ankara üniversitesi biyoteknoloji enstitüsü doktora tezi otozomal

ANKARA ÜNİVERSİTESİ
BİYOTEKNOLOJİ ENSTİTÜSÜ
DOKTORA TEZİ
OTOZOMAL RESESİF SENDROMİK OLMAYAN İŞİTME KAYIPLI ÜÇ
AİLEDE İŞİTME KAYBINDAN SORUMLU GENLERİN TÜM EKZOM
SEKANSLAMA YÖNTEMİ İLE BELİRLENMESİ
ASLI SIRMACI
Danışman Öğretim Üyesi
Doç. Dr. Hilal ÖZDAĞ
ANKARA
2012
ONAY
Doç. Dr. Hilal Özdağ danışmanlığında, Aslı Sırmacı tarafından hazırlanan bu çalışma
17/10/2012 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından Temel Biyoteknoloji Anabilim Dalı’nda
doktora tezi olarak kabul edilmiştir.
Başkan: Prof. Dr. Nurten AKARSU
İmza:
Doç.Dr. Hilal ÖZDAĞ
İmza:
Üye:
Üye: Doç.Dr. Hatice MERGEN
İmza:
Üye: Doç.Dr. Erkan YILMAZ
İmza:
Üye: Doç.Dr. Duygu Özel Demiralp
İmza:
Yukarıdaki sonucu onaylarım.
Prof. Dr. Aykut ÖZKUL
Enstitü Müdürü
ii
OTOZOMAL RESESİF SENDROMİK OLMAYAN İŞİTME KAYIPLI ÜÇ
AİLEDE İŞİTME KAYBINDAN SORUMLU GENLERİN TÜM EKZOM
SEKANSLAMA YÖNTEMİ İLE BELİRLENMESİ
ÖZET
2012, 208 sayfa
İşitme kaybı dünyada sık görülen duyusal bir bozukluk olup doğuştan veya dil gelişimi
öncesi gelişen işitme kaybı yaklaşık 1000 doğumda bir görülmektedir. Bu olguların
yarısına yakın bir bölümünde genetik faktörlerin etkili olduğu düşünülmektedir. Genetik
nedenli işitme kayıplarının yaklaşık %30’una başka klinik bulgular eşlik etmektedir ve
sendromik işitme kaybı olarak adlandırılır. %70’ine ise işitme kaybı dışında başka bir
klinik bulgu eşlik etmez ve sendromik olmayan işitme kaybı olarak adlandırılır. Olguların
yaklaşık %80’inde otozomal resesif kalıtım bulunmaktadır. Sendromik olmayan işitme
kaybı yaptığı gösterilmiş 39 tane gen bulunmaktadır.
Bu çalışmaya anne ile baba arasında akrabalık bulunan ve en az üç etkilenmiş bireyde
sendromik olmayan, doğuştan veya dil gelişimi öncesi ortaya çıkan ileri ve çok ileri
sensorinöral işitme kaybı bulunan üç aile dahil edilmiştir. Bu aileler, benzer özellikteki
daha çok sayıda aile içinden GJB2 geni taranmış ve mutasyon bulunmayan aileler
arasından seçilmiştir. Ailelerden elde edilen DNA örnekleriyle önce tüm aile bireylerinde
SNP mikrodizin analizi yapılarak bilinen işitme kaybı genleri elenmiştir, Ardından
etkilenmiş bireylerdeki ortak otozigot bölgeler belirlenmiştir. Her aileden etkilenmiş bir
birey, tüm ekzom sekanslama yöntemi kullanılarak genomda bulunan tüm genlerin
kodlayan ekzonları sekanslanmıştır.
Üç aileden birinde, bu tez çalışmasında tanımlanan OTOGL genindeki p.Val477GlufsX25
mutasyonu, diğerinde GIPC3 genindeki p.His170Asn mutasyonları saptanmıştır. Üçüncü
ailede ise herhangi bir mutasyon saptanamamıştır. OTOGL geninin işitme kaybından
sorumlu olduğu ve Otogelin-like proteinin iç kulaktaki aselülar membranların yapısında
bulunan bir protein olduğu çalışmalarımız kapsamında gösterilmiştir. GIPC3 proteininin
ise memeli kohleasında bulunan tüy hücrelerinde, akustik sinyal iletimi ve yayılmasında
görev yaptığı gösterilmiştir.
Sonuç olarak bu tez çalışması, ülkemizdeki işitme kaybı genlerinin spektrumları
saptanması ve işitme kaybının genetiğinin aydınlatılması açısından da önemli bir yere
sahiptir. Türkiye’deki işitme kaybına sebep olan genlerin ortaya çıkartılması ile genetik
testlerle daha hızlı tanı koyabilme ve sağlıklı genetik danışma verilebilme imkanı
artmaktadır.
Anahtar Kelimeler: İşitme kaybı, OTOGL, GIPC3, SNP mikrodizin, tüm ekzom
sekanslama
iii
DETERMINATION OF THE RESPONSIBLE GENE WITH USING THE WHOLE
EXOME SEQUENCING METHOD IN FIVE FAMILIES WITH
NONSYNDROMIC AUTOSOMAL RECESSIVE DEAFNESS
ABSTRACT
2012, 208 pages
Hearing loss is the most common sensorial disorder in human. Congenital or prelingual
hearing loss occurs approximately in one case per 1000 live births. Genetic causes are
responsible in 50% of cases. Additional findings are present in 30% of cases, which are
referred to as having syndromic deafness. Autosomal recessive transmission occurs in
80% of hereditary deafness. To date, 39 genes, in which mutations are responsible for
autosomal recessive deafness, have been identified.
Three families with parental consanguinity segregating with autosomal recessive deafness,
which have at least 3 affected individuals by profound prelingual deafness, were included
in this study. These families were ascertained among a larger number of families which
did not have mutations in GJB2. Genomic DNA extracted by using standard phenolchloroform method was used to genotype genomewide SNPs with microarray. With using
this method, first the known deafness genes were excluded and then the autozygous
segments which shared between affected individuals were detected. After this, one
affected individual per family were sequenced with using whole exome sequencing
method.
In one family, we identified p.Val477GlufsX25 mutation in OTOGL. This gene is
identified as new deafness gene in this study. OTOGL mutations affect the production
and/or function of acellular structures of the inner ear including the tectorial and otolithic
membranes. In the second family, we identified p.His170Asn mutation in GIPC3. This
gene has been identified as a deafness gene which has a role of acoustic signal acquisition
and propagation in cochlear hair cells.
This study is important to identify the genetic causes of hearing loss and the find the
specturms of the deafness genes. Identifiying genes that cause hearing loss in Turkey will
accelerate the molecular diagnosis and would improve accurate genetic counseling.
Key Words: Hearing loss, OTOGL, GIPC3, SNP microarray, whole exome sequencing
iv
ÖNSÖZ
Doktora eğitimim sırasında karşılaştığım her zorlukta bana yardım elini uzatan, her zaman
ve her koşulda desteğini esirgemeyen, bu ünvanı kendisine borçlu olduğum değerli
danışman hocam Doç. Dr. Hilal Özdağ’a sonsuz teşekkürü bir borç bilirim.
Bilimsel kariyerime başladığım ilk günden beri bilgisiyle beni yönlendiren ve Amerika’ya
gitmemi sağlayarak eğitimime ve kariyerime inanılmaz bir katkı sağlayan, bundan sonraki
çalışma hayatım boyunca bilgi, destek ve yardımını almaktan mutluluk duyacağım hocam
Prof.Dr.Mustafa Tekin’e teşekkürü bir borç bilirim.
Pediatrik Moleküler Genetik Ailesi’nden yıllarca beraber çalıştığım, yurtdışında
bulunduğum süre boyunca bana herzaman destek olan ve yardım eden canım arkadaşlarım
Dr.Duygu Duman ve Uzm.Bio.Didem Torun’a; yüksek lisans ve doktora eğitimim
süresince birikte çalıştığım çalışma arkadaşlarım Dr. Filiz Başak Cengiz, Dr. Ayşenur
Öztürk; ve Miami Üniversitesi’ndeki adını sayamadığım benden bilgi, tecrübe ve
yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen tüm çalışma arkadaşlarıma çok teşekkür ederim.
Bu çalışmanın gerçekleştirilmesine maddi destek saylayan TÜBİTAK ve NIH
kuruluşlarına, çalışmaya dahil olan ailelerden birini laboratuvarımıza gönderen Dr. Seyra
Erbek’e teşekkür ederim.
Bana verdikleri sonsuz sevgi, sabır, destek ve imkan için her zaman yanımda olan annem
ve babama sonsuz tesekkür ederim.
Aslı Sırmacı
Ankara, 2012
v
İÇİNDEKİLER
ONAY ................................................................................................................................... I
ÖZET................................................................................................................................... II
ABSTRACT ...................................................................................................................... III
ÖNSÖZ ................................................................................................................................ V
İÇİNDEKİLER ................................................................................................................ Vİ
ŞEKİLLER DİZİNİ ...................................................................................................... VIII
ÇİZELGELER DİZİNİ ................................................................................................... XI
SİMGELER DİZİNİ ..................................................................................................... XIII
1.
GİRİŞ ........................................................................................................................... 1
2.
GENEL BİLGİLER .................................................................................................... 3
2.1.
Ses Dalgaları ............................................................................................................. 3
2.2.
Kulağın Yapısı .......................................................................................................... 3
2.3.
İşitme Mekanizması .................................................................................................. 7
2.4.
İşitme Kaybının Sınıflandırılması ........................................................................... 10
2.4.1. Sendromik İşitme Kaybı ..................................................................................... 12
2.4.2. Sendromik Olmayan İşitme Kaybı ...................................................................... 12
2.4.2.1.
Sendromik Olmayan Otozomal Resesif Lokusların Tanımlanması ............ 15
2.5.
Strateji ..................................................................................................................... 17
2.6.
Moleküler Teknikler................................................................................................ 19
2.6.1. Polimeraz Zincir Reaksiyonu .............................................................................. 19
2.6.2. Restriksiyon Endonükleaz Enzimleriyle Kesim.................................................. 21
2.6.3. DNA Dizi Analizi ............................................................................................... 23
2.6.4. Genom Boyu Tek Nokta Polimorfizm Genotiplemesi ……………..………….25
2.6.5. Genetik Haritalama ve Bağlantı Analizi ............................................................. 27
2.6.6. Otozigozite Haritalaması ..................................................................................... 29
2.6.7. Tüm Ekzom Sekanslama ..................................................................................... 30
2.7.
3.
Yaklaşım ve Amaç .................................................................................................. 39
MATERYAL VE YÖNTEMLER............................................................................ 41
3.1.
Çalışma Grubunun Oluşturulması ........................................................................... 41
3.2.
DNA İzolasyonu...................................................................................................... 43
3.3.
Agaroz Jel Elektroforezi ......................................................................................... 44
3.4.
GJB2 Geni Mutasyon Analizi ................................................................................. 45
vi
3.5.
Mitokondriyal DNA’da 12SrRNA m.A1555G Mutasyon Analizi .......................... 46
3.6.
Genom Boyu Tek Nokta Polimorfizm Genotiplemesi ............................................ 47
3.6.1. Genomik DNA’nın Hazırlanması ....................................................................... 49
3.6.1.1.
StyI Restriksiyon Enzimi ile Kesim ............................................................ 49
3.6.1.2.
StyI Ligasyonu ............................................................................................ 50
3.6.1.3.
StyI PCR ..................................................................................................... 50
3.6.1.4.
NspI Restriksiyon Enzimi ile Kesim ........................................................... 51
3.6.1.5.
NspI Ligasyonu ........................................................................................... 51
3.6.1.6.
NspI PCR .................................................................................................... 51
3.6.1.7.
PCR Ürünü Pürifikasyonu .......................................................................... 52
3.6.1.8.
Kalite ve Miktar Tayini ............................................................................... 53
3.6.1.9.
Fragmentasyon ............................................................................................ 53
3.6.1.10 İşaretleme .................................................................................................... 54
3.6.1.11 Hedef Hibridizasyonu ................................................................................. 54
3.6.2. Yıkama ................................................................................................................ 55
3.6.3. Boyama ............................................................................................................... 56
3.6.4. Tarama................................................................................................................. 57
3.6.5. Veri Analizi ......................................................................................................... 58
3.7.
Bağlantı Analizi ve Otozigozite Haritalaması......................................................... 59
3.8.
Tüm Ekzom Sekanslama ......................................................................................... 60
3.8.1. Hedef Bölgelerin Seçimi (Capture) ..................................................................... 62
3.8.1.1.
Örneğin Hazırlanması ................................................................................. 64
3.8.1.2.
Hibridizasyon .............................................................................................. 73
3.8.1.3
Hibridazasyon Sonrası Amplifikasyon ile İndeks-Barkod İşaretlerinin
Eklenmesi .................................................................................................................... 76
3.8.1.4
Çoklu Sekanslama için Örnek Havuzunun Oluşturulması .......................... 82
3.8.2. Sekanslama.......................................................................................................... 84
3.8.2.1.
DNA Örneğinin Kümeleştirilmesi .............................................................. 85
3.8.2.2.
Sekanslama .................................................................................................. 89
3.8.3 Tüm Ekzom Sekanslama Veri Analizi ................................................................ 93
3.9
Polimeraz Zincir Reaksiyonu .................................................................................. 96
3.9.1. Bilinen İşitme Kaybı Genlerinin Elenmesi ......................................................... 97
3.9.2. Aday Varyantların Doğrulanması ....................................................................... 98
3.9.3. Sorumlu Genlerin Sekanslanması ....................................................................... 98
vii
3.10
Sephadex ile PCR Ürünlerinin Pürifikasyonu....................................................... 100
3.11
DNA Dizi Analizi ................................................................................................. 101
ARAŞTIRMA BULGULARI ................................................................................. 102
4.
4.1.
GJB2 Geni ve Mitokondriyal DNA’da 12SrRNA m.A1555G Mutasyon Analizi 102
4.2.
SNP Mikrodizin Analizi........................................................................................ 104
4.3.
Sorumlu Gen Bölgelerinin Belirlenmesi ............................................................... 107
4.3.1. Bağlantı Analizi ................................................................................................ 107
4.3.2. Otozigozite Haritalaması ................................................................................... 111
4.4.
Bilinen İşitme Kaybı Genlerinin Elenmesi ........................................................... 124
4.5.
Tüm Ekzom Sekanslama ....................................................................................... 126
4.6.
Filtreleme .............................................................................................................. 130
4.7.
Otozigozite Haritalaması ile Tüm Ekzom Sekanslama Sonuçlarının Birleştirilmesi
…………………………………………………………………………………...131
4.7.1. Aile 1’de Elde Edilen Aday Varyantlar ............................................................ 131
4.7.2. Aile 2’de Elde Edilen Aday Varyantlar ............................................................ 132
4.7.3. Aile 3’de Elde Edilen Aday Varyantlar ............................................................ 132
4.8.
Aday Varyantların Doğrulanması ......................................................................... 132
4.8.1. Aile 1’de Elde Edilen Verilerin Doğrulanması ................................................. 133
4.8.2. Aile 2’de Elde Edilen Verilerin Doğrulanması ................................................. 137
4.8.3. Aile 3’de Elde Edilen Verilerin Doğrulanması ................................................. 137
5.
TARTIŞMA VE SONUÇ........................................................................................ 141
5.1.
Bağlantı Analizi ve Otozigozite Haritalaması....................................................... 141
5.2.
Aile 1 ..................................................................................................................... 142
5.3.
Aile 3 ..................................................................................................................... 145
5.4.
Aile 2 ..................................................................................................................... 148
EKLER ............................................................................................................................. 155
KAYNAKLAR ................................................................................................................ 177
ÖZGEÇMİŞ ..................................................................................................................... 189
viii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1.
Kulağın anatomik yapısı ................................................................................. 4
Şekil 2.2.
Orta kulaktaki kemikçiklerin lokalizasyonu ................................................... 5
Şekil 2.3.
İç kulaktaki kohlea sisteminin enine kesiti ..................................................... 5
Şekil 2.4.
İç kulağın yapısı.............................................................................................. 6
Şekil 2.5.
İç kulaktaki iyon taşınımı ............................................................................... 7
Şekil 2.6.
İşitme sisteminde görev alan proteinler ve görev yerleri ............................... 9
Şekil 2.7.
İşitme kaybı yaptığı tanımlanmış olan genler ve genomik lokalizasyonları 14
Şekil 2.8.
Strateji ........................................................................................................... 18
Şekil 2.9.
Rekombinant olan ve olmayan lokuslar ....................................................... 27
Şekil 2.10.
Sonikasyon aşamasından sonra elde edilen DNA fragmentleri.................... 32
Şekil 2.11.
Tüm Ekzom Sekanslama yönteminin akış şeması ........................................ 38
Şekil 3.1.
Aile 1’in aile ağacı ........................................................................................ 42
Şekil 3.2.
Aile 2’nin aile ağacı ...................................................................................... 42
Şekil 3.3.
Aile 3’ün aile ağacı ....................................................................................... 42
Şekil 3.4
Affymetrix® Genome-Wide Human SNP 6.0 Assay akış şeması ............... 48
Şekil 3.5.
Affymetrix® Human GeneChip Genome-Wide Human SNP 6.0 çip
görüntüsü ...................................................................................................... 55
Şekil 3.7.
Tüm ekzom sekanslama yöntemi için akış şeması ....................................... 61
Şekil 3.8.
SureSelect Target Enrichment Sistemi akış şeması ...................................... 63
Şekil 3.9.
DNA örneğinin hazırlanma aşamaları .......................................................... 65
Şekil 3.10.
Agencourt AMPure XP boncukları ile pürifikasyon yönteminin basamakları
...................................................................................................................... 67
Şekil 3.11.
Parçalanmış DNA örneğinin temsili Bioanalyzer görüntüsü ....................... 68
Şekil 3.12.
Adaptör eklenmiş DNA kütüphanesinin temsili Bioanalyzer görüntüsü ..... 72
Şekil 3.13.
DNA kütüphanesinin hibridizasyon aşamaları (12 örneklik) ....................... 74
Şekil 3.14.
İndeks-Barkod işaretlerinin eklenmesi için hedef bölge kütüphanesinin
amplifikasyon basamakları ........................................................................... 78
Şekil 3.15.
İndeks-Barkod işaretleri eklenmiş DNA kütüphanesinin temsili Bioanalyzer
görüntüsü ...................................................................................................... 79
Şekil 3.16.
Q-PCR yöntemi ile işaretlenen kütüphanelerin miktarlarının
değerlendirilmesi .......................................................................................... 81
Şekil 3.17.
Bir flow cell görüntüsü ................................................................................. 85
ix
Şekil 3.18.
Illumina® cBot cihazının kısımları ............................................................... 87
Şekil 3.19.
DNA örneğinin kümeleştirme işleminin basamakları .................................. 89
Şekil 3.20.
Illumina® HiSeq™ 2000 cihazı ile sekanslama işleminin akış şeması ......... 90
Şekil 3.21.
Sekanslama işleminin temel basamakları ..................................................... 92
Şekil 4.1.
GJB2 geni ekzon 1 ve ekzon 2 PCR ürünlerinin %2’lik temsili agaroz jel
görüntüsü. ................................................................................................... 102
Şekil 4.2
12SrRNA m.A1555G mutasyonunun BsmAI enzimi ile kesim sonucunda
%2’lik temsili agaroz jel görüntüsü belirlenmesi. ...................................... 103
Şekil 4.3.
Affymetrix® Genome-Wide Human SNP 6.0 Assay Akış Şeması ............ 104
Şekil 4.4.
StyI PCR ürünü jel görüntüsü ..................................................................... 105
Şekil 4.5.
NspI PCR ürünü jel görüntüsü.................................................................... 106
Şekil 4.6.
Fragmentasyon ürünlerinin agaroz jel görüntüsü ....................................... 106
Şekil 4.7.
Aile 1’ün tüm genom LOD skor sonuçları ................................................. 108
Şekil 4.8.
Aile 2’ün tüm genom LOD skor sonuçları ................................................. 109
Şekil 4.9.
Aile 3’ün tüm genom LOD skor sonuçları ................................................. 110
Şekil 4.10.
Aile 1’deki 12. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler ................. 113
Şekil 4.11.
Aile 1’deki 2. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler ................... 113
Şekil 4.12.
Aile 1’deki 9. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler ................... 114
Şekil 4.13.
Aile 1’deki 12. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler ................. 114
Şekil 4.14.
Aile 1’deki 12. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler ................. 114
Şekil 4.15.
Aile 2’deki 8. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler ................... 115
Şekil 4.16.
Aile 2’deki 13. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler ................. 116
Şekil 4.17.
Aile 2’deki 17. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler ................. 118
Şekil 4.18.
Aile 2’deki 9. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler ................... 119
Şekil 4.19.
Aile 3’deki 15. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler ................. 120
Şekil 4.20.
Aile 3’deki 19. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler ................. 121
Şekil 4.21.
Aile 3’deki 8. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler ................... 122
Şekil 4.22.
Aile 3’deki 21. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler ................. 122
Şekil 4.23.
Aile 3’deki 16. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler ................. 123
Şekil 4.24.
PTPRQ geninin ekzonlarının PCR ürünlerinin agaroz jel görüntüsü. ........ 125
Şekil 4.25.
Baz coverage değerinin hesaplanması ........................................................ 126
Şekil 4.26.
Tüm ekzom sekanslama verisi genel coverage plotları .............................. 128
Şekil 4.27.
PCR ürünlerinin %2’lik agaroz jel görüntüsü. ........................................... 133
Şekil 4.28.
Aile 1’de doğrulanan aday varyantların DNA dizi analizi görüntüleri. ..... 134
x
Şekil 4.29.
OTOGL genindeki c.1430delT (p.Val477GlufsX25) ve c.4134T>C
(p.Cys1378Arg) varyantlarının lokalizasyonları. ....................................... 135
Şekil 4.30.
OTOGL geninin ekzonlarının tüm ekzom sekanslama yöntemi ile elde
edilen sekanslanma yüzdeleri. .................................................................... 136
Şekil 4.31.
OTOGL geninin ekzonlarının PCR ürünlerinin agaroz jel görüntüsü. ....... 136
Şekil 4.32.
Aile 3’de doğrulanan iki aday varyantın DNA dizi analizi görüntüsü. ...... 138
Şekil 4.33.
GIPC3 genindeki c.508C>A (p.His170Asn) varyantının lokalizasyonu. ... 139
Şekil 4.34.
GIPC3 geninin ekzonlarının tüm ekzom sekanslama yöntemi ile elde edilen
sekanslanma yüzdeleri. ............................................................................... 140
Şekil 4.35.
GIPC3 ekzonlarının PCR ürünlerinin agaroz jel görüntüsü. ...................... 140
Şekil 5.1.
Aile 1’in tüm bireylerinin 12. kromozomdaki otozigot blok için haplotipleri
.................................................................................................................... 143
Şekil 5.2.
Aile 3’ün elimizde örneği mevcut tüm bireylerinin 12. kromozomdaki
otozigot blok için haplotipleri..................................................................... 145
Şekil 5.3.
GIPC3 genindeki 170. pozisyondaki amino asitin diğer türlerle
karşılaştırılması ........................................................................................... 146
Şekil 5.4.
GIPC3 geninde bugüne kadar tanımlanmış tüm mutasyonların gen
üzerindeki yerleşimleri. .............................................................................. 147
Şekil 5.5.
Aile 2’nin baz coverage değerleri ............................................................... 149
Şekil 5.6.
Aile 2’nin 8. kromozomda bulunan otozigot bloğun coverage oranı ......... 150
Şekil 5.7.
Aile 2’nin 13. kromozomda bulunan otozigot bloğun coverage oranı ....... 150
Şekil 5.8.
Aile 2’nin 8. kromozomda bulunan otozigot bloğun coverage oranı ......... 151
Şekil 5.9.
Aile 2’nin 8. kromozomda bulunan otozigot bloğun coverage oranı ......... 151
xi
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1.
Sendromik olmayan otozomal resesif işitme kaybı genleri/lokusları ve
genomik lokalizasyonları ........................................................................... 16
Çizelge 2.2.
Piyasada bulunan tüm ekzom sekanslama kitlerinin özellikleri ................ 34
Çizelge 2.3.
Agilent Technologies firmasının piyasaya yeni sürülen SureSelect Human
All Exon v4 ve v4+UTR kitlerinin genel özellikleri ................................. 35
Çizelge 2.4.
Illumina® firmasının yüksek çözünürlüklü sekanslama cihazları ve
özellikleri ................................................................................................... 37
Çizelge 3.1.
Örneklerin Bioanalyzer sonuçları .............................................................. 83
Çizelge 3.2.
Dört örneklik bir havuz oluşturmak için gerçekleştirilen temsili hesaplama
................................................................................................................... 84
Çizelge 3.3.
PTPRQ genini çoğaltmak için kullanılan primer dizileri ve PCR ürün
boyutları ..................................................................................................... 97
Çizelge 3.4.
Aday varyantlar için kullanılan primerler dizisi ve ürün boyutları ........... 98
Çizelge 3.5.
OTOGL genini çoğaltmak için kullanılan primer dizileri ve PCR ürün
boyutları ..................................................................................................... 99
Çizelge 3.6.
GIPC3 genini çoğaltmak için kullanılan primer dizileri ve PCR ürün
boyutları ................................................................................................... 100
Çizelge 4.1.
Aile 1’de bulunan otozigot bloklar .......................................................... 112
Çizelge 4.2.
Aile 2’de bulunan otozigot bloklar .......................................................... 112
Çizelge 4.3.
Aile 3’de bulunan otozigot bloklar .......................................................... 112
Çizelge 4.4.
Tüm ekzom sekanslama verisi haritalama raporu ................................... 127
Çizelge 4.5.
İşitme kaybı genlerinin genel coverage yüzdeleri ................................... 129
Çizelge 4.6.
Aile 1’deki tüm ekzom sekanslama verisi filtreleme sonuçları ............... 130
Çizelge 4.7.
Aile 2’deki tüm ekzom sekanslama verisi filtreleme sonuçları ............... 130
Çizelge 4.8.
Aile 3’deki tüm ekzom sekanslama verisi filtreleme sonuçları ............... 131
Çizelge 4.9.
Veri analizi sonucunda aile 1’de elde edilen aday varyantlar ................. 132
Çizelge 4.10.
Veri analizi sonucunda aile 2’de elde edilen aday varyantlar ................. 132
Çizelge 4.11.
Veri analizi sonucunda aile 3’de elde edilen aday varyantlar ................. 132
Çizelge 5.1.
Otozigozite haritalaması ve bağlantı analizinin sonucunda elde edilen
otozigot blokların karşılaştırılması .......................................................... 142
Çizelge 5.2.
Aile 2’nin otozigot bloklarındaki sekanslanan (cover edilen) baz sayısı 152
xii
EKLER
EK 1
Aile 1’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler .................................. 155
EK 2
Aile 2’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler .................................. 157
EK 3
Aile 3’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler .................................. 167
xiii
SİMGELER DİZİNİ
A
A
ABD
Arg
Asn
Asp
ATP
Bç
C
C
C
Ca
cDNA
Cys
dATP
dB
dATP
dCTP
dGTP
dNTP
dTTP
ddATP
ddCTP
ddGTP
ddNTP
ddTTP
dH 0
DNA
EDTA
Fs
g
g
G
G
Gln
Glu
Gly
HCl
His
I
IHC
Ile
K+
kb
KCl
kDa
°
++
2
: Adenin bazı
: Alanin
: Amerika Birleşik Devletleri
: Arjinin
: Asparajin
: Aspartik Asit
: Adenozintrifosfat
: Baz çifti
: Sistein
: Sitozin bazı
: Santigrat derece
: Kalsiyum
: Tamamlayıcı deoksiribonükleik asit
: Sistein
: Deoksiadenintrifosfat
: Desibel
: Deoksiadenintrifosfat
: Deoksitozintrifosfat
: Deoksiguanintrifosfat
: Deoksinükleotid trifosfat
: Deoksitimidintrifosfat
: Dideoksiadenintrifosfat
: Dideoksisitozintrifosfat
: Dideoksiguanintrifosfat
: Dideoksinükleotid trifosfat
: Dideoksitimidintrifosfat
: Deiyonize su
: Deoksiribonükleik asit
: Etilendiamintetraasetikasit
: Çerçeve kayması (Ahmed et al.)
: Gram
: Dakikadaki dönüş sayısı
: Guanin bazı
: Glisin
: Glutamin
: Glutamik Asit
: Glisin
: Hidroklorik asit
: Histidin
: İzolösin
: İç tüy hücresi
: İzolösin
: Potasyum iyonu
: Kilobaz
: Potasyum klorür
: Kilo Dalton
xiv
L
M
M
Mb
Met
mg
Mg
MgCl
mL
mM
µg
µL
µm
N
Na
NaOAc
OH
OHC
P
PCR
pH
pmol
Pro
R
RBC
RFLP
RNA
Rpm
Ser
SNP
T
T
Taq
TAE
TBE
TE
TEMED
Thr
X
V
Val
W
++
2
+
32
: Lizin
: Molar
: Metiyonin
: Megabaz
: Metiyonin
: Miligram
: Magnezyum
: Magnezyum klorür
: Mililitre
: Milimolar
: Mikrogram
: Mikrolitre
: Mikromol
: Asparajin
: Sodyum iyonu
: Sodyum asetat
: Hidroksil
: Dış tüy hücresi
: Fosfor 32
: Polimeraz Zincir Reaksiyonu
: Asitlik-Bazlık Derecesi
: Pikomol
: Prolin
: Arjinin
: Kırmızı Kan Hücresi
: Restriksiyon fragment uzunluk polimorfizmi
: Ribonükleik asit
: Dakikadaki dönüş sayısı
: Serin
: Tek nükleotid polimorfizmi
: Timin bazı
: Treonin
: Thermus aquaticus
: Tris-Asetik asit-EDTA
: Tris-Borik asit-EDTA
: Tris-EDTA
: N,N,N',N'-tetrametilen-etilendiamin
: Treonin
: Dur kodonu
: Volt
: Valin
: Triptofan
xv
1. GİRİŞ
İşitme, bir kişinin bulunduğu sosyal ortamda bağımsız bir birey olarak yaşayabilmesi ve
çevresiyle iletişim kurabilmesini sağlayan en önemli araçtır. Doğuştan veya çocukluk
döneminde meydana gelen işitme kayıpları, kişilerin eğitim düzeylerini etkilemekte ve
çevresiyle olan iletişiminde zorluklara yol açmaktadır. Erişkin dönemde başlayan işitme
kayıpları ise kişilerin toplumdan soyutlanmalarına neden olarak yaşam standartlarının
düşmesine sebep olmaktadır.
İşitme kaybı dünya genelinde sık görülen duyusal bir bozukluktur. Toplumlar arasında
farklılık göstermekle birlikte yaklaşık olarak 1000 canlı doğumda 1-2 sıklıkta
görülmektedir (Bitner-Glindzicz 2002, Nance 2003). İşitme kaybına genetik nedenler ve
çevresel faktörler sebep olabilmektedir. Genetik nedenler, doğuştan işitme kayıplarının
yaklaşık olarak %50-60’lık bir kısmını oluşturmaktadır. Genetik nedenli işitme
kayıplarının ise %70-80’ini sendromik olmayan işitme kayıpları oluşturmaktadır (Nance
2003). Toplumların kültürel yapılarına bağlı olmakla birlikte bu oranın yaklaşık %80’ini
otozomal resesif işitme kayıpları oluşturmaktadır (Morton and Nance 2006). Ülkemizde
özellikle doğu bölgelerde akraba evliliğinin yaygın olması nedeniyle bu oran %90’lara
kadar ulaşmaktadır (Tekin and Arici 2007).
Birçok toplumda genetik nedenli işitme kayıplarının çok büyük bir kısmı GJB2 gen
mutasyonlarıyla açıklanmaktadır (Kelsell et al. 1997). Ülkemizde de GJB2 mutasyonları
%18.9’luk bir oranla en sık görülen işitme kaybı sebebidir (Tekin et al. 2007). Bugüne
kadar otozomal resesif sendromik olmayan işitme kaybından sorumlu 39 adet gen
tanımlanmıştır (http://hereditaryhearingloss.org/).
Otozomal resesif işitme kaybı genlerinin çokluğu ve her geçen gün yenilerinin
tanımlanması sebebiyle klasik yöntemlerle tanı konulması giderek imkansız hale
gelmektedir. Uzun yıllardır yapılan çalışmalarda araştırmacılar tarafından değişik
moleküler teknikler kullanılarak işitme kaybına sebep olan genlerin tanımlanmasına
yönelik araştırmalar devam etmektedir.
1
Bu amaç doğrultusunda, Ankara Üniversitesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim
Dalı, Pediatrik Moleküler Genetik Bilim Dalı laboratuvarında yürüttüğümüz çalışmalarda,
laboratuvar DNA bankamızda bulunan anne ile baba arasında akraba evliliği olan,
otozomal resesif sendromik olmayan işitme kaybına sahip ailelerdeki, işitme kaybına
sebep olan genleri araştırmaktayız. Çalışmamız kapsamındaki ailelerde görülen işitme
kaybının kalıtım şekilleri ve aile yapıları, otozigozite haritalama metodu ile sorumlu
genetik değişikliklerin hangi genomik lokuslarda olduğunu belirlememize imkan
sağlamaktadır. Ancak bu yöntem bizlere direkt olarak işitme kaybından sorumlu genetik
değişiklik konusunda bir bilgi vermemektedir. Bizim bu tez çalışmasındaki amacımız, bu
ailelerde SNP genotiplemesinin yanı sıra tüm ekzom sekanslama yöntemini de kullanarak,
ailedeki işitme kaybına neden olan geni/varyasyonu daha kısa sürede ve kesin sonuç veren
bir yöntem kullanarak tanımlamaktır. Böylelikle işitme kayıplı bireylere daha hızlı tanı
konulabilecek ve doğru genetik danışma verilmesi sağlanacaktır.
2
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Ses Dalgaları
Dalgalar, genel olarak mekanik ve elektromanyetik dalgalar olmak üzere iki ana gruba
ayrılır. Elektromanyetik dalgalar, yayılmak için bir ortama ihtiyaç duymazlar ve boşlukta
da yayılabilirler. Mekanik dalgalar ise, enerjilerini aktarabilmek için ortam taneciklerine
ihtiyaç duyarlar.
Ses dalgaları mekanik dalgalardır ve yayılmak için maddesel bir ortama ihtiyaç duyarlar.
Ses, nesnelerin titreşiminden meydana gelen ve uygun bir ortam içerisinde bir yerden
başka bir yere, sıkışma ve genleşmeler şeklinde ilerleyen bir dalgadır.
İnsan kulağı çok düşük ve çok yüksek şiddette sesleri duyabilme yeteneğine sahiptir. İnsan
kulağının algılayabileceği en düşük ses şiddeti, ‘eşik şiddet’ olarak bilinir. Kulağa zarar
vermeden işitilebilen en yüksek sesin şiddeti ise, eşik şiddetinin yaklaşık 1 milyon katı
kadardır. İnsan kulağının şiddet algı aralığı bu kadar geniş olduğundan, şiddet ölçümü için
kullanılan ölçek de 10'un katları, yani logaritmik olarak düzenlenmiştir. Buna ‘desibel
ölçeği’ adı verilmektedir. Sıfır desibel mutlak sessizliği değil; işitilemeyecek kadar düşük
ses şiddetini gösterir.
2.2. Kulağın Yapısı
İşitme ve denge işlevlerinden sorumlu olan kulak, üç ana bölümden oluşur. Kulağın yapı
ve görev bakımından ayrı olan bu bölümleri dış kulak, orta kulak ve iç kulak olarak
adlandırılır (Şekil 2.1). Beyine giden sinir yolları ise bu sistemin dördüncü bölümünü
oluşturur.
Dış kulak; kulak kepçesi (aurikula) ve dış işitme kanalı olmak üzere iki kısımdan oluşur.
Dışa doğru çıkıntı yapan kulak kepçesi, sesin yönünün belirlenmesinde görev alır. Kulak
kepçesi tarafından toplanan ses dalgaları, dış işitme kanalı boyunca ilerleyerek kulak
zarına yani timpanik membrana iletilir.
Bu kanal, yaklaşık olarak 2.5 cm boyunda
kıvrımlı bir yapıya sahiptir. Dış kulak yolunun sonunda bulunan yarı saydam renkli kulak
3
zarı dış ve orta kulağı birbirinden ayırır. Bu zar; basıncı dengelerken, dış kulak yolundan
gelen ses dalgalarını değiştirmeden hava ile dolu orta kulağa iletmede de rol alır.
Şekil 2.1. Kulağın anatomik yapısı
(http://www.biographixmedia.com değiştirilerek alınmıştır.)
Orta kulak; çekiç (malleus), örs (inkus), üzengi (stapes) adı verilen üç hareketli işitme
kemikçiğinden oluşur. Bu kemikler vücudun en küçük kemikçikleridir. Kulak zarına
tutunan ilk kemik çekiç kemiğidir ve kulak zarına yapışıktır. Ortada yer alan kemik örs
kemiğidir. En sonda bulunan kemik ise üzengi kemiğidir ve iç duvara yani oval pencereye
bağlıdır (Şekil 2.2).
Kulak zarı tarafından oluşturulan ses dalgaları, titreşim halinde üzengi kemiğinin tabanına
iletilir. Bu sayede oval pencere içe, dışa doğru hareketler oluşturur. Böylece kulak zarı ve
kemikleri, havadaki titreşimleri iç kulağın sıvı ortamına ulaştırmış olur (Petit 2001).
4
Şekil 2.2. Orta kulaktaki kemikçiklerin lokalizasyonu
(http://www.sciencephoto.com’dan değiştirilerek alınmıştır.)
İç kulak; temporal kemik içerisine gömülmüş, birbirinden ayrı üç kemik boşluktan
meydana gelen bir yapıdır. Bu boşluklara kemik labirent adı verilir. Kemik labirent üç
bölümden oluşur. Bunlar kohlea, semisirküler kanallar ve bu kanalların yapısında bulunan
utrikul ve sakkulu içeren vestibül aygıtıdır. Vestibül merkezde olmak üzere ön kısımda
kohlea arka kısımda ise semisirküler kanallar yerleşmiştir (Şekil 2.3).
Şekil 2.3. İç kulaktaki kohlea sisteminin enine kesiti
(http://www.baskent.edu.tr değiştirilerek alınmıştır.)
5
Kohlea 35 mm boyunda kıvrım yapan sarmal tüp şeklinde bir yapıdır. Bağ dokusundan
oluşan bazillar membran ve ince zar şeklindeki Reissner membran kohleayı uzunluğu
boyunca üç bölüme ayırır. Ortadaki bölme scala media adını alır ve işitme reseptörü olan
korti organını taşır. Scala media’nın bir tarafında scala timpani diğer tarafında ise scala
vestibuli bulunur. Scala media endolenf, scala vestibuli ve scala timpani perilenfle doludur
(Şekil 2.4).
Şekil 2.4. İç kulağın yapısı
(http://www.britannica.com’dan değiştirilerek alınmıştır)
Endolenf ile perilenfin iyonik kompozisyonları birbirlerinden farklıdır. Endolenf yüksek
K+ (150 mM), düşük Na+ (1 mM) ve çok az miktarda Ca++ (0.02 mM) iyon
konsantrasyonuna sahipken perilenf plazmaya benzer bir şekilde düşük K+ (3.5 mM),
yüksek Na+ (140 mM) ve endolenften daha yüksek oranda Ca++ (1 mM) iyon
konsantrasyonuna sahiptir (Petit 2001). Endolenfin perilenften farklı olan iyon
konsantrasyonu kohlear kanalın yan duvarında bulunan stria vaskülarisin marginal
hücreleri tarafından sağlanmaktadır.
6
İşitme sisteminin en önemli elemanı kohlea’da bulunan korti organıdır. Yapının en önemli
elemanları 2 çeşit tüy hücresidir. Bu tüy hücreleri, iç tüy hücresi (IHC) ve dış tüy hücresi
(OHC) olarak adlandırılır (Petit 2001). Bu hücreler sayesinde mekanik uyarılar elektriksel
uyarılara dönüştürülür. Tek sıra halinde bulunan iç tüy hücreleri akustik sinire ve işitme
korteksine sinyal iletiminde görev alır. Üç sıra halinde bulunan dış tüy hücreleri ise hem
sensorinöral hem de motor elemanlara sahiptir. Motor elemanlarınca, hem alınan sesleri
arttırarak işitmenin hassasiyetine hem de frekans seçiciliğine katkıda bulunurlar. Akustik
olarak uyarıldıklarında uzayıp bükülme özelliğine sahiptirler.
2.3. İşitme Mekanizması
Ses dalgalarının mekanik etkisi perilenf içindeki sıvının hareketlenmesine neden olarak
titreşimlere yol açar. Bu titreşimler sayesinde tüy hücrelerinin uç kısımlarında bulunan
stereosiller bükülür ve stereosillerin tepe uçlarında bulunan harekete duyarlı katyon
kanalları açılır. Böylece K+ iyonu endolenften hücre içine girer ve hücrelerin
depolarizasyonuna neden olur (Şekil 2.5). Bu durum hücrelerin bazolateral kısımlarındaki
Ca++ kanallarının aktivasyonu ile sonuçlanır ve Ca++ kanalları akustik siniri aktive eden
nörotransmitterlerin salınımını tetikler. Bu sayede mekanik enerji kohlear sinire aktarılan
elektrik enerjisine dönüştürülür (Willems 2000).
Şekil 2.5. İç kulaktaki iyon taşınımı
(Hubner and Jentsch 2002’den değiştirilerek alınmıştır.)
7
Normal işitmenin devamı için; tüy hücrelerine giriş yapan ve aksiyon potansiyeli oluşturan
K+ iyonlarının endolenfe geri dönmesi gerekmektedir. Hücrede Ca++ iyonu miktarının
artması Ca++ iyonuna duyarlı K+ iyonu geçiş yollarını açar ve K+ iyonlarının hücreden
dışarı salınmalarını sağlar (Noyan 1999). K+ iyonları ilk olarak tüy hücrelerinin
bazolateral kısmındaki kanalı geçer. Bu geçiş, hücreler arası kanallar (gap junction)
sayesinde gerçekleşir. K+ iyonları stria vaskularis hücrelerine ulaştığı zaman voltaj kapaklı
potasyum kanallarından geçerek endolenfe geri pompalanırlar (Tekin et al. 2001b).
İşitme sistemi birçok elemandan oluşan karmaşık bir yapıdır. Sistemdeki herhangi bir
yapının fonksiyon bozukluğu veya tahribatı işitme kaybı ile sonuçlanmaktadır. İşitmenin
mekanizmasında işlev gören proteinleri, görevlerine göre gruplandırmak mümkündür
(Şekil 2.6).
Hücreler arası iletişim bölgelerinde (gap junction ve tight junction) bulunan proteinler,
hücreler arası iyon transferinde görev alarak kohlear homeostazı sağlamaktadır. Hücreler
arasındaki aralıklı geçiş bölgeleri; komşu hücreler arasında iyon geçişine izin veren, 6 adet
konneksin proteininden oluşan ve konnekzon adı verilen kanallardan oluşmaktadır. Bu
kanallar iç kulaktaki K+ iyon dengesini sağlamaktadır. İç kulakta dört farklı konneksin
proteini görev almaktadır. Bunlar; konneksin 26, konneksin 30, konneksin 31 ve
konneksin 45 proteinleridir. Hücreler arası sıkı bağlantı bölgeleri ise korti organının
potasyumca zengin endolenfi ile sodyumca zengin perilenfini ayırmak için bariyer görevi
görürler. Klaudin 14 ve trisellülin proteinleri bu yapılarda görev almaktadır. Klaudin
protein ailesinin Q4, Q1 ve E1 üyeleri potasyum kanallarında, SLC26A4, TMC1,
TMPRSS3
proteinleri
ise
transmembranlarda
görev
almaktadırlar
(http://hereditaryhearingloss.org/).
Hücre iskeletinde görev alan proteinler miyozin gen ailesi tarafından kodlanan miyozin 3a,
miyozin 6, miyozin 7a ve miyozin 15a’dır (http://hereditaryhearingloss.org/) .
Tektorial membranda görev alan yapısal proteinler TECTA, COL11A2, COL11A1,
COL2A1, OTOA, STRC, OTOG tarafından kodlanmaktadır. Ekstraselüler matrix
proteinleri kohleada sesin meydana gelmesi ve yayılmasının biyomekanik işleminde kritik
rol oynarlar. PJVK ve OTOF’un kodladığı proteinler ise nöral iletimde görevli
proteinlerdir. POU3F4 ve POU4F3 genleri ise transkripsiyon faktörü olarak görev alan
proteinleri kodlarlar (http://hereditaryhearingloss.org/).
8
Şekil 2.6. İşitme sisteminde görev alan proteinler ve görev yerleri
(Morton and Nance 2006’dan değiştirilmeden alınmıştır.)
İşitmenin normal fonksiyonunun devamlılığı işitme sisteminin iki temel fonksiyonuna
bağlıdır. İlk olarak ses kohleaya ulaşmalı, frekans yönünden analiz edilmeli ve kohlear tüy
hücrelerinin osilasyonunu sağlamalıdır. Ardından kohlear tüy hücrelerinin osilasyonu
elektrokimyasal sinyallere dönüştürülmelidir. İşitme sistemindeki herhangi bir yapının
fonksiyon bozukluğu veya tahribatı işitme kaybı ile sonuçlanır. İşitme kaybının dünya
çapında yaklaşık 270 milyon insanı etkilediği bilinmektedir (Eisen and Ryugo 2007).
9
2.4. İşitme Kaybının Sınıflandırılması
İşitme sistemi bir bütün halinde çalışmakta ve sistemin içerisindeki herhangi bir sorun
işitme kaybına yol açmaktadır. İşitme kaybının etkisi, işitmenin şiddetine ve bireyin yaşına
bağlı olarak değişmektedir. Ancak genel olarak işitme kaybı çevresel nedenli işitme
kayıpları ve genetik nedenli işitme kayıpları olmak üzere iki temel sınıfa ayrılmaktadır.
Çevresel nedenli işitme kayıpları, işitme kayıplarının yaklaşık %40’lık bölümünü
oluşturmaktadır. Bunlar rubella, sitomegalovirüs gibi birtakım teratolojik ajanlar,
menenjit, kabakulak gibi genellikle çocukluk yaşta geçirilen birtakım enfeksiyonlar,
ototoksik ilaçlar, akustik travma, erken doğum ve düşük doğum ağırlığı gibi genetik
olmayan nedenlerdir (Bitner-Glindzicz 2002, Tekin et al. 2001b).
Genetik nedenli işitme kayıpları, işitme kayıplarını yaklaşık %60’lık bölümünü
oluşturmaktadır. Ancak ülkemizde bu oranlar; %23.2 çevresel nedenli ve %76.8 genetik
nedenli şeklinde farklılık göstermektedir (Tekin et al. 2007).
Bu genel ayırım dışında işitme kayıpları; başlangıç yaşına, işitme organ defektlerine,
şiddetine, progresyonuna, kalıtım şekillerine ve fenotipe yansımasına göre de
sınıflandırılmaktadır.
Başlangıç yaşına göre; doğuştan (konjenital), erken başlangıçlı (prelingual) ve geç
başlangıçlı (postlingual) işitme kaybı olarak üçe grup altında incelenmektedir. Prelingual
yani dil gelişimi öncesi meydana gelen işitme kayıpları genellikle 5 yaşına kadar oluşan
işitme kayıpları olup; otozomal dominant, otozomal resesif, X’e bağlı veya mitokondrial
kalıtım göstermektedir. Ancak postlingual yani dil gelişimi sonrası meydana gelen işime
kayıpları genellikle otozomal dominant kalıtım göstermektedir (Finsterer and Fellinger
2005).
İşitme organ defektlerine göre; iletim tipi işitme kaybı ve sensorinöral tip işitme kaybı
olmak üzere iki sınıfa ayrılmaktadır. İletim tipi işitme kaybı, dış veya orta kulakta
meydana gelen fiziksel problemler sonucunda meydana gelen işitme kaybıdır. Bu tip
işitme kaybına orta kulak patolojileri, timpanik membran perforasyonu, kemikçiklerin
hastalıkları, orta kulak enfeksiyonları örnek olarak gösterilebilir. Sensorinöral tip işitme
kaybı ise iç kulak, duyu sinirleri ve/veya merkezi sinir sistemindeki hasarlar sonucunda
10
meydana gelen işitme kaybıdır. Her iki tipin de görüldüğü olgular ise karışık tip işitme
kaybı olarak adlandırılır (Petit 2001, Tekin et al. 2001b).
Şiddetine göre; beş tip işitme kaybı bulunmaktadır (Petit 2006, Tekin et al. 2001b). Bu
tiplendirme odyolojik değerlendirme sonucunda yapılmaktadır.
1. Hafif dereceli işitme kaybına sahip bireyler 20-40 dB arasında olan fısıltı şeklindeki
çok düşük frekanslı sesleri işitemezler.
2. Orta dereceli işitme kaybına sahip bireyler 41-70 dB arasında olan normal konuşma
düzeyindeki sesleri işitemezler.
3. Orta-ileri dereceli işitme kaybına sahip bireyler 56-70 dB arasında olan sesleri
işitemezler.
4. Şiddetli işitme kaybına sahip bireyler 71-95 dB arasında olan bağırma düzeyindeki
sesleri işitemezler.
5. Çok ileri dereceli işitme kaybına sahip bireyler ise (>95 dB) hiçbir ses işitemezler.
Progresyonuna göre; ilerleyici işitme kaybı, ilerleyici olmayan işitme kaybı ve değişken
progresyon gösteren işitme kaybı olarak üç gruba ayrılmaktadır.
Kalıtım şekline göre; tek genli kalıtım ve çok genli kalıtım olarak iki grupta sınıflandırılır.
Değişik toplumlarda sıklıkları değişkenlik göstermekle birlikte tek genli kalıtım; otozomal
resesif, otozomal dominant, X’e bağlı ve mitokondrial olarak gruplandırılır (Nance 2003).
Ancak GJB2, GJB6, MYO7A, MYO6, TMC1, TECTA’daki mutasyonlar ise hem otozomal
dominant hem de otozomal resesif sendromik olmayan işitme kaybına neden
olabilmektedirler (Finsterer et al. 2005). Çok genli kalıtım ise kromozomal anomaliler ve
oligogenik kalıtım olarak iki gruba ayrılmaktadır (Nance 2003).
Son olarak işitme kayıpları fenotipe yansımasına göre sendromik işitme kayıpları (%3040) ve sendromik olmayan işitme kayıpları (%60-70) olarak iki ana sınıf altında
incelenmektedir.
11
2.4.1. Sendromik İşitme Kaybı
Sendromik işitme kaybı; işitme kaybına bir veya daha fazla doku veya organda bulunan
patolojik bulguların eşlik etmesi durumudur. Bunlar böbrek, iskelet, göz ve pigment
anomalileri gibi bulgulardır. Sendromik işitme kayıpları otozomal resesif, otozomal
dominant, X’e bağlı veya mitokondrial kalıtım gösterebilmektedir. Bu sendromlar arasında
en sık görülenleri Waardenburg Sendromu, Usher Sendromu, Alport Sendromu ve
Brankio-Oto-Renal (BOR) Sendromudur (Hone and Smith 2003). Bunların dışında Norrie
Sendromu, Jervell&Lange-Nielsen Sendromu (JLNS), Stickler Sendromu, Pendred
Sendromu da örnek olarak verilebilir (Nance 2003).
Bazı mitokondrial mutasyonlar da işitme kaybı ile birlikte seyreden sendromlara yol
açabilmektedir. Bu sendromlar arasında; Kearns-Sayre Sendromu, Pearson Sendromu,
MELAS
(Myoclonic
Epilepsi,
Lactic
Acidos,
Stroke-like
episodes),
MERRF
(Mitokondrial Encephalomyopathy with Ragged Red Fibers), Leber’in kalıtsal optik
nöropatisi (LHON) sayılabilir (Kokotas et al. 2007).
2.4.2. Sendromik Olmayan İşitme Kaybı
Bu grup, genetik nedenli işitme kayıplarının büyük bir kısmını (yaklaşık %70)
oluşturmaktadır. Sendromik olmayan işitme kaybına; kulak ve vestibüler sistem
hastalıkları dışında başka klinik veya laboratuvar bulgusu eşlik etmemektedir. Sendromik
olmayan işitme kaybı; otozomal resesif (%70-80), otozomal dominant (%10-20), X’e bağlı
(%1-2) ve mitokondrial (%0-20) olarak kalıtım göstermektedir (Nance 2003). Ülkemizde
akraba evliliğinin yüksek oranda olması ve ailelerin belli bölgelerde izole olarak
yaşamaları nadir görülen otozomal resesif işitme kaybı yapıcı genlerin sıklığını
arttırmaktadır. Bu nedenle bu oranlar ülkemizde %93.4 otozomal resesif ve %6.6
otozomal dominant olarak değişiklik göstermektedir (Tekin et al. 2007).
Sendromik olmayan işitme kaybına neden olan gen lokusları “DFN” şeklinde
gösterilmektedir. DFNA otozomal dominant, DFNB otozomal resesif, DFN ise X’e bağlı
kalıtım gösteren lokusları ifade etmek için kullanılmaktadır (Willems 2000).
12
Bazı genlerdeki mutasyonlar hem sendromik hem de sendromik olmayan işitme kaybına
neden olmaktadır. Bunlara CDH23 (Usher sendromu Tip1), COL11A2 (Sticker sendromu
Tip3, Osmed sendromu), DSPP (Dentinogenesis imperfecta), GJB2 (Palmoplantar
keratoderma ve işitme kaybı, Vohwinkel’s sendromu, KID), MYO7A (Usher sendromu
Tip1B), SLC26A4 (Pendred sendromu), USH1C (Usher sendromu Tip1C), GJB6,
PCDH15 örnek olarak verilebilir (Bolz et al. 2001, Finsterer et al. 2005).
Konneksin 26 (GJB2) geni, sendromik olmayan işitme kaybı nedeni olan genler içinde en
önemli yeri tutmaktadır. Birçok toplumda bu gendeki mutasyonların genetik nedenli işitme
kaybının %50’sini oluşturduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir (Bitner-Glindzicz 2002).
Bu gende bulunan c.35delG mutasyonu, Kuzey Amerika, Avrupa ve Akdeniz’de rastlanan
en sık mutasyon (Cohn and Kelley 1999, Gasparini et al. 2000, Green et al. 1999). Bugüne
kadar bu gen içinde 100’den fazla mutasyon bildirilmesine rağmen c.35delG mutasyonu
beyaz ırkta tüm mutasyonların yaklaşık %60-70’ini kapsamaktadır. Bu mutasyonun
taşıyıcılık sıklığı sağlıklı Türk toplumunda %1.8, Avrupa toplumunda ise %2-4 arasında
bulunmuştur (Gasparini et al. 2000, Tekin et al. 2001a). Türk toplumundaki işitme kayıplı
bireylerde GJB2 mutasyonlarının konjenital veya prelingual sendromik olmayan işitme
kayıplı olguların yaklaşık %20’sinden sorumlu olduğu yapılan çalışmalarda gösterilmiştir
(Baris et al. 2001, Tekin et al. 2001a, Tekin et al. 2005, Tekin et al. 2003b, Uyguner et al.
2003). Genetik nedenlerin sıklığı ve dağılımı neredeyse her toplumda farklılık
göstermektedir.
Mitokondriyal DNA’daki 12SrRNA geninde bulunan A1555G mutasyonunun sıklığı ise
Türk toplumundaki işitme kayıplı bireylerde yapılan çalışmada %1.8 bulunmuştur (Tekin
et al. 2003a).
İç kulağın anatomik yapısının karmaşık olması ve işitme mekanizmasında birçok proteinin
görev alması nedeni ile işitme kaybına neden olan genler çok fazladır. Bugüne kadar 25
tane otozomal dominant, 39 tane otozomal resesif ve 3 tane X’e bağlı kalıtım gösteren
genlerdeki mutasyonların sendromik olmayan işitme kaybı yaptığı gösterilmiştir (Şekil
2.7).
13
Şekil 2.7. İşitme kaybı yaptığı tanımlanmış olan genler ve genomik lokalizasyonları
(Dror et al. 2010’dan değiştirilerek alınmıştır.)
14
2.4.2.1.
Sendromik Olmayan Otozomal Resesif Lokusların Tanımlanması
Sendromik olmayan işitme kayıplarının genetik nedenlerini araştırmak bazı sebeplerden
dolayı güçlük göstermektedir. Bunlardan ilki iç kulağın karmaşık yapısında görev alan
proteinlerin çok sayıda olması ve bunlardan herhangi birindeki bir sorunun işitme kaybıyla
sonuçlanabilmesidir. Bugüne kadar 68 gendeki mutasyonların sendromik olmayan işitme
kaybına neden olduğu tanımlanmıştır (http://hereditaryhearingloss.org/). İkinci sorun ise
tanı koyma güçlüğüdür. Sendromik olmayan işitme kaybına sahip ailelerde herhangi bir
fenotipik bulgu gözlenmediğinden bu aileleri gruplara ayırmak neredeyse imkansızdır. Bu
gibi sorunlar uzun yıllar işitme kaybının genetik özelliklerinin aydınlatılmasına engel
olmuştur.
Ancak Orta Doğu ülkelerinde akraba evliliğinin olduğu geniş, işitme kayıplı ailelerle
yapılan araştırmalarda genom boyu bağlantı analizi yöntemiyle sağırlık gen lokusları
tanımlanmaya başlanmıştır.
Bugüne kadar sendromik olmayan otozomal resesif işitme kaybına sebep olan 46 tane
lokus haritalanmıştır. Bu lokuslar ve genomik lokalizasyonları Çizelge 2.1’de
gösterilmektedir.
15
Çizelge 2.1. Sendromik olmayan otozomal resesif işitme kaybı genleri/lokusları ve
genomik lokalizasyonları (http://hereditaryhearingloss.org/)
Lokus
Gen
Kromozom
Kromozomal
Lokalizasyon-hg19
Referans
DFNB1A
CDH23
10
73571640-73575702
DFNB1B
GJB6 (Cx30)
13
20796102-20806534
(del Castillo et al. 2002)
DFNB2
MYO7A
11
76839310-76914262
(Liu et al. 1997, Weil et al. 1997)
DFNB3
MYO15A
17
18057368-18060852
(Wang et al. 1998)
DFNB4
SLC26A4
7
107333777-107358250
DFNB6
TMIE
3
46742823-46752413
(Naz et al. 2002)
(Kurima et al. 2002)
DFNB7/11
TMC1
9
75242837-75451267
DFNB8/10
TMPRSS3
21
117947753-117990554
DFNB9
OTOF
2
26725168-26739467
DFNB12
GIPC3
19
3585569-3593538
(Kelsell et al. 1997)
(Li et al. 1998)
(Scott et al. 2001)
(Yasunaga et al. 1999)
(Bork et al. 2001)
STRC
15
44005856-44020948
DFNB16
USH1C
11
17515443-17565963
(Ain et al. 2007, Charizopoulou et al. 2011, Rehman
et al. 2011)
(Verpy et al. 2001)
DFNB18
GJB2 (Cx26)
13
20761606-20767114
(Ahmed et al. 2002, Ouyang et al. 2002)
DFNB21
TECTA
11
120973375-121061513
DFNB22
OTOA
16
21716290-21772049
(Zwaenepoel et al. 2002)
DFNB23
PCDH15
10
55580860-56561051
(Ahmed et al. 2003b)
DFNB24
RDX
11
110066287-110167437
DFNB25
GRXCR1
4
42895284-43032673
(Schraders et al. 2010)
DFNB28
TRIOBP
22
38153620-38172562
(Riazuddin et al. 2006, Shabbir et al. 2006)
DFNB29
CLDN14
21
37832920-37948867
(Wilcox et al. 2001)
DFNB30
MYO3A
10
26224673-26501465
(Walsh et al. 2002)
DFNB31
WHRN/DFNB31
9
117240601-117267730
(Mburu et al. 2003)
DFNB35
ESRRB
14
76837690-76968178
(Collin et al. 2008)
DFNB36
ESPN
1
6508103-6521003
DFNB37
MYO6
6
76527218-76629254
(Ahmed et al. 2003a)
DFNB39
HGF
7
81380217-81399452
(Schultz et al. 2009)
DFNB42
ILDR1
3
121706171-121741030
DFNB49
MARVELD2/TRICELLULIN
5
68710943-68737888
DFNB53
COL11A2
6
33130469-33160245
DFNB59
PJVK/MIR548N
2
179316163-179326107
DFNB63
LRTOMT/COMT2
11
71791382-71821827
(Ahmed et al. 2008, Du et al. 2008)
DFNB15/72/95
(Mustapha et al. 1999)
(Khan et al. 2007)
(Naz et al. 2004)
(Borck et al. 2011)
(Riazuddin et al. 2006)
(Chen et al. 2005)
(Delmaghani et al. 2006)
DFNB66/67
LHFPL5
6
35773071-35791852
DFNB73
BSND
1
55464617-55474464
(Kalay et al. 2006, Shabbir et al. 2006, Tlili et al.
2005)
(Riazuddin et al. 2009)
DFNB74
MSRB3
12
65672488-65860680
(Ahmed et al. 2011, Waryah et al. 2009)
DFNB77
LOXHD1
18
44109140-44135334
DFNB79
TPRN/C9orf75
9
140086069-140095163
DFNB82
GPSM2
1
109419603-109476957
DFNB84
PTPRQ
12
71031862-71148539
(Schraders et al. 2010)
DFNB91
SERPINB6
6
2948394-2972399
(Sirmaci et al. 2010a)
16
(Grillet et al. 2009)
(Li et al. 2010, Rehman et al. 2010)
(Walsh et al. 2010)
2.5. Strateji
Bugüne kadar yapmış olduğumuz çalışmalardaki amacımız, elimizde bulunan otozomal
resesif sendromik olamayan işitme kayıplı ailelerde işitme kaybına sebep olan genleri
açığa çıkarmaktır. Sendromik olmayan işitme kaybından sorumlu genlerin sayısının
çokluğu ve bu genlerin birçoğunun çok sayıda ekzondan oluştuğu düşünüldüğünde,
elimizdeki herhangi bir ailede işitmeden sorumlu genin bulunması neredeyse imkansız
hale gelmektedir. Ancak elimizde bulunan ailelerin yapısı, otozigozite haritalaması
yönteminin kullanılmasını mümkün kılarak sorumlu genetik değişikliklerin hangi lokusta
olduğunu belirlememize imkan sağlamaktadır.
Bu tez çalışmasında, çalışmalarımız kapsamındaki elimizde otozigozite haritalaması
sonucunda herhangi bilinen bir işitme kaybı geni lokusuna bağlantı göstermeyen 23
aileden üç ailede, işitme kaybına sebep olan sorumlu genetik değişikliğin tüm ekzom
sekanslama yöntemi kullanılarak saptanması amaçlanmıştır.
Bu amaç kapsamında öncelikle tüm genom tek nükleotid polimorfizmi genotiplemesi
yöntemi kullanılmıştır. Bu yöntem iki amaçla kullanılmaktadır. Öncelikli amacı bilinen
herhangi bir işitme kaybı genine bağlantı gösteren ailelerin elenmesidir. Ardından
herhangi bir işitme kaybı genine bağlantı göstermeyen aileler için otozigozite haritalaması
yardımıyla aday lokusların belirlenmesi amacı ile kullanılmıştır. Otozigozite haritalaması
sonucunda elde edilen 1 Mb’dan büyük olan otozigot bloklar öncelikli olarak ele
alınmıştır. Ancak bu bloklar içerisinde, blokların büyüklüğüne bağlı olmakla birlikte
yüzlerce gen bulunmaktadır. Bu genlerinde çok sayıda ekzonu olduğu düşünülürse, bu
genlerin hepsini klasik DNA dizi analizi yöntemi ile tarayarak aday genin tanımlanması
imkansız bir hal almaktadır. Bu sebeple ailelerdeki işitme kaybından sorumlu genetik
değişikliği tespit etmek amacı ile tüm ekzom sekanslama yöntemi kullanılmıştır. Bu
yöntemden elde edilen veride otozigozite haritalamasında elde edilen otozigot bloklar
içerisinde bulunan varyantlar öncelikli olarak dikkate alınmıştır.
Otozigot bloklarla kısıtlanmış bir alana sahipken sadece bu bölgelere özgü “Custom
Capture” (istenilen bölgelere özgü dizayn edilen yeni nesil sekanslama yöntemi) yöntemi
kullanmak yerine tüm ekzom sekanslama analizi yapılmasının birtakım nedenleri
bulunmaktadır. Bunlardan bir tanesi çalışmamız dahilindeki her ailede birden fazla sayıda
ve farklı genomik lokalizasyonlarda otozigot blok bulunmaktadır. Ayrıca çalışmalarımız
17
kapsamında sürekli topladığımız yeni ailelerin örneklerinden, otozigozite haritalaması
bakımından, aynı zamanda sonuç elde etmek imkansızdır. Bu koşullar altında her aileye
özgü bir kit dizayn edilmesi hem imkansız hem de maddi yönden anlamsız bir masraftır.
Biz bu amaçla piyasada hazır bulunan tüm ekzom sekanslama kitlerini kullanılması tercih
edilmektedir. Böylelikle elimizdeki aileye özgü çok daha geniş çaplı bir bilgiye sahip
olunmaktadır ve gerekli durumlarda otozigot bölgelerin dışında bulunan varyantları da
analiz etme imkanı sağlamıştır.
Şekil 2.8. Strateji
18
2.6. Moleküler Teknikler
2.6.1. Polimeraz Zincir Reaksiyonu
İlk kez 1985 yılında Kary Mullis tarafından geliştirilmiş olan bu yöntem; DNA üzerindeki
özgün bir bölgenin in-vitro ortamda enzimatik olarak çoğaltılması sağlamaktadır. Bu
yöntem bir polimeraz enzimiyle gerçekleştirildiği için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
adını almaktadır (Akar 1999). Metod basitçe tüp içerisinde nükleik asitlerin uygun
koşullarda çoğaltılması esasına dayanır ve bir çeşit "in vitro klonlama" olarak da
tanımlanmaktadır. Yöntem az miktarda DNA örneği ile çalışma imkanı sağlamaktadır ve
bu sayede moleküler biyoloji, adli tıp, evrim çalışmaları ve pek çok alanda tercih edilen en
önemli moleküler tekniklerden biridir.
PCR yani istenilen bir bölgenin amplifikasyon reaksiyonu üç temel basamaktan
oluşmaktadır. Bunlar, DNA’nın çift zincirli olan yapısının 94-98 °C aralığındaki yüksek
ısıda birbirinden ayrılması yani denatürasyon, 37-65 °C aralığındaki bir ısıda sentetik
oligonükleotidlerin hedef DNA’ya bağlanması yani hibridizasyon, son olarak 72 °C’de
ısıda gerçekleşen zincirin uzaması yani polimerizasyon basamaklarıdır. Bu üç basamak bir
PCR döngüsü olarak adlandırılır ve döngü sayısı çoğaltılmak istenen bölgenin özelliğine
bağlı olarak genellikle 30-40 arasında değişmektedir. İşlem sonrasında elde edilecek ürün
miktarı bu döngünün tekrar sayısına bağlıdır. Bir PCR işleminde “n” döngü sonunda kalıp
DNA’nın istenilen bölgesi yaklaşık olarak 2n kez çoğaltılmış olur.
Birinci basamakta, çift zincirli halde bulunan kalıp DNA’nın 90-95 °C’de %GC oranına
ve uzunluğuna bağlı olarak yaklaşık 5-10 dakika süreyle ısıtılarak tek zincirli hale gelmesi
sağlanır. Ardından sıcaklık 37-65 °C arasında bir sıcaklık değerine düşürülür ve kalıp
DNA’nın çoğaltılmak istenilen bölgesine komplementer olan oligonükleotidlerin tek
zincirli DNA'ya özgül olarak bağlanması sağlanır. Bu oligonükleotidler kalıp DNA’nın
sentezi için başlangıç noktası olarak görev yaparlar. DNA sentezi aşaması için gerekli olan
sıcaklık, kullanılan enzimin aktivasyon sıcaklığıdır ve bu değeri 70-75 °C arasındaki
değişmektedir. PCR reaksiyonu için kullanılan polimeraz enzimi Thermus aquaticus’dan
izole edilen ısıya dayanıklı Taq polimeraz enzimidir. Enzim, yüksek ısılarda iyi çalışması
ve hızlı DNA sentezi yapması nedeni ile tercih edilmektedir. Bu enzim için kullanılan
optimum sıcaklık 72 °C’dir. Polimeraz enzimi, hibridizasyon aşamasında kalıp DNA’ya
bağlanan oligonükleotidleri başlangıç olarak kullanır ve ortamda bulunan deoksinükleotid
19
trifosfatları (dNTP) oligonükleotidlerin 3’ ucuna ekleyerek hedef DNA'nın iki zincirli
kopyasını oluşturur (Öner 2002).
PCR’dan elde edilecek sonuç birçok faktöre bağlıdır. Bu faktörler; reaksiyonun pH’ı,
kullanılan oligonükleotidlerin hedef DNA’ya olan spesifikliği, sıcaklık değerleri ve
reaksiyon için gerekli olan diğer kimyasal maddelerin konsantrasyonlarıdır.
Taq polimerazın düzgün çalışabilmesi için, etkin olduğu pH değerinin tüm reaksiyon
boyunca sabit olması gerekmektedir. Bu amaçla reaksiyonlarda son konsantrasyonu 10
mM olacak şekilde TrisHCl (pH: 8.4) çözeltisi tampon olarak kullanılmaktadır. Ayrıca
çözeltide bulunan 50-60 mM düzeyinde K+ ve 100 μg/ml jelatinin istenilen DNA
bölgesinin çoğaltılma işlemini önemli ölçüde arttırdığı saptanmıştır (Öner 2002).
Hedef DNA bölgesini çoğaltmak amacı ile kullanılan oligonükleotidlerin kalıp DNA’ya
bağlanma sıcaklığı değişiklik göstermektedir. Bu değer oligonükleotidlerin nükleotid
konsantrasyonlarına bağlıdır ve hesaplanan uygun sıcaklık değeri PCR spesifikliğini
arttırmaktadır. Bu sıcaklık değeri kabaca 4(G+C)+2(A+T) formülüyle hesaplanır.
Kullanılan oligonükleotidlerin seçimi PCR işlemi için çok önemlidir. Kullanılan
oligonükleotidlerin uzunlukları da spesifikliği etkileyen diğer bir unsurdur ve optimal
uzunlukları yaklaşık 15-30 nükleotid arasında olmalıdır (Öner 2002). Oligonükleotid
dizisinin, çoğaltılması hedeflenen DNA bölgesine özgü olması gerekmektedir. Aksi
taktirde spesifik olmayan bağlanmalar ile istenilen bölge dışındaki benzer bazı bölgelerin
de çoğaltılması gerçekleşebilir. Ayrıca, kullanılan oligonükleotid çiftinin uç ve orta
bölgelerinde birbirine uygunluk gösteren bazların bulunmamasına dikkat edilmelidir; aksi
takdirde oligonükleotidin uç bölgeleri birbiri üzerine kıvrılarak ya da uygunluk gösteren
bölgeler birbirine bağlanarak PCR’ın olumsuz olarak etkilenmesine neden olur.
Oligonükleotidlerin nükleotid içerikleri de rastgele ancak orantılı olmalıdır. Tekrarlayan
bazlar içermemesi ve guanin-sitozin nükleotidlerinin oranının %50’yi geçmemesi
gerekmektedir (Öner 2002).
Reaksiyonun gerçekleşmesi için gerekli bir diğer kimyasal dNTP’lerdir. Reaksiyon
içerisindeki son konsantrasyonları dNTP başına 2 mM olacak şekilde kullanılmalıdır.
Reaksiyon sırasında ortamda dTTP, dCTP, dATP ve dGTP’nin konsantrasyonlarının eşit
olması doğru ürün elde edilmesi açısından önemlidir. dNTP’nin az miktarda kullanımı
oluşan PCR ürününün miktarının azalmasına; fazla miktarda kullanımı yanlış
20
oligonükleotid eşleşmesi sonucu hedef DNA dışındaki bölgelerin çoğalmasına neden olur
(Öner 2002).
Mg++, Taq polimerazın çalışmasını sağlayan en önemli faktör olup pozitif yükü sayesinde,
negatif yüklü DNA molekülü arasına girerek oligonükleotidlerin DNA molekülüne
bağlanmasını kolaylaştırır. Fazla Mg++ miktarı enzimin spesifikliğini azaltırken, az
miktarda olması enzimin aktivitesini düşürür ve enzimin inaktive olmasına neden olur
(Akar 1999).
2.6.2. Restriksiyon Endonükleaz Enzimleriyle Kesim
Restriksiyon endonükleazlar çift zincirli DNA’yı belirli nükleotid dizilerinden tanıyarak,
her iki zinciri birlikte kesen bir enzim türüdür (Geiger et al. 1993). Bakteri hücrelerinde
bulunan bu enzimler hücre içerisine giren yabancı DNA'ları (viral DNA) keserler. Bakteri
hücresinin kendi DNA'sı ise bu enzimlerin etkinliğinden korunmak için bir metilaz enzimi
tarafından metillenir (Kobayashi et al. 2001). Böylelikle bu enzimler, dışarıdan bakteriye
giren yabancı genetik materyalleri ayrıştırarak mutasyonları engellemek ve türlerin genetik
yönden stabilitesini korumakta rol oynarlar (Akar 1999, Klug et al. 2000).
Restriksiyon endonükleaz enzimleri adlandırılırken izole edilen prokaryotun cins isminin
ilk harfi ve tür isminin ilk iki harfi kullanılır (Kaynak: Desulfolobus desulfiricans, RE
enzimi: Dde I).
Restriksiyon endonükleazlar DNA’yı spesifik dizilerinden tanırlar ve her iki DNA
zincirini şeker-fosfat omurgasından kırarlar. DNA’yı sadece belirli bölgelerinden
parçalama özelliklerinden dolayı klonlama tekniği için çok önemlidirler. Tanıma dizileri
çoğu restriksiyon enzimi için DNA zincirinin her iki iplikçiğinde de aynıdır ve bu diziler
“palindromik diziler” olarak adlandırılır (Akar 1999, Klug et al. 2000). Bu diziler 4-8
nükleotid uzunluğundadır. Bu enzimler iki çeşit kesme işlemi gerçekleştirirler. Enzimlerin
yaptığı bu kesim işlemleri sonrasında "yapışkan" veya "küt" uçlar meydana gelir.
İzoşizomerler ise; farklı mikroorganizmalardan elde edilip, DNA üzerinde aynı diziyi
tanıyıp kesim yapan restriksiyon endonükleazlardır (Akar 1999, Klug et al. 2000).
21
Restriksiyon endonükleazlar; bileşenleri, kofaktörleri, hedef dizilerin özellikleri gibi
etkenlere bağlı olarak dört grupta kategorize edilirler (Williams 2003). Bunlar;

