DNA REP DNA tamir

Prof. Dr. Turgut Ulutin
DNA REPLİKASYONU
(DNA EŞLEŞMESİ)
DNA REPLİKASYONU
• Replikasyon genetik materyelin tamamen kendi
benzeri yeni bir molekül oluşturma işlemidir.
• DNA kendini eşleyebilen yegane biyomoleküldür
• Replikasyon sonrası ana DNA molekülü ile tüm
nukleotid dizisi tamamen aynı olan DNA
molekülü ortaya çıkar.
• Böylece DNA da taşınan genetik bilgi her
replikasyon olayı ile dölden döle aktarılır.
• Ökaryotik hücrelerde DNA replikasyonu
mitoz veya mayoz bölünmeye hazırlanan
hücrelerin hücre siklusunun sentez
fazında gerçekleşir.
• DNA replikasyonu yarı
koruyucu bir model ile
açıklanır.
• Bu model iki zincirli
sarmal DNA nın her bir
ipliğinin kalıp görevi
yaparak kendine yeni bir
eş DNA ipliği oluşturması
işlemidir.
• Böylece bir ana
molekülden yeni oluşan
her bir yavru molekül,
ana DNA nın bir zincirini
taşıyacaktır
• İlk kez Meselson ve Stahl (1958)
deneyleri ile DNA nın yarı koruyucu tipte
bir replikasyon gerçekleştirdiğini
kanıtlamişlardır.
DNA Replikasyonunun Temel
Mekanizmaları:
Hem prokaryotik hemde ökaryotik hücrelerde
replikasyonun temel mekanizmaları aynıdır.
• Replikasyon başlangıç noktalarının tayini
• DNA çift ipliğinin çözünmesi
• Replikasyon çatalının oluşması
Replikasyon başlangıç noktalarının
tayini:
• Replikasyonun gerçekleştiği genom birimine
replikon denir.
• Her replikonda bir başlangıç ve bir bitiş noktası
vardır.
• Prokaryotlarda çembersel DNA da bir başlangıç
ve bir bitiş noktası,
• Ökaryotik hücrede ise çok sayıda başlangıç ve
bitiş noktaları vardır.
• Ökaryotiklerde her bir başlangıç noktası
arasında 30-300 kilobazlık bir mesafe bulunur.
(1 kilobaz=1000 baz).
• Başlangıç noktaları özel nukleotid dizilerinden
oluşur ( A ve T den zengin tekrarlayan nukleotid
dizileri)
• ve “diziye özel olan DNA ya bağlanan
proteinler = başlatıcı proteinler” tarafından
tanınır.
• Bu proteinlerin başlangıç noktalarına
bağlanması ile replikasyonun ilk adımı atılır.
Saccoromyces cerevisia da;
Replikasyon orijin noktalarında 11
nukleotidlik bir dizinin tekrarı
saptanmıştır.
(A veya T)TTTAT(A veya G)TTT(A veya T)
DNA çift ipliğinin çözünmesi
• Replikasyonun başlıyabilmesi için DNA çift
zincirinin sarmal yapısının çözülmesi
gereklidir.
• Çözülme işlemi başlatıcı protein
kopleksinde yer alan DNA helikazlar ile
gerçekleştirilir.
Replikasyon çatalının oluşması
• Helikaz aktivitesi ile açılan
çift zincirde replikasyonun
olduğu bölgeye
replikasyon çatalı denir.
• Replikasyon olayı
“replikasyon çatalı”nın ana
DNA molekülü boyunca
ilerlemesi ile gerçekleşir.
Replikasyon çatalında replikasyonda iş gören 4
temel yapı vardır;
• DNA helikaz, DNA sarmalını çözen enzim
• Primaz, DNA sentezinin başlıyabilmesi için
gerekli olan RNA primerlerini (RNA öncül
molekül) sentezleyen enzim
• DNA Polimerazlar, kalıp zincire komplamenter
yeni DNA zincirini sentezleyen enzim
• Tek zincire bağlanan (SSB) proteinler,
replikasyon çatalının sürekliliğini saglayan ,tek
DNA ipliğine bağlanarak katlanmayı önleyen
proteinler
DNA replikasyon yönü (yeni sentezlenen
zincirin yönü) 5’
3’ ucuna doğrudur
DNA replikasyon yönü (yeni sentezlenen
zincirin yönü) 5’
3’ ucuna doğrudur
DNA molekülü birbirize zıt yönde paralel iki zincir
içerdiginden (biri 5’
3’ diğeri 3’
5’)
sentezin aynı anda ve devamlı olarak
ilerlemesi mümkün değildir.
• Bu nedenle replikasyon çatalında iki farklı
sentez tipi ortaya çıkar.
