenidoğan hemolitik hastalığına neden olmuştur. Anti-D + 0 Fenotip Rh D +ve Rh D -ve Beyaz ırk% 85 15 Afro-Americans % 72 28 RhD antijeninin zayıflamış ifadesi Kollektif terim Du normal D antijeninden daha zayıf olan eritrositleri tanımlamak için yaygın olarak kullanılır. Terim zayıf D eritrosit başına tamamlanmış D antijenleri az sayıyla tek tek gösterir. Terim kısmi D kayıp D antijen epitopeleri tek tek gösterir. DVI, çoğu kayıp D epitopeleri olan kısmi bir D kategorisidir. Reaktif, direkt aglutinasyon ile zayıf ve kısmı D eritrositin çoğu örneklerini tespit edecek fakat DVI hücrelerini tespit edemeyecektir. Bu reaktif DVI ve kısmi D hücreleri IAT faz içinde tespit edilecektir. REAKTİFLER Spinreact Monoclonal Anti-D kan gruplama reaktifi sodyum klorür (0.9 g%), sığır albumin (3 g%) ve makromoleküler potentiators içeren bir fosfat bufferda dilüe edilmiş insan monoklonal IgM ve IgG içeren harmanlanmış reaktif olan düşük bir proteindir. Hasta numunesi tiplendiğinde bu reaktif direk olarak Rh D pozitif hücre aglutinate olacaktır ve bu hücre önerilen teknikler kullanıldığında zayıf D (Du) fenotiplerin yüksek oranını ve variantların çoğunluğununu (DVI değil) kapsar. Her reaktif daha fazla dilüsyon veya eklemeye gerek olmadan aşağıda belirtilen tüm öneri teknikleriyle optimum dilüsyonda verilmiştir. Lot referans numarası ve son kullanım tarihi için Şişe Etiketine bakın. IgM / IgG Hücre hattı Line / klon IgM RUM-1 IgG MS-26 ÖNLEMLER 1. Reaktifler sadece in vitro diagnostik kullanım için tasarlanmıştır. 2. Eğer bir reaktif şişesinde kırık veya sızıntı varsa, hemen içeriğini atın. 3. Son kullanım tarihi geçmiş reaktifleri kullanmayın (Şişe etiketlerine bakın). 4. Eğer çökelti mevcutsa, reaktifleri kullanmayın. 5. Reaktiflerle çalışılırken tek kullanımlık eldiven ve laboratuar önlüğü gibi koruyucu giysileri giyinmelidir. 6. Reaktifler bir 0,2 mikron kapsül ile biyo-yükünü azaltmak için filtre edilmiştir. Bir şişe bir kez açıldığında içeriği eğer belirgin bozulma ve bulanıklık göstermediği sürece son kullanım tarihine kadar kalabilir. 7. Reaktifler < 0.1% sodyum azid içerir. Eğer patlayıcı metal azit formu ile bakır ve kurşun borular reaksiyona girerse veya yutulursa, sodyum azit toksik olabilir. Çok miktarda su ile yıkayarak uzaklaştırın. 8. Malzemeler ürünleri üretmek için kullanılan kaynakta test edildi ve kabul edilmiş mikrobiyolojik testleri kullanan HBsAg ve HIV 1+2 ve HCV antikorları için negatif olarak bulundu. 9. Bilinen hiçbir test insan ve hayvan kaynaklı ürünlerin enfeksiyon etkeni taşımadığını garanti edemez. Kullanım sırasında ve her şişenin ve içeriklerinin imhasında dikkatli olunmalıdır. 10. Dökülen reaktiflerin ve dekontaminasyonunun atılması ile ilgili bilgi için mevcut olan Malzeme Güvenlik Veri Sayfalar’ına bakın. NOTLAR 1. Bir pozitif kontrol (ideal olarak R1r hücre), bir negatif kontrol (ideal olarak rr hücre) ve bir reaktif negatif kontrol testlerin her bir lotuyla paralel test edilmesi önerilir. Eğer kontrol beklenen sonuçlar göstermiyorsa, testler geçersiz olarak kabul edilmelidir. 2. Hastanın eritrosit tiplendirmesini yaparken reaktifin negatif kontrol içermesi önemlidir.Çünkü IgG kaplı hücrelerle makromoleküler etkileşimciler yanlış pozitif reaksiyonlara neden olur. 3.Kategori DVI için test numuneleri Indirect Antiglobulin ve Coombs DiaMed-ID Teknikleri tarafından belirlenir. 