Tip I restriksiyon endonükleazlar; ilk keşfedilen gruptur ve E. coli’nin iki farklı
suşuna (K-12 ve B) özgüdürler (Murray 2000). Adenozin trifosfat ve Mg++ bu
enzimlerin kofaktörü olarak görevi alırlar (Dryden et al. 2001). Bu enzimlerin
tanıma bölgeleri asimetriktir ve 6-8 nükleotitlik bir boşlukla ayrılan iki kısımdan
oluşur ancak enzimler tanıma bölgelerinden en az 1000 baz çifti uzaklıktaki
bölgeleri keserler.

Tip II enzimler; tip I enzimlerden birkaç yönden farklıdır. Tek tip proteinden
oluşmuş dimer yapıya sahiptirler; tanıma bölgeleri genelde bölünmüş değildir,
palindromiktir ve 4-8 nükleotit uzunluktadır. Tip I enzimlerin aksine DNA'yı
tanıdıkları ve kestikleri yer aynıdır; etkinlikleri için ATP veya AdoMet'e gerek
göstermezler, kofaktör olarak genelde sadece Mg2+ gereksinimleri vardır (Williams
2003).

Tip III restriksiyon enzimleri; birbirine dönük olan iki ayrı, palindromik olmayan
dizi tanırlar. DNA'yı tanıma yerinden 20-30 baz uzakta keserler (Rao and Mitchell
2001). DNA metilasyonu için AdoMet, DNA restriksiyonu için ATP kofaktörlerine
ihtiyaç duyarlar (Meisel et al. 1992).