1- Devamlı iplik (DNA) sentezi
( 3’
5´ kalıbına uygun sentez )
2- Kesikli iplik (DNA) sentezi
( 5´
3´ kalıbına göre yapılan sentez)
• Kesikli DNA zincirlerinin
oluşumunu
deneysel
olarak gösteren Okazaki
ve Ark.(1968) dan dolayı
bunlara
Okazaki Parçaları
adı verilmiştir.
(ökaryotlarda 100-200
nukleotidlik parçalar)
• Her bir Okazaki
parçasınında
başlangıcında RNA
primerleri bulunmaktadır.
Kesikli zincir
Devamlı zincir
• Replikasyon ilerledikçe RNA primerleri
kesilip çıkarılır
• ortaya çıkan boş alanlar DNA polimerazlar
tarafından kalıp DNA ya uygun olarak
sentezlenir
• ve iki DNA ucu ligaz enzimi ile
birleştirilerek bir bütün DNA ipliği oluşur.
• Ökaryotiklerde replikonlarda tamamlanan
DNA parçalarıda yine ligaz enzimi ile
birleştirilir.
• Ökaryotik DNA polimerazlar
• α, β, δ, γ, ve ε.
γ : mitokondriumda bulunur .
mtDNA replikasyonunda iş görür
• Diğerleri nukleusta bulunur.
• α: kesikli ipliğin sentezi.
• β: DNA tamiri.
• δ: devamlı ipliğin sentezi.
• ε: DNA tamiri.
• Ökaryotiklerde DNA molekülünün
prokaryotlardan daha büyük olması ve
histon proteinleri ile kromatin yapı
oluşturmaları nedeniyle farklı sentez
aşamaları gözlenir.
Ökaryotik hücrelerde replikasyon adımları
•
•
•
•
•
•
Replikasyon orijin noktalarının tayini
DNA çift ipliğinin çözünmesi
Replikasyon çatalının oluşması
DNA polimeraz aktivitesi, sentez ve uzama
Replikasyon kabarcıklarının oluşması
Yeni sentezlenen DNA parçalarının
birleştirilmesi
• Kromatin yapısının yeniden oluşumu
•
•
Ökaryotik DNA da replikasyon orijinleri, 20 ila
80 orijinlik gruplar şeklinde (bir
replikon=replikasyon ünitesi) aktiflenirler.
Tüm DNA replike oluncaya kadar S fazı
boyunca yeni replikasyon orijinleri aktiflenmeye
devam eder.
• Bir replikasyon ünitesi içinde , her bir başlangıç
noktası birbirinden yaklaşık 30 000 - 300 000
nukleotidlik aralıklarla bulunur.
• Replikasyon orijin noktasından başlayan ve zıt
yönde ilerleyen replikasyon çatalları replikasyon
kabarcıkları oluşturur.
Replikasyon uç problemi
Telomer-telomeraz
• DNA replike oldukça yeni sentezlenen
histonlar ile kromatin şeklinde yeniden
düzenlenir.
• Histonlarda hücre siklusunun S fazında
sentezlenir.
•
S fazı boyunca aynı kromozomun farklı
bölgeleri farklı zamanlarda replike olur.
• Kondens kromatin (heterokromatin) geç S
fazında replikasyona uğrar
• Aktif kromatin (ökromatin) erkan S fazında
replikasyona uğrar
örneğin; aktif X kromozomu S fazı boyunca,
inaktif X kromozomu geç S fazında
replike olur
DNA Repliasyonunda Topoizomerazlar
• Replikasyon çatalında ortaya çıkan
Süperkıvrımların açılması-çözülmesinde iş
görürler
• topoizomeraz l ;Tip I tek iplikli DNAyı keser
topoizomeraz ll ;Tip II çift iplikli DNAyı keser
DNA TAMİRİ
DNA TAMİRİ
• DNA molekülünün yapısında meydana
gelen bir değişiklik şifrelerinde değişikliğe
yol açacagından hatalı protein
üretilmesine çeşitli mutasyonların, farklı
fenotiplerin veya hastalıkların ortaya
çıkmasına neden olur.
• DNA molekülünün içerdiği bilginin
değişmeden aktarımı-devamlılığı için,
replikasyon sırasında veya çevresel
faktörler ile DNA da oluşan hatalar bir seri
enzim tarafından düzeltilir.
DNA da oluşan hasarlar iki şekilde olabilir
• Replikasyon sırasında
• Çevresel etkilerle
**Fiziksel (UV ışınları veya radyasyon)
**Kimyasal ajanlar
• Her iki etkiylede ortaya çıkabilecek hatalar
DNA nın bazyapısında bir değişim veya
yapısında ortaya çıkan bir değişim şeklinde
olabilir.