4.Zayıf ve variant D antijenleri jel kartı, mikrotitre plaka ve slayt tekniği ile yetersiz bir şekilde tespit edilir. Zayıf ve kısmen variantlar tüp test tekniği kullanarak test edildi. 5.Antiglobulin tüp tekniği eğer bütün negatif testler ile IgG duyarlı olan eritrositler ile pozitif olarak reaksiyona girerse geçerli kabul edilebilir. 6.Şişe damlalık kullanıldığında bir hacim yaklaşık 40μl olarak alınır. 7.Reaktiflerin kullanımı ve sonuçların yorumlanması reaktifler kullanımdaysa o ülkenin şartlarına göre eğitimli ve kalifiye personel tarafından yapılmalıdır. 8.Kullanıcı diğer teknikleri kullanmak için reaktiflerin uygunluğunu belirlemelidir. SAKLAMA Dondurmayın. Reaktif şişeleri 2 -8ºC ‘de saklanmalıdır. Bu aralığın dışındaki sıcaklıklarda uzun süreli saklanmada reaktifin reaktivitesinin kaybına neden olabilir. GEREKLİ MATERYALLER • Cam test tüpler (10 x 75 mm or 12 x 75 mm). • Test tüp santrifüjü. • 37ºc ± 2ºC’ye dengelenmiş su banyosu veya kuru ısı inkübatör • Volumetrik pipetler. • Cam mikroskop slaytları • Aplikatör çubukları. • Fosfat Buffer tuzu (PBS): NaCl 0.9%, pH 7.0 ± 0.2 at 22ºC ± 1ºC. • Pozitif (ideal olarak R1r) ve negatif (rr) kontrol kırmızı hücreler. • DiaMed ID-Kardlar (Nötr). • DiaMed ID-Kardlar(AHG/Coombs) • DiaMed ID-Sentrifüj. • DiaMed ID-Diluent: e.g. ID-CellStab. • 37ºc ± 2ºC’ye dengelenmiş DiaMed ID- inkübatör • Plaka çalkalayıcısı. • Otomataik plaka okuyucu. • Onaylı "U" kuyu mikroplakaları • Mikroplaka Sentrifüjü. ÖNERİLEN TEKNİKLER (DVI KATEGORİ TESPİTİ İÇİN) A. Dolaylı Antiglobulin Tekniği (IAT) 1. PBS içinde 2-3% süspansiyon yıkanmış test eritrosit hazırlayın. 2. Etiketli tüpler içine Anti-D reaktifin 1 hacmini ve test eritrosit süspansiyonun 1 hacmini koyun. 3. İyice karıştırın ve 37ºC de 15 dakika inkübe edin. 4. Her bir yıkamadan sonra eritrosit çökeltisini hafifçe sallayın ve yıkama arasında tuzu boşaltmak için PBS ile 4 kez test eritrositleri yıkayın. Son yıkamadan sonra tuzu tamamen boşaltın. 5. Her bir kuru eritrosit çökeltisi için 2 damla anti-insan globulin veya anti- IgG ekleyin. 6. İyice karıştırın ve bütün tüpleri 1000 rcf de 20 saniye boyunca veya uygun bir alternatif zaman ve devirde santrifüjleyin. 7. Eritrosit çökeltisini hafifçe sallayın ve aglütinasyonu makroskopik olarak okuyun. B. DiaMed-ID Mikro Tipleme Tekniği (AHG/Coombs kartlar) 1. ID-Dilüent içinde % 0.8 süspansiyon yıkanmış test eritrosit hazırlayın. 2. İhtiyaç duyulan kadar mikrotüpleri alüminyum folyodan çıkarın. 3. Uygun mikrotüp içine 50µl test eritrosit süspansiyonu ve 25µl Anti-D reaktif ekleyin. 4. 37ºC de 15 dakika boyunca ID-Kart(lar) inkübe edin. 5. 1000 rpm de 10 dakika boyunca ID-Kart(lar) sentrifüjleyin. 6. Aglutinasyon için makroskopik olarak okuyun. TEST SONUÇLARININ YORUMLANMASI 1. Pozitif: Kabul edilebilir test koşullarında test eritrositlerinin aglütünasyon ile pozitif sonuç vermesi test hücrelerinde yeterli miktarda D antijeni olduğunu gösterir. 2. Negatif: Kabul edilebilir test koşullarında test eritrositlerinin aglütünasyon ile negatif sonuç vermesi test hücrelerinde D antijeni olmadığını gösterir 3. Negatif kontrol ile aglütinasyon veren hücreler dışlanmalıdır. Duyarlı hücreler ile reaktif içindeki makromoleküler etkileşimcilerin yalancı reaksiyon vermesi aglütinasyon gibi görünür. Reaksiyon stabilitesi 1. Santrifüjlemeden sonra tüm tüpleri ve mikroplaka testleri doğru okuyun. 