Tip IV restriksiyon enzimleri; ise sadece metillenmiş DNA'yı keser ve bu kesim
için Mg++ ve GTP’yi kofaktör olarak kullanırlar.
22
2.6.3. DNA Dizi Analizi
DNA dizi analizi ya da sekanslama DNA'nın nükleotid dizisinin saptanması amacıyla
kullanılan moleküler bir tekniktir. DNA dizilerinin bilinmesi temel biyoloji, biyoteknoloji,
adli bilim, tıbbi tanı koyma gibi pek çok alanda kullanılmaktadır. DNA dizilemesi
biyolojik araştırma ve keşifleri çok hızlandırmıştır. Modern DNA dizileme teknolojilerinin
imkanları ile geliştirilen hızlı DNA dizileme teknikleri sayesinde İnsan Genom Projesi
kapsamında tüm insan genomu dizilenmiştir. Benzer projelerle pek çok hayvan, bitki ve
bakteri genomunun tam dizisi elde edilmiştir.
1970'lerin başlarında DNA dizilenmesi amacıyla iki yöntem geliştirilmiştir. Bunlar 1973'te
Gilbert ve Maxam ardından da 1975'te Sanger ve arkadaşlarının geliştirdiği yöntemlerdir
(Gilbert and Maxam 1973, Sanger and Coulson 1975). Sanger ve arkadaşları tarafından
geliştirilen zincir sonlandırma yöntemi göreceli olarak daha kolay ve güvenilir olmasından
dolayı kısa süre içerisinde en tercih edilen yöntem olmuştur.
Allan Maxam ve Walter Gilbert tarafından geliştirilen yöntem, DNA'nın kimyasal
modifikasyonu ve ardından spesifik bazlardan kesilmesi esasına dayanmaktadır (Maxam
and Gilbert 1977). Dizisi saptanacak DNA fragmentinin, komplementer zincirleri ayrılır
ve zincirlerden sadece biri kullanılır. Bu yöntem DNA'nın 5' ucunun polinükleotid kinaz
enzimi kullanılarak 32P ile radyoaktif olarak işaretlenmesini, ardından da dizilenecek DNA
fragmentinin saflaştırılmasını gerektirir. Sonraki aşamada, her birinde bazlardan biri için
kimyasal kesimin meydana geldiği dört ayrı reaksiyon karışımı hazırlanır. Dört farklı
kimyasal reaksiyonda (G, A+G, C, C+T) uygulanan kimyasal işlemlerle, DNA'yı oluşturan
dört nükleotit bazdan biri veya ikisinde kesikler meydana gelir. Modifiye olmuş DNA'lar,
sonra sıcak piperidin ile modifiye olmuş bazların pozisyonunda kesilir. Modifikasyon
yapan kimyasalların konsantrasyonu ayarlanarak DNA molekülü başına ortalama bir
modifikasyon olması sağlanır. Sonuçta, kırıldığı noktaya göre, hepsi 5’ ucundan işaretli
ancak boyları farklı bir dizi parçacık elde edilir. Dört reaksiyonda meydana gelen
fragmentler daha sonra uzunluklarına göre elektroforetik olarak ayrılacakları poliakrilamid
jel üzerinde, yan yana dört paralel kuyuya yüklenir. DNA parçacıklarının uçları radyoaktif
olarak işaretli olduğu için otoradyografi yöntemiyle bantlar görüntülenir (Akar 1999,
Lüleci 2000, Öner 2002).
23
Fred Sanger ve arkadaşlarının geliştirdiği ikinci yöntemde ise, belirli bir bazda sonlanan
bir DNA zincir sentezi gerçekleştirilmektedir (Öner 2002). Bu nedenle yöntem zincir
sonlandırma yöntemi olarak da adlandırılmıştır. Maxam ve Gilbert yöntemine göre daha
verimli çalıştığı, daha az toksik kimyasal içerdiği ve radyoaktivite gerektirmediği için kısa
sürede yaygınlaşarak daha çok tercih edilir hale gelmiştir. Böylece 30 yıl boyunca
kullanılan tek DNA sekanslama yöntemi olmuştur. Dizisi saptanacak DNA zinciri yeni
sentezlenecek DNA zinciri için kalıp olarak kullanılır. Sentez reaksiyonu DNA polimeraz
enzimi ile kataliz edilir. Reaksiyon karışımı; dizisi belirlenecek DNA örneği, polimeraz
enzimi, oligonükleotid, dört farklı dNTP, dört farklı ddNTP ile enzimin çalışması için
tampon görevi görecek olan kimyasallardan oluşmaktadır. Reaksiyon; PCR’da olduğu gibi
denatürasyon, DNA’ya bağlanma ve uzama basamaklarından oluşan belirli sayıdaki
siklusların tekrarlanmasıyla gerçekleştirilir (Akar 1999). Yöntemde kullanılan ddNTP’ler,
dNTP’lerin aksine 3’ ucunda hidroksil (OH) grubu içermezler. Bu moleküller, yeni
sentezlenen DNA’ya eklendiklerinde 3’-OH grubu taşımadıkları için kendilerine nükleotid
ilavesi gerçekleşmez ve zincir sentezi sonlanarak bir DNA parçacığı elde edilir. Deneyde,
dört reaksiyon karışımı hazırlanır. Her bir reaksiyon karışımı; kalıp DNA zinciri, uygun
primer, nükleotid trifosfatların dördü ve az miktarda radyoaktif ddNTP’den sadece birini
içermektedir. Zincir sonlanması için dört reaksiyon tüpünde farklı bir ddNTP bulunur.
Elektroforez sonrası DNA bantları otoradyografi ile görüntülenir. Bu bantlar yukarıdan
aşağıya doğru (boyu küçük olan fragmentten büyük olana doğru) okunarak DNA dizisi
saptanır (Akar 1999, Öner 2002).
Günümüzde DNA dizi analizi için; elektroforez yerine otomatik cihazlar ve radyoaktif
izotoplar yerine de floresan boyalar kullanılmaktadır (Öner 2002). Bu sayede reaksiyon
tek bir tüpte hazırlanabilmektedir. Sistem, üzerindeki lazer ışığı ile farklı özellikteki
floresan boyaları algılar, her nükleotid için ayrı renkte bir pik oluşturarak nükleotid
dizisini belirler.
24
2.6.4. Genom Boyu Tek Nokta Polimorfizm Genotiplemesi (DNA Mikrodizin
Analizi)
Bu teknik; moleküler biyoloji ve biyoinformatik çalışmalarında, bir popülasyondaki
SNP’leri ve sıklıklarını tanımlamak amacı ile kullanılmaktadır. SNP’ler DNA üzerindeki
tek nokta değişimleridir ve genom boyunca en sık görülen varyantlardır. Örneğin insan
genomunda bugüne kadar yaklaşık 10 milyon SNP tanımlanmıştır. Bu varyasyonlar
evrimsel süreç içerisinde popülasyonlarda yüksek oranda korunmuşlardır, bu nedenle SNP
haritaları, araştırmalar için genotipik marker olarak kullanılmaktadır (Barnes et al. 2003).
Bu teknoloji; temeli Northern ve Southern blot tekniklerine dayanan bir tekniktir.
Oligonükleotidlerin veya cDNA parçalarının basit bir çip üzerinde yüksek yoğunlukta yan
yana dizilmeleri ile ortaya çıkmıştır. Yöntemin temeli baz eşleşmesi yani hibridizasyona
dayanmaktadır.
Tek
zincirli
işaretlenmiş
DNA
molekülü
çipin
üzerindeki
oligonükleotidlere bağlanmakta ve cihazdaki okuma işlemi sırasında ışıma yapmaktadır.
Bu ışımalar değerlendirilerek örneğin genotiplendirilmesi yapılmaktadır (Maskos and
Southern 1992, Maskos 1993).
Kullanılan çipler, 20-80 bç uzunluğundaki oligonükleotidlerin önce sentezlenip sonra çip
yüzeyine sabitlenmesi veya doğrudan çip üzerinde sentezlenmesi (fotolitografi) ile üretilir.
Yüzeye tutturulan bu DNA parçaları prob olarak tanımlanmaktadır.
DNA mikroarrayler; cam, plastik veya silikon gibi katı bir yüzey üzerine belirli
pozisyonlarda sıralı bir şekilde oluşturulmuş binlerce farklı gen sekanslarının immobilize
edildiği mikroskobik DNA spotlarıdır.
Affymetrix firması tarafından genom boyunca SNP taraması yapmak için Mapping 10K
2.0 Array, Mapping 50K Array, Mapping 100K Array , Mapping 500K Array, GenomeWide Human SNP Array 5.0 ve Genome-Wide Human SNP Array 6.0 çipleri
geliştirilmiştir. Bu alanda çip üreten diğer bir firma ise Illumina®’dır. Illumina®
HumanHap300 ile 317.000 SNP, Illumina® HumanHap550 ile 550.000 SNP, Illumina®
HumanHap650Y ile 650.000 SNP, Illumina® 1M ile 1.000.000 SNP taranabilmektedir.
25
Günümüzde yaygın bir kullanım alanına sahip olan ve bu tez çalışmasında da kullanılan
Genome-Wide Human SNP Array 6.0 çipleri sayesinde genom boyunca 1.8 milyon
genomik belirteç taranabilmektedir. Çipin içeriğinde, yaklaşık 906,600 adet SNP ve
yaklaşık 946,000 adet kopya sayısı (copy number-CN) probu bulunmaktadır. 906.600
SNP’in; 494,000 tanesi Affymetrix 5.0 çipi SNP’leri geri kalana 424,000 SNP Tag SNP,
X ve Y kromozomu SNPleri, mitokondriyal SNPler, SNP veri tabanlarına yeni eklenmiş
SNP’ler, rekombinasyon hot spot noktası SNP’leridir. 946,000 kopya sayısı problarının
içeriğini ise “Toronto Database of Genomic Variants” veri tabanı tarafından belirlenen
5,677 CNV bölgesinde bulunan 202,000 prob, genoma boyunca eşit aralıklarda dağılmış
744,000 prob ve özel olarak seçilmiş bazı problar oluşturmaktadır.
Affymetrix firmasının önerdiği protokole göre genomik DNA iki spesifik restriksiyon
enzimiyle kesilerek parçalara ayrılmaktadır. Kesimden elde edilen parçalar ligasyon
işlemine tabi tutularak parçaların uçlarına adaptör bağlanmaktadır. Adaptörün dizisini
tanıyan tek bir primer ile PCR yapılarak 250-1000 bç aralığında ürünler elde edilmektedir.
Bu ürünler biyotin ile işaretlenir ve çip ile hibridize edilmektedir. Çip bundan sonra
yıkama, streptavidin phycoerythin ile boyama ve tarama işlemlerinin yapılacağı cihaza
yerleştirilir. Lazer ile yapılan taramada, çipin üzerindeki proba bağlanmış olan floresan
işaretli moleküller ile biyotinle işaretli ürünler birbirine bağlanınca ışıma yaparlar. Array
tarayıcının amacı, komplementer noktalara bağlanan probun yaydığı ışını tespit etmektir.
SNP çipleri; genetik çeşitlilikten ve genetik hastalıklara yatkınlıktan sorumlu olduğu
düşünülen tek nükleotid polimorfizmlerini belirlemede, adli tıp çalışmalarında, ya da DNA
temelli ilaç adaylarının tanımlanmasında kullanılabilmektedir. SNP mikroarrayleri ayrıca
kansere neden olan somatik mutasyonların, özellikle de heterozigozite kaybının ya da
DNA
bölgelerinin
artan
ya
da
kaybedilen
profillerinin
belirlenmesinde
de
kullanılmaktadır.
Çiplerin bir diğer yaygın kullanım amacı ise, çalışılan hastalıkla bağlantılı aday gen
lokuslarını belirlemek amacıyla uygulanan genetik haritalama için veri üretmektir. Bu
çiplerle hastalığın hangi kromozomda ya da hangi aday gen ile ilişkili olacağı göz önünde
bulundurulmaksızın, genom belirli aralıklarla taranır. Böylelikle istatistiksel olarak
anlamlı sonuç veren potansiyel lokusların tespiti ile taranacak bölgeler daraltılmış olur.
26
2.6.5. Genetik Haritalama ve Bağlantı Analizi
Genetik haritalama işlemi, farklı moleküler biyolojik yöntemleri teknik olarak
kullanmakla birlikte temel olarak istatistiksel bir analizdir. Gen haritalama çalışması
yapabilmek için kuşaklar arası kalıtımı izleyebileceğimiz ailelere ihtiyaç vardır.
Haritalamada kullanılacak metoda karar vermek için çalışılacak aile/ailelerin kalıtım
şeklinin saptanması gerekmektedir. Gen haritalaması için kullanılan parametrik metod,
bağlantı (Linkage) analizidir.
Bağlantı (linkage); aynı kromozom üzerindeki birbirine yakın olan allellerin, tek bir birim
olarak mayoz bölünme sırasında birlikte aktarılma eğilimidir. Genetik bağlantı analizi ise
iki genin bir nesilden diğerine aktarılırken bağlantı gösterip göstermediklerini saptamak
amacıyla kullanılan bir gen haritalama metodudur. Herhangi iki lokus için heterozigot olan
bir insan (ebeveyn genotipi AB ve ab); rekombinant olan lokuslar bakımından Ab veya
aB, rekombinant olmayan lokuslar bakımından AB veya ab genotipine sahip olacaktır
(Şekil 2.9).
Şekil 2.9. Rekombinant olan ve olmayan lokuslar
Rekombinant lokuslar için bireyin genotipini tahmin etmek amacıyla hesaplanacak değer;
iki lokus arasındaki rekombinasyon katsayısıdır. Eğer bu iki lokus farklı kromozomlarda
lokalize olmuşsa bu lokuslar rekombinant lokuslardır ve bağlantılı değillerdir. Bu durumda
rekombinasyon katsayısı 0.5’dir. Bu iki lokusun aynı kromozomda lokalize olduğu
27
durumlarda, genellikle lokusların birlikte segregasyonu beklenir. Ancak mayozun profaz I
aşamasında homolog kromozom çiftleri arasında meydana gelen parça değişimleri
(krosover) durumu biraz karıştırmaktadır. Rekombinasyon nadiren birbirine çok yakın
olan lokusları ayırır. Çünkü aynı küçük kromozomal segmentteki allel setleri bir blok
halinde hareket etme eğilimi göstermektedirler. Bu kromozomal bloklara haplotip denir ve
bu tanınabilen kromozomal bloklar, kuşaklar boyunca takip edilebilirler. Bu bloklar
rekombinasyon
ile
kırılmadıkları
müddetçe
çok
polimorfik
lokuslarda
ailesel
genotiplendirme amacıyla kullanılabilmektedir.
Kromozomal lokalizasyonları uzak olan lokuslar büyük olasılıkla parça değişimi sırasında
ayrılırlar. Bu nedenle rekombinasyon katsayısı iki lokus arasındaki uzaklığı ölçmede
kullanılan bir değerdir. Bu değer genetik uzaklığı ifade eder ve bu uzaklık fiziksel
uzaklıktan oldukça farklıdır. Rekombinasyonun ortalama %1 oranında gözlendiği genetik
uzaklık 1 cM olarak tanımlanır.
İki lokusun bağlantılı olup olmadığını saptamak için ilk olarak iki lokus arasındaki
rekombinasyon katsayısını (Q) belirlememiz gerekmektedir. Bu değer birlikte segrege
olan lokuslar için 0, ayrı lokuslar için ise 0.5’dir. İkinci olarak “bağlantı olasılık oranı
(likelihood odds of ratio) olarak adlandırılan istatistiksel bir değer kullanılarak 0.5’lik
orandan sapmanın anlamlı olup olmadığının belirlenmesi gereklidir. Bunun için çalışma
kapsamındaki aile verisi incelenir ve lokuslar arasında rekombinasyon gösteren ve
göstermeyen çocukların sayısı hesaplanır. Q=0 (hiç rekombinasyonun olmadığı durum) ile
Q=0.5 (rastgele dağılım gösterdiği durum) arasında değişen muhtemel Q değerlerinde
gözlenen verilerin olasılığı hesaplanır. Yani; lokusların belirli bir Q’da bağlı olduğu
durumda verilerin olasılık değeri, lokusların bağlı olmadığı durumda verilerin olasılık
(Q=0.5) değerine bölünür. Logaritmaların kullanımı, farklı ailelerden elde edilen verilerin
toplama ile birleştirilmesine imkan tanıdığı için, bu değer log10 ile ifade edilir ve
olasılıkların logaritması (LOD skor-Z) olarak adlandırılır. Genel olarak, bir ailenin
verisinden elde elde edilmiş veya birleştirilmiş LOD skorun ≥3 olması, iki lokusun bağlı
oldukları konusunda kesin bir kanıttır (Robert 2005).
28
2.6.6. Otozigozite Haritalaması
Otozigozite terimi; tek bir ata tarafından kalıtılan ve kuşaklar boyu aynı (identity bu
descent-IBD) olan homozigot alleleri ifade eder. Resesif kalıtılan hastalıklarda, sorumlu
geninin lokalizasyonunun belirlenmesi için aynı soydan gelen etkilenmiş bireylerde
homozigot kromozomal bölgeler ilk olarak RFLP haritalaması yapılarak çıkartılmıştır
(Lander and Botstein 1987). Homozigozite haritalaması ile ortaya çıkarılan aday
kromozomal bölgelerin büyüklüğü anne ile baba arasındaki akrabalığın derecesi,
etkilenmiş aile bireylerinin sayısı, tahmini doğal rekombinasyon oranı gibi faktörlere
bağlıdır. Akraba evliliğinin derecesi düşük olan ailelerde hastalıkla ilgili olarak aranan
homozigot bölge daha küçük olmaktadır (Gibbs and Singleton 2006). Akraba evliliği olan,
nadir resesif bir hastalığa sahip ailelerde otozigot belirteçlerin hastalık lokusu ile bağlantılı
olması beklenir. Bir allel ne kadar nadir olursa o homozigot allelin otozigot olma ihtimali,
aileye bağımsız olarak girmiş olma ihtimalinden çok daha yüksektir. Son derece nadir bir
allel için, ikinci kuzen ebeveynlerden doğan tek bir etkilenmiş (homozigot) çocuk için
hesaplanan LOD skoru 1.8 iken üç etkilenmiş (homozigot) çocuk için hesaplanan LOD
skoru 3’dür. Bu durumda bu allel hastalıkla ilişkili olmasa bile atasaldır (kalıtsaldır). Bu
durumda akraba evliliği yapmış aileler yüksek değerde anlamlı LOD skor üretirler.
Özellikle ailelerde birden fazla etkilenmiş birey ve birkaç kuşak boyunca süre gelen bir
akraba evliliği söz konusu ise otozigozite haritalaması çok güçlü ve etkili bir bağlantı
analiz yöntemidir.
Özellikle Orta Doğu ülkelerinde ve ülkemizin doğu illerinde yaygın olan bu tip evlilik
şekline sahip olan ailelerde otozomal resesif işitme kaybı genlerini haritalamada kullanılan
çok başarılı ve tercih edilen bir metoddur.
29
2.6.7. Tüm Ekzom Sekanslama
Linkage ve aday genlerin sekanslanması yöntemleri ile bilinen/aday Mendeliyen
hastalıkların altında yatan lokusların neredeyse yarısından çoğu (yaklaşık 3000 lokus)
tanımlanmıştır. Ancak çok az sayıda etkilenmiş ailenin/bireyin varlığı, azaltılmış penetrans
ve lokus heterojenitesi gibi bir takım faktörler klasik gen keşif yöntemlerinin kullanımını
kısıtlamaktadır (Bamshad 2011). Genlerin çok büyük ve/veya çok sayıda ekzondan
oluştuğu da göz önüne alındığında, bu genleri Sanger sekanslama ve genom boyu SNP
genotiplemesi gibi klasik genetik metodlarla taramak hem maddi açıdan çok pahalı
olmakta hem de zaman bakımından çok uzun sürmektedir. Tüm ekzom sekanslama, Ng ve
arkadaşları tarafından 2009 yılında klasik genetik metodlarına alternative olarak
tanımlanmış bir metoddur (Ng et al. 2009). Bu metod, yeni nesil teknolojiler yardımıyla
dönüşümsel bir yaklaşım sağlayarak kompleks ve monogenik hastalıklardaki, etkili
mutasyonu saptamakta kullanılmaktadır.
İnsan genomu yaklaşık 3 milyar bazdan meydana gelmektedir. Ancak bunun çok küçük
yani yaklaşık %1.5’lik bir kısmı protein üretmektedir yani fonksiyoneldir. Ekzon kelimesi
“ifade olan bölge” kelimelerinin İngilizce karşılıklarından (EXpressed regiON)
oluşturulmuştur. Ekzom terimi ise genom içerisinde bulunan tüm protein kodlayan dizileri
yani ekzonları tanımlamak amacıyla kullanılan bir terimdir.
Mendeliyen hastalıklarda; hastalık yapıcı mutasyonların yaklaşık olarak %85’i, proteinin
amino asit dizisini etkileyecek şekilde, genlerin ekzon veya ekzon-intron birleşme
bölgelerinde bulunmaktadır. Bu bölgeler de genomun %1,5’lik bir bölümünü
oluşturmaktadır (Teer and Mullikin 2010). Bu nedenle etkilenmiş bireylerde öncelikle
tüm genom sekanslaması yapmak hem iş gücünü hem de maddi yükü arttırmaktadır.
Öncelikle tüm ekzom sekanslama yöntemini kullanarak genomdaki sadece protein
kodlayan bölgelerin sekanslanması daha uygundur. Tüm genom sekanslamaya tercih
edilen bu yöntem ile nadir Mendeliyen hastalıklara sebep olan alleler daha verimli bir
şekilde tanımlanabilmektedir. Bu yöntem yardımı ile çok çeşitli hatalıklara neden olan
nadir varyantların tanımlanabileceği yapılan çalışmalarla kanıtlanmış, ve günümüzde
yaygın bir kullanım alanına sahip olmuştur.
30
Tüm ekzom sekanslama yöntemi; genoma, assosiyansyon çalışmalarından (GWAS) daha
geniş bir perspektif ile bakılmasını sağlamaktadır. Çünkü assosiyasyon çalışmaları için
kullanılan tekniklerde, sadece toplumda sıklığı en az %1 olan varyasyonlar
tanımlanabilmektedir. Ancak tüm ekzom sekanlama yöntemi, sık veya nadir olmasına
bakmaksızın ekzomdaki her bazın tanımlanmasını sağlamaktadır. Bu nedenle bu yüksek
çözünürlüklü sekanslama yöntemi gün geçtikçe bilim adamları tarafından nadir varyantları
tanımlamada tercih edilen bir yöntem halini almaktadır.
Ng ve ark. (2010) tarafından Kabuki sendromu geni MLL2 ve Miller sendromu geni
DHODH, Walsh ve ark. (2010) tarafından sendromik olmayan işitme kaybı geni GPSM2,
Sırmacı ve ark. (2010) tarafından Carnevale, Malpuech, Michels, ve oculo-skeletalabdominal (OSA) sendromu geni MASP1, Sırmacı ve ark. (2011) tarafından KBG
sendromu geni ANKRD11, Becker ve ark. (2011) tarafından Osteogenesis imperfecta geni
SERPINF1, Montenegro ve ark. (2011) CMT(Charcot Marie Tooth) geni GJB1,
Osteogaard ve ark. (2011) tarafından Primary lymphoedema geni GJC2, Zuchner ve ark.
(2011) tarafından Retinitis pigmentosa geni DHDDS bu teknoloji kullanılarak yapılan
çalışmalar arasında yer almaktadır (Becker et al. 2011, Montenegro et al. 2011, Ng et al.
2010a, Ng et al. 2010b, Ostergaard et al. 2011, Sirmaci et al. 2011, Sirmaci et al. 2010b,
Walsh et al. 2010, Zuchner et al. 2011) .
Yöntem temel olarak hedef bölgelerin seçimi ve sekanslanması olmak üzere iki basamak
içermektedir. Hedef bölgelerin seçimi yani “capture” aşamasında genomik DNA rastgele
yerlerden parçalanarak fragmente edilmektedir. Bu parçalama işlemi sonikasyon (ses
dalgalarının enerjisinden yararlanarak biyolojik maddenin parçalanması) tekniği
kullanılarak gerçekleştirilmektedir. Tüm ekzom sekanslama yönteminde hedef bölgelerin
seçimi işlemi bir adet kalıp DNA üzerinden gerçekleşmemektedir. Yani işleme başlarken
kullanılan 100 μL DNA’nın içerisinde çok sayıda aynı kalıp DNA bulunmaktadır.
Sonikasyon işleminden sonra rastgele yerlerinden parçalanan bu kalıp DNA’lar, aynı
bölgelerden parçalanmazlar. Bu nedenle tek bir baz üzerinden konuşursak, bu bazı farklı
lokalizasyonlarda içeren çok sayıda farklı fragment oluşmaktadır. Bu baz; bazı
fragmentlerde baş, bazı fragmentlerde orta, bazılarında ise son kısma denk gelmektedir.
Böylelikle bu baz farklı fragmentlerce birden çok kez kapsanmış olur. Bu bazın farklı
fragmentler tarafından kapsanma sayısını (sekanslama aşamasında ise; kaç kere okunduğu
yani sekanslandığı sayı) ifade etmek için “coverage” terimi kullanılmaktadır (Şekil 2.10).
31
Bu sayı her baz için değişkenlik göstermektedir. Bunun sebeplerinden biri genomun o
bölgesindeki GC baz içeriğidir. Diğer bir neden ise örneğin kalitesidir. Bu yöntem için
kullanılacak örneğin yüksek kalitede olması elde edilecek sonuç açısından çok önemlidir.
Degrade olmuş yani bir takım sebeplerden dolayı parçalanmış bir DNA örneği, sonikasyon
işlemi ile parçalanacağı için istenilenden çok daha küçük boyutta fragmentler
oluşturmaktadır. Bu fragmentler de pürifikasyon aşamalarında atılmaktadır.
Şekil 2.10. Sonikasyon aşamasından sonra elde edilen DNA fragmentleri
Elde edilen bu fragmentlerin uçlarına sekanslama işleminde kullanılmak amacıyla bir
takım adaptörler bağlanmaktadır. Ardından bu fragmentlerin pürifikasyon aşaması
gerçekleştirilir ve elde edilen ürün sizin örneğinizin hazırlanmış kütüphanesidir. Ardından
sekanslamak istediğiniz bölgeye özgü hazırlanmış kitler sayesinde sizin elinizdeki
kütüphaneden bu bölgelerin seçimi aşaması gerçekleştirilir. Bu seçim bir hibrid seçimidir.
Ve bu işlem sonucunda hibrid oluşturmayan fragmentler temizlenerek uzaklaştırılır. Elde
edilen hibridli bu fragmentler pürifiye edildikten sonra sekanslama aşamasına
geçilmektedir.
32
Hedef bölgelerin seçimi için kullanılan kitler; sekanslanmak istenen genetik materyale ve
sekanslanmak istenen bölgelere göre değişiklik göstermektedir. Genetik materyal olarak
DNA’nın kullanılması koşuluyla kullanılan kitler iki büyük firma tarafından
üretilmektedir. Bunlardan biri Roche firması tarafından desteklenen NimbleGen Seq
Capture kitleri, diğeri ise Agilent Technologies firması tarafından üretilen Sure Select
Target Enrichment System kitleridir. Bu iki firma dışında Atlas Biolabs firması tarafından
üretilen Raindance PCR Enrichment kiti de mevcuttur.
Agilent Technologies firması tarafından üretilen Sure Select Target Enrichment System
kitleri solüsyon bazlı hibridizasyona, Roche firması tarafından desteklenen NimbleGen
Seq Capture kitleri array bazlı hibridizasyona, Atlas Biolabs firması tarafından üretilen
Raindance PCR Enrichment kiti ise tek parçalı parallel PCR yöntemine dayanmaktadır.
Bu üç kiti karşılaştırmak amacı ile yapılan bir çalışmada, 1X baz coverage değerinde Sure
Select ve NimbelGen kitlerinin %100, Raindance kitinin ise %97 oranında genel sekans
coverage değerinin mevcut olduğu gösterilmiştir. Bu değerler 10X baz coverage değerinde
ise bu değerler sırası ile %95, %95 ve %93 şeklindedir (Hedges et al. 2011). Yaklaşık 20X
baz coverage değerine kadar Sure Select ve NimbleGen kitlerinin genel sekans coverage
değerinin aynı gittiği ancak 30X baz coverage değerinden sonra Sure Select kitinin
NimbleGen kitine göre daha yüksek oranda coverage değerine sahip olduğu gözlenmiştir
(Hedges et al. 2011). Çalışmada SureSelect kitinin diğer kitlere kıyasla üstün bir coverage
performansına sahip olduğu gösterilmektedir. Aynı zamanda her üç kit kullanılarak
sekanslanan örnekler arasındaki, hedef bölgelerin sekansı sonucunda elde edilen
sonuçlardaki tutarlılık karşılaştırılmasında, SureSelect kitinin yüksek oranda tutarlılık
gösterdiği, ardından NimbleGen kiti ve en son olarak da Raindance kitlerinin geldiği
gösterilmiştir. İki hibridizasyon temelli teknik olan Sure Select ve NimbleGen kitlerinin
sonuçları, amplikon tabanlı bir metod olan Raindance kitine kıyasla yüksek benzerlik
göstermektedir. Bu üç kit heterozigot lokuslardaki allelik denge bakımından da
karşılaştırılmıştır. Normal koşullarda beklenen değer 0.5’dir, yani her iki allelin eşit sayıda
olması beklenmektedir ancak DNA kütüphanesi hazırlanırken hedef bölgelerin
çoğaltılması aşaması sırasında bir allelin diğerine gore daha fazla tercih edilmesi söz
konusu olabilmektedir. Kitler bu değer bakımdan karşılaştırıldıklarında Sure Select 0.41,
NimbleGen ve Raindance 0.39’ luk bir orana sahip olduğu gösterilmiştir. Son olarak bu üç
kit genotip uyumluluğu açısından karşılaştırılmıştır. Karşılaştırma için Illumina 1M
33
Infinium SNP array kullanılmıştır. Genotip uyumluluğu açısından en başarılı olan kitin
Sure Select olduğu gözlemlenmiştir. Sonuç olarak SureSelect kitinde on-target yani hedef
bölgelerin seçiminde yüksek derecede verim gözlenmektedir, bu sayede coverage ve
okuma derinliği değerleri artmakta ve örnekler arasındaki uyumluluk artmaktadır. Buna
karşılık Raindance kitleri istenilen hedef bölgelerin seçiminde primer değiştirme esnekliği
sayesinde farklı bir avantaj sağlamaktadır. Hem Raindance hem NimbleGen, SureSelect
ile karşılaştırıldığında daha sıkı bir coverage değerine sahiptirler (Hedges et al. 2011) .
Ancak bu çalışmalar yapılırken, NimbleGen ve Raindance kitlerinin ek hedef bölge
zenginleştirme seçeneklerinin ortaya çıkması ve NimbleGen’in yeni bir kitinin piyasaya
sürüldüğü de unutulmamalıdır. Roche ve Agilent firmalarının piyasaya sürdüğü tüm
ekzom sekanslama kitlerinin özellikleri ve kapsamları Çizelge 2.2’de gösterilmektedir.
Çizelge 2.2. Piyasada bulunan tüm ekzom sekanslama kitlerinin özellikleri
Hedef Bölge
(ekzom) (Mb)
Problar
tarafından
kapsanan alan
(Mb)
NimbleGen SeqCap EZ Exome
26.2
35.0
NimbleGen SeqCap EZ Exome v2.0
36.5
44.1
28.5
37.6
32.7
38
39.3+ Broad
içeriği
yaklaşık 50
Kit
Agilent Technologies
SureSelect Human All Exon(v1)
Agilent Technologies
SureSelect Human All Exon v2 (Broad)
Agilent Technologies
SureSelect Human (Sanger ICGC)
Primer hedefleri seçmek
için kullanılan veri tabanı
CCDS (Haziran 2008),
miRbase (v11, Nisan 2008)
CCDS (Eylül 2009),
miRbase (v11, Eylül 2009),
RefSeq (Ocak 2010)
CCDS (Eylül 2008)
v1+CCDS (Eylül 2009)+
RefSeq
V2+GENCODE+Sanger,
miRBase (v13), Rfam
Agilent Technologies firması tarafından yeni iki tüm ekzom sekanslama kiti daha piyasaya
sürülmüştür. Henüz herhangi bir yayında yer almayan bu iki kitin genel özellikleri Çizelge
2.3’de gösterilmektedir.
34
Çizelge 2.3. Agilent Technologies firmasının piyasaya yeni sürülen SureSelect Human All
Exon v4 ve v4+UTR kitlerinin genel özellikleri
Parametreler
SureSelect All Exon V4
SureSelect All Ekzon V4+UTR
Hedef boyutu
51 Mb
71 Mb
Kapsadığı gen sayısı
20,965
21,058
Hedeflenen ekzon sayısı
334,378
335,765
CCDC versiyonu
Mart 2011
Mart 2011
RefSeq versiyonu
Mart 2011
Mart 2011
GENCODE versiyonu
v6
v6
miRBase
V17
V17
UCSC
Mart 2011
Mart 2011
Hibridizasyon zamanı
1x24 saat
1x24 saat
Bu tez çalışmasında hedef bölgelerin sekanslanması (tüm ekzom) işlemi için Agilent
Technologies firmasına ait All Ekzon 50 Mb kiti (Agilent Technologies 5190-4626, ABD)
kullanılmıştır. Agilent Technologies firmasının, kalıp olarak DNA’nın kullanıldığı yüksek
çözünürlüklü sekanslama kapsamında ürettiği diğer kitler;

X kromozomu

Kinom (genomda bulunan tüm protein kinaz genleri)

Sekanslamak istenilen spesifik bölgeleri

Tüm ekzomu hedef alacak şekilde çeşitlilik göstermektedir.
Hedef bölgelerin seçimi aşamasının ardından elde edilen seçilmiş fragmentler, yüksek
çözünürlüklü otomatize sekanslama cihazları ile sekanslanmaktadır.
Sekanslama işlemi, öncelikle hibridizasyon işlemi ile başlamaktadır. Bu aşamada silika bir
yüzeye sahip, üzerinde adaptörler bulunan bir yapı kullanılmaktadır. Bu yapı “flow cell”
olarak adlandırılmaktadır (Flow cell hakkında deyatlı bilgi materyal ve yöntemler
kısmında verilmiştir). Hedef bölgelerin seçimi sırasında elde edilen fragmentlere bağlanan
adaptörler, flow cell üzerinde bulunan adaptörlere komplementerdir. Elde edilen
fragmentleri içeren solüsyon flow cell içerisine yüklenerek fragmentlerin bu silika yüzeye
bağlanması sağlanmaktadır. Sekanslama işlemi flow cell üzerinde gerçekleşmektedir.
Aynı klasik dizileme yönteminde olduğu gibi birbirinden farklı 4 adet boya ile işaretli
dNTP’leri içeren reaksiyon solüsyonu flow cell içerisine yüklenmektedir. Reaksiyon, 101
35
siklustan oluşan bir amplifikasyon programında gerçekleşmektedir. Bu sekanslama
reaksiyonunun klasik sekanslamadan farkı flor bağlı dNTP’lerin kullanmamasıdır. Temel
olarak sekanslama işleminin aşamaları (tek bir fragment üzerinden konuşulduğunda)
aşağıdaki sıradadır.
1. Primer bağlanması; Fragmentlere hedef bölgelerin seçimi sırasında eklenen
primerlere komplemeter primerlerin bağlanması
2. Sekanslama solüsyonunun flow cell’e yüklenmesi
3. Primerden sonraki birinci bazın bağlanması
4. Ortamdaki bağlanmayan bazların uzaklaştırılması
5. Flow cell’in fotoğrafının çekilmesi; her baz farklı renk floresan ışıma
gerçekleştirmektedir. Bu nedenle her bağlanan bazın arkasından flow cell’ın
fotoğrafı çekilerek bağlanan baz saptanmaktadır.
Sekanslama aşaması için günümüzde yaygın olarak kullanılan birkaç platform
bulunmaktadır. İlk yüksek verimli (high-throughput) sekanslama teknolojisi, Roche
firması tarafından 2005 yılında piyasaya sürülen 454 prosequencing cihazıdır (Margulies
et al. 2005). Bu cihaz pirosekanslama tekniği denilen bir yöntem ile çalışmaktadır.
Pirosekanslama
“sentezleyerek
sekanslama”
prensibine
dayanmaktadır.
Sanger
sekanslamadan farkı, dideoksinükleotid ile zincir sonlanma tekniği yerine nükleotid
birleşmesi sonucunda salınan pirofosfatın deteksiyonuna dayanmasıdır.
Applied Biosystems Inc tarafından piyasaya sürülen SOLID cihazı, adaptör bağlı bir DNA
kütüphanesine ihtiyaç duymaktadır. Hedef bölgelerin çoğaltılması için gerçekleştirilen
PCR işlemi manyetik boncuklarla gerçekleşmekte ve amplifiye olmuş fragmentler kendine
özgü bir yöntem ile sekanslanmaktadır.
Illumina® firması tarafından piyasaya sürülen ilk cihaz Genome Analyzer’dır. Daha
sonraları HiSeq ve MiSeq cihazları da aynı firma tarafından piyasaya sürülmüştür. Bu
cihazlar da adaptör bağlanmış DNA kütüphanelerine ihtiyaç duymaktadır. Reaksiyon,
yüzeyinde oligonükleotidlerin bulunduğu “flow cell” adı verilen özel aparatlarda
gerçekleşmektedir (Bentley 2006). Illumina® firmasının piyasada bulunan cihazlarının
özellikleri Çizelge 2.4’de karşılaştırılmaktadır. Bu tez çalışmasında Illumina® firmasına ait
HiSeq sekanslama cihazı kullanılmıştır.
36
Çizelge 2.4. Illumina® firmasının yüksek çözünürlüklü sekanslama cihazları ve özellikleri
Cihazlar
Boyut
Tek yönlü okuma
İki yönlü okuma
Gerekli başlangıç
konsantrasyonu
Okuma uzunluğu
600 Gb
150 Gb
Genome Analyzer
IIx
95 Gb
3 milyar toplam
187 milyon/sıra
6 milyar
374 milyon / sıra
750 milyon toplam
94 milyon /sıra
1.5 milyar
188 milyon / sıra
320 milyon toplam
40 milyon /sıra
640 milyon
80 milyon / sıra
12–15 milyon toplam
12–15 milyon /sıra
24–30 milyon toplam
24–30 milyon / sıra
100 ng – 1 µg
100 ng – 1 µg
100 ng – 1 µg
100 ng – 1 µg
2 × 100 bç
2 × 100 bç
2 × 150 bç
2 × 250 bç
HiSeq Systems
HiScanSQ
MiSeq
6–7 Gb
Piyasada bulunan bu üç firma tarafından üretilen cihazlar, sekanslama kimyası ve
amplifikasyon yaklaşımı bakımından farklıdır. Roche platformu pirosekanslama ve
emülsiyon PCR ile amplifikasyon, Illumina platformu polimeraz temelli sentezleyerek
sekanslama ve köprü amplifikasyonu, ABI ise ligasyon temelli sekanslama ve emülsiyon
PCR ile amplifikasyon yöntemi kullanmaktadır.
Bu üç teknolojide adaptör kullanılarak sekanslamaya dayanmaktadır. Yani sekanslanacak
bölgeler adaptörler yardımı ile çoğaltılmaktadır. Böylece bakteriyel klonlama ile
amplifikasyon aşamasına gerek kalmamıştır (Mardis 2008).
En sıklıkla kullanılan bu üç platform dışında Pacific Bioscience firmasına ait SMRT cihazı
ve The Helicos firması tarafından piyasaya sürülen Heliscope cihazları da bulunmaktadır.
Heliscope cihazı diğer yüksek verimli sekanslama teknolojilerinden farklı olarak “tek
molekül sekanslama (SMS)” tekniğini kullanmaktadır. Bu yöntem ilk olarak 1989 yılında
tanımlanmıştır (Jett et al. 1989). Bu yöntemin yüksek verimli sekanslama yöntemine
sağladığı en büyük avantajlardan biri hedef bölgelerin zenginleştirilmesi sırasında
gerçekleştirilen PCR aşamasının atlanmasıdır. Böylelikle direkt DNA sekanslanması
imkanı sağlamakta ve DNA kütüphanesi hazırlanma aşaması basitleşmektedir. Ayrıca
PCR, değişik DNA örnekleri üzerinde değişken başarı oranına sahip bir yöntemdir. Bu
sayede PCR sırasında oluşabilecek olası sorunlar da elimine edilmiştir (Dalca and Brudno
2010).
Yüksek verimli sekanslama cihazları, klasik kapiller sistemli cihazlardan farklı bir
prensiple çalışmaktadırlar. Öncelikle bu cihazların yürüme ve veri oluşturma zamanları
farklıdır. Yeni nesil sekanslama, kullanılan platform ve okuma tipine (tek taraflı/çift
taraflı) göre 8 saat ile 10 gün arasında değişkenlik gösteren yürüme süresine sahiptir ve bu
37
sure sonunda elde edilen okumalar 35-250 baz çifti uzunluğundaki fragmentler
şeklindedir. Kapillerli sistemler sonucunda yaklaşık 650-800 baz çiftlik 96 okuma elde
edilirken, yeni nesil sekanslama sonucunda elde edilen veri Roche 454 platformu ile
yüzler-binlerce, Illumina ve ABI platformlarında ise on milyonlarca okuma şeklindedir
(Mardis 2008). Yöntemin temel basamakları Şekil 2.11’deki şemada gösterilmektedir.
Şekil 2.11. Tüm ekzom sekanslama yönteminin akış şeması
2005 yılından bu yana geniş çapta kullanımda olan yeni nesil sekanslama platformları,
masrafı çok büyük oranda düşürmektedir. Bu yöntem sayesinde uygun fiyatla insan
genomunda bulunan tüm kodlayan bölgelerdeki varyasyonları saptama imkanı doğmuştur.
Böylelikle bu teknik kompleks ve monogenik hastalıklardaki sorumlu genleri tanımlamada
homozigozite haritalaması gibi bir takım klasik teknikleri geride bırakarak çok güçlü bir
yaklaşım halini almaktadır.
38
2.7. Yaklaşım ve Amaç
Kulağın karmaşık yapısını ve işitmenin birçok faktöre bağlı olmasını göz önünde
bulundurursak, iç kulakta henüz görevi tam olarak tanımlanamamış yüzlerce protein
bulunmaktadır. Uzun yıllardır dünyanın değişik ülkelerinde bulunan araştırmacılar
tarafından bu proteinleri kodlayan genlerin tanımlanmasına yönelik araştırmalar
gerçekleştirilmektedir.
Bu amaç doğrultusunda, Ankara Üniversitesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları ABD,
Pediatrik Moleküler
Genetik
BD laboratuvarında uzun
yıllardır
yürüttüğümüz
çalışmalarda, laboratuvar DNA bankamızda bulunan anne ile baba arasında akraba evliliği
olan, otozomal resesif sendromik olmayan işitme kaybına sahip ailelerdeki işitme kaybına
sebep olan genleri araştırmaktayız. Ailelerde görülen işitme kaybının kalıtım şekilleri ve
yapıları, otozigozite haritalama metodu ile sorumlu genetik değişikliklerin hangi genomik
lokuslarda olduğunu belirlememize imkan sağlamaktadır.
Otozomal resesif kalıtım gösteren hastalıklarda etkilenmiş bireyler, sorumlu genin her iki
kopyasında da ilgili mutasyonu taşımaktadırlar. Bu durum homozigotluk olarak
tanımlanır. Akraba evliliğinin olduğu ailelerde yüksek bir olasılıkla etkilenmiş bireylerde
mutasyona uğrayan genin her iki kopyasının da aynı atadan kalıtılması beklenmektedir.
Ebeveynlerin ortak olan atalarından birinde çekinik yani tek bir allelinde bulunan bu
mutasyon, kuşaklar boyunca heterozigot olarak kalıtılmaktadır. Böylelikle bu mutasyonu
çevreleyen bölge kuşaklar boyunca daha düşük olasılıkla rekombinasyona uğramaktadır.
Bu sebeple, ailede bulunan genetik değişikliğin otozomal kromozomlardan birinde
bulunan homozigot bir bloğun içinde bulunması ve bu homozigot bloğun ailede segrege
olması beklenmektedir.
Otozomal resesif kalıtım için segregasyon terimi; ailedeki tüm etkilenmiş bireylerin aynı
allele homozigot, anne ile babanın heterozigot, etkilenmemiş bireylerin ise heterozigot
veya diğer allel için homozigot olmaları şeklinde tanımlanmaktadır. Ailede elde edilen bu
homozigot blokları tanımlamak amacı ile otozigot bloklar terimi kullanılmaktadır. Genom
boyunca yer alan bu otozigot blokları tespit etmek için kullanılan metoda ise otozigozite
haritalaması denmektedir.
39
Bugüne kadarki çalışmalarımız kapsamında öncelikle her aileden bir etkilenmiş bireye
ülkemizde sıklığı %18.9 olan GJB2 geni mutasyon analizi gerçekleştirilmektedir (Tekin et
al. 2007). Ardından bu gende mutasyon bulunmayan otozomal resesif sendromik olmayan
işitme kayıplı ve en az üç etkilenmiş bireye sahip 49 aile çalışmamız kapsamına alınmıştır.
Bu ailelere tüm genom tek nükleotid polimorfizmi genotiplemesi yöntemi ve ardından elde
edilen veri ile otozigozite haritalaması gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak bu ailelerden
%52’sinde bugüne kadar tanımlanmış olan 39 otozomal resesif sendromik olmayan işitme
kaybı geninden birine bağlantı bulunmuştur. Bir gene bağlantı bulunan her ailede, bu gene
yapılan DNA dizi analizi sonucunda sorumlu genetik değişiklik belirlenmiştir.
Ancak elimizde otozigozite haritalaması sonucunda herhangi bilinen bir işitme kaybı geni
lokusuna bağlantı göstermeyen 23 aile bulunmaktadır. Bu ailelerdeki genetik
değişikliklerin saptanması için tüm genom tek nükleotid polimorfizmi genotiplemesine ek
teknikler gerekmektedir.
Bu nedenle, bu tez çalışmasında tüm genom tek nükleotid polimorfizmi genotipleme
metoduna ilaveten tüm ekzom sekanslama yöntemini de kullanarak ailelerdeki işitme
kaybı sebebi olan yeni varyantların bulunması amaçlanmıştır.
40
3. MATERYAL VE YÖNTEMLER
3.1. Çalışma Grubunun Oluşturulması
Bu tez çalışması kapsamındaki aileler Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Sağlığı ve
Hastalıkları Ana Bilim Dalı, Çocuk Genetik Bilim Dalı’na muayene amacı ile gelen aileler
arasından seçilmiştir. Tez çalışmasının laboratuvar aşaması ise Miami Üniversitesi John P.
Hussman Institute of Human Genomics laboratuvarında gerçekleştirilmiştir.
Çalışmaya dahil edilen aileler, anne ile baba arasında akrabalık bulunan ve en az üç
etkilenmiş bireye sahip olan aileler arasından seçilmiştir. Ailelerin aile ağaçları Şekil 3.1,
Şekil 3.2 ve Şekil 3.3’de gösterilmektedir.
Ailelerdeki etkilenmiş bireylerde; otozomal resesif, sendromik olmayan, doğuştan veya dil
gelişimi öncesi ortaya çıkan ileri ve çok ileri derecede sensorinöral işitme kaybı
bulunmaktadır. Ailelerin odyolojik incelemeleri yapılmıştır ve aileler çevresel işitme kaybı
nedenleri açısından incelenmiştir.
Ailelerde GJB2 mutasyonlarının ve mitokondrial DNA’daki m.A1555G mutasyonunun
olmadığı gösterilmiştir. Ardından bu aileler araştırmalarımız kapsamında, genom boyunca
SNP genotiplemesi yöntemi kullanarak bugüne kadar otozomal resesif işitme kaybı yaptığı
tanımlanmış tüm genlerinin dışlandığı aileler arasından seçilmiştir.
Çalışmaya dahil edilen üç aileye çalışmanın olası sonuçları hakkında bilgi verilmiş ve
gönüllü olarak katıldıklarına dair onam formları alınmıştır. Bu çalışma için Ankara
Üniversitesi ve Miami Üniversitesi Etik Kurulları tarafından onaylanan formlar
kullanılmıştır (Tarih:30.01.2006, Karar no:85-2215).
Çalışmaya dahil edilen kontrol örnekleri, ülkemizin değişik bölgelerinden toplanmış
sağlıklı bireyleri örnekleridir.
41
Şekil 3.1. Aile 1’in aile ağacı
Şekil 3.2. Aile 2’nin aile ağacı
Şekil 3.3. Aile 3’ün aile ağacı
42
3.2. DNA İzolasyonu
DNA izolasyonu, klasik fenol-kloroform yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu
yöntem kapsamında; bireylerden, 1 mL (0.5 M) Etilendiamintetraasetik asitli (EDTA,
AppliChem, Almanya) polietilen tüp içerisine 9 mL kan örneği alınır. Alınan kan örneği
50 mL’lik falkon tüpüne aktarılarak içerisine 25 mL RBC (Red Blood Cell) lizis
solüsyonu (155 mM Amonyum Klorid (AppliChem, Almanya); 10 mM Sodyum
Bikarbonat (Merck, Almanya); 0.5 mM EDTA (AppliChem, Almanya)) eklenir ve 20
dakika buzda bekletilir. Ardından 4000 rpm hızda 4 °C’de 15 dakika santrifüj (Hettich,
Almanya) edilir. Dipte bulunan pembe/kırmızı renkli pellete dokunulmadan üstteki
süpernatant uzaklaştırılır. Tüpün dibindeki pelletin üzerine tekrar 20 mL RBC lizis
solüsyonu ilave edilir. Bu işlem tüm eritrositler giderilene yani pellet beyaz renk alana
kadar tekrarlanır. Son kez pellet üzerinde bulunan süpernatant uzaklaştırılır ve dipte kalan
pelletin (lökosit) üzerine 1000 µL RBC lizis solüsyonu eklenir. Tüp iyice karıştırılarak
pelletin, üzerine eklenen solüsyon içerisinde iyice çözünmesi sağlanır. Bu karışımın 800
µL’si ependorf tüpüne alınarak -20 °C’de saklanır. Geriye kalan 200 µL bir ependorf
tüpüne alınarak üzerine 20 μg/mL konsantrasyondaki Proteinaz K enzimi (Fermentas,
Litvanya), son konsantrasyonu %0.5 olan (%10) Soydum Dodesil Sülfat (Merck,
Almanya) ve lökosit hacminin 2.5 katı nükleaz solüsyonu (10 mM pH: 8 Trisklorid
(Amresco, ABD); 100 mM Sodyum Klorid (Merck, Almanya); 1 mM pH:8 EDTA
(AppliChem, Almanya)) eklenerek bir gece 56 °C sıcak su banyosunda (Kotterman,
Almanya) bekletilir. Ertesi gün tüplere 1:1 oranında Fenol/Kloroform (Fenol (Merck,
Almanya); Kloroform (Merck, Almanya); İzoamil alkol (Merck, Almanya)] eklenerek 10
dakika çalkalanır. Buz içerisinde 20 dakika bekletildikten sonra 4000 rpm hızda 4 °C’de
20 dakika santrifüj edilir. İki faza ayrılan karışımın üst kısmı başka bir ependorf tüpüne
aktarılarak üzerine toplam hacmin 1/10’u kadar 3 M Sodyum Asetat (Sigma-Aldrich,
ABD) ve toplam hacmin 2 katı kadar %95’lik alkol (Tekel, Türkiye) eklenir. Ependorf
tüpü ters düz edilerek DNA’nın görünür hale getirilmesi sağlanır. Ardından tüp -20 °C’de
bir gece bekletilir. Ertesi gün tüpler 4000 rpm hızda 4 °C’de 20 dakika santrifüj edilerek
DNA’nın çökmesi sağlanır. Süpernatant kısmı dökülerek tüpe 500 µL (%70) alkol eklenir
ve 4000 rpm hızda 4 °C’de 20 dakika santrifüj edilir. Ardından alkol dökülür ve tüpler
kurutma kağıdı üzerinde kapakları açık bir şekilde kurumaya bırakılır. Alkol iyice
uçtuktan sonra tüp içerisine 50-100 µL Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl (AppliChem,
Almanya); 1 mM EDTA (AppliChem, Almanya)) solüsyonu eklenip 37 °C’de bir gece
43
bekletilerek DNA’nın çözülmesi sağlanır. İzole edilen DNA, 4 °C veya -20°C ‘de
saklanabilmektedir.
3.3. Agaroz Jel Elektroforezi
Agaroz (Sigma-Aldrich A9539, ABD) kullanılacağı amaca uygun olarak belirli yüzdelerde
hazırlanır. Bu çalışma boyunca; genomik DNA’nın kalitesini görüntülenmesi amacı ile
%1, PCR ürünü görüntülenmesi ve diğer işlemler için %2’lik agaroz jel kullanılmıştır.
%1’lik agaroz jel için 1.5 g toz halindeki agaroz tartılıp, 1X TAE solüsyonu ile 150 mL’ye
tamamlanır. %2’lik agaroz jel için 3 g toz halindeki agaroz tartılıp, 1X TAE 1X solüsyonu
ile 150 mL’ye tamamlanır. Bu tez çalışmasında kullanılan TAE (Tris-Asetik asit-EDTA)
solüsyonu 50X konsantrasyonda (G Bio Science R024, ABD) hazır olarak alınmış ve 1/50
oranında sulandırılarak 1X çalışma konsantrasyonu elde edilmiştir.
Agaroz, istenilen yüzdelerde hazırlandıktan sonra mikrodalga fırında kaynatılır. Sıvının bir
miktar soğuması beklenir. Ardından her 50 mL için 1 damla olacak şekilde Etidyum
Bromid ilave edildikten sonra iyice karıştırılır. Jel dökülmeden önce jel tabağı uygun
taraklar kullanılarak hazırlanır ve eritilen agaroz, jel tabağına (ABgene, İngiltere) dökülür.
Agarozun donması için yaklaşık 30 dakika beklenir. Agaroz donduktan sonra jel tabağıyla
birlikte jel elektroforez tankına (ABgene, İngiltere) yerleştirilir. Elektroforez tankı 1X
TAE solüsyonu ile jelin üstünü kapatacak şekilde doldurulur. PCR ürünü yüklenecek ise 4
μl, DNA yüklenecek ise 10 μl (500 ng/μl); 2 µL (6X) Brom-Fenol Mavisi (BBF, Merck,
Almanya) ile karıştırılarak kuyucuklara yüklenir. PCR ürünlerinin boyutlarının
değerlendirilebilmesi amacı ile 2 µg DNA Ladder (Invitrogen 10068-013, ABD) yüklenir.
Jel 90-100 V akımda 20-60 dakika kadar yürütülür (Bio-Rad, ABD). Jel ultraviyole ışık
kullanan bir görüntüleme sistemi tarafından görüntülenir (FluorChemE, Cell Bioscience,
ABD).
44
3.4. GJB2 Geni Mutasyon Analizi
GJB2 geninin 1. ve 2. ekzonları polimeraz zincir reaksiyonu yardımıyla çoğaltılır. Her iki
bölge için her biri 0.1 µg/mL konsantrasyonunda iki primer seti kullanılır. Bu primerlerin
dizisi; ekzon 1 için düz pimer 5'-CCGGGAAGCTCTGAGGAC-3' ve ters primer 5'GCAACCGCTCTGGGTCTC-3',
ekzon
2
ve
GCTTACCCAGACTCAGAGAAG-3’
için
düz
ters
primer
primer
5’5’-
TGAGCACGGGTTGCCTCATC-3’ şeklindedir. Polimeraz zincir reaksiyonu sonunda
elde edilecek ürün boyutları ise ekzon 1 için 370 bç, ekzon 2 için ise 840 bç
uzunluğundadır.
Ekzon 1’in PCR reaksiyonu için AmpliTaq Gold 360 adı verilen ticari bir PCR kiti
kullanılır (Invitrogen, 4398818, ABD). PCR reaksiyonu için 12.5 µL Master Mix, 5 µL
Enhancer, son konsantrasyonu 0.6 mM (20 μM) olacak şekilde ters ve düz primer (IDT,
ABD), 20 ng/µL DNA ve reaksiyonun hacmi dH2O ile 25 µL’ye tamamlanır. Polimeraz
zincir reaksiyonu için gerekli olan sıcaklık koşulu; 95 °C 5 dakika, 35 siklus 94 °C’de, 30
saniye, 60 °C’de 30 saniye, 72 °C’de 30 saniye ve 72 °C’de 7 dakika PCR cihazında
gerçekleştirilir (Applied Biosysytems Veriti, ABD).
Ekzon 2’nin PCR reaksiyonu için; son konsantrasyonu 1X (10X) olacak şekilde PCR
Buffer, 200 μM dNTP (her biri 2 mM) (Invitrogen, 18427-088 ,ABD), 1.5 mM (50 mM)
MgCl2, 0.4 mM (20 μM) düz ve ters primerler (IDT, ABD), 1 U (5 U/µL) Platinum® Taq
DNA Polimeraz (Invitrogen 10966034, ABD) kullanılır ve reaksiyonun hacmi dH2O ile 25
µL’ye tamamlanır. Polimeraz zincir reaksiyonu için gerekli olan sıcaklık koşulu; 94 °C 3
dakika, 2 siklus 94 °C’de 5 saniye, 65 °C’de 30 saniye, 72 °C’de 30 saniye, 2 siklus 94
°C’de 5 saniye, 63 °C’de 30 saniye, 72 °C’de 30 saniye, 2 siklus 94 °C’de 5 saniye, 61
°C’de 30 saniye, 72 °C’de 30 saniye, 2 siklus 94 °C’de 5 saniye, 59 °C’de 30 saniye, 72
°C’de 30 saniye, 2 siklus 94 °C’de 5 saniye, 57 °C’de 30 saniye, 72 °C’de 30 saniye, 32
siklus 94 °C’de 5 saniye, 55 °C’de 30 saniye, 72 °C’de 45 saniye ve 72 °C’de 3 dakika
PCR cihazında gerçekleştirilir (Applied Biosysytems Veriti, ABD).
DNA dizi analizi öncesinde PCR ürünlerinin dNTP ve primer artıklarından temizlenmesi
için sephadex ile pürifikasyon yöntemi kullanılır (GE Healthcare 17-0010-01, ABD).
45
3.5. Mitokondriyal DNA’da 12SrRNA m.A1555G Mutasyon Analizi
Bu gende tanımlanmış olan m.A1555G mutasyonu, PCR/RFLP yöntemi ile taranmıştır.
12S rRNA için her biri 0,1 µg/mL konsantrasyonunda iki primer seti kullanılmıştır. Bu
primerleri dizisi; düz primer 5’-CCGCCATCTCTCAGCAAACCCT-3’ ve ters primer 5’TGAAGTCTTAGCATGTACTGCTCG-3’dir. Diğer PCR komponentleri ise; son
konsantrasyon 200 μM dNTP (her biri 2 mM) (Invitrogen 18427-088, ABD), Platinum®
Taq DNA (Invitrogen 10966034, ABD), 10 mM Tris-HCl (oda sıcaklığında pH: 9), 50
mM KCl ve %0,1 Triton®, 25 mM MgCl2’dir. Son hacim 50 µL’ye dH2O ile tamamlanır.
Polimeraz zincir reaksiyonu için gerekli olan sıcaklık koşulu; 95 °C 10 dakika, 35 siklus
94 °C’de 1 dakika, 60 °C’de 1 dakika, 72 °C’de 1 dakika ve 72 °C’de 7 dakika olarak PCR
cihazında gerçekleştirilir (Primus, ABD). Polimeraz zincir reaksiyonu sonunda 1604 bç
uzunluğunda PCR ürünleri elde edilir.
1604 bç’lik PCR ürünleri m.A1555G mutasyonunu belirlemek amacıyla BsmAI (5’GTCTCN↓N-3’) restriksiyon endonükleaz enzimi (New England Biolabs Inc, ABD) ile
kesime tabi tutulur. 10 mM Tris-HCl (37 °C’, pH: 7.5), 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl ve
0.1 mg/mL BSA’dan oluşan restriksiyon endonükleaz tamponu ve 10 U restriksiyon
endonükleaz enzimi PCR ürünleriyle karıştırılır. Enzimin optimum çalışma sıcaklığı olan
55 °C’de 16 saat inkübe edilir. Kesilen örnekler %1’lik agaroz jelde incelenir. Enzim
yabanıl tipte; 1113 bç, 285bç ve 206 bç uzunluklarında üç; mutasyon olması durumunda
ise; 1398 bç ve 206 bç uzunluklarında iki fragment oluşturur.
Bu basamaktan sonra gerçekleştirilecek olan tüm moleküler teknikler University of
Miami, Institute of Human Genomics’de gerçekleştirilmiştir. Yöntemlerin bazı bölümleri
ve kullanılan kimyasalların miktarları üretici firmanın önerileri temel alınarak Institute of
Human Genomics Core Laboratuvarlarında optimize edilmiştir.
46
3.6. Genom Boyu Tek Nokta Polimorfizm Genotiplemesi
Affymetrix® Genome-Wide Human SNP 6.0 Nsp/Sty çipler (Genome-Wide SNP 6.0
Assay) 48 örneği aynı anda haritalamaya imkan saglayacak şekilde dizayn edilmiştir.
Protokolün temel basamakları aşağıda sıralandığı şekildedir (Şekil 3.4).
1. Genomik DNA’nın hazırlanması
1.1
StyI Restriksiyon Enzimi ile kesim
1.2
StyI Ligasyonu
1.3
StyI PCR’ı
1.4
NspI Restriksiyon Enzimi ile kesim
1.5
NspI Ligasyonu
1.6
NspI PCR’ı
1.7
PCR ürünü pürifikasyonu
1.8
Kalite ve Miktar Tayini
1.9
Fragmentasyon
1.10 İşaretleme
1.11 Hedef Hibridizasyonu
2. Yıkama
3. Boyama
4. Tarama
5. Veri Analizi
47
Şekil 3.4. Affymetrix® Genome-Wide Human SNP 6.0 Assay akış şeması
(Affymetrix kullanma klavuzundan değiştirilecek alınmıştır.)
Bu yöntem için Affymetrix firmasının Genome-wide Human SNP Nsp/Sty Assay 6.0 kiti
kullanılmıştır. Kitin içeriğinde bulunan kimyasallar;