Hasar Tipleri:
1-Tek baz değişimleri;
• Depurinasyon
• Deaminasyon (sitozinin urasile, adeninin hipoksantine
dönüşümü)
• Nukleotid kaybı veya kazanımı
• Baz analogları ile yer değişimi
2- İki baz değişimi ;
• Timin-timin dimeri (U.V.etkisi ile)
3- Zincir kırıkları ( İyonizan ışınlar , X-ışını, etkisi ile)
4- Zıt bağlantılar kurulması;
• Aynı veya zıt ipliklerdeki bazlar arasında
• DNA ve protein molekülleri arasında (örn:histonlar)
•
DNA üzerindeki hasarlı bölgeler
3 mekanizma ile düzeltilir;
1- Hatalı eşleşmenin tamiri ile
2- Baz çıkarımı ile
3- Nukleotid çıkarılması ile
Mekanizma
Problem
•
Hatalı eşleşmenin tamiri
*Kopyalama hatası
(1,2 veya 5 bazlık hatalı eşleşmeden
dolayı DNA da ki hasar)
•
Baz çıkarımı
*Spontan, kimyasal veya radyasyon
etkisi ile tek bazdaki hasar
•
Nukleotid çıkarımı
*Spontan, kimyasal veya radyasyon
etkisi ile bir DNA segmentindeki hasar
DNA tamir mekanizmasında ki ( örneğin
deaminasyon için) işlem dizisi sırası ile;
• Anormal bazın tanınması ; N-glikozilaz enzimi ile
• Apurinik veya aprimidinik endonukleaz ile kesim
(hatalı bölgenin kesilip atılması)
• DNA polimeraz beta ile DNA sentezi ( boşluğun
doldurulması)
• Ligaz ile iki DNA ucunun birleştirilmesi
DNA tamir sendromları
• DNA tamir mekanizmasındaki yetersizlik
veya eksiklikler insanda önemli kalıtsal
hastalıklara yol açar.
• Tamir mekanizmasına katılan enzim veya
proteinlerin gen defektlerine bağlı olarak
insanda otosomal ressesif kalıtım
gösteren DNA tamir sendromları vardır.
• Xeroderma pigmentosum (XP) ;
DNA nın UV ışığa aşırı hasasiyetine bağlı olarak
gelişen bir genetik temelli deri hastalığıdır.
Kişilerde güneşe aşırı hassasiyet, UV den
etkilenen bölgelerde çeşitli deri kanserlerinin
oluşumuna yatkınlık gözlenir.
Moleküler mekanizmasında,UV ile hasarlanan
DNA nın onarılamaması , bozuk eksizyon (kesipçıkarma) enzimi veya bozuk helikaz enzimi
olduğu tespit edilmiştir.
DNA tamir genleri
• ilk kez mayalarda radyasyona hassasiyet genleri olarak
bulunmuş ve RAD genleri olarak isimlendirilmiştir.
• İnsanda da DNA tamir genleri olarak bilinen ve
hasarlandığı zaman yukarıda verilen sendromlara neden
olan genlerden bazıları ve ürünleri şunlardır,
Gen
• XPA
• XPB
• XPC
• XPD
• XPF
• XPG
Ürün
Hasarı tanıma enzimi
Helikaz
DNA ya bağlanan proteinler
Helikaz
5’ nukleaz
3’ nukleaz
Ataxia telangiectasia (AT) ;
• İyonizan radyasyon (X - ışınları) etisi ile
ortaya çıkan DNA hasarının onarılamaması
• Kas kontrol kaybı,immun sistem bozuklukları,
kansere yatkınlık (lösemi ve lenfoma gibi).
• Moleküler temelinde anormal DNA sentezi
yatar.
Fanconi anemia ;
• UV ve bazı kimyasallar nedeniyle DNA
hasarının meydana gelmesi ve eksizyon
enzim eksikliği nedeniyle tamir olmaması
hastalığın altında yatan nedendir.
• Azalmış kan hücreleri, kalp ve böbrek
malformasyonları, deride pigmentleşme,
kanser ve kromozom anomalileri klinik
bulgularıdır.
MUTASYON
MUTASYON
• Mutasyon; DNA dizilerinde ( “genotipte”),
meydana gelen kalıtsal değişiklerdir.
• Mutasyon; gen ürünü olan protein yapısında
değişikliğe yada o proteinin hiç
yapılmamasına neden olabilir.
• Mutasyon ; hücre veya organizmada kısmi
bozukluklara neden olabilir.
• Mutasyona uğramış organizma yada
hücreye MUTANT denir
görünüş, fizyolojik işlemler veya
davranışlardaki farklılıklar ile
yabani=mutasyona uğramamış
organizmalardan ayırt edilirler
Mutasyonlar
•
•
1. Spontan (kendiliğinden )
2. İndüklenebilir (yapay- yönlendirilmiş)
Spontan mutasyonlar
•
•
•
•
DNA replikasyonu sırasında düşük oranlarda
purin veya pirimidin bazlarında meydana
gelen değişiklerden kaynaklanır
Çoğu DNA tamir mekanizmaları ile kaldırılır.