2. Kesintisiz yıkama adımlarını tamamlayın ve sentrifüjleyin ve reaktif eklendikten hemen sonra testleri okuyun çünkü gecikmeler yanlış negatif veya zayıf pozitif reaksiyonlara ve antijen-antikor kompleksinin ayrışmasına neden olur. 3. Slayt testler iki dakika içinde değerlendirilmelidir. Negatif sonuçlar kurumaya bağlı olarak yanlışlıkla pozitif olarak değerlendirilebilir. 4. Belirtilerden başka sıcaklıklarda yapılan testlerin sonuçlarının yorumlanmasına dikkat edilmelidir. SINIRLAMALAR 1. Spinreact Anti-D reaktifler, enzim tedavisi hücreleriyle veya LISS de süspansiyon olmuş hücrelerle kullanmak için uygun değildir. 2. Saklanmış kan taze kandan daha zayıf reaksiyon verir. 3. Yanlış pozitif aglütinasyon IgG duyarlı hücreler test edildiğinde görünebilir. 4. Yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçlar: • Test malzemelerinin kirliği, • Saklama, hücre konsantrasyonu, inkübasyon süresi veya sıcaklığın uygunsuzluğu, • Uygunsuz veya aşırı santrifüjleme • Önerilen tekniklerden sapma nedeniyle oluşabilir. 5.Kullanıcı eğer belirtilen methodlardan başka method kullanırsa reaktifin performansından sorumludur. 6. Önerilen tekniklerden kaynaklanan sapmalar kullanım öncesi doğrulanmış olmalıdır9. BİBLİYOGRAFYA PROSEDÜR (DVI KATEGORİSİ DEĞİL) A. Tüp Yöntemi 1. PBS içinde % 2-3 süspansiyon yıkanmış test eritrosit hazırlayın. 2. Etiketli bir test tüpe 1 hacim Anti-D reaktifi ve 1 hacim test eritrosit süspansiyonu koyun. 3. İyice karıştırın ve bütün tüpleri 1000 rcf de 20 dakika boyunca veya uygun bir alternatif zaman ve devirde santrifüjleyin. 4. Eritrosit çökeltisini hafifçe sallayın ve aglütinasyonu makroskopik olarak okuyun. 5. Negatif veya şüpheli bir sonuç (Du veya zayıf D numuneleri olan) gösteren tüpler oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilmelidir. 6. İnkübasyon boyunca 3 ve 4’üncü adımları tekrar edin. Ed.2006 B. Slayt Yöntemi 1. Serum, plazma veya PBS de 35-45% süspansiyon test eritrosit hazırlayın. 2. Etiketli bir testi slayt üzerine 1 hacim Anti-D reaktifi ve 1 hacim test eritrosit hücresi süspansiyonu yerleştirin 3. Temiz bir aplikatör çubuğu kullanın ve yaklaşık 20 x 40 mm lik bir alan üzerinde reaktif ve hücreleri karıştırın. 4. Oda sıcaklığında slaytı hafiçe eğerek arkaya ve yana doğru 30 saniye kadar çalkalayın.bu işlemi 2 dakika süreci içinde arada bir tekrarlayın . 5. Diffüz bir ışık üzerinde 2 dakika sonra makroskopik olarak okuyun ve fibrin ipliklerini aglütinasyon olarak değerlendirip hata yapmayın. 6. Zayıf gerçekleşen reaksiyonlar tüp tekniği ile tekrarlanmalıdır. C. DiaMed-ID Mikro Tipleme Tekniği 1. Bir ID-Dilüent ile % 0.8 süspansiyon yıkanmış test eritrosit hazırlayın. 2. Gerektiği kadar mikrotüpleri alüminyum folyodan çıkarın. 3. Uygun mikrotüp içine 50μl test eritrosit süspansiyonu ve 25μl Anti-Rh reaktif yerleştirin. 4. ID Kartları 90 rcf de 10 dakika boyunca ya da uygun alternatif bir zaman ve güçle sentrifüjleyin. 5. Aglütinasyon için makroskopik olarak okuyun. D. Mikroplaka Teknik, “U” kuyularında kullanılan 1. PBS içinde 2-3% süspansiyon yıkanmış test eritrosit hazırlayın. 2. Uygun kuyular içine 1 hacim Anti-D reaktif and 1 hacim test eritrosit süspansiyonu koyun. 3. Tercihen mikroplaka çalkalayıcı kullanarak uygun şekilde çalkalayın, kuyudan kuyuya bulaşma olmamasına dikkat edin . 4.15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin (zaman kullanıcıya bağlı). 