NspI ve StyI Adaptörleri

PCR Primer 002

Referans Genomik DNA, 103

GeneChip Fragmentasyon Reagent

10X Fragmentasyon Bufferı

GeneChip DNA Labelling Reagent (İşaretleme Solüsyonu)

Terminal Deoksinükleotidil Transferaz

5X Terminal Deoksinükleotidil Transferaz Buffer

Oligo Kontrol Solüsyonu, 0100 dir.
48
3.6.1. Genomik DNA’nın Hazırlanması
Affymetrix® Genome-Wide Human SNP 6.0 Nsp/Sty çipleri ile çalışılacak DNA örneği
çift zincirli olmak zorundadır. DNA örneği tüm PCR inhibitorlerinden arındırılmalı ve
herhangi bir canlı genomu ile kontamine olmadığından emin olunmalıdır. Yüksek oranda
degrege olmuş DNA örnekleri bu teknik için uygun değildir.
Genomik
DNA’nın
kalitesi
%1
oranında
hazırlanmış
agaroz
jelde
kontrol
edilebilmektedir. Yüksek kalitedeki degrege olmamış bir DNA örneği yaklaşık olarak 1020 kb civarında temiz bir bant vermektedir. Ardından UV absorbans methodu ile DNA’nın
konsantrasyonu ölçülür. Bunun için genomik DNA öncelikle yüksek derecede 3 saniye
vortekslenerek iyice homojenize edilir. Ardından NanoDrop Spektrofotometre® cihazı
yardımı ile DNA örneklerinin konsantrasyonları belirlenir. Elde edilen OD ölçümlerine
dayanarak her DNA örneği dH2O kullanılarak son konsantrasyonu 50 ng/µL olacak
şekilde ayarlanır. Konsantrasyonu ayarlanmış DNA örneğinden 5 µL alınarak ayrı bir tüpe
aktarılır. Bu yöntem için kullanılacak olan toplam DNA konsatrasyonu 250 ng’dır. Her
DNA örneği için iki ayrı tüp hazırlanır. Bu tüplerden biri StyI, diğeri NspI restriksiyon
enzimi kesim reaksiyonu için kullanılacaktır.
3.6.1.1.
StyI restriksiyon Enzimi ile Kesim
Öncelikle genomik DNA içermeyen çalışma solüsyonu hazırlanır. Örnek başına 11.55 µL
dH2O, 2 µL (10X) StyI Buffer (NEBuffer 3), 0.2 µL (100X, 10 U/µL) BSA ve 1 µL (10
U/µL) StyI restriksiyon enzimi (New England Biolabs Inc, ABD) kullanılır. Hazırlanan
reaksiyon solüsyonuna, konsantrasyonu 50 ng/µL’ye ayarlanmış 5 µL DNA örneğine
eklenir. Reasiyonun toplam hacmi 19.75 µL’dir. Ardından tüpler 3 saniye vortekslenerek
solüsyonun karışması sağlanır.
Tüpler 2000 rpm hızda 30 saniye santrifuj edilir.
Reaksiyon için gerekli olan sıcaklık koşulu; 37 °C’de 120 dakika, 65 °C’de 20 dakika
PCR cihazında (Applied Biosystems Veriti, ABD) gerçekleştirilir.
49
3.6.1.2.
StyI Ligasyonu
StyI ligasyon reaksiyonu solüsyonunun hazırlanışı sırasında tüm kimyasallar buzda
bekletilir. Örnek başına 2.5 µL (10X) T4 Ligaz Buffer, 0.75 µL (50 μM) Adaptör StyI ve 2
µL (400 U/uL) T4 DNA Ligaz karıştırılır. Ardından 5.25 µL reaksiyon solüsyonu bir
önceki basamakta elde edilen 19.75 µL StyI restriksiyon enzimi ile kesilmiş olan DNA
örneği ile karıştırılır. Toplam reaksiyon hacmi 25 µL’dir. Ardından tüpler 3 saniye
vortekslenerek solüsyonun karışması sağlanır ve 2000 rpm hızda 30 saniye santrifuj edilir.
Reaksiyon için gerekli olan sıcaklık koşulu; 16 °C’de 180 dakika, 70 °C’de 20 dakika
PCR cihazında (Applied Biosystems Veriti, ABD) gerçekleştirilir. Reaksiyonun ardından
DNA örneklerini dilüye etmek amacı ile 75 µL dH2O StyI ligasyonlu DNA’ya eklenerek
son hacim 100 µL’ye getirilir.
3.6.1.3.
StyI PCR
PCR reaksiyonu için: 39.5 µL dH2O, 4.5 µL (100 μM) PCR primeri, 14 µL dNTP (her biri
2.5 mM), 20 µL (5 M) GC-Melt, 2 µL (50X) TITANIUM Taq DNA Polimeraz ve 10 µL
(10X) TITANIUM Taq PCR Buffer kullanılır. Hazırlanan StyI PCR reaksiyon solüsyonu,
10 µL StyI ligasyon ürünü ile karıştırılarak toplam PCR hacmi 100 µL’ye tamamlanır.
Tüpler 3 saniye vortekslenerek solüsyonun karışması sağlanır ve 2000 rpm hızda 30
saniye santrifuj edilir. Ardından reaksiyon için gerekli olan sıcaklık koşulu; 94 °C’de 3
dakika, 30 siklus 94 °C 30 saniye, 60 °C’de 45 saniye, 68 °C’de 15 saniye ve 68 °C’de 7
dakika PCR cihazında (Applied Biosystems Veriti, ABD) gerçekleştirilir.
Sonuçların eşit olması açısından her örnekten 3 µL, 3 µL (2X) yükleme solüsyonu ile
karıştırılır. %2 TAE agaroz jele örnekler yüklenerek 120 V’da 40 dakika ile 1 saat
arasında yürütüldükten sonra UV’de görüntülenir. Beklenen PCR ürünü boyutu yaklaşık
200 bç ile 1100 bç arasındadır.
50
3.6.1.4.
NspI Restriksiyon Enzimi ile Kesim
Öncelikle genomik DNA içermeyen çalışma solüsyonu hazırlanır. Örnek başına 11.55 µL
dH2O, 2 µL (10X) NspI Buffer (NEBuffer2), 0.2 µL (100X, 10 U/µL) BSA ve 1 µL (10
U/µL) NspI Restriksiyon Enzimi (New England Biolabs Inc, USA) kullanılır. Hazırlanan
reaksiyon solüsyonu, konsantrasyonu 50 ng/µL’ye ayarlanmış 5 µL DNA örneğine
eklenir. Reasiyonun toplam hacmi 19.75 µL’dir. Ardından tüpler 3 saniye vortekslenerek
solüsyonun karışması sağlanır. Tüpler 2000 rpm hızda 30 saniye santrifuj edilir.
Reaksiyon için gerekli olan sıcaklık koşulu; 37 °C’de 120 dakika, 65 °C’de 20 dakika
PCR cihazında (Applied Biosystems Veriti, ABD) gerçekleştirilir.
3.6.1.5.
NspI Ligasyonu
NspI ligasyon reaksiyonu solüsyonunun hazırlanışı sırasında tüm kimyasallar buzda
bekletilir. Örnek başına 2.5 µL (10X) T4 Ligaz Buffer, 0.75 µL (50 μM) Adaptör NspI ve
2 µL (400 U/µL) T4 DNA Ligaz karıştırılır. Ardından 5.25 µL reaksiyon solüsyonu bir
önceki basamakta elde edilen 19.75 µL NspI restriksiyon enzimi ile kesilmiş olan DNA
örneği ile karıştırılır. Toplam reaksiyon hacmi 25 µL’dir. Ardından tüpler 3 saniye
vortekslenerek solüsyonun karışması sağlanır ve 2000 rpm hızda 30 saniye santrifuj edilir.
Reaksiyon için gerekli olan sıcaklık koşulu; 16 °C’de 180 dakika, 70 °C’de 20 dakika
PCR cihazında (Applied Biosystems Veriti, ABD) gerçekleştirilir. Reaksiyonun ardından
DNA örneklerini dilüye etmek için 75 µL dH2O NspI ligasyonlu DNA’ya eklenerek son
hacim 100 µL’ye getirilir.
3.6.1.6.
NspI PCR
PCR reaksiyonu için: 39.5 µL dH2O, 4.5 µL (100 μM) PCR Primeri 002, 14 µL dNTP (her
biri 2.5 mM), 20 µL (5M) GC-Melt, 2 µL (50X) TITANIUM Taq DNA polimeraz ve 10
µL (10X) TITANIUM Taq PCR Buffer kullanılır. Hazırlanan NspI PCR reaksiyon
solüsyonu 10 µL NspI ligasyon ürünü ile karıştırılarak toplam PCR hacmi 100 µL’ye
tamamlanır. Tüpler 3 saniye vortekslenerek solüsyonun karışması sağlanır ve 2000 rpm
51
hızda 30 saniye santrifuj edilir. Ardından reaksiyon için gerekli olan sıcaklık koşulu; 94
°C’de 3 dakika, 30 siklus 94 °C 30 saniye, 60 °C’de 45 saniye, 68 °C’de 15 saniye ve 68
°C’de 7 dakika PCR cihazında (Applied Biosystems Veriti, ABD) gerçekleştirilir.
Sonuçların eşit olması açısından her örnekten 3 µL, 3 µL (2X) yükleme solüsyonu ile
karıştırılır. %2 TAE agaroz jele örnekler yüklenerek 120 V’da 40 dakika ile 1 saat
arasında yürütüldükten sonra UV’de görüntülenir. Beklenen PCR ürünü boyutu yaklaşık
200 bç ile 1100 bç arasındadır.
3.6.1.7.
PCR Ürünü Pürifikasyonu
Elde edilen PCR ürünleri “İzopropanol Presipitasyon Methodu” kullanılarak pürifiye
edilir. 12 µL (0.5 M, pH:8) EDTA (Ambion 9260G, ABD) PCR ürünlerine eklenir.
Tüplerin üzeri kapatılarak 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. Tüm PCR ürünlerinin
şeffaf hale gelmesi beklenir. Aksi halde 5 dakika daha inkübasyon süresi uzatılır. Bu
sırada başka bir tüpte örnek başına 200 µL (7.5 M) NH4OAC (Sigma-Aldrich A2706,
ABD) ve 700 µL (%99) izopropanol (Sigma-Aldrich I9516, ABD) içeren reaksiyon
solüsyon hazırlanır. 10 dakika inkübasyon süresinin ardından hazırlanan bu karışımdan her
PCR ürününe 900µL eklenir. Tüpler oda sıcaklığında 30 dakika inkube edilir. Ardından
2250 rpm hızda 4 °C’de 30 dakika santrifuj edilir. Tüplerin dibindeki pellete dikkat
edilerek tüplerdeki sıvı uzaklaştırılır. Pelleti yıkamak amacı ile 1.6 mL oda sıcaklığındaki
%75’lik etanol (Sigma-Aldrich 459844, ABD) eklenir. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe
edilen tüpler 2250 rpm hızda 4 °C’de 5 dakika santrifuj edilir. Tüplerin dibindeki pellete
dikkat edilerek tüplerdeki sıvı uzaklaştırılır ve tüpler 2 dakika boyunca ters bir şekilde
temiz bir emici kağıt üzerinde bekletilir ve her 2 dakikada bir emici kağıt değiştirilir. Tüm
sıvının süzüldüğünden emin olunduktan sonra pelleti çözmek için 55 µL Elüsyon Buffer
(Qiagen 19086, ABD) eklenir. 30 dakika boyunca karıştırıcıda pelletin çözülmesi beklenir.
52
3.6.1.8.
Kalite ve Miktar Tayini
Spektrofotometre kullanılmadan 10 dakika önce çalıştırılarak cihazın ısınması sağlanır. Bu
sırada pürifiye edilmiş ürünlerin dilüsyonu yapılır. Bunun için 2 µL pürifiye edilmiş PCR
ürünü 198 µL dH2O ile karıştırılır. Böylece her örnek 100 kat sulandırılmış olur. Bu
dilüsyondan 180 µL başka bir tüpe aktarılır. Ardından tüpler spektrofotometrede 260, 280
ve 320 nm değerlerinde okutularak PCR ürününün OD değeri ölçülür. PCR ürünleri ile
birlikte her ürün için bir dH2O’da spektrofotometrede okutulur. Her PCR ürününün ve
dH2O’nun OD260 değerleri kullanılarak, her örnek için ayrı ayrı OD değeri hesaplanır.
Bunun için aşağıdaki formül kullanılır.
OD = (örneğin OD değeri) – (tüm dH2O’ların ortalama OD)
Ardından aşağıdaki formül kullanılarak her PCR örneğinin dilüye edilmemiş OD değeri
hesaplanır.
μg/µL’deki örneğin konsantrasyonu = OD X 0.05 μg/µL X 100
3.6.1.9.
Fragmentasyon
Örnek başına 5 µL (10X) Fragmentasyon Buffer daha önce hazırlanan 45 µL pürifiye
edilmiş PCR ürünü ile karıştırılır, böylece toplam reaksiyon hacmi 50 µL’ye ulaşır.
Fragmentasyon reaktifinin konsantrasyonu 2 U/µL olacak şekilde dilüye edilir. Bunun için
buzda; 306 µL dH2O, 36 µL (10X) Fragmentasyon Buffer ve 18 µL Fragmentasyon
Reaktifi karıştırılır ve toplam hacmi 360 µL olan reaksiyon solüsyonu elde edilir.
Ardından 50 µL‘lik reaksiyon solüsyonuna, hazırlanan dilüye edilmiş Fragmentasyon
Reaktifi’nden 5 µL eklenerek toplam hacim 55 µL’ye ulaştırılır. Tüpler 2000 rpm hızda 4
°C’de 30 saniye santrifüj edilir ve daha önceden 37 °C’ye ayarlanmış PCR cihazında
(Applied Biosystems Veriti, ABD) 35 dakika ardından 95 °C’de 15 dakika inkübasyona
bırakılır.
53
Fragmentasyon reaksiyonu %4 TAE agaroz jelde yürütülerek kalitesinden emin olunur.
Her örnek için 1.5 µL fragmentasyon ürünü 4 µL (6X) yükleme boyası ile karıştırılır ve
120 V’da 30 dakika yürütülür.
3.6.1.10. İşaretleme
PCR cihazı, örnekler yüklenmeden önce 37 °C’ye ayarlanır. Bu sırada buzda işaretleme
reaksiyon solüsyonu hazırlanır. Örnek başına; 14 µL (5X) TdT Buffer, 2 µL (30 mM)
DNA İşaretleme Reaktifi ve 3.5 µL (30 U/µL) TdT Enzim’i kullanılır. Ardından bu
karışımdan 19.5 µL, fragmente edilmiş örneklerin üzerine eklenir ve iyice karışmaları
sağlanır. Böylece reaksiyon hacmi 73 µL’ye ulaşır. Bu karışım 2000 rpm hızda 30 saniye
santrifuj edilir ve daha önceden 37 °C’ye ısıtılmış olan PCR cihazında (Applied
Biosystems Veriti, ABD) 4 saat ardından 95 °C’de 15 dakika inkübasyona bırakılır.
3.6.1.11. Hedef Hibridizasyonu
Bu aşama için hibridizasyon fırını (GeneChip® Hybridization Oven 640, Affymetrix,
ABD) önceden ısıtılmalıdır. Fırının sıcaklığı 50 °C’ye ve hızı 60 rpm’e ayarlanır. Çipler
fırına konulmadan önce fırın boş bir şekilde 1 saat çalıştırılır.
Çiplerin Hazırlanışı; çipler paketlerinden çıkartılarak oda sıcaklığında 10-15 dakika
bekletilir. Ardından çipin sağ üst kısmında bulunan delik 200 µL’lik pipet ucu ile tıkanır.
Hibridizasyon Reaksiyon Karışımının Hazırlanışı; Çip başına; 12 µL (12X; 1.25 M)
MES, 13 µL (50X) Denhard Solusyon’u, 3 µL (0.5 M) EDTA, 3 µL (10 mg/mL) HSDNA,
2 µL OCR (0100), 3 µL (1 mg/mL) Human Cot-1 DNA, 1 µL (%3) Tween-20, 13 µL
(%100) DMSO, 140 µL (5 M) TMACL (Tetrametil Amonyum Klorid) karıştırılarak
toplam hacmi 190 µL olan reaksiyon karışımı elde edilir. Reaksiyon karışımı 73 µL’lik
işaretleme reaksiyon ürünü ile karıştırılarak toplam 263 µL’lik reaksiyon karışımı elde
edilir ve 95 °C’de 10 dakika inkübe edilir.
54
Örneğin Çipe Yüklenmesi; 200 µL denature edilmiş örnek, çipin sol alt kısmında
bulunan delikten çipe injekte edilir ve çipte bulunan her iki delikte Şekil 3.5‘de
gösterildiği gibi yuvarlak yapışkan bant ile kapatılır.
Şekil 3.5. Affymetrix® Human GeneChip Genome-Wide Human SNP 6.0 çip görüntüsü
Ardından çipler dengeli bir şekilde hibridizasyon fırınına yerleştirilir. Çiplerin oda
sıcaklığında 1.5 dakikadan daha uzun süre kalmamasına dikkat edilmelidir. Çipler 50 rpm
hızda 50 °C’de 16-18 saat inkube edilir.
Hibridizasyon işleminin ardından çiplerin yıkama, boyama ve tarama aşamaları
gerçekleştirilir. Yıkama ve boyama aşaması için Fluidics Station 450 cihazı, tarama
aşaması için GeneChip® Scanner 3000 7G kullanılmıştır.
3.6.2. Yıkama
16-18 saatlik hibridizasyonun ardından çiplerin içindeki hibridizasyon karışımı tüplere
transfer edilerek -80 °C’de saklanabilmektedir. Çipler 270 µL Array Holding Buffer
(Affymetrix 901691, ABD) ile doldurulur. Bu aşama GeneChip® için otomatize edilmiş
Fluidics Station450/250 cihazında gerçekleştirilir.
55
Yıkama Solusyonlarını Hazırlanışı;
Wash A (6X SSPE, %0.01 Tween 20); 300 mL (20X) SSPE, 1.0 mL (%10) Tween-20 ve
699 mL dH2O karıştırılır. Hazırlanan solüsyon 0.2 μm filtreden geçirilir.
Wash B (0.6X SSPE, %0.01 Tween 20); 30mL (20X) SSPE, 1.0mL (%10) Tween-20 ve
969 mL dH2O karıştırılır. Hazırlanan solüsyon 0.2 μm filtreden geçirilir.
Anti-Streptavdin Antibody; 0.5 mg/mL Anti-Streptavdin Antibody 1mL suda çözülür.
12X MES Stok Buffer (1.22 M MES, 0.89 M (Na+)); 70.4 g MES hidrat, 193.3 g MES
Sodium tuzu, son hacim 1 L olacak şekilde dH2O ile tamamlanır. pH 6.5-6.7’ye
ayarlandıktan sonra 0.2 μM filtreden geçirilir.
1X Array Holding Buffer (100 mM MES, 1M (Na+), %0.01 Tween-20); 8.3 mL (12X)
MES Stock Buffer, 18.5 mL (5 M) NaCl, 100 μL (%10) Tween-20 karıştırılır ve
son hacim 100 mL olacak şekilde dH2O ile tamamlanır. Işıktan korunarak 2-8
°C’de saklanır.
3.6.3. Boyama
Boyama Solüsyonlarının Hazırlanışı;
Stain Buffer; 300 µL (20X) SSPE, 3.3 µL (3%) Tween-20, 20 µL (50X) Denhardt
Solüsyonu, 666.7 µL dH2O karıştırılır.
SAPE Boya Solüsyonu; 495 µL Stain Buffer, 5 µL (1 mg/mL) Streptavidin Phycoerythrin
karıştırılır (SAPE). Bu solüsyonu içeren tüp, Fluidics Station450/250 cihazının 1.
tüp konumuna yerleştirilir.
Antikor Boya Solüsyonu; 495 µL Stain Buffer, 5 µL (0.5 mg/mL) Biyotinlenmiş Antikor
karıştırılır. Bu solüsyonu içeren tüp, Fluidics Station450/250 cihazının 2. tüp
konumuna yerleştirilir.
56
Array Holding Buffer: 8.3 mL (12X) MES Stok Buffer, 18. 5mL (5 M) NaCl, 0.1 mL
(10%) Tween-20, 73.1 mL dH2O karıştırılır. Koyu renkli tüp içerisine 800 µL
Array Holding Buffer konularak Fluidics Station450/250 cihazının 3. tüp
konumuna yerleştirilir.
Fluidics Station450/250 cihazının tüp konumlarına yerleştirilen solüsyonlardan sonra
cihaz çalıştırılarak yıkama ve boyama işlemi gerçekleştirilir. İşlemin bitmesinin ardından
çipler cihazdan çıkartılarak içlerinde hava kabarcığı olup olmadığı kontrol edilir. Hava
kabarcığı olmadığından emin olunduktan sonra tarama işlemine geçilir.
3.6.4. Tarama
Çiplerin taraması için The GeneChip Scanner 3000 7G tarayıcısı kullanılır. Cihaz tarama
işlemi başlamadan 10 dakika önce çalıştırılır. Bu sırada çipin üzerinde bulunan iki delik
tekrar kapatılır. Çipler tarayıcıya yerleştirilerek görüntüleme işlemi gerçekleştirilir. Çipin
beklenen görüntüsü Şekil 3.6.a‘de gösterildiği gibidir.
Şekil 3.6. Çipin tarayıcı tarafından oluşturulan genel görüntüsü
a. Çipin beklenen görüntüsü; b. Yüksek kalitede sonuç veren bir çipin sol alt köşesinde oluşması beklenen
görüntü; c. Yüksek kalitede sonuç veren bir çipin (kopya sayısı değişikliklerini analiz etmek amacı için)
ortasında oluşması beklenen “+” işareti.
57
3.6.5. Veri Analizi
Çiplerin tarayıcı tarafından oluşturulan görüntüleri üzerinde de kalite kontrolü
yapılmaktadır. Çipin görüntüsünün sol alt köşesinde Şekil 3.6.b‘da gösterildiği şekilde,
kullanılan çipin adının gözükmesi gerekmektedir. Ayrıca kopya sayısı değişikliklerini
göstermek amacı ile çipin ortasında Şekil 3.6.c‘de gösterildiği gibi bir “+” işareti
görülmelidir.
Tarama işleminin ardından cihaz .CEL uzantili bir dosya oluşturur. Tarayıcı tarafından
oluşturulan bu dosya Affymetrix Genotyping Console ™ programı kullanılarak analiz
edilir.
Bunun için öncelikle bir çalışma alanı oluşturulur. Bu alan veri setleri ve SNP listesini
içermektedir. Veri setleri kullanılarak, tablo ve grafikler elde edilebildiği gibi, SNP
genotipleri, QC değerleri (kalite kontrol değeri), SNP grupları da elde edilebilir. “.CEL”
uzantılı dosya kullanılarak oluşturulan veri setleri ile SNP okuma değeri (SNP call rate),
Hardy-Weinberg p değeri, minor allel frekansı ve SNP annotasyonlarını içeren “.CHP”
dosyaları oluşturulur.
Veri Filtreleri; oluşan verinin içinde bulunan, kalitesi kötü okumaları filtreleyerek daha
temiz ve güvenilir bir veri elde etmek amacı ile kullanılır. Bu amaçla kullanılan filtreler;

QC değeri filtreleme; Bu değer elde edilen okumanın kalitesini gösteren bir
değerdir ve Genome-Wide SNP 6.0 çipleri için kullanılan en düşük QC değeri
0.4’dür.