Tamir olamayanlar Mutasyonlar olarak ortaya
çıkar.
Mutasyon DNA tamir mekanizmasındaki
yetmezlik sonucudur.
İndüklenebilir mutasyonlar
•
Hücre veya organizmanın çevresel
koşullardan etkilenmesi sonucu DNA da
ortaya çıkan yapısal değişiklerdir
Mutajenler
• Fiziksel (U.V ışınlar, İyonizan ışınlar,
Manyetik alan, Sıcaklık)
• Kimyasal (kanserojen ajanlar
örn; aflotoksin-B1, nitröz asidi,
Alkilleyici ajanlar)
Mutasyon Tipleri
1- Gen Mutasyonları
2- Kromozom Mutasyonları ( yapı ve sayı
değişimi ) (büyük ölçekli Mutasyonlar)
Mutasyon Tipleri
1. Gen Mutasyonları
• Tek baz değişimleri
** Yanlış eşleşme
** Anlamsız mutasyon
** Sessiz mutasyon
• Kırpılma-yeri mutasyonları
2. Kromozom Yapı-Sayı Değişikliği Mutasyonları
** Nukleotid Katılım veya Çıkarım mutasyonları
** Duplikasyonlar
** Translokasyonlar
Tek-Baz değişimleri ( Nokta Mutasyonları)
• Bir bazın, bir diğeri yer değiştirmesidir
• Eğer bir purin ( A veya G) veya bir pirimidin (C
veya T) bir diğeri ile yer değiştirirse buna
transisyon adı verilir.
• Eğer bir purin, bir pirimidin ile yer değiştirirse
veya tersi olursa buna transversiyon adı verilir
GAG -------- Glutamik asit
GTG -------- Valin
Örneğin Orak hücre anemisi
17. Nukleotidte A yerine T geldiğinde hemoglobinnin beta
zincirindeki gende GAG ( glutamik asit) ile GTG (valine).
yer değiştirir
Tek-Baz değişimleri ( Nokta Mutasyonları)
•
•
Bazı nukleotid değişimleri anlamsız
kodon (sonlandırıcı=stop kodonlar)
ortaya çıkmasına neden olur
TAA, TAG, veya TGA
Bu kodonlar mRNA nın o noktalarda
translasyonu durdurmasına neden olur
ve kısa proteinler (disfonksiyonel
proteinler) oluşur.
Tek-Baz değişimleri ( Nokta Mutasyonları)
• Örn; Kistik fibroziste 1609. Nukleotid te
oluşan baz değişimi
CAG
---------- TAG
Glutamin -------- sonlandırıcı kodon
• oluşan protein 1480 amino asid (a.a)
yerine 493 a.a lik bir proteindir ve
fonksiyonsuzdur.
Sessiz mutasyon
• Bazı a.a ler birden fazla kodona sahiptirler
örn:Serin TCT
TCA
TCC
TCG
• Üçüncü baz değişiminde yine serin a.a. i
polipeptitde yer alır.
Kırpılma-yeri mutasyonları
İnsersiyon - Delesyon
Bir genin DNA’ sından ekstra bir baz çiftinin
veya nukleotid dizisinin eklenmesi
İnsersiyon - çikarılması ise Delesyon
adını alır.
Sayı değişikliği birden - binlerce nukleotide
kadar değişir.
• İnsersiyon ve delesyon translasyon sırasında
codon kaymasına ve farklı okumaya neden olan
Çerçeve Kayması na neden olur.
• “Çerçeve kayması” bazen yeni bir
sonlandırıcı (=stop) kodon oluşmasına
neden olarak yeni bir anlamsız mutasyon
oluşur ve fonksiyonel olmayan kısa
proteinler üretilir.
Frajil -X Sendromu
• İnsanda X kromozomunun bir lokusunda
CGG tripleti çok sayılarda tekrarlanır
(CGGCGGCGGCGG,,,,,,,,)
yaklaşık 4000 den fazla
• Bu olay X kromozomunu kırılgan yapar ve
mental gerilik ile seyreden ciddi genetik
hastalık ortaya çıkar.
Kromzom mutasyonları;
translokasyon
• Burkitt lenfoma
Philadelphia kromozomu
Somatik – Germ hücre Mutasyonları
• Somatik mutasyonlar
Somatik hücrelerde (örn;Kemik iliği, karaciğer vs)
ortaya çıkan mutasyonlar
* hücre hasarına,
* kanser hücresi oluşumuna,
* hücre ölümüne
neden olabilir
Somatik mutasyonlar oluştuğu hücre ile sınırlıdır
ve döle geçiş yapmaz
• Germ hücre mutasyonları
Gametlerde ortaya çıkan mutasyonlardır ve dölden
döle geçiş gösterir