5.140 rcf de 1 dakika boyunca veya uygun alternatif bir zaman ve güçle mikroplakaları sentrifüjleyin. 6.Mikroplaka çalkalayıcısında çalkalanmayı kontrol ederek hücre çökeltisini dikkatlice tekrar süspansiyon hale getirin. 7.Makroskobik olarak veya doğrulanmış otomatik bir okuyucu ile okuyun. 8.Zayıf reaksiyonlar tüp tekniği ile tekrarlanmalıdır. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ 1. Reaktifler, burada belirtilen tüm prosedürler ile karakterize edilmiştir. 2. Serbest kalmadan önce, Spinreact Monoklonal Anti-D’in her bir lotu uygun reaktivite sağlamak için antijen-pozitif eritrositi bir paneline karşı önerilen teknikler ile test edilir. 3. Hastanın D grubu için Anti-D gruplama reaktifi önerilen methodlar kullanarak DVI hücreler ile reaksiyona girmez. Negatif sonuçların ‘Follow-on’ testleri bir antiglobulin prosedürü kullananarak yapılması önerilmez. 4. Monoklonal antikor kaynağının özgünlüğü antijen-negatif hücrelerinin bir panelini kullanarak gösterilmiştir. 5. Reaktifin gücü, Ulusal Biyolojik Standartlar ve Kontroller enstitüsünden elde edilen aşağıdaki minimum etki gücüne sahip referans standartlarına karşı test edilmiştir. Anti-D reference 91/592 6. Reaktifin kalite kontrolü eritrositler kullanılarak yapıldı ve bu hücreler kullanımdan önce PBS ile iki kez yıkandı. 7. Reaktifler İngiltere Kan Transfüzyon Hizmetleri Rehberinin son sayısında yer alan önerilere uymalıdır. NUMUNE Antikoagülanlı veya antikoagülansız olarak elde edilen kan örnekleri antijen tiplendirmesi için kullanılabilir Eğer test gecikirse örnekler 2-8 ° C'de saklanır. EDTA ve sitrat numuneleri 48 saat içinde tiplendirilmelidir. ACD, CPD veya CPDA-1 içinde toplanan numuneler çekildiği tarihten 35 güne kadar test edilebilir. Tüm kan numuneleri test edilmeden en az iki kez PBS ile yıkanmalıdır. Hemoliz görüntüsüne sahip kan numuneleri güvenilmez sonuç verebilir. GSIS04 Tube, Slide, Diamed-ID and Microplate Tests Blood Grouping 1. Kholer G, Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975, 256, 495-497. th 2. Race RR, Sanger R. Blood Groups in Man 6 Edition, Oxford, Blackwell Scientific Publishers 1975, Chapter 2. rd 3. Issitt PD. Applied Blood Group Serology, 3 Edition, Montgomery Scientific, Miami, 1985, Chapter 10. 4. Mollison PL. Blood Transfusion in Clinical Medicine, 8th Edition, Oxford, Blackwell Scientific Publications, 1987, Chapter 7. 5. Tippett P. Sub-divisions of the Rh (D) antigen. Medical. Laboratory Science 1988; 45, 88-93 6. Thompson KM, Hughes-Jones NC. Production and characteristics of monoclonal anti-Rh. Bailliere’s Clinical Haematology 1990; April 7. Jones J, Scott ML, Voak D. Monoclonal anti-D specificity and Rh D structure: criteria for selection of monoclonal anti-D reagents for routine typing of patients and donors. Transfusion Medicine 1995. 5, 171-184 8. Guidelines for the Blood Transfusion Service in the United Kingdom. H.M.S.O. Current Edition. 9. British Committee for Standards in Haematology, Blood Transfusion Task Force. Recommendations for evaluation, validation and implementation of new techniques for blood grouping, antibody screening and cross matching. Transfusion Medicine, 1995, 5, 145-150. PAKETLEME Anti-D IgG + IgM Ref: 1700021 10 ml SPINREACT,S.A. Ctra.Santa Coloma, 7 E-17176 SANT ESTEVE DE BAS (GI) SPAIN Tel. +34 972 69 08 00 Fax +34 972 69 00 99. e-mail: [email protected]