SNP seviyesinde filtreleme; Bu sayede düşük SNP okuma değeri olan,
kontrollerdeki Hardy-Weinberg değerinin dışında olan ve mendeliyen hatası olan
SNP’lerin uzaklaştırılmasını sağlamaktadır.
Böylelikle elimizdeki veri yanlış pozifitliklerin çok düşük olduğu daha güvenilir bir veri
haline gelir.
58
3.7. Bağlantı Analizi ve Otozigozite Haritalaması
DNA mikrodizin yöntemi sonrasında elde edilen bireylere ait SNP genotipleri, Microsoft
Excel programına aktarılır. Her aile için ayrı dosyalar oluşturulur. Tüm aile bireyleri aynı
Microsoft Excel dosyasında birleştirilir. SNP’ler öncelikle kromozom numarasına,
ardından genomik lokalizasyonlarına göre sıralanır. Elde edilen kromozomal lokalizasyon
UCSC veri tabanının Mart 2006 (NCBI36/hg18) tarihinde güncelleştirilmiş insan genomu
versiyonuna aittir (http://genome.ucsc.edu/). Bugüne kadar tanımlanmış 39 sendromik
olmayan,
otozomal
resesif
işitme
kaybı
yaptığı
tanımlanmış
genin
genomik
lokalizasyonları da UCSC veri tabanı kullanılarak belirlenir. Bu genler, hazırlanmış SNP
verilerini içeren Microsoft Excel tablolarında ilgili genomik lokalizasyonlara yerleştirilir.
Etkilenmiş bireylerin genotipleri, bilinen bir geni homozigot olarak çevreliyorsa yani
ailedeki her etkilenmiş birey aynı allel için homozigot ise, bu gendeki homozigot bir
mutasyonun ailedeki işitme kaybına neden olabileceği düşünülür. Bu durumda anne ve
babanın heterozigot, ailedeki etkilenmemiş bireylerin de heterozigot ya da diğer allele
homozigot olmaları gerekmektedir.
Bugüne kadar tanımlanmış sendromik olmayan, otozomal resesif işitme kaybı yaptığı
tanımlanan genleri çevreleyen homozigot bloğun bulunmadığı ailelerde; genom boyunca 1
Mb’dan büyük olan otozigot bölgeler belirlenir. Bu bölgeler için de aynı şekilde; ailedeki
tüm etkilenmiş bireylerin aynı allele homozigot, anne ve babanın heterozigot, ailedeki
etkilenmemiş bireylerin ise heterozigot veya diğer allele homozigot olmaları beklenir. Bu
tez çalışmasında, bu bölgeleri saptamak amacıyla iki yöntem kullanılmıştır. Her iki
yöntem içinde DNA mikrodizin analizinden elde edilen ve Microsoft Excel programına
aktarılmış verileri kullanılmaktadır.
Birinci yöntemde, easyLINKAGE adı verilen bir bağlantı analizi programı ile ailedeki
homozigot bölgeler belirlenmektedir (Hoffmann and Lindner 2005). Ardından bu işlemin
bir benzeri Microsoft Excel programının macro opsiyonu ile bir tarama yapılarak
tekrarlanmaktadır. Bu yöntem kapsamında kullanılan çiplerin yaklaşık olarak bir milyon
adet SNP içeriği bulunmaktadır. Bu da tüm genomu taramak için kullanılan bu SNP’lerin
birbirlerine yeteri kadar yakın olduklarını göstermektedir. Bu amaçla yazılan macro ile;
birbirini takip eden 40 satır boyunca, etkilenmiş tüm bireylerin aynı alele homozigot
olduğu bölgeler saptanmıştır. Ardından bu veride bu bölgelerin tüm ailede hastalığa uygun
59
şekilde segrege olanları (etkilenmemiş bireylerde ise heterozigot veya diğer allele
homozigotluk) tespit edilmektedir.
Sadece easyLINKAGE programının kullanılmamasının sebebi; program içerisinde veriyi
karşılaştırmak amacı ile bulunan en kapsamlı SNP haritası Affymetrix 500K çiplerine
aittir. Bu çiplerin SNP içeriği yaklaşık olarak 500.000 yani bizim kullandığımız çipin
içeriğinin yarısı kadardır. Bu durumda sadece bu program ile analiz yapıldığında elde
edilecek otozigot bloklar aslında olduğundan daha büyük veya bazı durumlarda daha
küçük gözükmesine sebep olmaktadır. Bu durum hedef aldığımız bölgenin, asıl hedef
alınması gereken bölgeden farklı olması anlamına gelmektedir. Bu ise aday
varyantın/genin kaçırılması yani istemsiz yere elenmesine neden olmaktadır.
3.8. Tüm Ekzom Sekanslama
Teknik üç temel aşama içermektedir. Bunlar; hedef bölgelerin seçimi (capture), seçilen bu
bölgelerin sekanslaması ve veri analizidir (Şekil 3.7).
60
Şekil 3.7. Tüm ekzom sekanslama yöntemi için akış şeması
61
3.8.1. Hedef Bölgelerin Seçimi (Capture)
Bu teknikte, iki yönlü sekanslama yapmak amacıyla kullanılacak örneğin kütüphanesini
oluşturmak için Agilent Technologies firması tarafından geliştirilmiş “SureSelect® Target
Enrichment System” (hedef zenginleştirme) kitleri kullanılmıştır. Agilent Technologies
firması tarafından geliştirilen ve hedef bölgelerin zenginleştirilmesini amaçlayan bu
sistem, yüksek verimli hibrid seçimi tekniğine dayanır ve yeni jenerasyon sekanslama için
optimize edilmiştir. Bu sistem Illumina firmasına ait Genome Analyzer ve HiSeq, Applied
Biosystems firmasına ait SOLiD, ve Roche firmasına ait 454 Life Sciences FLX
cihazlarında iki veya tek yönlü sekanslama protokolleri için uygundur.
Hedef bölgelerin seçimi 4 temel aşamadan oluşmaktadır. Bunlar;
1. Örneğin Hazırlanması
2. Hibridizasyon
3. Hibridizasyon Sonrası Amplifikasyon ile İndeks-Barkod İşaretlenmesi
4. Çoklu (Multiplex) sekanslama için örnek havuzunun oluşturulması
Bu teknikte, bu sistem kapsamında önerilen Illumuna® Paired-End Library Preperation Kit
(Illumina® PE-102-1001, ABD) ve
Illumina® Multiplexing Samle Preperation
Oligonucleotide Kit (Illumina® PE-400-1001, ABD) kullanılmıştır. Her bir örneğin
sekanslanması için, ayrı ayrı kütüphane oluşturulması, hibridizasyon ve hedef bölgelerin
seçimi aşamaları gerçekleştirilir. Ardından örnekler PCR tekniği kullanılarak barkodlanır.
SureSelect Capture Kiti; sekanslanmak istenen hedef bölgelerin boyutuna bağlı olarak
maksimum 12 örneklik bir havuz oluşturmak koşulu ile, örnekleri indeks-barkod işaretleri
sayesinde tek sırada sekanslamaya imkan sağlamaktadır. Bu yöntemin temel basamakları
Şekil 3.8’da gösterilmektedir.
62
Şekil 3.8. SureSelect Target Enrichment Sistemi akış şeması
(Agilent Technologies firmasının kullanma klavuzundan alınarak türkçeleştirilmiştir.)
63
3.8.1.1.
Örneğin Hazırlanması
DNA örneğinin hazırlanması (Şekil 3.9) için gerekli basamaklar;
1.
DNA örneğinin konsantrasyonunun Qubit™ florometre cihazı ile belirlenmesi
2.
DNA’nın parçalanması
3.
Agencourt AMPure XP boncukları ile örneğin pürifikasyonu
4.
Agilent
Technologies
2100
Bioanalyzer
cihazı
ile
öneğin
kalitesinin
değerlendirilmesi
5.
Örneğin uçlarının onarımı
6.
Agencourt AMPure XP boncukları ile örneğin pürifikasyonu
7.
DNA fragmentlerinin 3’ ucuna Adenin bazının eklenmesi
8.
Agencourt AMPure XP boncukları ile örneğin pürifikasyonu
9.
İndekslemeye özel iki yönlü adaptör ligasyonu
10.
Agencourt AMPure XP boncukları ile örneğin pürifikasyonu
11.
Adaptör eklenmiş DNA kütüphanesinin amplifikasyonu
12.
Agencourt AMPure SPRI XP boncukları ile örneğin pürifikasyonu
13.
Agilent
Technologies
2100
Bioanalyzer
değerlendirilmesi
64
cihazi
ile
öneğin
kalitesinin
Şekil 3.9. DNA örneğinin hazırlanma aşamaları
(www.illumina.com’da değiştirilerek alınmıştır.)
1. DNA Örneğinin
Konsantrasyonunun
Qubit™
Florometre
Cihazı
ile
Belirlenmesi
Sekanslanacak her örnek için ayrı bir DNA kütüphanesi oluşturulur. Bunun için öncelikle
genomik DNA örneğinin konsantrasyonu, Qubit™ dsDNA BR Assay (Invitrogen Q32850,
ABD) yardımıyla Qubit™ Florometre cihazı (Life Technologies PN Q32857, ABD)
kullanılarak belirlenir. Bu aşamada dikkat edilmesi gereken nokta DNA örneğinin degrade
olmamış olması ve yüksek kalitede olmasıdır (A260/A280 değeri 1.8 ile 2.0 arasında
olmalıdır).
65
2. DNA’nın Parçalanması
Genomik DNA örneği; 1.5 mL LoBind tüpünün (Eppendorf 022431021, ABD) içinde, 1X
Low TE Buffer (Applied Biosystems 4389764, ABD) ile toplam konsantrasyonu 3 µg ve
son hacmi 120 µL olacak şekilde ayarlanır.
Bu işlem için Covaris® S-Serisi Tek Tüp Örnek Hazırlama Sistemi (Covaris Model S2,
ABD) kullanılır. İşleme başlamadan önce öncelikle cihazın su tankının dolu olduğundan
emin olunur. Cihaz her zaman taze dH2O ile doldurulmalıdır. Ardından suyun, cihazın
tüpünün görünür kısmını kapladığından emin olunur. Sıcaklık 2-5 °C arasında ayarlanır ve
su banyosundaki sıcaklığın 5 °C olduğundan emin olunur. Cihazın kullanımından 30
dakika önce cihaz üzerinde bulunan “de-gas” düğmesine basılarak içeride birikmiş olan
hava boşaltılır. Ardından Covaris® mikrotüpleri (Covaris 520045, ABD) kapakları açık
bir şekilde yükleme ve boşaltma istasyonlarına konur. 120 µL örnek cihazın “pre-split
septa” kısmına aktarılır. Bu aşama sırasında hava kabarcığı oluşturmadan örneğin transferi
önemlidir. Ardından mikrotüp cihazın tüp tutma kısmına güvenli bir şekilde yerleştirilir ve
DNA parçalama işlemi başlatılır.
İşlem sonunda elde edilecek örneğin uzunluğu 150-200 bç boyutunda olmalıdır. Ardından
Covaris® mikrotüpü kapağı açık bir şekilde yükleme ve boşaltma istasyonlarına geri
konur. 120 µL örnek “pre-split septa” kısmından pipet yardımıyla çekilerek yeni bir 1.5
mL LoBind tüpüne aktarılır.
3. Agencourt AMPure XP Boncukları ile Örneğin Pürifikasyonu
SPRI XP boncukları (Beckman Coulter A63880, ABD) kullanılmadan en az 30 dakika
önce oda sıcaklığında bekletilir. Solüsyon iyice karıştırılarak renginin homojen hale
gelmesi sağlanır. Ardından 180 µL homojen sıvı solüsyon halindeki SPRI XP boncukları
1.5 mL LoBind tüpüne aktarılır ve üzerine bir önceki basamakta elde edilmiş DNA
kütüphanesi (~120 µL) eklenir. Vorteks karıştırıcıda iyice karıştırılır ve oda sıcaklığında 5
dakika inkubasyona bırakılır. Tüpler inkübasyonun ardından manyetik plaka üzerine
konur. 3-5 dakika solüsyonun berraklaşması beklenir. Tüp manyetik plakanın
üzerindeyken boncuklara dokunmadan, berraklaşan solüsyon tüpten uzaklaştırılır.
66
Manyetik plaka üzerindeki her tüpe 500 µL %70’lik etanol (Sigma-Aldrich E7023, ABD)
eklenir. Bir dakika bekletildikten sonra etanol uzaklaştırılır. Bu basamak bir kez daha
tekrar edilir. Ardından örnekler 37 °C’ye ayarlanmış ısı bloğunda 5 dakika veya etanolün
tamamen buharlaştığından emin oluncaya kadar bekletilir. Tüplerin içine 30 µL
nükleazlardan arındırılmış dH2O eklenir ve iyice karıştırılır. Tüpler oda sıcaklığında 2
dakika inkübasyona bırakılır. Tüpler tekrar manyetik plaka üzerine konur ve solüsyon
berraklaşana kadar 2-3 dakika bekletilir. Yaklaşık 30 µL supernatant yeni 1.5 mL LoBind
tüpüne aktarılır (Şekil 3.10).
Şekil 3.10. Agencourt AMPure XP boncukları ile pürifikasyon yönteminin basamakları
(Agencourt AMPure XP kitinin kullanma klavuzundan değiştirilerek alınmıştır.)
4. Agilent Technologies® 2100 Bioanalyzer Cihazı ile Öneğin Kalitesinin
Değerlendirilmesi
Bu aşama için Agilent Technologies® Bioanalyzer DNA 1000 Kitinin (Agilent
Technologies PN 5067-1504, ABD) çip ve solüsyonları kullanılmıştır (Agilent
Technologies G2938C, ABD). Öncelikle cihazın elektrotlarının temiz olduğundan emin
olunur. Cihaz içerisinde analiz amacıyla kullanılan program Agilent Technologies® 2100
Expert Software (B.02.02 veya yüksek versiyonu)’dır.
Çip, örnekler ve marker kitin kullanma klavuzunda belirtildiği şekilde hazırlanır.
Hazırlanmış çipler Agilent Technologies® 2100 Bioanalyzer cihazına yüklenir ve çipin
yürütülmesi
gerçekleştirilir. Ardından sonuçlar analiz
edilir. Elektroferogramlar
değerlendirilir. Oluşan pikin yüksekliğinin 150-200 nükleotid civarında olması
gerekmektedir (Şekil 3.11).
67
Şekil 3.11. Parçalanmış DNA örneğinin temsili Bioanalyzer görüntüsü
5. Örneğin Uçlarının Onarımı
Öncelikle DNA örneği içermeyen reaksiyon solüsyonu hazırlanır. Bunun için her DNA
kütüphanesi başına; Paired-End Sample Preperation Kit (Illumuna PE-102-1001, ABD)
içinde bulunan 46 µL nükleazlardan arındırılmış dH2O, 10 µL (10 mM ATP içeren) T4
DNA Ligaz Buffer, 4 µL (10 mM) dNTP karışımı, 5 µL T4 DNA Polimeraz, 1 µL Klenow
DNA Polimeraz ve 5 µL T4 PNK karıştırılır. Her DNA kütüphanesi başına; 71 µL
reaksiyon karışımı, 29 µL DNA örneğine eklenir ve 20 °C’de 30 dakika inkubasyona
bırakılır.
6. Agencourt AMPure XP Boncukları ile Örneğin Pürifikasyonu
SPRI XP boncukları kullanılmadan en az 30 dakika önce oda sıcaklığında bekletilir.
Solüsyon iyice karıştırılarak renginin homojen hale gelmesi sağlanır. Ardından 180 µL
homojen sıvı solüsyon halindeki SPRI XP boncukları 1.5 mL LoBind tüpüne aktarılır
(~120 µL) eklenir. Vorteks karıştırıcıda iyice karıştırılır ve oda sıcaklığında 5 dakika
inkubasyona bırakılır. Tüpler inkübasyonun ardından manyetik plaka üzerine konur. 3-5
dakika solüsyonun berraklaşması beklenir. Tüp manyetik plakanın üzerindeyken
boncuklara dokunmadan, berraklaşan solusyon tüpten uzaklaştırılır. Manyetik plaka
üzerindeki her tüpe 500 µL %70’lik etanol (Sigma-Aldrich E7023, ABD) eklenir. Bir
68
dakika bekletildikten sonra etanol uzaklaştırılır. Bu basamak bir kez daha tekrar edilir.
Ardından örnekler 37 °C’ye ayarlanmış ısı bloğunda 5 dakika veya etanolün tamamen
buharlaştığından emin olunana kadar bekletilir. Tüplerin içine 32 µL nükleazlardan
arındırılmış dH2O eklenir ve iyice karıştırılır. Tüpler oda sıcaklığında 2 dakika
inkübasyona bırakılır. Tüpler tekrar manyetik plaka üzerine konur ve solüsyon
berraklaşana kadar 2-3 dakika bekletilir. Yaklaşık 32 µL supernatant yeni 1.5 mL LoBind
tüpüne aktarılır.
7. DNA Fragmentlerinin 3’ Ucuna Adenin Bazının Eklenmesi
Öncelikle DNA örneği içermeyen reaksiyon solusyonu hazırlanır. Bunun için her DNA
kütüphanesi başına; Paired-End Sample Preperation Kit (Illumuna PE-102-1001, ABD)
içinde bulunan 5 µL Klenow Buffer (10X), 10 µL dATP (1 mM) ve 3 µL Klenow
Fragmenti (3'-5' ekzominus) karıştırılır. Her DNA kütüphanesi başına; 17 µL reaksiyon
karışımı 32 µL DNA örneği ile iyice karıştırılır. 37 °C’de 30 dakika inkubasyona bırakılır.
8. Agencourt AMPure XP Boncukları ile Örneğin Pürifikasyonu
SPRI XP boncukları kullanılmadan en az 30 dakika önce oda sıcaklığında bekletilir.
Solüsyon iyice karıştırılarak renginin homojen hale gelmesi sağlanır. Ardından 90 µL
homojen sıvı solüsyon halindeki SPRI XP boncukları 1.5 mL LoBind tüpüne aktarılır ve
üzerine bir önceki basamakta elde edilmiş DNA kütüphanesi (~ 50µL) eklenir. Vorteks
karıştırıcıda iyice karıştırılır ve oda sıcaklığında 5 dakika inkubasyona bırakılır. Tüpler
inkübasyonun ardından manyetik plaka üzerine konur. 3-5 dakika solüsyonun
berraklaşması beklenir. Tüp manyetik plakanın üzerindeyken boncuklara dokunmadan,
berraklaşan solusyon tüpten uzaklaştırılır. Manyetik plaka üzerindeki her tüpe 500 µL
%70’lik etanol (Sigma-Aldrich E7023, ABD) eklenir. Bir dakika bekletildikten sonra
etanol uzaklaştırılır. Bu basamak bir kez daha tekrar edilir. Ardından örnekler 37 °C’ye
ayarlanmış ısı bloğunda 5 dakika veya etanolün tamamen buharlaştığından emin olunana
kadar bekletilir. Tüplerin içine 15 µL nükleazlardan arındırılmış dH2O eklenir ve iyice
karıştırılır. Tüpler oda sıcaklığında 2 dakika inkübasyona bırakılır. Tüpler tekrar manyetik
69
plaka üzerine konur ve solüsyon berraklaşana kadar 2-3 dakika bekletilir. Yaklaşık 15 µL
supernatant yeni 1.5 mL LoBind tüpüne aktarılır. Yaklaşık 15 µL supernatant yeni 1.5 mL
LoBind tüpüne aktarılır. Bu işlemden sonra hiç bekletilmeden diğer basamağa
geçilmelidir.
9. İndekslemeye Özel İki Yönlü Adaptör Ligasyonu
Bu basamakta 3 μg başlangıç konsantrasyonu olan bir genomik DNA için, 10:1 molar
oranında adaptör kullanılır. Öncelikle DNA örneği içermeyen reaksiyon solüsyonu
hazırlanır. Bunun için her DNA kütüphanesi başına; 25 µL (2X) DNA Ligaz Buffer, 6 µL
Index PE Adaptör Oligo Solüsyonu ve 5 µL DNA Ligaz karıştırılır. Kütüphane başına 36
µL reaksiyon karışımı 14 µL DNA örneği ile iyice karıştırılır. 20 °C’de 15 dakika
inkubasyona bırakılır.
10. Agencourt AMPure XP Boncukları ile Örneğin Pürifikasyonu
SPRI XP boncukları kullanılmadan en az 30 dakika önce oda sıcaklığında bekletilir.
Solüsyon iyice karıştırılarak renginin homojen hale gelmesi sağlanır. Ardından 90µL
homojen sıvı solüsyon halindeki SPRI XP boncukları 1.5 mL LoBind tüpüne aktarılır ve
üzerine bir önceki basamakta elde edilmiş DNA kütüphanesi (~50 µL) eklenir. Vorteks
karıştırıcıda iyice karıştırılır ve oda sıcaklığında 5 dakika inkubasyona bırakılır. Tüpler
inkübasyonun ardından manyetik plaka üzerine konur. 3-5 dakika solüsyonun
berraklaşması beklenir. Tüp manyetik plakanın üzerindeyken boncuklara dokunmadan,
berraklaşan solusyon tüpten uzaklaştırılır. Manyetik plaka üzerindeki her tüpe 500 µL
%70’lik etanol (Sigma-Aldrich E7023, ABD) eklenir. Bir dakika bekletildikten sonra
etanol uzaklaştırılır. Bu basamak bir kez daha tekrar edilir. Ardından örnekler 37 °C’ye
ayarlanmış ısı bloğunda 5 dakika veya etanolün tamamen buharlaştığından emin olunana
kadar bekletilir. Tüplerin içine 52 µL nükleazlardan arındırılmış dH2O eklenir ve iyice
karıştırılır. Tüpler oda sıcaklığında 2 dakika inkübasyona bırakılır. Tüpler tekrar manyetik
plaka üzerine konur ve solüsyon berraklaşana kadar 2-3 dakika bekletilir. Yaklaşık 52µL
supernatant yeni 1.5 mL LoBind tüpüne aktarılır.
70
11. Adaptör Eklenmiş DNA Kütüphanesinin Amplifikasyonu
Bu protokol, adaptör eklenmiş fragmentlerin yarısını kullanır. Diğer yarısı ise gerektiği
koşulda deneyin tekrarı için -20 °C’de saklamaya elverişlidir.
Öncelikle DNA örneği içermeyen reaksiyon solüsyonu hazırlanır. Bunun için her DNA
kütüphanesi başına, Multiplex Oligonukleotid Kit (Illumina® PE-4002-1001, ABD) içinde
bulunan, 11.5 µL nükleazlardan arındırılmış dH2O, 1 µL Illumina® InPE1.0 PCR Primer
(düz primer), 1 µL SureSelect Indexing Pre-Capture PCR Primer (ters primer), 10 µL (5X)
Herculase II Reaksiyon Buffer, 0.5 µL dNTP karışımı ve 1 µL Herculase II Polimeraz
(Agilent Technologies PN 600677, ABD)karıştırılır. DNA kütüphanesi başına, 25 µL
reaksiyon karışımı, 25 µL Index PE Adaptör Bağlanmış Kütüphane ile iyice karıştırılır.
Reaksiyon için gerekli olan sıcaklık koşulu; 98 °C’de 30 saniye, 5 siklus 98 °C’de 10
saniye, 65 °C’de 30 saniye, 72 °C’de 30 saniye ve 72 °C’de 5 dakika PCR cihazında
(Applied Biosystems Veriti, ABD) gerçekleştirilir.
12. Agencourt AMPure SPRI XP Boncukları ile Örneğin Pürifikasyonu
SPRI XP boncukları kullanılmadan en az 30 dakika önce oda sıcaklığında bekletilir.
Solüsyon iyice karıştırılarak renginin homojen hale gelmesi sağlanır. Ardından 90 µL
homojen sıvı solüsyon halindeki SPRI XP boncukları 1.5 mL LoBind tüpüne aktarılır ve
üzerine bir önceki basamakta elde edilmiş DNA kütüphanesi (~50 µL) eklenir. Vorteks
karıştırıcıda iyice karıştırılır ve oda sıcaklığında 5 dakika inkubasyona bırakılır. Tüpler
inkübasyonun ardından manyetik plaka üzerine konur. 3-5 dakika solüsyonun
berraklaşması beklenir. Tüp manyetik plakanın üzerindeyken boncuklara dokunmadan,
berraklaşan solusyon tüpten uzaklaştırılır. Manyetik plaka üzerindeki her tüpe 500 µL
%70’lik etanol (Sigma-Aldrich E7023, ABD) eklenir. Bir dakika bekletildikten sonra
etanol uzaklaştırılır. Bu basamak bir kez daha tekrar edilir. Ardından örnekler 37 °C’ye
ayarlanmış ısı bloğunda 5 dakika veya etanolün tamamen buharlaştığından emin olunana
kadar bekletilir. Tüplerin içine 30 µL nükleazlardan arındırılmış dH2O eklenir ve iyice
karıştırılır. Tüpler oda sıcaklığında 2 dakika inkübasyona bırakılır. Tüpler tekrar manyetik
plaka üzerine konur ve solüsyon berraklaşana kadar 2-3 dakika bekletilir. Yaklaşık 30 µL
supernatant yeni 1.5 mL LoBind tüpüne aktarılır.
71
13. Agilent Technologies® 2100 Bioanalyzer Cihazı ile Öneğin Kalitesinin
Değerlendirilmesi
Bu aşama için Agilent Technologies® Bioanalyzer DNA 1000 çip ve solüsyonları
kullanılır (Agilent Technologies G2938C, ABD). Öncelikle Bioanalyzer cihazının
elektrotlarının temiz olduğundan emin olunur. Cihaz içerisinde analiz amacıyla kullanılan
program Agilent Technologies® 2100 Expert Software (B.02.02 veya yüksek
versiyonu)’dır.
Çip, örnekler ve marker kitin kullanma klavuzunda belirtildiği şekilde hazırlanır.
Hazırlanmış
çipler 2100 Bioanalyzer cihazına
yüklenir
ve
çipin
yürütülmesi
gerçekleştirilir. Ardından sonuçlar analiz edilir. Elektroferogramlar değerlendirilir ve
oluşan pikin yüksekliğinin 250-275 nükleotid civarinda olması gerekmektedir (Şekil 3.12).
Şekil 3.12. Adaptör eklenmiş DNA kütüphanesinin temsili Bioanalyzer görüntüsü
72
3.8.1.2.
Hibridizasyon
1.
DNA Kütüphanesinin Hibridizasyonu
2.
Manyetik Boncukların Hazırlanışı
3.
SureSelect ile Hibrid Hedef Bölge Seleksiyonu
4.
Agencourt AMPure SPRI XP boncukları ile örneğin pürifikasyonu
1. DNA Kütüphanesinin Hibridizasyonu
Her DNA örneğinin kütüphanesi için, bir hibridizasyon ve bir hedef bölge seçim işlemi
gerçekleştirilir. Bu aşamada örnekler (DNA kütüphaneleri) havuz yapılmamalıdır. Eğer
hazırlanmış DNA kütüphanesinin konsantrasyonu 147 ng/µL’den düşük ise, konsantre
edici vakum cihazı yardımı örnek konsantre edilmelidir. Bunun için hazırlanmış tüm DNA
kütüphanesi (toplam 50 µL), 45 °C’de vakumlanır.
Ardından 25 µL SureSelect Hyb #1, 1 µL SureSelect Hyb #2, 10 µL SureSelect Hyb #3,
13 µL SureSelect Hyb #4 solusyonları karıştırılarak bir Hibridizasyon Buffer solüsyonu
oluşturulur. Ardından bu solüsyon 65 °C’de 5 dakika inkubasyona bırakılır. Bu sırada
hedef bölgenin zenginleştirilmesi için kullanılacak olan SureSelect Hedef Bölge
Kütüphanesi (Capture Library) karışımı hazırlanır. Bu aşama buzda gerçekleştirilmelidir. 5
µL örneğe (SureSelect DNA kütüphanesine), 2 µL RNase Block Dilusyonu (1:3 oranında
RNase Block/dH2O) eklenir. Ayrı bir PCR tüpünde SureSelect Block Karışımı için, 2.5 µL
SureSelect Indexing Block#1, 2.5 µL SureSelect Block#2, 0.6 µL SureSelect Indexing
Block#3 solüsyonları karıştırılır.
Bir 96 kuyucuklu PCR plakasının B sırasına ayrı bir örnek (toplam 12 kuyucuk/12 örnek)
olacak şekilde; 3.4 µL 147 ng/µL konsantrasyonda hazırlanmış DNA kütüphanesi
solusyonundan konur. Ardından 5.6 µL SureSelect Block Karışımı örneklerin üzerine
eklenir (B sırasına) ve pipetlenerek karışması sağlanır. Kuyucukların tepesi kapatılarak
plaka PCR cihazında 95 °C’de 5 dakika inkübe edilir ve 65 °C’de beklemeye bırakılır. Bu
aşamadan sonraki tüm basamaklar plaka 65 ºC’de inkübasyonda iken gerçekleştirilir. 40
µL Hibridizasyon Buffer plakanın A sırasındaki tüm kuyucuklara eklenir. Kuyucukların
tepesi kapatılarak plaka en az 5 dakika (65 ºC’de) bekletilir. Ardından 7 µL SureSelect
73
Hedeflenmiş Kütüphane Karışımı aynı plakanın C sırasında eklenir ve kuyucukların tepesi
kapatılarak 2 dakika daha (65 °C’de) inkubasyona bırakılır. Ardından A sırasından 13 µL
Hibridazasyon Buffer, C sırasındaki SureSelect hedeflenmiş kütüphane karışımına eklenir.
Ardından B sırasındaki Hazırlanmış Kütüphane Solüsyonu’nun tamamı C sırasına eklenir
ve 8-10 kere pipetaj yapılarak karışımın homojenizasyonu sağlanır (Şekil 3.13). Toplam
Hibridasyon Karışımı bu aşamada 27-29 µL arasındadır (buharlaşma oranına bağlı).
Kuyucukların tepesi iyice kapatılır ve plaka 65 °C’de 24 saat inkübasyona bırakılır.
Şekil 3.13. DNA kütüphanesinin hibridizasyon aşamaları (12 örneklik)
(Agilent Technologıes firmasının kullanma klavuzundan alınarak türkçelerştirilmiştir.)
74
2. Magnetik Boncukların Hazırlanışı
Bir sonraki basamakta kullanmak için SureSelect Wash Buffer #2, 65 °C’deki su
banyosunda önceden ısıtılır.
Kitin içinde bulunan Dynal MyOne Streptavidin T1 (Life Technologies 65601, ABD)
manyetik boncuklar kuvvetli bir şekilde vortekslenir. Her hibridizasyon karışımı için 50
µL Dynal manyetik boncuk, 1.5 mL’lik mikrosantrifuj tüpüne aktarılır. Boncukların
üzerine yıkama amacı ile, 200 µL SureSelect Binding Buffer eklenir ve 5 saniye
vortekslenir. Tüpler manyetik tabla üzerine yerleştirilir (Dynal Magnetic Separator, Life
Technologies PN 123-21D, ABD). Ardından süpernatant uzaklaştırılır. Bu yıkama aşaması
3 kez tekrar edilir. Boncuklar 200 µL SureSelect Binding Buffer ile sulandırılır.
3. SureSelect ile Hibrid Hedef Bölge Seleksiyonu
24 saat sonra hibridasyondan alınan hibridizasyon karışımının hacmi ölçülür ve elde edilen
tüm karışım direkt olarak manyetik boncukların üzerine eklenir. Tüp 3-5 kere ters düz
edilerek solüsyonun iyice karışması sağlanır. Hibrid-Hedef bölge/boncuk karışımını içeren
solüsyon oda sıcaklığında 30 dakika inkübasyona bırakılır. Solüsyonun tüpte sürekli
karışma halinde olduğundan emin olunur. Ardından tüpler hızlıca santrifuj edilir ve DynaI
manyetik ayırıcı yardımıyla boncuklar ve tampon birbirinden ayrılır. Süpernatant
uzaklaştırılır.
Boncukların üzerine 500 µL SureSelect Wash Buffer #1 eklenir ve 5 saniye vortekslenir.
Ardından tüpler oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. Tüpler hızlıca santrifüj edilir ve
DynaI manyetik ayırıcı yardımıyla boncuklar ve tampon birbirinden ayrılır. Süpernatant
uzaklaştırılır.
Boncukların üzerine 500 µL SureSelect Wash Buffer #2 eklenir ve 5 saniye vortekslenir.
Tüpler 65 °C’de 10 dakika inkübe edilirken arada bir vortekslenir ve ardından hızlıca
santrifüj edilir. DynaI manyetik ayırıcı yardımıyla boncuk ve tampon birbirinden ayrılır.
Süpernatant uzaklaştırılır. SureSelect Wash Buffer #2 ile yıkama işlemi bir kere daha
tekrarlanır. Bu işlemler sırasında tüpten Wash Buffer’in uzaklaştırıldığından emin
75
olunmalıdır. Ardından boncuklara 50 µL SureSelect Elution Buffer eklenir ve 5 saniye
vortekslenir.
4. Agencourt AMPure SPRI XP Boncukları ile Örneğin Pürifikasyonu
SPRI XP boncukları kullanmadan en az 30 dakika önce oda sıcaklığında bekletilir.
Solüsyon iyice karıştırılarak rengin homojen hale gelmesi sağlanır. Ardından 180 µL
homojen SPRI XP boncukları 1.5 mL LoBind tüpüne eklenir ve üzerine bir önceki
basamakta elde edilmiş DNA kütüphanesi (~100 µL) eklenir. Vorteks karıştırıcıda iyice
karıştırılır ve 5 dakika inkubasyona bırakılır. Tüpler inkübasyonun ardından manyetik
plaka üzerine konur. 3-5 dakika solüsyonun berraklasması beklenir. Tüp manyetik
plakanın üzerindeyken boncuklara dokunmadan berraklaşan solüsyon tüpten uzaklaştırılır.
Ardından manyetik tabla üzerindeki her tüpe 500 µL %70’lik etanol (Sigma-Aldrich
E7023, USA) eklenir. 1 dakika bekletildikten sonra etanol uzaklaştırılır. Bu basamak bir
kere daha tekrar edilir. Ardından örnekler 37 °C ısı bloğunda 5 dakika veya etanol
tamamen buharlaşana kadar bekletilir. Tüplerin içine 30 µL nükleazlardan arındırılmış
dH2O eklenir ve iyice karıştırılır. Ardından tüpler oda sıcaklığında 2 dakika inkübasyona
bırakılır. Tüpler tekrar manyetik plaka üzerine konur ve solüsyon berraklaşana kadar 2-3
dakika bekletilir. Yaklaşık 30 µL süpernatant yeni 1.5 mL LoBind tüpüne aktarılır.
3.8.1.3
Hibridazasyon Sonrası Amplifikasyon ile İndeks-Barkod İşaretlerinin
Eklenmesi
1.
İndeks-Barkod
İşaretlerinin
Eklenmesi
için
Hedef
Bölge
Kütüphanesi
Amplifikasyonu
2.
Agencourt AMPure SPRI XP boncukları ile örneğin pürifikasyonu
3.
Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer cihazı ile öneğin kalitelerinin
değerlendirilmesi
4.
Q-PCR yöntemi ile işaretlenen kütüphanelerin kalitesinin değerlendirilmesi
76
1. İndeks-Barkod İşaretlerinin Eklenmesi için Hedef Bölge Kütüphanesinin
Amplifikasyonu
Her hibrid/hedef bölge için ayrı bir amplifikasyon reaksiyonu hazırlanır. Bunu için; buz
içinde bir PCR tüpüne 14 µL hedeflenmiş DNA, 22.5 µL nükleazlardan arındırılmış dH2O,
10 µL (5X) Herculase II Reaksiyon Buffer, 0.5 µL (herbiri 25 mM) dNTP, 1 µL Herculase
II Fusion DNA Polimeraz, 1 µL SureSelect Indexing Post-Capture PCR Primer (düz
primer) ve 1 µL Index PCR Primer (ters primer) karıştırılır. Reaksiyon solüsyonu pipetaj
yapılarak iyice karıştırılır. Eğer karışım birden fazla DNA kütüphanesi için hazırlanacaksa
örnek içermeyen 35 µL reaksiyon solüsyonuna 1 µL SureSelect Indexing Primer
(Illumina® Multiplexing Sample Preparation Oligonucleotide Kit/PE-400-1001 içinde
bulunan 12 primerden/indexden biri) eklenir.
Bazı sekanslama deneylerinde bir sırada 12’den daha az sayıda örnek kullanılır. Bu
durumda örneklerin yüksek yoğunlukta bir kümeleştirme oluşturmaları söz konusudur. Bu
nedenler kullanılacak indexlerin çok dikkatli bir sekilde seçilmesi gerekmektedir. Bu
durum için Illumina firması tarafından tavsiye edilen index setleri aşağıda belirtildiği
şekildedir.

İki örneklik bir havuz için; index #6 GCCAAT ve index #12 CTTGTA

Üç örneklik bir havuz için; index #4 TGACCA, index #6 GCCAAT ve index #12
CTTGTA

Altı örneklik bir havuz için; index #2 CGATGT, index #4 TGACCA, index #5
ACAGT, index #6 GCCAAT, index #7 CAGATC ve index #12 CTTGTA
Sekans cihazında aynı sırada (flow cell üzerindeki tek bir sıra/lane) yürütülecek her DNA
kütüphanesi için değişik bir index kullanılır. Ardından tüplere 14 µL örnek eklenerek
pipetaj yardımıyla sıvının iyice karışması sağlanır. Örnek içermeyen negatif kontrol
mutlaka eklenir. Reaksiyon için gerekli olan sıcaklık koşulu; 98 °C’de 30 saniye, 16 siklus
98 °C’de 10 saniye, 57 °C’de 30 saniye, 72 °C’de 30 saniye ve 72 °C’de 5 dakika PCR
cihazında (Applied Biosystems Veriti, ABD) gerçekleştirilir (Şekil 3.14).
77
Şekil 3.14. İndeks-Barkod işaretlerinin eklenmesi için hedef bölge kütüphanesinin
amplifikasyon basamakları
(www.illumina.com’da değiştirilerek alınmıştır.)
2. Agencourt AMPure SPRI XP Boncukları ile Örneğin Pürifikasyonu
SPRI XP boncukları kullanmadan en az 30 dakika önce oda sıcaklığında bekletilir.
Solüsyon iyice karıştırılarak rengin homojen hale gelmesi sağlanır. Ardından 90 µL
homojen SPRI XP boncukları 1.5 mL LoBind tüpüne eklenir ve üzerine bir önceki
basamakta elde edilmiş DNA kütüphanesi (~50 µL) eklenir. Vorteks karıştırıcıda iyice
karıştırılır ve 5 dakika inkubasyona bırakılır. Tüpler inkübasyonun ardından manyetik
plaka üzerine konur. 3-5 dakika solüsyonun berraklasması beklenir. Tüp manyetik
plakanın üzerindeyken boncuklara dokunmadan berraklaşan solüsyon tüpten uzaklaştırılır.
Ardından manyetik plaka üzerindeki her tüpe 500 µL %70’lik etanol (Sigma-Aldrich
E7023, ABD) eklenir. 1 dakika bekltildikten sonra etanol uzaklaştırılır. Bu basamak bir
kere daha tekrar edilir. Ardından örnekler 37 °C ısı bloğunda 5 dakika veya etanol
tamamen buharlaşana kadar bekletilir. Tüplerin içine 30 µL nükleazlardan arındırılmış
dH2O eklenir ve iyice karıştırılır. Ardından tüpler oda sıcaklığında 2 dakika inkübasyona
78
bırakılır. Ardından tüpler tekrar manyetik plaka üzerine konur ve solüsyon berraklaşana
kadar 2-3 dakika bekletilir. Yaklasık 30 µL süpernatant yeni 1.5 mL LoBind tüpüne
aktarılır.
3. Agilent Technologies® 2100 Bioanalyzer Cihazı ile Örneğin Kalitesinin
Değerlendirilmesi
Bu aşama için Bioanalyzer DNA 1000 çip and solüsyonları kullanılır (Agilent
Technologies G2938C, ABD). Öncelikle 2100 Bioanalyzer cihazının (Agilent Techologies
G2938C, ABD) elektrotlarının temiz olduğundan emin olunur. Cihaz için kullanılan
program “Agilent Technologies® 2100 Expert Software” (B.02.02 veya yüksek
versiyonu)’dır.
Çip, örnekler ve marker kitin kullanma klavuzunda belirtildiği şekilde hazırlanır.
Hazırlanmış
çipler 2100 Bioanalyzer cihazına
yüklenir
ve
çipin
yürütülmesi
gerçekleştirilir. Ardından sonuçlar analiz edilir. Elektroferogramlar değerlendilirir ve
oluşan pikin yüksekliğinin 330-345 nükleotid civarında olması gerekmektedir (Şekil 3.15).
Şekil 3.15. İndeks-Barkod işaretleri eklenmiş DNA kütüphanesinin temsili Bioanalyzer
görüntüsü
79
4. Q-PCR Yöntemi ile İşaretlenen DNA Kütüphanelerinin Miktarlarının
Değerlendirilmesi
Bioanalyzer cihazının kuantitasyon sonucuna göre, örnekler 10 nM dilusyonunda
hazırlanır. Bu basamak için Agilent Technologies Q-PCR NGS Library Quantification Kit
(Ilumina G4880A, ABD) ve Stratagene Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Green QPCR
Master Mix (Agilent Technologies 600882, ABD) kullanılır.
Kesin sonuç elde etmek için; reaksiyonun gerçekleştirileceği 96 kuyucuklu plakada her
örnek için hazırlanan dilüsyonlar birer kere daha tekrar etmelidir. Öncelikle kontrol DNA
örneğinden, birbirlerinin 10 katı olacak şekilde 5 dilüsyon (0.0001 pM, 0.001 pM, 0.1 pM,
1 pM, 10 pM) hazırlanır ve her dilüsyon 96 kuyucuklu plakada 2 ayrı kuyucuğa konur.
Her reaksiyonda, DNA örneğinin bulunmadığı negatif kontrol reaksiyonu olmalıdır (2 ayrı
kuyucuk). Bu durumda tek seferde 21 adet DNA kütüphanesinin değerlendirmesi
yapılabilmektedir.
Kitin içinde bulunan 200X Dilüsyon Buffer dH2O ile 1X olacak şekilde dilüye edilir.
Kontrol DNA örneğinin dilüsyonları için 100 µL 1X Dilüsyon Buffer gereklidir. 100 pM
konsantrasyondaki kontrol DNA’sı, hazırlanan 1X Dilüsyon Buffer ile firmanın önerisi
doğrultusunda her biri diğerinin 10 katı olan 5 dilüsyon şeklinde hazırlanır. Dilüsyon
konsantrasyonları 0.001 pM ile 10 pM arasındadır. Her dilüsyondan iki adet hazırlanır.
Her dilüsyon 2 µL kontrol DNA, 18 µL 1X Dilüsyon Buffer şeklinde hazırlanır.
1 mM stok referans boya ddH2O ile dilüye edilmelidir. 1:50 oranında hazırlanacak
dilüsyon sonrasında reaksiyon için kullanılacak boyanın konsantrasyonu 20 µM olur.
Her bir DNA kütüphanesi için, birbirinin 10 katı olan 2 adet dilüsyon hazırlanır. Herbir
DNA kütüphaneside kontrol DNA’sı gibi iki adet hazırlanır. DNA kütüphaneleri, 1X
Dilüsyon Buffer kullanılarak 1 pM ile 10 pM arasında dilüye edilir. Dilüsyon
hazırlanırken kullanılan dilüsyon faktör sayısı unutulmamalıdır. Ortalama 300 bazçifti
olan
DNA
kütüphanesi
için
1-10
pM
konsantrasyondadır (Şekil 3.16).
80
aralık
yaklaşık
olarak
0.2-2
ng/mL
Q-PCR reaksiyonu için kuyucuk başına; 5.3 µL dH2O, 10 µL 2X Brilliant III Master Mix,
10X GC Additive, 0.4 µL 50X Illumina® GA Primer Mix, 0.3 µL dilüye edilmiş Referans
Boya karıştırılır. Her kuyucuğa 18 µL’lik reaksiyon karışımı eklenir. Ardından 2 µL
dilüye edilmiş DNA örneği (kontrol DNA/DNA kütüphanesi) eklenir böylece reaksiyonun
toplam hacmi 20 µL’ye ulaşır.
Ardından plaka Q-PCR cihazına yerleştirilir. Reaksiyon için gerekli olan sıcaklık koşulu;
95 °C’de 3 dakika, 30 siklus 95 °C’de 20 saniye, 60 °C’de 30 saniye PCR cihazında
(Applied Biosystems Veriti, ABD) gerçekleştirilir. Cihaz her siklusun 60 °C’deki
bağlanma/uzama zamanında floresan ışıma değerlerini ölçmektedir.
Şekil 3.16. Q-PCR yöntemi ile işaretlenen kütüphanelerin miktarlarının değerlendirilmesi
(Agilent Technologies Q-PCR NGS Library Quantification Kit klavuzundan değiştirilerek alınmıştır.)
81
Elde edilen verilerin analizi için; öncelikle cihaz tarafından elde edilen kontrol DNA
dilüsyonlarından çizilecek standart eğriye ihtiyaç vardır. Bu elde edilen standart eğrinin
R2 değerinin 0.98 değerinden büyük olması ve amplifikasyon veriminin %90-110 arasında
olması gerekmektedir. Eğer kontrol DNA’sının dilüsyonlarından oluşturulan eğri bu
değerleri
karşılamıyorsa
elde
edilecek
konsantrasyon
değerleri
gerçeğe
yakın
olmayacaktır.
Her DNA kütüphanesi dilüsyonu için; kontrol DNA’sı ile oluşturulan standart eğri
kullanılarak (yani Ct değeri baz alınarak) konsantrasyon hesaplanır. Eğer her dilüsyon için
hazırlanan iki ayrı reaksiyonun Ct değerleri birbirlerine yakın ise iki değerin ortalaması
alınır. Eğer sadece bir Ct değeri kullanılabilecek değer aralığında ise sadece sınırlar
içerisinde olan değer kullanılır ve diğer değer elimine edilir. Çoklu sekanslama için
kullanılacak her örneğin konsantrasyonları birbirine eşit olmalıdır.
Eğer elde edilen ortalama hedef kütüphane uzunluğu 288 bç’den çok farklı ise (>310 bç
veya <260 bç) konsantrasyon aşağıda belirtilen formüle göre hesaplanmalıdır (Ortalama
hedef kütüphane uzunluğu Agilent Technologies® 2100 Bioanalyzer cihazı yardımıyla
veya agaroz jel kullanılarak tahmini olarak ölçülmektedir).
Kullanılacak konsantrasyon: ölçülen konsantrasyon X (288 bç/kütüphanenin ortalama
uzunluğu)
3.8.1.4
Çoklu Sekanslama için Örnek Havuzunun Oluşturulması
Çoklu (Muptiplex) sekanslama aynı sırada birden fazla örneğin havuz yapılarak
sekanslanmasına olanak sağlayan bir aşamadır. Örneklerin büyüklüklerine göre havuz
yapılacak örnek sayısı değişiklik göstermektedir. Bu basamak iki aşamadan oluşmaktadır.
1. DNA örneğinin kümeleştirilmesi için hazırlanması
2. Örneklerin havuz oluşturmak için hazırlanması
82
1. DNA Örneğinin Kümeleştirilmesi için Hazırlanması
Deneyin bu aşaması için öncelikle DNA örneğinin konsantrasyonu yüksek hassasiyete
sahip bir cihaz ile ölçülmelidir. Bunun için Qubit™ Florometre cihazı kullanılır.
DNA’nın, elde edilen konsantrasyona göre 5-500 pg/µL arasında birkaç değişik dilusyonu
hazırlanır. Bu hazırlanan dilusyonlar Agilent Technologies® Bioanalyzer 2100 cihazında
HS DNA çipi kullanılarak yürütülür. Elde edilen sonuçlar (örneklerin numaraları, indeksbarkod numaraları, boyutları, pg/µL ve pmol/L değerleri) Microsoft Excel dosyasında
kaydedilir (Çizelge 3.1).
Çizelge 3.1. Örneklerin Bioanalyzer Sonuçları
Örnekler
Barkod
No
ortalama
fragment
uzunluğu (bç)
BIOANALYZER
pg/ul
BIOANALYZER
pmol/l
BIOANALYZER
nmol
Aile1-101
Aile2-102
Aile3-103
7
11
12
314
298
371
1112.5
499.68
402.72
5365.8
2540.4
1642.8
5.3658
2.5404
1.6428
2. Örneklerin Havuz Oluşturmak için Hazırlanması
Illumina®’nın cBot kullanma klavuzunda belirtildiği şekilde öncelikle havuz oluşturulacak
örnekler arasında aynı indeks-barkodun tekrar etmediğinden emin olunur. Örnekler 5 nM
olacak şekilde yeni bir 0.5 mL tüpte dilüye edilir. İki yönlü sekanslanacak (paired-end)
kütüphaneler için gerekli olan konsantrasyon 5 nM, ~2,0 ng/µL adaptörler dahil 310 bç
fragmentlerdir. Bunun için DNA örneklerinin konsantrasyonları EB Buffer ile son hacmi
20 µL olacak şekilde ayarlanır. Bunun için aşağıda belirtilen formül kullanılır.
(Son örnek hacmi) = (toplam son hacim X son konsantrasyon) / (Bioanalyzer nM
konsantrasyonu)
Ardından örnekler yeni bir tüpte havuz oluşturmak için birleştirilir. Havuza eklenecek her
DNA kütüphanesi için, aşağıda gösterilen formül kullanılarak hangi miktarda örnek
konulacağı hesaplanır.
83
Kullanılacak örnek miktarı = V(f) x C(f) / # x C(i)
Formülde bulunan;

V(f); havuzun istenilen son hacmini,

C(f); havuzdaki total DNA’nin istenilen son konsantrasyonu,

#; havuz yapılacak örnek sayısını (indeks-barkod işaretlerinin sayısı),

C(i); her bir barkodlanan örneğinin başlangıçtaki konsantrasyonunu (Bioanalyzer
konsantrasyonu) ifade etmektedir.
Dört örneklik bir havuz oluşturmak için gerçekleştirilen temsili hesaplanma Çizelge 3.2’de
yer almaktadır.
Çizelge 3.2. Dört örneklik bir havuz oluşturmak için gerçekleştirilen temsili hesaplama
İçerik
V(f)
C(i)
C(f)
#
Kullanılacak hacim (µL)
DNA kütüphanesi 1 (örnek 1)
20
20 nM
10 nM
4
2.5
DNA kütüphanesi 2 (örnek 2)
20
10 nM
10 nM
4
5
DNA kütüphanesi 3 (örnek 3)
20
17 nM
10 nM
4
2,9
DNA kütüphanesi 4 (örnek 4)
20
25 nM
10 nM
4
2
EB Buffer
7,6
3.8.2. Sekanslama
Sekanslama aşaması iki temel basamaktan oluşmaktadır. Bunlardan ilki hedef bölgelerin
seçimi aşamasında elde edilen fragmentlerin kümeleştirilmesi, diğeri ise bu fragmentlerin
sekanslanmasıdır. Sekanslama işlemi için kullanılacak aparatın adı “flow cell” dir. Flow
cell Şekil 3.17’da görüldüğü gibi boylamasına 8 sıra içeren silika bir slayt şeklindedir. Her
sıra 2 kolon, her kolon ise 50 adet hücre içermektedir. Bu silika yüzeye bağlı yoğun
miktarda kısa adaptörler (oligonükleotit) bulunmaktadır. Bu sayede sekanslanacak
fragmentler bu oligonükleotidlere yani adaptörlere bağlanmak koşuluyla kümeleştirilir
yani çoğaltılmaları sağlanarak sekanslanır.
84
Şekil 3.17. Bir flow cell görüntüsü
(http://biosciences.exeter.ac.uk‘den değiştirilerek alınmıştır.)
3.8.2.1.
DNA Örneğinin Kümeleştirilmesi
Bu işlem için Illumina® firmasının cBot cihazı (SY-301-2002, ABD) ve TruSeq PairedEnd Cluster Generation Kiti (PE-401-3001) kullanılmıştır. Bu yöntem 3 temel aşama
içermektedir. Bunlar;
1. DNA’nın denatürasyonu
2. Denatüre edilmiş DNA’nın hibridizasyon aşaması için dilüsyonu
3. Hibridizasyondur.
85
1. DNA’nın Denatürasyonu
Öncelikle DNA kalıbı, son konsantrasyonu 1 nM olacak şekilde 2 N NaOH ile denatüre
edilir. 1 nM dilüsyon için öncelikle, havuz yapılacak örnekler için gerekli hacmin
hesaplanması gerekmektedir. Bunun için aşağıda belirtilen formül kullanılır.
(havuz yapılacak örneklerin hacmi) = (son hacim / havuzun son konsantrasyonu)
Ardından reaksiyon karışımına eklenecek EB Buffer miktarı hesaplanır. Bunun için
aşağıda belirtilen formül kullanılır.
(kullanılacak EB Buffer hacmi) = 19-(havuz yapılacak örneklerin hacmi)
Bunun için 2 µL (10 nM) kalıp DNA, 17 µL EB Buffer ve 1 µL (2 N) NaOH toplam
hacim 20 µL olacak şekilde karıştırılır. Böylelikle son DNA konsantrasyonu 1 nM olur.
Tüp dikkatlice vortekslenir. Kalıp DNA’nın tek zincir haline gelmesi yani denatürasyonu
için oda sıcaklığında 5 dakika inkübasyona bırakılır. Ardından tüp buz içerisinde
bekletilir.
2. Denatüre Edilmiş DNA’nın Hibridizasyon Aşaması için Dilüsyonu
Illumina®’nın cBot kullanma klavuzunda belirtildiği şekilde öncelikle HT1 Hibridizasyon
Buffer (PE-300-1001, Genome Analyzer Paired-End Cluster Generation Kit), -20 ºC’den
çıkartılarak buza gömülür ve erimesi sağlanır.
Dilüsyona başlamadan önce flow cell için gerekli olan pM konsantrasyonunun
ayarlanması gereklidir. Bu çalışma için pM konsantrasyonu 4.5’dir. Bu hacim aynı
zamanda kullanılacak 1 nM denatüre edilmiş DNA’nın hacmidir. HT1 Hibridizasyon
Buffer hacmini hesaplamak için aşağıda belirtilen formül kullanılır.
(HT1 hacmi)= 1mL-(1nM denatüre edilmiş DNA’nın hacmi)
Ardından tüp dikkatlice vortekslenir ve santrifüj edilir.
86
3. Hibridizasyon
8’li şerit şeklindeki tüplerin 4. sırada bulunanına 120 µL kitin içinde bulunan kontrol DNA
kütüphanesi (PhiX174 kontrol kütüphanesi), diğerlerine ise her 1 nM denatüre edilmiş ve
havuz yapılmış DNA’dan 120 µL konur. Ardından hazırlanan 8’li şerit tüpler Illumina®
cBot cihazına yüklenir.
Cihazın ana 4 kısmı bulunmaktadır. Bunlar, iki adet 8’li şerit şeklindeki tüplerin (havuz
DNA’lar ve amplifikasyon primeri) yerleştirildiği kısım, kit içinde hazır gelen 96
kuyucuklu kimyasal plakasının konulduğu kısım, örnekleri flow cell’e yüklemek için
kullanılan kapiller ve flow cell’dir (Şekil 3.18).
Şekil 3.18. Illumina® cBot cihazının kısımları
(Illumina® cBot Cluster Station kullanma klavuzundan değiştirilerek alınmıştır.)
87
Kümeleştirme aşaması Illumina® cBot cihazında aşağıdaki basamaklarda gerçekleştirilir.
Cihazda gerçekleştirilen basamaklar Şekil 3.19’de gösterilmektedir. Temel olarak çoklu
sekanslama için havuzlanmış örneklerin, flow cell üzerinde bulunan adaptörlere
hibridizasyonu birinci aşamadır. Ardından bu fragmentlerin küme oluşturması için gerekli
olan aşamalar olan denatürasyon, hibridizasyon ve uzama işlemleri gerçekleştirilir. Bu
aşamalar için gerekli olan sıcaklık değerleri ve zaman ayarları cihazın kullanma
klavuzunda belitildiği şekilde uygulanmış, kullanılan solüsyonlar ise cBot Cluster
Generation Kit içinde 96 kuyucuklu solüsyon plakası şeklinde hazır olarak gelmiştir.
Cihaz içerisine yüklenen DNA fragment kütüphanesi dilüye edilir, denatüre edilir ve flow
cell’deki sıralara cihazda bulunan kapillerler aracılığı ile yüklenir. Fragmentler silika
tabana bağlı olan adaptörlere bağlanır. Adaptörlere bağlanan 3’ ucundan uzama
gerçekleştirecek olan fragmentler kovalent bağ ile bağlanır. Çift sarmal halindeki
fragmentler dentüre edilir ve böylece tek zincir orjinal fragmentler yıkama ile temizlenir.
Bir ucu silika tabandaki adaptörlere bağlı, diğer ucu ise serbest olan fragmentler izotermal
yolla bükülerek bitişiklerinde bulunan silika tabana bağlı diğer adaptörlere bağlanırlar.
Böylece U-şekilli köprüler oluştururlar. Bu köprüler reaksiyona eklenen primerler
sayesinde uzama reaksiyonu ile çift zincir haline getirilir. Bu çift zincirli fragmentler
tekrar denatüre edilir. Serbest uçları bitişiklerinde bulunan silika tabana bağlı diğer
adaptörlere bağlanır. Yeni köprüler oluşturulur ve tekrar uzama reaksiyonu ile çift zincir
haline getirilir. Bu siklus 35 kere tekrar ederek her bir fragment için yaklaşık 2000
molekül yoğunluğunda bir küme oluşturulur. Tüm bu işlemlerin ardından oluşan küme
içerisinde silika tabana ters ve düz fragmentler yer almaktadır. Son aşama olarak tüm ters
fragmentler uzaklaştırılır ve sekanslanmak üzere her bir küme içerisinde sadece düz
fragmentler bulunur.
88
Şekil 3.19. DNA örneğinin kümeleştirme işleminin basamakları
(Illumina® firmasının cBot cihazına ait kullanma klavuzundan değişitirilerek alınmıştır.)
3.8.2.2.
Sekanslama
Adaptörlere bağlanmış olan fragmentleri sekanslanmak için kümeleştirme işlemi sonlanan
flow cell, Illumina® firmasının yeni nesil sekanslama cihazlarından biri olan HiSeq™
2000’e yüklenir. Bu basamak için cihazın kullandığı tüm solüsyonlar ve kontrol örnekleri
Multiplexing Sequencing Primers (Illumina® PE-400-1002, ABD) ve PhiX Control Kit
(Illumina® PN CT-901-2001, ABD) ve HiSeq Paired-End Cluster Generation Kit
(Illumina® PE-401-1001, ABD) içerisinde hazır olarak gelmektedir. Sekanslama için
gerekli olan bütün sıcaklık değerleri ve diğer cihaz ayarları cihazın kullanma klavuzunda
89
belirtildiği şekilde kullanılmıştır. Sekanslama işlemi sırasında gerçekleştirilen basamaklar
Şekil 3.20’de gösterilmiştir.
Şekil 3.20. Illumina® HiSeq™ 2000 cihazı ile sekanslama işleminin akış şeması
Cihazın kullanacağı solüsyonlar kitlerin içerisinde hazır gelmektedir. Tüm solüsyonlar
Illumina® HiSeq 2000 cihazının kullanma klavuzunda öngörüldüğü miktar ve
konsantrasyonda kullanılmıştır. Bu tez çalışmasında sekanslanan örneklere iki yönlü
sekanslama protokolü uygulanmıştır. Bu protokol için gerekli olan kimyasallar da yine
kitlerin içerisinde hazır gelmektedir ve cihazın kullanma klavuzunda belirtildiği miktar ve
konsantrasyonda kullanılmıştır.
90
Cihazda gerçekleştirilen reaksiyon Şekil 3.21’da gösterilmektedir. Illumina firmasina ait
HiSeq 2000 platformu “geri dönüştürülebilir sonlandırmalı sentezleyerek sekanslama”
yöntemini kullanmaktadır. Cihaz, uygun sıcaklık koşulları altında flow cell’in her sırasına
eşit miktarda olmak koşulu ile sekans solüsyonlarını enjekte etmektedir. Her siklus;
solüsyonların içerisinde bulunan bazların fragmente bağlanması, bağlanmayan flor işaretli
dNTP’lerin uzaklaştırılması ve signalin (floresan ışımanın) algılanması ve fotoğraflanması
basamaklarını içerir. Her siklusta 4 adet floresan işaretli dNTP reaksiyon tüpünde eşit
miktarda bulunmaktadır. Siklus başına her fragmentte tek baz okunması gerçekleşir.
Toplam fragment uzunluğuna göre 101 siklus süren sekanslama işlemi sonucunda yaklaşık
olarak her fragment 100 baz uzunluğunda bir okumaya sahip olur. Her bir okuma 2.5-3
Mb büyüklüğünde bir imaj dosyası oluşturur ve reaksiyon sonunda 115.000 adet imaj elde
edilir. Kümeleştirme işleminden sonra flow cell üzerinde gözüken her bir öbek (her bir
yoğun floresan ışıma) bir fragmente aittir. Yani sekanslama boyunca aynı noktadan elde
edilen tüm okumalar birleştirilerek o fragmentin dizisi elde edilmektedir. Çoklu
sekanslama için her bir örnek farklı bir barkod ile işaretlendiğinden dolayı hangi
fragmentin hangi örneğe ait olduğu ayır edilebilmektedir.
Birinci okuma bittikten sonra, iki yönlü okuma işlemi için flow cell içerisine cihaz
tarafından bir kimyasal solüsyon enjekte edilir. Bu solüsyon kümeleştirme işleminde
olduğu gibi fragmentlerin U-şekilli köprüler oluşturarak silika membran üzerinde bulunan
diğer adaptörlere bağlanmalarını sağlar. Ardından fragmentlerin birinci okuma sırasında
silika membrana bağlı olan uçları yüzeyde bulunan adaptörlerden ayrılır. Böylelikle birinci
aşamada okunan fragmentler yüzeye ters uçlarından bağlı kalırlar. İkinci okumanın amacı
aynı fragmentleri ters tarafından da okuyarak elde edilen verinin daha kuvvetli ve az hatalı
olmasını sağlamaktadır. Aynı sikluslar bu aşamada da tekrarlanır.
Birinci (düz) ve ikinci (ters) okumadan elde edilen veriler, görüntü/imaj dosyaları
şekindedir
ve
.tiff
dosya
91
formatındadır.
Şekil 3.21. Sekanslama işleminin temel basamakları
(Illumina® firmasının internet sitesinden değiştirilerek alınmıştır.)
92
3.8.3 Tüm Ekzom Sekanslama Veri Analizi
Sekanslama işlemi sırasında cihaz tarafından oluşturulan veri, .tiff dosyaları şeklindeki
görüntülerdir. Bu görüntülerin analiz edilebilir bir veri haline getirilmesi için bir takım
program/veri tabanları kullanılır. Bunlar;
1. HiSeqControl Software; İlk aşama olarak; elde edilen bu görüntülerin (.tiff
dosyalarının) bazlara çevrilmesi yani yaklaşık 150 bazlık okumalar haline getirilmesi
gerekmektedir. Bu işlem için HiSeqControl Software (Illumina®, ABD) kullanılmaktadır.
Bu program sayesinde her bir görüntüde bulunan ışımanın rengi bir baz ile eşleştirilir.
Ayrıca bu program her görüntüden elde edilen ışıma yoğunluğunu değerlendirir. Böylece
okunan her bazın kalitesi ölçülmiş olur. Sonuç olarak elimize geçen veri bir .txt
dosyasıdır. Bu dosyanın içeriğinde; sekanslanan örnekte bulunan yaklaşık 150 bazlık
milyonlarca amplikonun (fragmentin) dizisi, okunan her bir bazın kaç kere okundukları ve
bir takım kalite değerleri bulunmaktadır.
Ancak elimizdeki bu veri hala bir ham veri niteliğini taşımaktadır. Çünkü bu elde edilen
amplikonların genomun hangi bölgesine karşılık geldiği ile ilgili bir bilgi vermemektedir.
2. CLC Bio Genomics Workbench; İkinci aşama bir önceki program ile elde edilen
bu amplikonları insan genomu üzerine hizalamak ve referans dizi ile arasındaki
farklılıkları belirlemektir. Bu amaçla CLC Bio Genomics Workbench adı verilen Windows
tabanlı bir program kullanılır. Bu programın “High Throughput Sequencing” opsiyonu
kullanilarak verinin işlemleri gerçekleştirilir. Programa ilk olarak bir referans dizi
yüklenir. Bu dizi, elimizdeki okumaları karşılaştırmak istediğiniz dizidir. Tüm ekzom
sekanslama yöntemi için UCSC veri tabanının Şubat 2009 (GRch37/hg19) yılında
güncellenen insan genom sekansı dizisi kullanılır. Ardından bir önceki aşamadan elde
edilen iki adet .txt dosyası (birinci ve ikinci okumalardan ayrı ayrı elde edilen dosyalar)
programa yüklenir. Ardından programdaki “Map Reads to Reference (okumaları referans
dizi üzerine yerleştirme)” seçeneği kullanılır. Bu işlem sırasında birtakım parametreler
kullanılır. Bu parametreler içinde varyasyon içeren amplikonların; referans dizi ile
eşleştirilme sırasında elimine edilmemesi için önemlidir. Bu durumda fragment başına; 3
93
bazın farklılığı, 3 bazın insersiyonu ve 3 bazın delesyonu gözardı edilmektedir. Yani
referans dizi ile amplikon arasında yaklaşık olarak %80 benzerlik durumunda, bu
amplikon o bölgeye yerleştirilir. Böylelikle elde edilen tüm amplikonlar referans dizi
üzerine yerleşir ve tüm ekzom boyunca ne kadarlık bir bölgenin o örnekte sekanslandığı
görülür. Ardından programın varyant bulma (SNP ve insersiyon-delesyon) seçenekleri
kullanılır. Bu işlemin amacı, referans dizi ile sekanslanan örnek arasındaki farklı olan tüm
varyantların elde edilmesidir. Bu işlemden sonra elde edilen veri; kromozom numarası,
genomik
pozisyon,
referans
baz,
örneğin
genotipi,
o
nokta
için
örnekte
okunan/sekanslanan bazlar (heterozigotluk durumunda iki farklı baz) ve o noktayı/bazları
kaç kere okuduğu bilgilerinin bulunduğu bir tablodur. Ancak bu veri hala tam analize
hazır bir veri halinde değildir. Çünkü her ne kadar referans dizi ile sekanslanan örneğin
dizisi arasındaki farklılıklar saptanmış olsa da, bu farklı olan bazların tam olarak
ekzom/genom üzerinde nerede bulundukları bilgisine sahip değiliz.
3. SeattleSeq Annotasyonu; Son aşama olarak elimizdeki veride bulunan referans dizi
ile sekanslanan örneğin dizisi arasındaki farklılıkların; ekzom/genom üzerindeki
lokalizasyonları ve fonksiyonları hakkındaki bilgilere ihtiyaç vardır. Bu amaçla CLC Bio
programından elde edilen tablo Washington Üniversitesi tarafından oluşturulan SNP veri
tabanına (http://snp.gs.washington.edu/SeattleSeqAnnotation134) yüklenir. Bu veri tabanı
ile her bir farklı baz için elde edilen bilgiler;
1. Herhangi bir SNP veri tabanına kayıtlı olup olmadığı, kayıtlı ise rs numarası
2. Bir SNP olarak tanımlanmış ise, SNP olarak tanımlanan baz
3. Bir transkriptin içine denk geliyorsa, transkriptin RefSeq numarası
4. Fonksiyonu (missense, nonsense, frame-shift, synonymous, intronic, splice, UTR,
intergenik, near gene)
5. Amino asit değişimi
6. Protein düzeyinde değişen amino asitin numarası
7. cDNA düzeyinde değişen bazın numarası
8. Gen adı
9. Korunmuşluk değerleri (Grantham Skoru, Phas Skoru, GERP Skoru)
10. Aynı genomik pozisyonda şempanze genotipi
11. Polyphen2 skoru
94
4. Fitreleme; Elimizdeki annote edilmiş veri birtakım filtrelerden geçirilerek
ailelerdeki aday genleri bulmaya yönelik olarak analiz edilir.
Baz Coverage; Aynı noktadaki bazın tüm okuma değerini ifade eder (yani kaç amplikon
tarafından
o
bazım
kapsandığını
ifade
eder).
Bir
kalite
değeri
olarak
da
kullanılabilmektedir. Baz coverage değeri ne kadar artarsa elde edilen veri o kadar
güvenilir olur. Ancak şunu da unutmamak gerekir ki; ekzom genelinde bazı bölgeler , o
bölgenin baz içeriği ve yapısı nedeni ile zor amplifiye olan bölgelerdir. Bu nedenle
filtreleme sırasında bu değer ne kadar yüksek tutulursa, o bölgelerdeki bazları eleme
olasılığı da o kadar artar. Biz analizlerimizi yaparken elde edilen verinin herhangi bir zayıf
okumayı atlamaması ancak aynı zamanda bir veya iki kere okunan yanlış okuma
değerlerini de içermemesi amacı ile minimum sınır olarak 4X coverage değerini kullandık.
Nadir Varyantlar; Bizim amacımız nadir varyantları bulmaktır. Bu sebeple elde edilen
veriden tüm bilinen/tanımlanmış SNP’ler filtrelenir.
Homozigot Varyantlar; Çalışmaya katılan ailelerin yapısı nedeni ile (akraba evliliği olan
otozomal resesif kalıtım) ailedeki işitme kaybına sebep olan varyantın homozigot olduğu
düşünülür. Bu durunda veriden tüm heterozigot varyantlar filtrelenir. Ancak bu filtreleme
sırasında heterozigotluk oranı %70 olarak seçilmiştir. Bunun amacı bazı bazların;
sekanslanan amplikonların en baş veya en sonda bulunan ilk üç baza denk gelerek,
sekanslama sırasında yanlış okunabilmeleridir. Filtreleme sırasında herhangi bir veri kaybı
olmaması amacı ile %30’luk bir yanlış okumayı göz ardı etmeyi tercih ettik.
Fonksiyon; Aradığımız varyantların bir proteinin fonksiyonunu değiştirerek işitme
kaybına yol açtığını düşünülür. Bu durumda synonymous, intronik, intergenik, genlerin
UTR bölgelerinde veya genlerin yakınlarında bulunan tüm varyantlar filtrelenir.
Otozigozite Haritalaması Sonucu ile Birleştirme; Elimizde geriye kalan veri hala büyük
bir veridir. Bundan sonra yapılacak olan filtreleme için DNA mikrodizin analizi verisi
kullanılır. Ailelerimizin yapısından dolayı, ailedeki işitme kaybına sebep olan genin bir
homozigot blok içerisinde olduğu düşünülür. Bu doğrultuda tüm ekzom verisinde geriye
kalan varyantların içerisinden sadece DNA mikrodizin analizi sonucunda gerçekleştirilen
otozigozite haritalamasından elde ettiğimiz homozigot bölgelerin içerisinde bulunan
95
varyantlar seçilir. Bu varyantlardan bir tanesinin o ailede aradığımız nadir variant olması
beklenir.
Tüm bu filtrelemeler sonucunda elde edilen varyantlar, öncelikle PCR ile çoğaltılır ve
klasik DNA dizi analizi yöntemi ile öncelikle yeni nesil sekanslama işlemi uygulanan
bireyde doğrulanır, ardından tüm aile bireylerindeki segregasyonu kontrol edilir.
3.9
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Yapılan DNA mikrodizin analizi ve tüm ekzom sekanslama analizi sonuçlarına göre; üç
ailede elde edilen tüm varyasyonlar için değişime uğrayan bazı içine alacak şekilde
primerler dizayn edilmiştir (http://frodo.wi.mit.edu/).
Her bölge için her biri 0.1 µg/mL konsantrasyonunda primer setleri kullanılmıştır. PCR
reaksiyonları için; son konsantrasyonu 1X (10X) olacak şekilde PCR Buffer, 200 μM
dNTP (her biri 2 mM konsantrasyonda) (Invitrogen 18427-088, ABD), 1.5 mM (50 mM)
MgCl2, 0.4mM (20 μM) düz ve ters primerler (IDT, ABD), 1 U (5 U/µL) Platinum® Taq
DNA Polimeraz (Invitrogen 10966034, ABD), kullanılır ve reaksiyonun hacmi dH2O ile
25 µL’ye tamamlanır. Polimeraz zincir reaksiyonu için gerekli olan sıcaklık koşulu; 94 °C
3 dakika, 2 siklus 94 °C’de 5 saniye, 65 °C’de 30 saniye, 72 °C’de 30 saniye, 2 siklus 94
°C’de 5 saniye, 63 °C’de 30 saniye, 72 °C’de 30 saniye, 2 siklus 94 °C’de 5 saniye, 61
°C’de 30 saniye, 72 °C’de 30 saniye, 2 siklus 94 °C’de 5 saniye, 59 °C’de 30 saniye, 72
°C’de 30 saniye, 2 siklus 94 °C’de 5 saniye, 57 °C’de 30 saniye, 72 °C’de 30 saniye, 32
siklus 94 °C’de 5 saniye, 55 °C’de 30 saniye, 72 °C’de 45 saniye ve 72 °C’de 3 dakika
PCR cihazında gerçekleştirilmiştir (Applied Biosysytems Veriti, ABD). Bu tez
çalışmasında kullanılan tüm primer çiftleri bu touch-down sıcaklık koşulu (td) kullanılarak
amplifiye edilmiştir. Ancak bazı primer çiftlerinin amplifikasyonu sırasında 4 µL (5 M)
Betaine (b) (Sigma-Aldrich B0300, ABD)’e ihtiyaç duyulmuştur. Bu bölgeler primer
çizelgelerinde “+b” şeklinde belirtilmiştir.
96
3.9.1. Bilinen İşitme Kaybı Genlerinin Elenmesi
Aile 1’de en büyük otozigot bölge içerisinde 2010 yılında tanımlanmış olan PTPRQ geni
bulunmaktadır. bu amaçla öncelikle bu gen PCR yöntemiyle çoğaltılmış ve ardından
Sanger sekanslama ile taranmıştır. Genin kodlayan her ekzonu için dizayn edilen primerler
Çizelge 3.3’de gösterilmektedir.
Çizelge 3.3. PTPRQ genini çoğaltmak için kullanılan primer dizileri ve PCR ürün
boyutları
Ekzon
No
Ekzon Bilgisi
Düz Primer Dizisi (5'-3')
Ters Primer Dizisi (5'-3')
1
2
3
4
5
6
7-8
9-12
13-14
15
16
17
18
19-20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48-49
50
51
52-53
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
only refseq
only refseq
only refseq
only ensembl
only ensembl
only ensembl
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
ensemble+refseq
AATGCAGGCAACATTTCTCTC
TTTAGCTTGCTTGCTTTCCAG
CAGAGCTGTAGGGAGTGTGAAC
TTCGAAGAAACCCTTGATGG
CTGAATGAGGCCAATTGTGT
AAGTGGCCATGCTACTGAGAA
CCCTCAACAAAGTAGGCATCA
ATTGCCCAGGCTTGCTTAG
TTGACAGACCGCTAGCAAGA
TGTATTTAATAGGGTGCGCTTTC
CACTTGAATTGTTGTCTTTGGC
AGCCACCGCACCTAGCC
CAGCATGATTCCAAAGTTATAGG
CATGGAGAGATTAATGAATACGGAG
TAAATGGCACCAATCCCAAG
AGGGTCTAAAGCAACAAACATC
GCAAGATATGTTCCTATAGTTCCAAG
CAGCCATTTCATAGTTTGCC
GAGAAAAGCACTGAACCTAATTCC
TGTTTGGACAATGAAAACATCAG
GGTAAAATTCAGGCCATTTCAG
AAAACCACCATCTATTTCTCTTTTAG
AAGAGCTGATGATGTAATAGTTGCC
TCTGCTAAGAAAATCAAATCCC
TCAAGAAAGTAAGTCACGGTGC
TGCCCAATTCATCCTTGTATC
CAACAGCCTTTTGATTCTGTC
TTGACAGATCTCTACTAGCTCCTCC
TTATTGTGCTGTAGCAAGTACTAATTC
CNTAGCTTTGTATTATTATGTTTTGG
GCAGTTTATATGGTTTAATTTGTGG
GAAATACTTCATTGTTAATGTTCTTCC
GTGCCTGAAAATCACACCTG
TTGCATCGAGAGTCCCC
TCCTGATGATGATTCCATTCC
AGAGGAACAAACAAGCTGCTAC
TTCAGAGAGGTGATTTTAACAAGG
TCTTTCAGAATTAGCTGTCCACTC
AAGCCAGNGCCAATGCTAAC
AAGAGCAAAACCCAGCTGAC
TACCGCCATCTGTGAAATTG
GGTAATTTTACAACCAGCATATGTTTC
TGGGACTATTGCCTTCAACC
CATCAAAATGAACAACCCTTTG
AGCTTTAACAATATAACTCCCTTTATG
TCACAGCCTAAGTCAGCATTTC
TGAATTTAATGTACNTGTTGCCAG
GTGTGAGGCCATGACTGTG
AACTGCAGACATAAATGGGTACAA
TTTTTATTTTAGGCAAAGTTCAGTT
ATCTTATGGATAAGTCAAAGTTTTGTT
GCCATCTGTCACCCCTTTC
GGGTTTTTGGTGTGGATGTC
AAGCTTTTTGGTGTGCTGCT
TCCTTATGACTTTCCTATTGTTTGC
GCTTCTAATATCATGTTTTACCAATTC
TGGGTGCTAGCAAATCTTCC
AAGCTTAGGTTCATTTCTGTGC
ATGGGCATATTTTCCACCAG
AGCATGAAGTGAAGGCAGTG
ATGGCGATTATCAGCTTTGC
TGACCTGCAATAAACTCCTAGC
CGCTGGTATGGTACACAACTG
TGTAGCACCACATTCTGAAATC
TACCAATGGGAAATTGAGGC
TGCCTAATTATCAATGTAAGGTAAAC
GGATGTTAGCAGTTTTCTTGAACAG
TCAGAAAGCAATGTAAATGAAAAG
CTTTCATATTCCATGCTGTTCC
CCATTTTCCTCCTATATGTCAAAAG
TGCAATTTCCCTTTGAGTAGAC
AGATTGCANGTGGTATTGACAC
TGTCGTTATATATGGTAGTGTCCTCAG
TTCAAATAGTCTGGTTCCAAATC
TGTAAGAAAGCCAGCTAAATCTC
AAAAGATATGGGAAATGTCATGTG
TCACTTAAAGGCTTGTCTACATCC
GAAGCTATCAAGATTCCATCTTACC
ATGAAAGGACAGGCAGATGG
AACCTTCACAGGTACTCCTAAACC
GGCTTCTNTCTCCTGATTGG
GAATAGGGTCATGGCTCCAG
TGAATCACACATTAAGGTTCTACTGAG
TGACACATGAAACGACTGGAG
AAGTGAACNTGTGTGAACAAACTG
AGCATATTAAGATCCATAGGAGTTG
GGTATCCTTGAAAGGGATAGTTC
CAAGCTGGAAGAAATTTACATGAAC
TGCTGCCACTAAGATCTCCC
GGGTAACTTTGGCCCCTG
97
Ürün
Boyutu
(bç)
242
270
503
582
566
293
400
537
557
336
320
399
358
632
247
416
618
305
340
707
329
570
468
457
311
463
521
570
262
325
478
421
740
410
414
324
313
171
211
525
315
660
328
262
559
3.9.2. Aday Varyantların Doğrulanması
Tüm ekzom sekanslama verisinin analizi sonucunda elde edilen varyantlar ailedeki
segregasyonun doğrulanması amacı ile PCR yöntemiyle çoğaltılmış ve ardından Sanger
sekanslama ile taranmıştır. Her ailenin elde edilen aday varyantları için dizayn edilen
primerler dizileri Çizelge 3.4’de gösterilmektedir.
Çizelge 3.4 Aday varyantlar için kullanılan primerler dizisi ve ürün boyutları
Aile
No
Gen Adı
Varyasyonun Adı
Düz Primer Dizisi (5'-3')
Ters Primer Dizisi (5'-3')
Ürün
boyutu
(bç)
1
OTOGL
p.Cys1378Arg
CCTGAGTGACAGAGCGAGAC
CCTGCCACATAGTAGGCTCTC
243
1
OTOGL
p.Val477GlufsX25
TGCTTTTAAAGGATTAACCTAATGG
TCCATATTCCTCTGGTCATTTTG
407
2
C17orf77
p.Asp100Gly
TTGACCCCAAGATCAATTCC
CAGGCTGGGAGACCTACTTG
229
2
LGALS3BP
p.Thr556Ile
GGTTCTCCGGTTCTCACCAC
GACGAGCTCCCTGTCCTG
300
3
ADAMTS7
p.Ser1175Pro
GCCACGTCAGGACTAGGAGA
CACACAGCCATCCTGCTG
481
3
ZNF57
p.Thr443Met
AGCCCTATGAATGCAAGCAG
TGATTATGTAAGGTTGAGGACCA
565
3
GIPC3
p.His170Asn
TTCTGCGGATTGGAGGC
AGGCATCCGTAGAACGCAC
295
3
PTPRS
p.Thr496Pro
CATAACCCACAAACCGCTCT
TGGAGGACGAGACCTACACC
190
3
HNF4G
p.Gln421His
CAAATTACGCTAATGTGTATTGGTG
TGCCAAAAGTGCTATCCTGA
299
3.9.3. Sorumlu Genlerin Sekanslanması
Aile 1’de tanımlanan işitmeden sorumlu gen OTOGL için dizayn edilen primerlerin listesi
Çizelge 3.5’de, Aile 3’de tanımlanan sorumlu gen GIPC3 için dizayn edilen primerlerin
listesi Çizelge 3.6’de gösterilmektedir.
98
Çizelge 3.5. OTOGL genini çoğaltmak için kullanılan primer dizileri ve PCR ürün
boyutları
Ekzon No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39-40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50-51
52
53
54
55
56
57
58
Düz Primer Dizisi (5'-3')
CAATTTGGTTACATTTCAGGGG
TTCTTTTAAACAACTGGAACATGTAG
CTTGGGAAAGGCTTGTTCAG
CAATTTGCATGTTTGGCTTG
TGCTTAAAAGAACAAATGGATG
CCTGTGTTATAGACCAAGGAAGG
AACGTTGTAAAGTGTCATGGG
TTTGGAGCTCTTGCTGCAC
CCATGTCTGTTTGTGGAAAATG
GAGAACTGAAAATCTTGCAAATAGA
TGCACTCAGCATTTCTAGGG
CCATGAACTTGCATACTTTTTGA
TGCCTGAGAGTCAGGTTGTC
GCCAGCCAGCTCAAAATTAC
TGCTTTTAAAGGATTAACCTAATGG
CCTTCTCCCTTTCTCCCATC
GGAAGAGAGTCCTGGTGGTG
TTTCAAGCTGTAAGATTTCCTTG
AAGCTGAAATTGTTCACTCTTGT
CCCAATTCCTTGCCTTGTAA
TGACCAATGGAGAGCACAAG
GCTTGTAAAAACTTCTGTGGGAAA
GGAAGGCAGCTAACATTCTCA
ATGTGGAAAAAGCGAGGAGA
GAACTGGCAATATTCGTAAGGG
TGCAATCCATTGTCAATATTTAAG
AAAAGGCATGACCATGCAAC
AATTAAATTGGTATGAGAAAATCCAC
GGTTACTCTGTTTGAGAAATTGTCC
AGAGAACTCTCTAGGTGGCAGTG
GCCATATCTTGCCCACATTC
TTGCTCAATTTTTGAAGTATTTTG
ATGTTTGGCAATTGTGCAGT
CCTGAGTGACAGAGCGAGAC
AACGAAGTAGCAGATGGAGCA
TTCCCAAAACATTTTCCTTGA
CATCACAGGATTCTAGGAAGGAA
CATGGGCAATATGAATGTGG
TGATTTATGATTTTGGCTCACAG
TTTCTGAAAACCTTTCTTATCAATC
AGGCACAGCAAAGGAACAAT
TTTCAATGTAAAAGTTCAAGGATACA
GATTTGTGTAGATTAGTGCAGATGG
CATTGATGCCTTTGTTTCTGA
TGGTGATGAAAGAGAAATCTGAG
GATGTATGAATCAAGGGTGAAAGAC
GCNGACTTGTCTTGCTAATTTT
GTGTTCTATATGTCACTGTGCTTGG
CCAACACATGGCAATCTGAC
TTAAAGTGTCTGGCTGTGTGATAAG
GCTTTTGGAGGAAGTTCAATCA
GGAAGCTTCTCATATTCAACCTTAG
AGGGTCATTTTCAGATGGAAC
TGGAAGTAGTTTAGGTTATTTCAAGG
CATTATTACATGTGTGGAATATTTCTG
CAGAAGCTTGAGGGTTGGAG
Ters Primer Dizisi (5'-3')
Ürün Boyutu (bç)
TTCAAAGTGCTTTATAAGGGAAAAC
GGTTTGCTCATTCCCATTAAC
AAGTGACAGCAGAGTCCAAAAC
CCCCAAAGGGATTTTCTGAG
ATGCCTTAATTTTCTCCTTGG
TCGTAACTGAACCCAGACCC
TTCCAGCATGTGATGTTTGG
ACAAACAACTTGGTCAGGGG
CCTATTGCAATTACATTTCCTGG
TGTGAACAGCTGAAATGGTTAAG
TCAAAAAGTATGCAAGTTCATGG
CTGGGAAAGGACAGCAAAAC
TTTGTGTTGGAATTTGGGAAG
AGATGTCTTCATAAAGATCAGTGCTA
TCCATATTCCTCTGGTCATTTTG
AAGATCCCATTTTGTTTGCG
TGAATTTATATCCTTTAAATGACCAG
GCATTGATTTTACCATAATGGAG
TTTCATTTGCTTTTCATGTTTG
GCCCGTAAGGAGAAAAAGAG
AAACCTGCACGTTGTACACATA
CATGCACATTGGGAAGAAGA
CAGAACAACAATTCTGGCTATTTC
GGCTTGATTTACTTTTTGCTGA
CAGACCTTCCCAAGTACCCC
GACCATTTACAGAGAGGAGTAGACC
CAAGGGTATGAGTTAGTAATTCTGG
CCCTGAGCCTCAATTTCTTC
TGTCGTGTTCACCTCAGTATTATAG
CATGAGTCTCCTGGCATTATTTC
TTCACAGCATAAGTTGTTCAAAA
AAGCTGGCTGATATGCCAAT
TGCTTATATGCAGTAAGAATGGTTTT
CCTGCCACATAGTAGGCTCTC
GAGTTGATTGTCTGTTTAAAACTTCTG
GGGTTTCCTAGCCCATAGGT
GCATTTGGATATTGACACAGAAA
AACTTTGGCTTGATGAGGTG
AGATTCTTCCAGAGGGAGCC
AATTTTCCCTCTTATTGGAAATAACT
TGAAAAATGGGGCAACAGG
GACAGAAGGTTGGGGGTTTT
GCTTCTTCTGTGCATTTTATGCT
CCTTTCCAACAGAGGCTGTC
TGACATTTATGGCCCTTTTT
AAAATTAGCAAGACAAGTCNGC
TGTTGATGGGGGAAGGTATTTA
AGAGTACTGGTGCTAGGATAGCTCA
CAATATTTTGCTTCATTTTAATACAGG
ACTCAAATACTGGCAAATGGCT
GTTATGCACAGGAAAGTGAAAGTCT
AATGTAACTGTGTCTTGTGTGCTGT
CGATTGCACAGTATCTATTCAAGAC
AAATGCAAACACTTTCTTTACACTC
TGTTAAGCGTTGGCAGTTTG
AGCATAAATCTGCCACATGC
211
177
187
189
215
422
314
416
338
301
341
378
393
447
407
304
328
371
498
346
297
299
392
390
440
331
415
513
256
387
192
436
494
243
344
295
288
362
670
400
481
486
482
479
481
469
484
449
658
355
609
392
486
674
482
416
99
Çizelge 3.6. GIPC3 genini çoğaltmak için kullanılan primer dizileri ve PCR ürün boyutları
Ekzon No
Düz Primer Dizisi (5'-3')
Ters Primer Dizisi (5'-3')
Boyutu
(bç)
406
Reaksiyon
Koşulu
td
1
TCCCAGATCCCCTTACCC
CTACCCCTCACCCCATCAG
2
GACAGGGTGGCTGCGTG
AACCCACGTCGACCCAG
326
td+b
3
TTCTGCGGATTGGAGGC
AGGCATCCGTAGAACGCAC
295
td+b
GCCTCCCAGGGTTTACAAAG
CCTGCCTCCTCCCGTAGG
597
td
GTCCCAGCGGGAAGTTG
TGGGTTCTGGAGCAGGG
289
td+b
4-5
6
DNA dizi analizi öncesinde, elde edilen PCR ürünlerinin dNTP ve primer artıklarından
temizlenmesi için sephadex pürifikasyon yöntemi uygulanmıştır (GE Healthcare, 17-001001, ABD).
3.10
Sephadex ile PCR Ürünlerinin Pürifikasyonu
Bu yöntem için tabanında Watmann kağıdı (0.45 μm porlu) bulunan özel 96 kuyucuklu
plakalar (Pall Corporation 8029, ABD) kullanılır. Her kuyucuğa, özel bir aparat
(MultiScreen Column Loader, Milipore MACL09645, ABD) yardımıyla toz halindeki
Sephadex`den (Sephadex G-50 Fine DNA Grade F, GE Health Care 17-0573-02, ABD)
0.45 μg konur. Ardından kuyucuklara 300 μL dH2O eklenir. Böylelikle kuyucuklardaki toz
Sephadex, eklenen dH2O ile birleşerek polimerleşir. Kullanmadan önce en az 2 saat oda
sıcaklığında bekletilir.
Pürifikasyon işlemine başlamadan önce 20 μL PCR ürününe 1/5 oranında SOPE resin
(Quick step 2 SOPE resin, Edge Biosystems 72418, ABD) adı verilen kimyasal bir
solüsyon eklenir ve pipetaj yardımıyla sıvının PCR ürününe iyice karışması sağlanır.
Ardından içi polimerleşmiş Sephadex ile dolu olan kolonların yıkanması gerekmektedir.
Bunun için Sephadex içeren plaka, altına boş bir plaka konarak oda sıcaklığında 850 g
hızda 5 dakika santrifuj edilir. Ardından kuyucuklara 150 μL dH2O eklenir ve aynı şekilde
oda sıcaklığında 850 g hızda 5 dakika tekrar santrifuj edilir. Bu işlemden sonra Sephadex
içeren plakanın altına örneklerin toplanacağı temiz bir plaka konur. Kuyucuklara SOPE
resin eklenmiş olan PCR ürünleri konur ve oda sıcaklığında 850 g hızda 5 dakika tekrar
100
santrifuj edilir. Elde edilen PCR ürünleri DNA dizi analizi için gerçekleştirilecek BigDye
reaksiyonu için kullanılır.
BigDye reaksiyon ürünlerinin de DNA dizi analizi cihazına yüklenmeden önce
pürifikasyonu gerekmektedir. BigDye reaksiyon ürünlerinin pürifikasyonu için kullanılan
yöntem, PCR ürünlerinin pürifikasyonu için kullanılan Sephadex ile pürifikasyon
yöntemidir. Bu yöntemin PCR ürünlerinin pürifikasyonundan farkı, ürünlere SOPE resin
eklenmemesidir. Onun yerine ürünlere 10 μL dH2O eklenerek reaksiyonu hacmi 20 μL`ye
çıkartılır. Sephadex ile pürifiye edilmiş ürünler Applied Biosystem firmasının ABI3730
otomatize edilmiş sekanslama cihazına yüklenir.
3.11
DNA Dizi Analizi
Bu çalışmada istenen DNA parçacığının nükleotit dizisinin belirlenmesi için Sanger’in
enzimatik yöntemi esasına dayalı, tam otomatik kapiller sistemli çalışan bir DNA dizi
analizi cihazı kullanılmıştır (ABI3130/ABI3730, Applied Biosystems, ABD). Cihaz için
0,1 mL’lik, 96 tane kuyucuk içeren plakalar kullanılmıştır.
Her bir örnek için BigDye reaksiyonu solüsyonu; 0.75 µL BigDye solüsyonu (BigDye®
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems PN 4336948, ABD), 0.5 µL
Sephadex pürifikasyonu ile temizlenmiş PCR ürünü, 0.75 μL (20 pmol) düz veya ters
oligonükleotid ve hacmi 10 µL’ye tamamlayacak kadar dH2O içermektedir. Reaksiyon
için gerekli olan sıcaklık koşulu; 96 oC’de 1 dakika, 25 siklus 96 oC’de 10 saniye, 50
o
C’de 5 saniye ve 60 oC’de 4 dakika PCR cihazında gerçekleştirilmiştir.
Ardından PCR ürünlerinin pürifikasyonu için kullanılan Sephadex ile pürifikasyon
yöntemi tekrarlanır. Sephadex ile pürifiye edilmiş ürünler Applied Biosystem firmasının
ABI3730 otomatize edilmiş sekanslama cihazına yüklenir.
Cihazdan elde edilen okumalar Sequencher 4.7 programı (GeneCodes Corporation, ABD)
yardımı ile elektroferogram şeklinde görüntülenir.
101
4. ARAŞTIRMA BULGULARI
4.1. GJB2 Geni ve Mitokondriyal DNA’da 12SrRNA m.A1555G Mutasyon Analizi
Her aileden etkilenmiş bir bireyde, GJB2 geninin 1. ve 2. ekzonları polimeraz zincir
reaksiyonu yardımıyla çoğaltılmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu sonunda elde edilen
PCR ürün boyutları ekzon 1 için 370 bç, ekzon 2 için ise 840 bç uzunluğundadır (Şekil
4.1).
Şekil 4.1. GJB2 geni ekzon 1 ve ekzon 2 PCR ürünlerinin %2’lik temsili agaroz jel
görüntüsü.
M; X174 DNA-HaeIII Marker, 1; 1. ekzonun PCR ürünü, 2; 2. ekzonun PCR ürünü.
Elde edilen PCR ürünleri, DNA dizi analizi yöntemi ile dizilenmiş ve her ailede etkilenmiş
bir bireyde de GJB2 geninde herhangi bir baz değişimine rastlanmamıştır.
Ardından her aileden etkilenmiş bir bireyde 12S rRNA polimeraz zincir reaksiyonu
yardımıyla çoğaltılmış ve 1604 bç uzunluğunda PCR ürünleri elde edilmiştir.
12S
rRNA’da tanımlanmış olan m.A1555G mutasyonu, PCR/RFLP yöntemi ile taranmıştır.
1604 bç’lik PCR ürünleri BsmAI restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesime tabi
tutulmuştur. Her üç bireyde de; enzimle kesim sonucunda, yabanıl tipte gözlemlenen bant
profili olan, 1113 bç, 285bç ve 206 bç uzunluklarında üç bant elde edilmiştir. Enzim ;
mutasyon olması durumunda ise; 1398 bç ve 206 bç uzunluklarında iki fragment
oluşturmaktadır (Şekil 4.2). Her reaksiyonda enzimin aktivitesini ölçmek amacıyla
mutlaka bir pozitif kontrol örneği bulundurulmuştur.
102
Şekil 4.2. 12SrRNA m.A1555G mutasyonunun BsmAI enzimi ile kesim sonucunda %2’lik
temsili agaroz jel görüntüsü belirlenmesi.
M; X174 DNA-HaeIII Marker, 1; Kesilmemiş PCR ürünü, 2 ve 3; Yabanıl tip, 4: Mutant.
İşitme kayıplı ailelerde en sık görülen gen GJB2’dir. Bu gen ailelerde elendikten sonra,
öncelikle diğer işitme kaybı genlerinin de değerlendirilmesi gerekmektedir. Ancak bugüne
kadar tanımlanmış olan işitme kaybı genlerinin tek tek sekanslanması hem zaman hem de
maddi açıdan çok büyük bir iştir. Bunun yerine SNP mikrodizin yöntemi uygulanarak hem
ailede bu genlerden herhangi birine bağlantı olup olmadığını saptanması hem de
ailelerdeki aday/sorumlu gen bölgelerinin saptanması gerçekleştirilebilmektedir.
103
4.2. SNP Mikrodizin Analizi
Uygulanan protokolün basamakları Şekil 4.3’de gösterildiği şekilde gerçekleştirilmiştir.
Şekil 4.3. Affymetrix® Genome-Wide Human SNP 6.0 Assay akış şeması
(Affymetrix kullanma kılavuzundan değiştirilecek alınmıştır.)
104
Genomik DNA’nın Hazırlanması; Aile bireylerinin genomik DNA örnekleri öncelikle
kalitelerinin değerlendirilmesi amacı ile, % 0.8-1 oranında hazırlanmış agaroz jelde
kontrol edilebilmektedir. Ardından NanoDrop Spektrofotometre® cihazı yardımı ile DNA
örneklerinin konsantrasyonları belirlenmiştir. Elde edilen OD ölçümlerine dayanarak her
DNA örneği dH2O kullanılarak son konsantrasyonu 50 ng/µL olacak şekilde ayarlanmıştır.

StyI Restriksiyon Enzimi ile Kesim; Hazırlanan genomik DNA StyI restriksiyon
enzimi ile belirli yerlerinden kesilmiştir.

StyI Ligasyonu; StyI restriksiyon endonükleaz enzim kesimi ile elde edilen
ürünün ligasyon aşaması gerçekleştirilmiştir.

StyI PCR’ı; Ligasyon ürününü çoğaltmak amacı ile PCR reaksiyonu
gerçekleştirilmiştir. Ardından elde edilen PCR ürünleri %2 TAE agaroz jele
yüklenmiş, 120 V’da 40 dakika ile 1 saat arasında yürütüldükten sonra UV’de
görüntülenmiştir. Beklenen PCR ürünü boyutu yaklaşık 200 bç ile 1100 bç
arasındadır (Şekil 4.4).
Şekil 4.4. StyI PCR ürünlerinin temsili jel görüntüsü

NspI Restriksiyon Enzimi ile Kesim; Hazırlanan genomik DNA NspI
restriksiyon enzimi ile belirli yerlerinden kesilmiştir.

NspI Ligasyonu; StyI restriksiyon endonükleaz enzim kesimi ile elde edilen
ürünün ligasyon aşaması gerçekleştirilmiştir.

NspI PCR’ı; Ligasyon ürününü çoğaltmak amacı ile PCR reaksiyonu
gerçekleştirilmiştir. Ardından elde edilen PCR ürünleri %2 TAE agaroz jele
yüklenmiş, 120 V’da 40 dakika ile 1 saat arasında yürütüldükten sonra UV’de
105
görüntülenmiştir. Beklenen PCR ürünü boyutu yaklaşık 200 bç ile 1100 bç
arasındadır (Şekil 4.5).
Şekil 4.5. NspI PCR ürünlerinin temsili jel görüntüsü

PCR Ürünü Pürifikasyonu; Elde edilen PCR ürünleri “İzopropanol Presipitasyon
Methodu” kullanılarak pürifiye edilmiştir.

Kalite ve Miktar Tayini; Örnekler spektrofotometrede 260, 280 ve 320 nm
değerlerinde okutularak PCR ürününün OD değeri ölçülmüştür.

Fragmentasyon;
Ardından
fragmentasyon
reaksiyonu
gerçekleştirilmiştir.
Fragmentasyon reaksiyonu %4 TAE agaroz jelde, 120 V’da 30 dakika yürütülerek
kalitesinden emin olunmuştur. (Şekil 4.6).
Şekil 4.6. Fragmentasyon ürünlerinin temsili agaroz jel görüntüsü
106

İşaretleme; Fragmente edilmiş örnekleri, işaretlemek amacıyla bir reaksiyon
gerçekleştirilmiştir.

Hedef Hibridizasyonu; Yukarıdaki basamaklarda hazırlanan örnekler; çiplere
yüklenerek, hibridizasyon fırını yardımıyla çipin üzerindeki oligonükleotidlere
hibridize edilmiştir.
Hibridizasyon işleminin ardından çiplerin yıkama, boyama ve tarama aşamaları
gerçekleştirilmiştir.
4.3.
Sorumlu Gen Bölgelerinin Belirlenmesi
DNA mikrodizin analizi sonucunda elde edilen genotip verileri bağlantı analizi ve
otozigozite haritalaması için kullanılmıştır.
Öncelikle Microsoft Excel programına aktarılmış olan SNP verileri kullanılarak bugüne
kadar sendromik olmayan, otozomal resesif işitme kaybı yaptığı tanımlanmış 39 adet
genin ailedeki segregasyonları gözle kontrol edilir. Etkilenmiş bireylerin genotipleri, bu
genlerden birini homozigot olarak çevreliyorsa yani ailedeki her etkilenmiş birey aynı allel
için homozigot ise, bu gendeki homozigot bir mutasyonun ailedeki işitme kaybına neden
olabileceği düşünülmüştür. Bu amaçla analiz edilen verilerde, üç ailede de daha önce
tanımlanmış olan 39 adet işitme kaybı genlerinden birine bağlantı bulunmamıştır.
4.3.1. Bağlantı Analizi
Ardından ailelerde hangi genomik bölgelere bağlantı bulunduğunu saptamak amacı ile
easyLINKAGE adı verilen bir program kullanılmıştır. Tüm genom tek nükleotid
polimorfizmi genotiplemesi sonucunda elde edilen genotip verileri kullanılarak, ailelerde
bulunan ve segrege olan homozigot bölgeler saptanmış ve LOD skor hesaplanması
yapılmıştır. Elde edilen tüm genom boyu LOD skor hesaplama sonuçları Şekil 4.7, 4.8 ve
4.9’da
gösterilmektedir.
107
Şekil 4.7. Aile 1’ün tüm genom LOD skor sonuçları
108
Şekil 4.8. Aile 2’ün tüm genom LOD skor sonuçları
109
Şekil 4.9. Aile 3’ün tüm genom LOD skor sonuçları
110
Ancak analiz yaparken program içerisinde SNP verisini karşılaştırmak amacı ile bulunan
ve bu analiz için de kullanılan, en kapsamlı SNP haritası Affymetrix 500K çiplerine aittir.
Bu çiplerin SNP içerikleri yaklaşık olarak 500.000’dir. Ancak bizim bu tez çalışması
kapsamında kullanmış olduğumuz Affymetrix firmasına ait olan 6.0 çiplerinin SNP içeriği
yaklaşık bir milyondur. Bu durumda sadece bu program ile analiz yapıldığında elde
edilecek homozigot bloklar, aslında olduğundan çok daha küçük veya büyük
gözükebilmektedir. Bunun sebebi Affymetrix 6.0 çiplerinin içeriğinde bulunup, 500K
çiplerinde bulunmayan bazı SNP’ler yapılan analizde gözükmeyebilir ve bu SNP’lerin
etkilenmiş bireylerdeki heterozigotluk durumu homozigot olarak saptanmış bölgelerin
bölünmelerine yol açmaktadır. Bu durum hedef aldığımız bölgenin, asıl hedef alınması
gereken bölgeden çok daha büyük olması anlamına gelmektedir. Başka bir durum ise
aslında homozigot olan bir bölgenin SNP’lerin sayısının azlığı sebebiyle olduğundan çok
daha küçük gözükebilmesidir. Bu durumda aday gen; aslında bu homozigot bölgenin
içinde olmasına rağmen, dışında gibi gözükerek elenebilmektedir. Ayrıca bazı informative
olmayan yani ailedeki her bireyde (etkilenmiş ve etkilenmemiş) aynı allele homozigot
bulunan SNP’lerin oluşturdukları bölgeler de, bu program tarafından seçilmektedir. Ancak
bu bölgeler aslında bizim arama kriterlerimiz içerisinde bulunmamaktadır.
4.3.2. Otozigozite Haritalaması
easyLINKAGE programı ile elde edilen bu homozigot blokların asıl aralıklarını
belirlemek amacı ile SNP verilerini içeren Microsoft Excel tabloları kullanılır. Microsoft
Excel programına yazılan macro ile; birbirini takip eden 40 satır boyunca, etkilenmiş tüm
bireylerin aynı alele homozigot olduğu bölgeler saptanmıştır. Ardından bu veride bu
bölgelerin tüm ailede hastalığa uygun şekilde segrege olanları (etkilenmiş tüm bireylerin
aynı alele homozigot ve etkilenmemiş bireylerde ise heterozigot veya diğer allele
homozigotluk) tespit edilmiştir.
Otozigozite haritalaması sonucunda üç ailede elde edilen 1 Mb’dan büyük otozigot bloklar
Çizelge 4.1, 4.2 ve 4.3’de gösterilmektedir. Aile 1’de sadece bir adet 1 Mb’dan büyük
blok bulunmaktadır. Bu sebeple çizelgede ailedeki en büyük beş otozigot blok
gösterilmektedir.
111
Çizelge 4.1. Aile 1’de bulunan otozigot bloklar
Kromozom Başlangıç SNP ID Başlangıç Noktası
(hg19)
12
rs6581822
68,804,480
2
rs3771875
75,878,062
9
rs2821195
11,690,141
12
rs7312819
63,471,816
12
rs10878294
65,914,157
Bitiş SNP ID
rs10862688
rs1879191
rs10114316
rs513203
rs10784502
Bitiş Noktası
(hg19)
83,923,162
76,627,379
12,257,152
63,939,990
66,344,060
Boyut
15,118,682
749,317
567,011
468,174
429,903
Çizelge 4.2. Aile 2’de bulunan otozigot bloklar
Kromozom Başlangıç SNP ID
8
13
17
9
rs13276051
rs9318258
rs9899293
rs10814410
Başlangıç Noktası
(hg19)
41,102,764
74,942,895
70,909,052
46,587
Bitiş SNP
rs7461595
rs7982823
rs8079641
rs16920867
Bitiş Noktası
(hg19)
87,083,602
94,565,251
78,212,420
4,270,147
Boyut
45,980,838
19,622,356
7,303,368
4,223,560
Çizelge 4.3. Aile 3’de bulunan otozigot bloklar
Kromozom Başlangıç SNP ID
15
19
8
21
16
rs16952059
rs8102615
rs2981099
rs11702247
rs9926500
Başlangıç Noktası
(hg19)
Bitiş SNP
Bitiş Noktası
(hg19)
Boyut
66,505,054
211,970
74,018,081
37,621,029
84,438,172
rs12593367
rs7247153
rs7836491
rs2205081
rs4782341
79,122,155
6,402,433
80,514,342
40,630,864
87,177,256
12,617,101
6,190,463
6,496,261
3,009,835
2,739,084
easyLINKAGE programı ile Microsoft Excel programının macro opsiyonu kullanılarak
yapılan analizlerin sonucunda elde edilen otozigot blokların tamamen birbirinin aynı
olmasa da uygunluk gösterdiği gözlemlenmektedir. Belirlenen bu otozigot blokların gen
içerikleri UCSC veri tabanı yardımıyla belirlenmiştir. Her aile için elde edilen bu
bloklarda çok sayıda gen bulunmaktadır. Bu genlerin UCSC veritabanına (hg19) göre
saptanan genomik lokalizasyonları Şekil 4.10-4.23’de ayrıntılı olarak gösterilmektedir. Bu
otozigot bloklar içerisinde toplam aile 1 için 73, aile 2 için 420 ve aile 3 için 434 adet gen
bulunmaktadır. Her aile için belirlenen bu genler, Ek 1 (aile 1), Ek 2 (aile 2) ve Ek 3 (aile
3)’de
tablo
halinde
112
gösterilmektedir.
Şekil 4.10. Aile 1’deki 12. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler
Şekil 4.11. Aile 1’deki 2. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler
113
Şekil 4.12. Aile 1’deki 9. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler
Şekil 4.13. Aile 1’deki 12. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler
Şekil 4.14. Aile 1’deki 12. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler
114
Şekil 4.15. Aile 2’deki 8. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler
115
Şekil 4.16. Aile 2’deki 13. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler
116
Şekil 4.16 devamı. Aile 2’deki 13. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler
117
Şekil 4.17. Aile 2’deki 17. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler
118
Şekil 4.18. Aile 2’deki 9. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler
119
Şekil 4.19. Aile 3’deki 15. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler
120
Şekil 4.20. Aile 3’deki 19. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler
121
Şekil 4.21. Aile 3’deki 8. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler
Şekil 4.22. Aile 3’deki 21. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler
122
Şekil 4.23. Aile 3’deki 16. kromozomdaki otozigot blokta bulunan genler
123
Şekillerde de gösterildiği gibi her aile başına yüzlerce aday gen bulunmaktadır.
Ailelerdeki sorumlu genin bulunması amacıyla yapılması gereken işlem, bu genlerin
öncelikle fonksiyon ve bulundukları yolak açısından değerlendirilerek bir sıralamaya
sokulması ve sekanslanmasıdır. Ancak genlerin bazılarının onlarca ekzondan oluştuğu göz
önünde bulundurulduğunda bunların hepsinin sekanslanması neredeyse imkansız bir hal
almaktadır.
Teknolojinin her geçen gün daha da ilerlemesi ile, günümüzde Sanger sekanslamaya
alternative yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin kullanılması hem zaman açısından
hem de maddi açıdan kolaylık sağlamaktadır.
Bu nedenle elde edilen her aday genin tek tek Sanger sekanslama yöntemi yardımıyla
sekanslanması yerine yeni nesil sekanslama tekniği kullanılarak, her aileden bir birey tüm
ekzom sekanslama yöntemi ile sekanslanmıştır.
4.4.
Bilinen İşitme Kaybı Genlerinin Elenmesi
Aile 1’deki otozigot blokların en büyüğünde birinde bulunan ve bir işitme kaybı geni
olarak tanımlanmış PTPRQ geni, öncelikle bu genin tüm ekzonları PCR yöntemi ile
çoğaltılarak ailedeki etkilenmiş bir bireyde sekanslanmıştır. PCR sonucunda elde edilen
ürünler %2’lik agaroz jele boyutlarını kontrol etmek amacıyla yüklenmiştir. Jel 90 V’da
yaklaşık 45 dakika kadar yürütülmüştür (Şekil 4.24).
124
Şekil 4.24. PTPRQ geninin ekzonlarının PCR ürünlerinin agaroz jel görüntüsü.
M:Marker, 1-53: genin ekzon numaraları
Elde edilen PCR ürünleri sephadex pürifikasyon yöntemi ile fazla primer, dNTP ve
atıklardan temizlenmiş ardından Sanger sekanslama yöntemi kullanılarak dizilenmiştir. Bu
işlemin ardından elde edilen sonuçlar Sequencher programı yardımıyla referans dizi ile
karşılaştırılmış ve herhangi bir farklılık belirlenmemiştir. Böylece işitme kaybı yaptığı
yeni tanımlanmış olan bu gen, aday gen olmaktan çıkmış yani elenmiştir.
125
4.5.
Tüm Ekzom Sekanslama
Tüm ekzom sekanslama yöntemi sonucunda elde edilen veri CLC Bio Genomics
Workbench programında analiz edilmiştir. Bu program, elde edilen verinin referans
sekansa haritalanmasının ardından veri hakkında detaylı bir rapor oluşturmaktadır.
Çalışmaya dahil edilen üç bireyin haritalama raporu Çizelge 4.4’de gösterilmektedir.
Ailelerden elde edilen verinin kalitesi öncelikle “Ortalama Coverage (4x)” değerlerine
bakılarak anlaşılabilmektedir. Bu değer; sekanslanan bireyde en az 4 kez okunan tüm
bazların (Şekil 4.25), toplam sekanslanan bazların % kaçını oluşturduğunu belirtmektedir.
Şekil 4.25. Baz coverage değerinin hesaplanması
Bunun dışında bu tablo; her bireyin sekanslanması sonucunda toplam kaç adet amplikonun
sekanslandığı, bu sekanslanan amplikonlardan kaç tanesinin karşılaştırılan referans dizi
üzerine eşleşebildiği, kaç adet amplikonun iki yönlü olarak sekanslanabildiği verilerini
göstermektedir.
126
Çizelge 4.4. Tüm ekzom sekanslama verisi haritalama raporu
Aile 1 (101 nolu birey)
Aile 2 (102 nolu birey)
Aile 3 (103 nolu birey)
0.83859378
0.839015025
0.882166345
Ortalama
Coverage (4x)
Amplikon
Adedi
Ortalama
Amplikon
Uzunluğu
Toplam
sekanslanan
baz adedi
Toplam
Okuma
87,243,422
81.45
7,105,649,510
Toplam
%GC oranı
37.77
Eşleşen
çiftler
84,763,800
82.07
6,956,445,687
Eşleşmeyen
çiftler
2,478,622
60.17
149,203,823
64,063,93
2
Ortalama
Amplikon
Uzunluğu
Toplam
sekanslanan
baz adedi
Amplikon
Adedi
Ortalama
Amplikon
Uzunluğu
Toplam
sekanslanan
baz adedi
84.89
5,424,672,959
85,122,135
92.65
7,937,179,360
37.81
25
Referans
Amplikon
Adedi
3,095,693,983
kromozom
İki yönlü
okumalar
33,104,624
210.73
İki yönlü
okumalar
50,926,840
37.77
63,423,36
7
640,565
37.81
85.53
5,424,672,959
85,122,135
93.11
7,924,699,262
21.03
13,471,328
550,196
22.68
12,480,098
25
3,095,693,983
kromozom
25,602,28
8
37,292,96
1
25
3,095,693,983
kromozom
211.32
32,578,186
211.41
85.39
50,723,220
93.06
Eşleşen çiftler; elde edilen amplikon kaç tanesinin referans sekans ile eşleştiğini göstermektedir.
Eşleşmeyen çiftler; elde edilen amplikon kaç tanesinin referans sekans ile eşleşmediğini göstermektedir.
İki yönlü okumalar; Sekanslama aşamasında her fragment için gerçekleşen düz (birinci) ve ters (ikinci) okumaların birbiri ile komplementer olduğu amplikon sayısı.
İki yönlü olmayan okumalar; Sekanslama aşamasında her fragment için gerçekleşen düz (birinci) ve ters (ikinci) okumaların birbiri ile komplementer olmayan amplikonların
sayısı. Bunlar teknik nedenlerden dolayı gerçekleşen sadece tek taraftan okunan veya ikinci okuma işlemi sırasında kırılarak okunamayan amplikonlardır.
127
Bu üç ailenin tüm ekzom sekansı sonucunda elde edilen coverage değerleri ise Şekil
4.26’te gösterilmektedir. Bu grafiğe göre X ekseninde belirtilen değerler genel olarak
örneğin coverage değerini ifade etmektedir. Y ekseninde belirtilen değerler ise genel
olarak bazların coverage değerlerini ifade etmektedir. Örneğin X eksenindeki 10 değeri, en
az 10 kere okunmuş olan tüm bazları ifade etmektedir. Bu anlamda aile 1’de X
eksenindeki 10 değerine; karşılık gelen Y eksenindeki değeri %78’dir ve bunun anlamı, bu
ailedeki tüm veride, en az 10 kere okunmuş bazlar, tüm okunan bazların %78’dir anlamına
gelmektedir. Bu tez çalışmasında yapılan analizlerde genel baz coverage değeri (X
eksenindeki değeri) 4X olarak kullanılmıştır.
Şekil 4.26. Tüm ekzom sekanslama verisi genel coverage plotları
Bu değerlerin üç birey arasında farklılık göstermesinin nedeni örnekler arasındaki DNA
kalite farkıdır.
Bu aileler, DNA mikrodizin analizi sonuçları ile işitme kaybı yaptığı tanımlanmış 39 gen
bakımından değerlendirilmiştir. Ancak bu değerlendirme birde tüm ekzom sekanslama
verileri kullanılarak tekrar değerlendirilmiştir. Bu değerlendirme sonucunda bu genlerin
elimizdeki örneklerde % kaç oranında coverage değerine sahip oldukları hesaplanmıştır
(Çizelge 4.5).
128
Çizelge 4.5. İşitme kaybı genlerinin genel coverage yüzdeleri (4X genel baz coverage
değeri için)
Gen Adı
Kromozom
Genomik Lokalizasyon (hg19)
Aile 1-101
Aile 2-102
Aile 3-103
BSND
1
55,464,617-55,474,464
100
100
100
CDH23
10
73,571,640-73,575,702
95.5
98.5
97.1
CLDN14
21
37,832,920-37,948,867
63.7
85.9
100
COL11A2
6
33,130,469-33,160,245
100
100
100
ESPN
1
6,508,103-6,521,003
49.9
65.5
64.4
ESRRB
14
76,837,690-76,968,178
79.8
81.8
85.7
GIPC3
19
3,585,569-3,593,538
60.1
66.5
78.4
GJB2 (Cx26)
13
20,761,606-20,767,114
100
100
100
GJB3/CX31
1
35,249,172-35,252,849
83.5
100
100
GJB6 (Cx30)
13
20,796,102-20,806,534
100
100
100
GPSM2
1
109,419,603-109,476,957
96.5
96.5
96.5
GRXCR1
4
42,895,284-43,032,673
100
100
100
HGF
7
81,380,217-81,399,452
100
100
96.9
ILDR1
3
121,706,171-121,741,030
95.6
98.5
85.2
LHFPL5
6
35,773,071-35,791,852
100
100
95.6
LOXHD1
18
44,109,140-44,135,334
97.4
97
96.9
LRTOMT/COMT2
11
71,791,382-71,821,827
91
94.1
100
MARVELD2/TRICELLULIN
5
68,710,943-68,737,888
100
100
100
MSRB3
12
65,672,488-65,860,680
100
100
100
MYO15A
17
18,057,368-18,060,852
87.5
90.6
94.8
MYO3A
10
26,224,673-26,501,465
97
100
100
MYO6
6
76,527,218-76,629,254
100
100
100
MYO7A
11
76,839,310-76,914,262
85
91.2
90.9
OTOA
16
21,716,290-21,772,049
97.2
99.3
98
OTOF
2
26,725,168-26,739,467
82.3
92.5
97.6
PCDH15
10
55,580,860-56,561,051
99.2
99.2
99.2
PJVK/MIR548N
2
179,316,163-179,326,107
100
100
100
PRESTIN/SLC26A5
7
103,014,659-103,083,658
100
100
100
PTPRQ
12
71,031,862-71,148,539
6.7
6.7
6.7
RDX
11
110,066,287-110,167,437
95.5
95.5
95.5
SERPINB6
6
2,948,394-2,972,399
100
100
100
SLC26A4
7
107,333,777-107,358,250
95
95
95
STRC
15
44,005,856-44,020,948
95.8
95.8
96.1
TECTA
11
120,973,375-121,061,513
96.7
99.6
99
TMC1
9
75,242,837-75,451,267
100
100
100
TMIE
3
46,742,823-46,752,413
75
75
75
TMPRSS3
21
117,947,753-117,990,554
99
100
100
TPRN/C9orf75
9
140,086,069-140,095,163
47.8
77.4
51.8
TRIOBP
22
38,153,620-38,172,562
68.1
74.1
84.8
USH1C
11
17,515,443-17,565,963
92.4
96
95.2
WHRN/DFNB31
9
117,240,601-117,267,730
83
89.2
96.9
129
4.6.
Filtreleme
Bu üç ailenin tüm ekzom sekansı sonucunda elde edilen öncelikle SeattleSeq veri
tabanında annote edilmiştir. Ardından elde edilen veride bir takım filtreler uygulanmıştır.
Bu filtreler sırası ile;

yeni varyantlar; dbSNP veri tabanında kayıtlı tüm varyantlar filtrelenmiştir.

homozigot varyantlar; örnekteki sekanslanma sıklığı %70’in altındaki tüm
varyantlar filtrelenmiştir.

fonksiyonel olarak anlamlı varyantlar; missense, nonsense, splice veya frameshift
olmayan yani intronik, UTR bölgeleri, intergenik varyantlar
tüm varyantlar
filtrelenmiştir.

otozigot bloklar içerisinde bulunan varyantlar; DNA mikrodizin verisi
kullanılarak yapılan otozigozite haritalaması sonucunda elde edilen blokların
dışında bulunan tüm varyantlar filtrelenerek elenmiştir.
Bu kullanılan filtrelemeler sırasında elde edilen varyantların sayısı Aile 1 için Çizelge 4.6,
Aile 2 için Çizelge 4.7 ve Aile 3 için Çizelge 4.8’de gösterilmiştir.
Çizelge 4.6. Aile 1’deki tüm ekzom sekanslama verisi filtreleme sonuçları
Bölgeler
Tüm Ekzom
Yeni Varyantlar
Homozigot Varyantlar
Missense, nonsense, splice, frameshift
Otozigot Bloklardaki Varyantlar
SNP
171,303
53190
2,527
98
1
indel
13,576
9,738
2452
12
1
Total varyantlar
184,879
62,928
4,979
110
2
Çizelge 4.7. Aile 2’deki tüm ekzom sekanslama verisi filtreleme sonuçları
Bölgeler
Tüm Ekzom
Yeni Varyantlar
Homozigot Varyantlar
Missense, nonsense, splice, frameshift
Otozigot Bloklardaki Varyantlar
SNP
134,928
28,791
10,104
146
2
130
indel
14,037
4,289
1,645
17
NA
Total varyantlar
148,965
33,080
11,749
163
2
Çizelge 4.8. Aile 3’deki tüm ekzom sekanslama verisi filtreleme sonuçları
Bölgeler
Tüm Ekzom
Yeni Varyantlar
Homozigot Varyantlar
Missense, nonsense, splice, frameshift
Otozigot Bloklardaki Varyantlar
4.7.
Otozigozite
Haritalaması
SNP
200,932
57,917
15,713
55
5
ile
Tüm
Ekzom
indel
18,547
5,921
2151
9
NA
Total varyantlar
219,479
63,838
17,864
64
5
Sekanslama
Sonuçlarının
Birleştirilmesi
Tüm genom tek nokta polimorfizmi genotipleme verisiyle elde edilen otozigozite
haritalaması ile tüm ekzom sekanslama verisi, öncelikle bilinen işitme kaybı genleri
açısından karşılaştırılır. Ailelerde tüm genom tek nokta polimorfizmi genotiplemesi
sonucunda bilinen bir işitme kaybını çevreleyen bir homozigot bloğa rastlanmamıştır.
Ancak tüm ekzom sekanslama verisinde Çizelge 4.5’de de gösterildiği gibi bu genlerin her
ekzonu sekanslanamamıştır. Bu durumda sekanslanamayan genler için tüm genom tek
nokta polimorfizmi genotipleme verisine geri dönülmüş ve bu genlerin aile bireylerindeki
hastalıkla ilişkili segregasyonu kontrol edilerek ikinci kere dışlanmıştır. Özellikle büyük
genlerin içlerine de denk gelen SNP’ler sayesinde bu dışlanma daha kolay
gerçekleştirilmektedir.
Bunun ardından her aile için ayrı olmak koşulu ile tüm ekzom sekanslama verisinde
sadece otozigozite haritalaması verisinden elde edilen otozigot bloklar içerisinde yer alan
varyantlara odaklanılmıştır.
4.7.1. Aile 1’de Elde Edilen Aday Varyantlar
Ailede bulunan otozigot blokların içerisinde aynı gende olmak üzere iki yeni varyant tespit
edilmiştir (Çizelge 4.9).
131
Çizelge 4.9. Veri analizi sonucunda aile 1’de elde edilen aday varyantlar
12
Genomik
Pozisyon
(hg19)
80,717,580
12
80,648,835
Kromozom
Referans
Baz
Örneğin
Genotipi
Transkript
Numarası
Fonksiyon
Protein
Pozisyonu
T
C
NM_173591.3
Missense
1378/2344
Amino
asit
değişimi
CYS/ARG
T
-
NM_173591.3
Frameshift
-
-
Gen Adı
OTOGL
OTOGL
4.7.2. Aile 2’de Elde Edilen Aday Varyantlar
Ailede farklı gende olmak üzere iki yeni varyant tespit edilmiştir (Çizelge 4.10).
Çizelge 4.10. Veri analizi sonucunda aile 2’de elde edilen aday varyantlar
17
Genomik
Pozisyon
(hg19)
72,584,730
17
76,967,749
Kromozom
100/195
Amino
asit
değişimi
ASP/GLY
C17orf77
556/586
THR/ILE
LGALS3BP
Örneğin
Genotipi
Transkript
Numarası
Fonksiyon
Protein
Pozisyonu
T
C
NM_001115152.1
Missense
G
A
NM_005567
Missense
Referans
Baz
Gen Adı
4.7.3. Aile 3’de Elde Edilen Aday Varyantlar
Ailede farklı gende olmak üzere beş yeni varyant tespit edilmiştir (Çizelge 4.11).
Çizelge 4.11. Veri analizi sonucunda aile 3’de elde edilen aday varyantlar
15
Genomik
Pozisyon
(hg19)
79,058,730
A
G
NM_014272
Missense
1175/1687
Amino
asit
değişimi
SER/PRO
19
2,917,947
C
T
NM_173480
Missense
443/556
THR/MET
19
3,586,908
C
A
NM_133261
Missense
170/313
HIS/ASN
GIPC3
19
5,243,969
T
G
NM_130855
Missense
496/1506
THR/PRO
PTPRS
8
76,476,256
A
T
NM_004133
Missense
421/446
GLN/HIS
HNF4G
Kromozom
4.8.
Referans
Baz
Örneğin
Genotipi
Transkript
Numarası
Fonksiyon
Protein
Pozisyonu
Gen Adı
ADAMTS7
ZNF57
Aday Varyantların Doğrulanması
Ailelerde, tüm ekzom sekanslama verilerinden tespit edilen aday varyantlar PCR yöntemi
ile çoğaltılarak Sanger sekanslama yöntemi ile öncelikle tüm ekzom sekanslama yöntemi
uygulanan bireyde doğrulanır, arkasından ailedeki segregasyonu kontrol edilir.
132
4.8.1. Aile 1’de Elde Edilen Verilerin Doğrulanması
Ailede bulunan otozigot blokların içerisinde yer alan varyantlar (Çizelge 4.9) PCR ile
çoğaltılarak öncelikle tüm ekzom sekanslama yöntemi uygulanan bireyde doğrulanmış,
arkasından ailedeki segregasyonu kontrol edilmiştir. Elde edilen PCR ürünlerinin agaroz
jel görüntüsü Şekil 4.27’da gösterilmektedir.
Şekil 4.27. PCR ürünlerinin %2’lik agaroz jel görüntüsü.
M;Marker, 1; OTOGL missense,
2; LGALS3BP, 3; ZNF57, 4; PTPRQ, 5; ADAMTS7, 6; C17orf77, 7;
OTOGL frame-shift, 8; HNF4G, 9; GIPC3 genindeki varyantların PCR ürün görüntüleri.
Elde edilen PCR ürünleri sephadex pürifikasyon yöntemi ile fazla primer, dNTP ve
atıklardan temizlenmiş ardından Sanger sekanslama yöntemi kullanılarak dizilenmiştir.
Elde edilen sonuçlar Sequencher programı yardımıyla referans dizi ile karşılaştırılmış ve
her iki varyantında varlığı doğrulanmıştır. Ardından tüm aile bireyleri bu iki varyant için
sekanslanmış ve ailede segregasyonu doğrulanmıştır (Şekil 4.28).
133
Şekil 4.28. Aile 1’de doğrulanan aday varyantların DNA dizi analizi görüntüleri.
a. OTOGL genindeki c.4134T>C (p.Cys1378Arg) varyantını taşımayan yabanıl tip, b. c.4134T>C varyantı
için homozigot mutant, c. c.4134T>C varyantı için heterozigot birey, d. OTOGL genindeki c.1430delT
(p.Val477GlufsX25) varyantını taşımayan yabanıl tip, e. c.1430delT varyantı için homozigot mutant, f.
c.1430delT varyantı için heterozigot birey. c.1430delT varyantının dizi analizi ters primer kullanılarak
gerçekleştirilmiştir.
Genin lokalizasyonu ve varyantların genomik lokalizasyonu UCSC veri tabanı
kullanılarak doğrulanmıştır. Ayrıca bu varyantların CLC Bio programı yardımıyla 12.
kromozom
üzerindeki
görüntülenmesi
de
yapılabilmektedir.
c.1430delT
(p.Val477GlufsX25) ve c.4134T>C (p.Cys1378Arg) varyantlarının transkriptte denk
geldiği nokta, neden olduğu aminoasit değişimi ve hangi ekzonda bulundukları “Ensembl”
e-veri tabanı kullanılarak belirlenmiştir (http://www.ensembl.org/index.html) (Şekil 4.29).
134
Şekil 4.29. OTOGL genindeki c.1430delT (p.Val477GlufsX25) ve
(p.Cys1378Arg) varyantlarının lokalizasyonları.
c.4134T>C
a. varyantların UCSC veri tabanı kullanılarak elde edilen genomik lokalizasyonları, b. varyantların CLC
Bio programı yardımıyla 12. kromozom üzerindeki lokalizasyonları, c. varyantlarının Ensembl veri tabanı
kullanılarak elde edilen transkript üzerinde denk geldikleri baz ve kodon kırmızı ok ile gösterilmektedir.
Ardından bu genin tamamının sekanslanıp sekanslanmadığı kontrol etmek amacıyla tüm
ekzom sekanslama verisine geri dönülmüş ve toplam 58 ekzonun %93.7’sinin
sekanslandığı saptanmıştır (Şekil 4.30).
135
Şekil 4.30. OTOGL geninin ekzonlarının tüm ekzom sekanslama yöntemi ile elde edilen
sekanslanma yüzdeleri.
a. genin ekzonlarının coverage oranlarının UCSC veri tabanı kullanılarak oluşturulan görüntüsü, b. genin
ekzonlarının coverage oranlarının grafiksel görüntüsü.
Yukarıdaki şekilde de gözüktüğü gibi genin 1. ve 2. ekzonları hiç sekanslanmamış, 9, 24,
26 ve 32. ekzonlarının ise sadece bir kısmı sekanslanmıştır. Bu durumda genin tüm
ekzonlarını ailedeki etkilenmiş bir bireyde PCR yöntemiyle çoğaltılmış ve PCR sonucunda
elde edilen ürünler %2’lik agaroz jele boyutlarını kontrol etmek amacıyla yüklenmiştir. Jel
90 V’da yaklaşık 45 dakika kadar yürütülmüştür (Şekil 4.31).
Şekil 4.31. OTOGL geninin ekzonlarının PCR ürünlerinin agaroz jel görüntüsü.
M:Marker, 1-58: genin ekzon numaraları
136
Elde edilen PCR ürünleri sephadex pürifikasyon yöntemi ile fazla primer, dNTP ve
atıklardan temizlenmiş ardından Sanger sekanslama yöntemi kullanılarak dizilenmiştir. Bu
işlemin ardından elde edilen sonuçlar referans dizi ile karşılaştırılmış ve ailedeki
etkilenmiş bireyde başka herhangi bir varyasyona rastlanmamıştır. Ailede segregasyonu
doğrulanan her iki varyantın da 370 etnik kontrolde bulunmadığı gösterilmiştir.
4.8.2. Aile 2’de Elde Edilen Verilerin Doğrulanması
Ailede bulunan otozigot blokların içerisinde yer alan varyantlar (Çizelge 4.10) PCR ile
çoğaltılarak öncelikle tüm ekzom sekanslama yöntemi uygulanan bireyde doğrulanmış,
arkasından ailedeki segregasyonu kontrol edilmiştir. Elde edilen PCR ürünlerinin agaroz
jel görüntüsü Şekil 4.6’da gösterilmektedir. Ardından elde edilen PCR ürünleri sephadex
pürifikasyon yöntemi ile fazla primer, dNTP ve atıklardan temizlenmiş ardından Sanger
sekanslama yöntemi kullanılarak dizilenmiştir. Elde edilen sonuçlar referans dizi ile
karşılaştırılmış ve her iki varyantında bu bireyde bulunmadığı görülmüştür.
4.8.3. Aile 3’de Elde Edilen Verilerin Doğrulanması
Ailede bulunan otozigot blokların içerisinde yer alan varyantlar (Çizelge 4.11) PCR ile
çoğaltılarak öncelikle tüm ekzom sekanslama yöntemi uygulanan bireyde doğrulanmış,
arkasından ailedeki segregasyonu kontrol edilmiştir. PCR sonucunda elde edilen ürünler
%2’lik agaroz jele boyutlarını kontrol etmek amacıyla yüklenmiştir. Jel 90 V’da yaklaşık
45 dakika kadar yürütülmüştür (Şekil 4.6). Ardından elde edilen PCR ürünleri sephadex
pürifikasyon yöntemi ile fazla primer, dNTP ve atıklardan temizlenmiş ardından Sanger
sekanslama yöntemi kullanılarak dizilenmiştir. Elde edilen sonuçlar referans dizi ile
karşılaştırılmış ve bu 5 varyanttan ZNF57 ve GIPC3 genlerindeki iki varyantında varlığı
doğrulanmıştır (Şekil4.32).
137
Şekil 4.32. Aile 3’de doğrulanan iki aday varyantın DNA dizi analizi görüntüsü.
a. GIPC3 genindeki c.508C>A (p.His170Asn) varyantını taşımayan yabanıl tip, b. GIPC3 genindeki
c.508C>A varyantı için homozigot mutant, c. GIPC3 genindeki c.508C>A varyantı için heterozigot birey, d.
ZNF57 genindeki c.1328C>T (p.Thr443Met) varyantını taşımayan yabanıl tip, e. ZNF57 genindeki
c.1328C>T varyantı için homozigot mutant, f. ZNF57 genindeki c.1328C>T varyantı için heterozigot birey.
Ancak çalışmalarımız devam ederken ZNF57 genindeki c.1328C>T (p.Thr443Met)
varyantının bir polimorfizm olduğu (dbSNP135-rs142727006) ve GIPC3 geninin ise
işitme kaybı yaptığı tanımlanmıştır. Bu durumda bu varyant aday olmaktan çıkmıştır ve
aile 3’de sadece GIPC3 genindeki c.508C>A (p.His170Asn) varyantının üzerinden
çalışmalar devam etmiştir.
GIPC3 genin lokalizasyonu ve varyantın genomik lokalizasyonu UCSC veri tabanı
kullanılarak doğrulanmıştır. Ayrıca bu varyantların CLC Bio programı yardımıyla 19.
kromozom üzerindeki görüntülenmesi de yapılabilmektedir. GIPC3 genindeki c.508C>A
(p.His170Asn) varyantının transkriptte denk geldiği nokta, neden olduğu aminoasit
değişimi ve hangi ekzonda bulunduğu “Ensembl” e-veri tabanı kullanılarak belirlenmiştir
(Şekil 4.33).
138
Şekil 4.33. GIPC3 genindeki c.508C>A (p.His170Asn) varyantının lokalizasyonu.
a. varyantların UCSC veri tabanı kullanılarak elde edilen genomik lokalizasyonu, b. varyantların CLC Bio
programı yardımıyla 19. kromozom üzerindeki lokalizasyonu, c. varyantlarının Ensembl veri tabanı
kullanılarak elde edilen transkript üzerinde denk geldiği baz ve kodon kırmızı ok ile gösterilmektedir.
Ardından bu genin tamamının sekanslanıp sekanslanmadığı kontrol etmek amacıyla tüm
ekzom sekanslama verisine geri dönülmüş ve tüm 6 ekzonun %78.4’ünün sekanslandığı
saptanmıştır (Şekil 4.34).
139
Şekil 4.34. GIPC3 geninin ekzonlarının tüm ekzom sekanslama yöntemi ile elde edilen
sekanslanma yüzdeleri.
a. genin ekzonlarının coverage oranlarının UCSC veri tabanı kullanılarak oluşturulan görüntüsü, b. genin
ekzonlarının coverage oranlarının grafiksel görüntüsü.
Bu durumda ailedeki etkilenmiş bir bireyde genin tanımlanmış tüm ekzonları PCR
yöntemiyle çoğaltılmış ve dizilenmiştir. PCR sonucunda elde edilen ürünler %2’lik agaroz
jele boyutlarını kontrol etmek amacıyla yüklenmiştir. Jel 90 V’da yaklaşık 45 dakika kadar
yürütülmüştür (Şekil 4.24).
Şekil 4.35. GIPC3 ekzonlarının PCR ürünlerinin agaroz jel görüntüsü.
M:Marker, 1-6: genin ekzon numaraları
Elde edilen PCR ürünleri sephadex pürifikasyon yöntemi ile fazla primer, dNTP ve
atıklardan temizlenmiş ardından Sanger sekanslama yöntemi kullanılarak dizilenmiştir. Bu
işlemin ardından elde edilen sonuçlar referans dizi ile karşılaştırılmış ve ailedeki
etkilenmiş bireyde başka herhangi bir varyasyona rastlanmamıştır.
140
5.
TARTIŞMA ve SONUÇ
Bugüne kadar toplam 39 gendeki değişikliklerin sendromik olmayan otozomal resesif
işitme
kaybına
neden
olduğu
yapılan
çalışmalarla
gösterilmiştir
(http://hereditaryhearingloss.org/). Teknolojinin de ilerlemesi ile yeni işitme kaybı genleri
tanımlanmakta ve işitme kaybının genetiği aydınlatılmaktadır.
5.1.
Bağlantı Analizi ve Otozigozite Haritalaması
Bağlantı analizi için kullanılan easyLINKAGE programı ile oluşturulan ve LOD skoru
2’den büyük olan homozigot bölgeler ile Microsoft Excel programının macro opsiyonu
kullanılarak yapılan tarama sonucunda elde edilen otozigot blokların karşılaştırılması
Çizelge 5.1’de gösterilmektedir. İki yöntemle belirlenen bölgelerin boyutları arasında
birtakım farklılıklar bulunmaktadır. Otozigozite haritalaması sonucunda elde edile
otozigot bölgelerin, bağlantı analizi sonucunda elde edilen homozigot bölgelerle olan
benzerlikleri Çizelge 5.1’de gösterilmektedir. Çizelgede de gözüktüğü gibi Aile 1’de ve
Aile 3’de aday olan otozigot bölgeler, boyut olarak birbirlerine birebir uygunluk
göstermese de her iki yöntemle de saptanmıştır. Ancak Aile 2’de her iki yöntemle de
saptanan otozigot bölgelerden sadece 13. kromozomda bulunan bölge ortaktır. Bunun
dışındaki bölgeler birbirleri ile uygunluk göstermemektedir. easyLINKAGE programı ile
saptanan her homozigot bölge aslında ailede segrege olan gerçek anlamda homozigot
bölgeler değildir. Yani genom boyunca bazı SNP’ler “uninformatif” yani bilgi verici
olmayan SNP’lerdir. Bu SNP’lerin toplumdaki heterozigot sıklıkları çok düşüktür.
Böylece her bireyde homozigot olarak gözükürler ve easyLINKAGE programı gibi
birtakım bağlantı analizi programları için homozigot bölge özelliğindedirler. Aslında SNP
mikrodizin verisine geri dönüldüğünde bu bölgelerdeki SNP’lerin aile bireylerinin
hepsinde aynı allele homozigot oldukları gözükmektedir. Bu sebepten her iki yöntem ile
elde edilen veride farklılıklar mevcuttur.
141
Elde edilen bu bölgelerde bulunan genlerin sayısının fazlalığı, ailelerdeki sorumlu genetik
değişikliğin saptanmasını oldukça zorlaştırmaktadır. Bu amaçla ailelerdeki sorumlu
genetik değişikliklerin saptanması için tüm ekzom sekanslama yöntemi kullanılmıştır.
Çizelge 5.1. Otozigozite haritalaması ve bağlantı analizinin sonucunda elde edilen
otozigot blokların karşılaştırılması
Aile
1
12:68,803,390-84,049,547
(pLOD: 3.36)
-
2: 75,878,062-76,627,379
Tüm Ekzom Sekanslama
Sonucunda Elde Edilen
Aday Varyantlar
OTOGL-p.Val477GlufsX25
OTOGL-p.Cys1378Arg
-
1
-
9: 11,690,141-12,257,152
-
-
1
-
12: 63,471,816-63,939,990
-
-
1
-
12: 65,914,157-66,344,060
-
-
2
-
8: 41,102,764-87,083,602
-
-
2
13:74,942,645-94,565,001
(pLOD:2.56)
17:74,127,160-78,057,601
(pLOD:0.52)
-
13: 74,942,895-94,565,251
-
-
No
1
2
2
Bağlantı Analizi
(easyLINKAGE)
Otozigozite Haritalaması
12: 68,804,480-83,923,162
-
9: 46,587-4,270,147
C17orf77-p.Asp100Gly
LGALS3BP- p.Thr556Ile
ADAMTS7- p.Ser1175Pro
-
17: 70,909,052-78,212,420
3
15:68,717,750-78,656,069
(pLOD:2.52)
15: 66,505,054-79,122,155
3
19:880,911-6,451,683
(pLOD:2.52)
19: 211,970-6,402,433
ZNF57-p.Thr443Met
GIPC3-p.His170Asn
PTPRS-p.Thr496Pro
3
8:73,855,277-80,562,009
pLOD:2.52
21:38,613,337-41,709,244
(pLOD:2.52)
16:85,836,041-89,721,158
(pLOD:2.52)
8: 74,018,081-80,514,342
HNF4G-p.Gln421His
3
3
5.2.
Sanger Sekanslama
ile
Doğrulanan Varyantlar
OTOGL-p.Val477GlufsX25
OTOGL-p.Cys1378Arg
-
-
ZNF57-p.Thr443Met
(dbSNP134)
GIPC3-p.His170Asn
-
21: 37,621,029-40,630,864
-
-
16: 84,438,172-87,177,256
-
-
Aile 1
Aile 1’de tüm ekzom sekanslama sonrasında OTOGL geninde bulunan iki varyant
üzerinde durulmuştur. Bu varyantlar genin 15. ekzonunda bulunan c.1430delT
(p.Val477GlufsX25)
ve
34.
ekzonunda
bulunan
c.4134T>C
(p.Cys1378Arg)
varyantlarıdır. Ancak ailedeki en büyük otozigot bölgede, bu gen ile birlikte 2010 yılında
işitme kaybı yaptığı tanımlanan PTPRQ geni de (Schraders et al. 2010, Shahin et al. 2010)
yer almaktadır (Şekil 5.1). Öncelikle ailede PTPRQ geni PCR yöntemi ile çoğaltılmış ve
sekanslanarak herhangi bir mutasyon olmadığı gösterilmiştir.
142
Şekil 5.1. Aile 1’in tüm bireylerinin 12. kromozomdaki otozigot blok için haplotipleri
Tüm ekzom sekanslama sonrasında OTOGL geninde elde edilen c.4134T>C
(p.Cys1378Arg) varyantı, genin evrim boyunca korunmuş bir bölgesinde bulunmaktadır.
Ayrıca bu amino asit değişiminin protein üzerindeki etkisinin hasara uğratıcı olduğu
gözükse de, p.Cys1378Arg amino asit değişimi aynı gende bulunan p.Val477GlufsX25
amino
asit
değişimine
kıyasla
genin
3’
kısmında
yer
almaktadır.
Ayrıca
p.Val477GlufsX25 amino asit değişiminin proteini kırparak güdük bir protein oluşturduğu
da göz önünde bulundurulduğundan, p.Cys1378Arg amino asit değişiminin fenotipe
katkısının bulunması olası gözükmemektedir.
Otogelin-like (NP_775862.3) 2344 amino asit içeren ve 262 kD moleküler ağırlığına sahip
bir proteindir. OTOGL geninin ürünü olan otogelin-like proteini, yeni annote edilmiş bir
protein olup otogelin proteinine (OTOG) yapısal benzerliği sayesinde bu ismi almıştır
(Schraders et al. 2010, Shahin et al. 2010).
143
OTOG geni tarafından kodlanan otogelin proteini ilk olarak iç kulaktaki aselular
membranlara özel bir ekstraselular glikoprotein olarak tanımlanmıştır (Cohen-Salmon et
al. 1997). Bu protein epitelyal olarak salgılanan musin protein ailesi üyelerine yapısal
benzerlik göstermektedir. Bu benzerlik N-terminal signal peptid, WF benzeri sisteince
zengin domain tarafından korunan merkezi theonin/serin/prolince zengin bölge (TSP) ve
C-terninal düğüm motif domainidir (Cohen-Salmon et al. 1997).
Omurgalı hayvanların iç kulaklarında tüy hücreleri ve destek hücreleri çok organize bir
şeklide çalışmaktadır ve aselular membranlar, tüy hücrelerinin uç kısımlarında bulunan
stereosil yapılarıyla sıkı etkileşim halindedirler. İç kulaktaki her nöroepitel, jelatinöz yapılı
bir aselular membran ile kaplıdır. Aselular membranlar aynı zamanda birçok kollajen ve
kollajen olmayan protein de içermektedir. Bu proteinler arasında α-tectorin (TECTA), βtectorin (TECTB) ve otogelin (OTOG) de bulunmaktadır (Goodyear and Richardson
2002). Yarız ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada otogelin-like (OTOGL) proteininin de
aselular membranların yapısında bulunduğu gösterilmektedir. Bu çalışmada aynı zamanda
otogelin proteininin, membranın ses ile uyarılmasındaki dirençliliğinde rol aldığı
gösterilmiştir. Bu proteinin fetal insan dokusundaki en yüksek ekspresyonunun iç kulakta
olduğu da bu çalışmada gösterilmektedir. Bu protein, gelişme sırasında dinamik bir
ekspresyon paternine sahiptir ve iç kulakta bulunan Claudius hücrelerinde, tüy
hücrelerinde, tektorial membranın tabanında, kohleada ve bazı destek hücrelerinde
eksprese olmaktadır. Zebrafish üzerinde yapılan knock-down çalışmalarında, bu proteinin
yokluğunda işitmede azalmanın görüldüğü saptanmıştır. Otogelin-like proteininin,
otogelin proteinine yapısal ve ekspresyonel benzerliği, bu iki proteinin de benzer görevde
rol aldığını düşündürmektedir. Ayrıca ailede klinik olarak gözlenen sabit işitme kaybı ve
vestibüler bulgular da bu hipotezi doğrulamaktadır (Yarız and Duman et al. 2012).
Böylelikle bu gendeki p.Val477GlufsX25 aminoasit değişiminin insanda işitme kaybına
sebep olduğu ilk kez bu tez çalışmasında gösterilmektedir.
144
5.3.
Aile 3
Aile 3’de tüm ekzom sekanslama sonrasında belirlenen ve ailede 19. kromozomda
saptanmış olan ikinci büyük otozigot blok içerisinde yer alan c.508C>A (p.His170Asn)
varyantı GIPC3 geninde bulunmaktadır (Şekil 5.2).
Şekil 5.2. Aile 3’ün elimizde örneği mevcut tüm bireylerinin 12. kromozomdaki otozigot
blok için haplotipleri
Bu gen GIPC (GAIP-interacting protein C terminus) gen ailesinin bir üyesidir. Bu gen
ailesinde GIPC3 dışında GIPC1 ve GIPC2 genleri de bulunmaktadır (Katoh 2002, Saitoh
et al. 2002). GIPC3, 19. kromozomun kısa kolunda p13.3 bölgesinde lokalize olmuştur.
Altı ekzondan oluşan gen ve 640 nükleotid içermektedir. Sadece merkezde bulunan PDZ
domaini 122-189. amino asitlerde lokalizedir. GIPC3 proteini (NP_573568.1), 312 amino
asit içeren ve 34 kD moleküler ağırlığına sahip bir proteindir. Merkezi bir PDZ domainine
sahip olup, her iki tarafında da GIPC-homoloji domainin ile çevrilmiştir (Katoh 2002).
145
Ailede bu gende saptanan varyant, genin 3. ekzonunda bulunmaktadır ve 170.
pozisyondaki histidin amino asidini asparajin amino asidine çevirmektedir. Bu amino asit
değişiminin protein üzerindeki etkisini saptamak amacıyla Polyphen2 adı verilen internet
tabanlı insiliko analiz yapan bir program kullanılmıştır (Adzhubei et al. 2010,
http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2). Bu programa proteinin amino asit dizisi girilmekte
ve bulunan amino asit değişikliği belirtilmektedir. Program, bu bölgenin evrim boyunca
korunmuşluğu ve proteinin tahmini yapısını göz önünde bulundurarak bir hesaplama
yapmaktadır. Yapılan hesaplamada bu noktada bulunan amino asit ile değişim sonucunda
oluşan amino asidin profil skoru 0.991 (hassaslık: 0.71; spesifiklik: 0.97) olarak
hesaplanmıştır. Program, bu değer 1’e yaklaştıkça bu değişimin proteini büyük ihtimalle
hasara uğrattığını belirtmektedir. Diğer bir program olan MutPred ise hesapladığı g skoru
(zararlı bir mutasyon olma olasılığı) üzerinden bir değerlendirme yapmaktadır ve H170
amino asit değişimi için hesapladığı g skoru 0.85’dir.
Ardından NCBI e-veri tabanı içersinde yer alan “multiple alignment tool” seçeneği
kullanılarak sırası ile insan, şempanze, domuz ve faredeki bu proteinin aminoasit
dizilerinin karşılaştırılması yoluyla His170Asn mutasyonunun türler arasında korunmuş
olan kritik önemdeki bir noktaya denk geldiği belirlenmiştir ve birbirinden farklı dört
organizmada da aynı konumda yer alacak şekilde korunmuştur (Şekil 5.3). Bu noktadaki
amino asidin korunmuşluk değeri ConSeq program kullanılarak da hesaplanmış ve H170
noktasının korunmuşluk değeri 9 olarak hesaplanmıştır. Programın hesapladığı
korunmuşluk değeri 1-9 arasındadır ve 1 değeri en düşük, 9 değeri en yüksek oranda
korunmuşluğu ifade eder (Berezin et al. 2004).
Şekil 5.3. GIPC3 genindeki 170. pozisyondaki amino asitin diğer türlerle karşılaştırılması
(NCB e-veri tabanı içersinde yer alan “multiple alignment tool” seçeneği kullanılmıştır). Değişimin olduğu
amino asit kırmızı ile işaretlenmiştir.
146
Bu gen ilk olarak 2011 yılında Charizopoulou ve arkadaşları tarafından tanımlanmıştır ve
proteinin; memeli kohleasında bulunan tüy hücrelerinde, akustik sinyal iletimi ve
yayılmasında görev yaptığı gösterilmiştir (Charizopoulou et al. 2011). Bu çalışmada
Hollandalı bir ailede, genin 6. ekzonunda tanımlanan c.903G>A (p.Trp301Ter) nonsense
değişimin, erken başlangıçlı, çift taraflı sensorinöral işitme kaybı yaptığı gösterilmiştir.
Aynı çalışmada bir Hindistanlı ailede ise c.785T>G (p.Leu262Arg) missense mutasyonu
tanımlanmıştır (Charizopoulou et al. 2011). İlk tanımlanan bu iki mutasyonun ardından,
Rehman ve arkadaşları tarafından 7 Pakistanlı ailede tanımlanan p.Gly46Arg, p.Met88Ile,
p.Gly94Asp, p.Arg189Cys, p.Thr221Ile, p.Ala229GlyfsX10, p.Gly256Asp mutasyonları
ve bu tez çalışmasında tanımlanan p.His170Asn olmak üzere bu gende toplam 10 adet
mutasyon tanımlanmıştır (Charizopoulou et al. 2011, Rehman et al. 2011, Sirmaci et al.
2012). Tanımlanan mutasyonların gen üzerinde bulundukları bölgeler Şekil 5.4‘de
gösterilmektedir.
Şekil 5.4. GIPC3 geninde bugüne kadar tanımlanmış tüm mutasyonların gen üzerindeki
yerleşimleri.
(Kırmızı okla işaretli olan mutasyon bu tez çalışmasında tanımlanmıştır, mavi okla işaretli olan mutasyonlar
ise bugüne kadar bu gende tanımlanmış olan diğer mutasyonları göstermektedir.)
Daha önce Pakistanlı bir ailede tanımlanmış olan p.Arg189Cys mutasyonu ile bizim bu
tez çalışması kapsamında tanımlamış olduğumuz p.His170Asn mutasyonu, gende bulunan
iki adet GH domaininin dışında tanımlanmış olan iki mutasyondur. Ancak bu ailede
ZNF57 geninde bulunan ve ailede segrege olan p.Thr443Met mutasyonu da tamamen
yabana atılamamalıdır. Bu amino asit değişiminin de işitme kaybına katkıda
bulunabileceği veya daha büyük bir olasılıkla bu ailede görmediğimiz başka bir fenotipe
katkıda bulunabileceği de göz ardı edilmemelidir. Ailede saptanan her iki varyant ta
(ZNF57 p.Thr443Met ve GIPC3 p.His170Asn) ailede segrege olmaktadır.
147
Ailede
ZNF57
geninde
saptanan
varyant
(NC_000019.9:2917947C.T,
NM_173480.2:c.1328C.T, NP_775751.1:p.Thr443Met) dbSNP veri bankasının 132.
versiyonunda bulunmamakta ancak
dbSNP veri bankasının 135. versiyonunda
rs142727006 SNP numarası ile bulunmaktadır ve 0.003’lük bir allel frekansına sahiptir.
Ailede GIPC3 geninde saptanan ve ailedeki işitme kaybından sorumlu olduğu düşünülen
varyant (NC_000019.9:3586908) dbSNP veri bankasının her iki versiyonunda ve “NHLBI
Sequencing
Project/Exome
Variant
Server
Database”
veri
bankasında
da
bulunmamaktadır.
5.4.
Aile 2
Aile 2’ de ise tüm ekzom sekanslama yöntemi sonucunda, herhangi bir aday varyanta
rastlanmamıştır. Bunun sebeplerinden bir tanesi Çizelge 4.4’de gösterildiği üzere yeni
nesil sekanslama yöntemi uygulanan bireydeki amplikonların iki yönlü okunması
sonucunda elde edilen değerin azlığıdır. Kullanılan kitin 50 Mb olduğu göz önüne
alındığında bu okumaların ortalama olarak 50,000,000 adet olması beklenmektedir. Ancak
bireyde elde edilen değer yaklaşık olarak 37,000,000’dur. Bunun en önemli sebeplerinden
bir tanesi DNA örneğinin kalitesidir. Deneye giren DNA örneğinin kalitesi her ne kadar
her aşamada değerlendirilse de DNA örneklerinin az miktardaki degradasyonu bile bu tür
sonuçlara sebep olmaktadır. Deneye giren DNA örneğinin degrade olması, elimizdeki
kalıp DNA’nın izolasyon yöntemine, saklama koşullarına, enzim kontaminasyonu ve
benzeri nedenlere bağlı olarak rastgele yerlerinden parçalanmış olması demektir. Ancak bu
deneyin ilk aşamasında da DNA örneği rastgele yerlerinden parçalanmaktadır. Bunun
sonucunda zaten parçalanmış olan DNA örneği, deney için gerekli olandan çok daha
küçük fragmentlere ayrılmaktadır. Bu da DNA fragmentlerinin deneyin özellikle
pürifikasyon olmak üzere belirli basamakları sırasında kaybolmasına neden olmaktadır.
Böylelikle sekanslamak için geriye kalan DNA fragmentleri, sekanslanmak istenilen
bölgelerden çok daha azını kapsamaktadır ve elde edilen sekans verisi de beklenilenden
çok daha azdır.
148
Laboratuvarımızda tüm ekzom sekanslama yöntemi uyguladığımız 49 adet örnek
bulunmaktadır. Bu örneklerin, tüm ekzom sekanslama yöntemi sonucunda elde edilen
veriler değerlendirildiğinde, bu örneklerden %79.6’sinin (40 tanesi) 8X’deki ortalama
coverage değerleri ≥0.85’dir. Bunun anlamı sekanslanan bazların %85’i en az sekiz kere
sekanslanmıştır yani bu örneklerin sekans verileri kalitelidir. Aile 2’nin de dahil olduğu
10 örneğin veri kalitesi diğerlerine oranla oldukça düşüktür. Şekil 5.5’da da gösterildiği
gibi Aile 2’de sekanslanan bireydeki 8X ortalama coverage değerleri %77’dir. Bu da
elimizde bulunan verinin hem düşük kalitede olduğu hem de beklenilenden daha az veri
içeriği olduğunun bir göstergesidir.
Şekil 5.5. Aile 2’nin baz coverage değerleri
Ekzom üzerinde sekanslanmak istenilen bölgelerin hepsinin sekanslanamaması, aday
bölgelerin dolayısı ile aday varyantların kaçırılmasına sebep olmaktadır (Şekil 5.6, 5.7, 5.8
ve 5.9).
149
Şekil 5.6. Aile 2’nin 8. kromozomda bulunan otozigot bloğun coverage oranı
(UCSC veri bankası hg19 versiyonu kullanılarak görüntülenmiştir.)
Şekil 5.7. Aile 2’nin 13. kromozomda bulunan otozigot bloğun coverage oranı
(UCSC veri bankası hg19 versiyonu kullanılarak görüntülenmiştir.)
150
Şekil 5.8. Aile 2’nin 8. kromozomda bulunan otozigot bloğun coverage oranı
(UCSC veri bankası hg19 versiyonu kullanılarak görüntülenmiştir.
Şekil 5.9. Aile 2’nin 8. kromozomda bulunan otozigot bloğun coverage oranı
(UCSC veri bankası hg19 versiyonu kullanılarak görüntülenmiştir.)
151
Yukarıda gösterilen, Aile 2’deki otozigot blokların coverage şekilleri Çizelge 5.2’de
özetlenmektedir.
Çizelge 5.2. Aile 2’nin otozigot bloklarındaki sekanslanan (cover edilen) baz sayısı
Ailede Tespit Edilen
Otozigot Bölgeler
Otozigot Bölgedeki
Toplam Baz Sayısı
Otozigot Bölgedeki
Kodlayan Gen Sayısı
Otozigot Bölgedeki
Toplam Ekzon Sayısı/
Ekzonların Toplam
8. kromozom
13. kromozom
17. kromozom
9. kromozom
41102764-87083602
74942895-94565251
70909052-78212420
46587-4270147
45,980,838
19,622,356
7,303,368
4,223,560
156
24
157
14
1,546/559,185
274/98,140
1,336/358,315
197/51,182
924/160,414
267/52,040
1,265/218,880
186/35,189
137,206/(%85)
42,297/ (%81)
163,440/(%75)
31,350/ (%89)
Baz sayısı
Kodlayan Ekzon
Sayısı/ Kodlayan
Ekzonların Toplam
Baz Sayısı
Cover Edilen Baz
Sayısı/Yüzdesi
genlerin toplam baz sayısı: intron ve ekzonların toplamı
toplam ekzon sayısı ve ekzonların toplam baz sayısı: kodlayan ve kodlamayan ekzonların toplamı
cover edilen baz sayısı: tüm ekzom sekanslama yöntemi ile sekanslamam bazların sayısı
Ekzom üzerinde sekanslanmak istenilen bölgelerin hepsinin sekanslanamaması, bu ailede
olduğu gibi, aday bölgelerin dolayısı ile aday varyantların kaçırılmasına sebep
olabilmektedir.
Yukarıda bahsedilen teknik nedenlerin dışında, çalışmaya dahil edilen ailelerde, aile
hakkındaki bilgilerde de birtakım eksiklik veya yanlışlılar söz konusu olabilmektedir.
Ailelerin eğitim düzeylerinin ve yaşadıkları coğrafi bölgenin sağlık hizmetleri yönünden
özellikleri de göz önünde bulundurulduğunda, ailelerin bizlere verdikleri bir takım yanlış
bilgiler de yapılan araştırmanın hassasiyet ve doğruluğunu etkileyebilmektedir. Örneğin
ailedeki etkilenmiş
bireylerden herhangi birinin başka bir çevresel nedenden dolayı
işitmesini kaybetmesi karşılaşılan sık bir problemdir. Çocukların küçük yaşta geçirdikleri
bir takın enfeksiyonlar sonrasında ortaya çıkan işitme kayıpları, aile tarafından “doğuştan
beri işitmiyor” şeklinde yorumlanmaktadır. Bu durumda bizim çalışmaya dahil
etmememiz gereken bu birey çalışmaya dahil olmakta ve bu durum da çalışmanın
sonuçlarını etkilemektedir.
152
Son olarak epigenetik faktörlerin işitme kaybına olan etkileri de unutmamak
gerekmektedir. Bilindiği gibi işitme kaybı en sık görülen duyusal bozukluklardan biridir.
Çoğu durumda, gelişimsel iç kulak anomalileri veya kohlea tüy hücrelerinin
dejenerasyonu sonucunda ortaya çıkmaktadır. Genetik faktörlerin, işitme kaybında çok
ciddi bir yeri bulunmaktadır. birtakım genler ve gen lokusları, sendromik ve sendromik
olmayan işitme kaybından sorumludur. Ancak işitme kaybının etiyolojisi hala tamamen
aydınlatılmamıştır. Epigenetik sebeplerin işitme kaybı yaptığı yapılan bazı çalışmalarla
gösterilmiştir. Bu çalışmalarda, miRNA’ların iç kulaktaki tüy hücrelerinin fonksiyonunda
görev aldığı düşünülmektedir. MicroRNA-96 (miRNA-96)’nın sendromik olmayan
ilerleyici tip işitme kaybına sebep olduğunu göstermektedir (Lewis et al. 2009, Mencia et
al. 2009). Bu iki çalışma, miRNA fonksiyonunun bilinen Mendeliyen hastalıklarla
ilişkilendirildiği ilk örnek olmakla birlikte, bir miRNA genini yerleştirmek için kalıtsal
sağırlık veya işitme bozukluğu ile ilişkilendirilmiş 100’den fazla lokusun bulunduğunu
göstermektedir (Lewis et al. 2009, Mencia et al. 2009, Nance 2003). Tüy hücre gelişimi ve
korunmasında miRNA’nın önemi ortak gerçekleştirilen bir çalışmada da gösterilmiştir
(Friedman and Avraham 2009, Soukup 2009). Bu çalışmalara göre Dicer knockout
farelerinde, mikroRNA’ların işitsel epitel gelişimi ve korunmasında genel olarak gerekli
olduğu gösterilmektedir (Harfe 2005). Ayrıca tüy hücreleri gelişiminde miRNA-96
ekspresyonunun miRNA-183 ekspresyonu ile korelasyonu gözlenmiştir. Sonuç olarak,
miR-96/182/183’ün tüy hücrelerinin gelişim, korunma ve fonksiyonunda diğer
miRNA’lara gore önemli bir rol oynamaktadırlar (Friedman et al. 2009, Soukup et al.
2009).
İşitme kaybı, insanlarda en sık görülen duyusal bozukluklardan biridir. Doğuştan işitme
kayıplarının %50’den fazlasını genetik faktörler oluşturmaktadır ve çoğunluğu otozomal
resesif kalıtım göstermektedir (Friedman and Griffith 2003, Morton et al. 2006).
Etkilenmiş ailelerdeki işitme kaybından sorumlu genin bulunması bu genlerin sayısının
fazlalığı nedeni ile giderek zorlaşmaktadır. Bu genlerin sayısı günümüzde 40’a ulaşmıştır
(Duman et al. 2011, http://hereditaryhearingloss.org/). Bu genlerden GJB2 genindeki
mutasyonlar, bazı toplumlarda otozomal resesif sendromik olmayan işitme kayıplı
ailelerinin %50’sini oluşturmaktadır. Ancak buna karşılık işitme kaybı mutasyonlarının
büyük bir kısmı sadece bir ya da birkaç ailede gözlenmektedir (Duman and Tekin 2012).
153
2012 yılında Diaz-Horta ve arkadaşlarının yaptığı bu tezin de bir parçası olduğu, otozomal
resesif sendromik olmayan işitme kayıplı 20 ailede yapılan çalışmada, tüm ekzom
sekanslama yöntemi ve Agilent firmasına ait The SureSelect Human All Exon 50 Mb kit
kullanılarak bilinen otozomal resesif sendromik olmayan işitme kaybı genlerinin
ekzonlarının %90’ını kapsandığı gösterilmektedir. Böylelikle bu yöntem, klasik
yöntemlere oranla daha kısa sürede ve daha az masrafla, tanımlanmış tüm olmayan
otozomal resesif sendromik işitme kayıplı genlerin taranmasına da imkan sağlamaktadır
(Diaz-Horta et al. 2012).
Sonuç olarak tüm ekzom sekanslama yöntemi ile, otozomal resesif sendromik olmayan
işitme kaybı genlerin saptanması klasik yöntemlere göre çok daha kolay ve daha az
masraflı bir şekilde gerçekleştirilebilmektedir. Bu yöntem işitme kayı ile çalışan tüm
gruplar tarafından da yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Böylelikle ülkemizdeki ve diğer
ülkelerdeki işitme kaybı genlerinin spektrumları kolaylıkla saptanabilecektir. Bu gibi
çalışmalar, işitme kaybının genetiğinin aydınlatılması açısından da önemli bir yere
sahiptir. İşitme kaybının genetiğinin aydınlatılması ile ailelere daha sağlıklı genetik
danışma
verilebilme
imkanı
154
artmaktadır.
EKLER
EK 1 Aile 1’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
(UCSC veri tabanının Şubat 2009 tarihli güncelleştirmesi baz alınmıştır.)
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
12
+
69004618
69054385
69042504
69050967
8
RAP1B
NM_001010942
12
+
69080730
69136473
69080845
69136242
28
NUP107
NM_020401
12
+
69139935
69159853
69140157
69158670
5
SLC35E3
NM_018656
12
+
69201970
69239320
69202257
69233629
11
MDM2
NM_002392
12
-
69244955
69326979
69250216
69326617
9
CPM
NM_001005502
12
+
69633316
69668138
69633426
69656339
10
CPSF6
NM_007007
12
+
69742133
69748013
69742188
69746999
4
LYZ
NM_000239
12
+
69753531
69784576
69753752
69784096
7
YEATS4
NM_006530
12
+
69864128
69973562
69962810
69968735
10
FRS2
NM_001042555
12
+
69979207
69995357
69979301
69995105
16
CCT2
NM_006431
12
+
69979461
69995357
69980595
69995105
16
CCT2
NM_001198842
12
-
70002344
70004942
70003784
70004618
1
LRRC10
NM_201550
12
-
70047388
70093196
70048686
70091578
10
BEST3
NM_032735
12
-
70047388
70083056
70048686
70072668
6
BEST3
NM_152439
12
+
70132630
70216984
70149188
70209226
11
RAB3IP
NM_022456
12
+
70172753
70216984
70188228
70209226
9
RAB3IP
NM_001024647
12
+
70760061
70828072
70760514
70824433
3
KCNMB4
NM_014505
12
-
70910631
71031220
70915268
71031175
34
PTPRB
NM_001109754
12
-
71031852
71314584
71032963
71314170
14
PTPRR
NM_002849
12
-
71518876
71551779
71519113
71551458
9
TSPAN8
NM_004616
12
+
71833812
71978621
71833860
71978514
18
LGR5
NM_003667
12
-
72003378
72057749
72004207
72057390
35
ZFC3H1
NM_144982
12
+
72057676
72074428
72058289
72070888
3
THAP2
NM_031435
12
+
72079877
72097839
72080460
72094775
6
TMEM19
NM_018279
12
+
72148657
72181150
72148909
72179453
7
RAB21
NM_014999
12
+
72233486
72320629
72233561
72316984
18
TBC1D15
NM_022771
12
+
72332625
72426221
72332766
72425475
11
TPH2
NM_173353
12
+
72666528
73059422
72666558
73056975
19
TRHDE
NM_013381
12
+
74931550
74935232
74931892
74932186
1
ATXN7L3B
NM_001136262
12
-
75433857
75603528
75436092
75601763
6
KCNC2
NM_139136
12
-
75669758
75723836
75670022
75723639
18
CAPS2
NM_032606
12
-
75891418
75905418
75893588
75905377
10
KRR1
NM_007043
12
-
76419226
76425556
76424315
76425521
2
PHLDA1
NM_007350
12
-
76438671
76478738
76442208
76467999
16
NAP1L1
NM_139207
155
EK 1 devamı Aile 1’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
12
-
76738265
76742222
76739592
76742138
2
BBS10
NM_024685
12
-
76745577
76953589
76749668
76881331
24
OSBPL8
NM_020841
12
+
77157853
77247474
77158016
77244765
17
ZDHHC17
NM_015336
12
-
77252495
77272799
77252731
77260040
6
CSRP2
NM_001321
12
-
77415025
77459360
77417794
77458415
13
E2F7
NM_203394
12
+
78225068
78606790
78225241
78604297
39
NAV3
NM_014903
12
+
79257772
79845788
79611299
79842904
12
SYT1
NM_001135805
12
-
79985744
80084790
79986386
80084024
7
PAWR
NM_002583
12
-
80167342
80329235
80169708
80328711
26
PPP1R12A
NM_001143885
12
+
80603232
80772870
80603238
80771828
58
OTOGL
NM_173591
12
+
80838125
81073968
80838125
81072802
42
PTPRQ
NM_001145026
12
+
81101407
81103256
81101498
81102739
3
MYF6
NM_002469
12
+
81110707
81113447
81110842
81112830
3
MYF5
NM_005593
12
-
81191170
81331694
81205243
81331501
6
LIN7A
NM_004664
12
+
81471808
81649582
81471899
81648701
16
ACSS3
NM_024560
12
-
81652044
82152286
81655760
82148000
32
PPFIA2
NM_001220476
12
-
81652044
82153109
81655760
82148000
33
PPFIA2
NM_003625
12
-
82746082
82752199
82746929
82752155
4
CCDC59
NM_014167
12
+
82752275
82873016
82752344
82872803
12
C12orf26
NM_032230
12
+
83080933
83528067
83081365
83526168
12
TMTC2
NM_152588
2
+
75873908
75889334
75873933
75882411
6
MRPL19
NM_014763
2
-
75889831
75938111
75891791
75937981
17
GCFC2
NM_003203
12
-
63536538
63546590
63541138
63544616
2
AVPR1A
NM_000706
12
+
66218239
66360071
66219050
66357072
5
HMGA2
NM_003483
156
EK 2 Aile 2’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
(UCSC veri tabanının Şubat 2009 tarihli güncelleştirmesi baz alınmıştır.)
Kromozom
Kodlaya
n zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
chr8
-
41119475
41166990
41122685
41166678
3
SFRP1
NM_003012
chr8
+
41348080
41368499
41348373
41364625
6
GOLGA7
NM_016099
chr8
+
41386724
41402565
41387721
41399606
8
GINS4
NM_032336
chr8
+
41435706
41482520
41456658
41478520
13
AGPAT6
NM_178819
chr8
-
41503828
41504878
41503967
41504874
2
NKX6-3
NM_152568
chr8
-
41510743
41655140
41518983
41655056
43
ANK1
NM_000037
chr8
-
41786996
41909505
41789722
41906495
18
KAT6A
NM_001099413
chr8
+
42010463
42028701
42012205
42026579
10
AP3M2
NM_001134296
chr8
-
42032235
42065194
42033510
42050703
14
PLAT
NM_000930
chr8
+
42128819
42190171
42129618
42188497
22
IKBKB
NM_001556
chr8
+
42195972
42229331
42196142
42229175
14
POLB
NM_002690
chr8
-
42231585
42234674
42231617
42234563
4
DKK4
NM_014420
chr8
+
42249278
42263455
42251729
42262980
10
VDAC3
NM_005662
chr8
-
42273979
42397356
42275320
42329908
11
SLC20A2
NM_006749
chr8
+
42396938
42408140
42401615
42407751
4
C8orf40
NM_001135675
chr8
+
42552561
42592209
42552689
42591761
6
CHRNB3
NM_000749
chr8
-
42607779
42623929
42608321
42623573
6
CHRNA6
NM_004198
chr8
-
42691816
42698474
42693104
42698237
3
THAP1
NM_018105
chr8
-
42708437
42751866
42711301
42743007
7
RNF170
NM_001160223
chr8
+
42752032
42885682
42752274
42873641
22
HOOK3
NM_032410
chr8
+
42911441
42940932
42911489
42940425
9
FNTA
NM_002027
chr8
+
42948656
42978323
42958691
42978020
5
SGK196
NM_032237
chr8
+
42995591
43057970
42995639
43054712
18
HGSNAT
NM_152419
chr8
+
43147584
43218328
43147627
43212038
14
POTEA
NM_001005365
chr8
+
48173488
48648563
48173550
48648012
20
KIAA0146
NM_001080394
chr8
-
48649475
48650726
48649872
48650682
1
CEBPD
NM_005195
chr8
-
48685668
48872743
48686733
48872686
86
PRKDC
NM_006904
chr8
+
48872762
48890719
48873704
48889338
17
MCM4
NM_182746
chr8
+
48920994
48974454
48921014
48973388
4
UBE2V2
NM_003350
chr8
-
49627473
49647870
49637300
49647710
6
EFCAB1
NM_001142857
chr8
-
49830238
49833999
49831365
49833824
3
SNAI2
NM_003068
chr8
+
49966894
49988642
49985389
49987732
5
C8orf22
NM_001256596
chr8
+
50824596
51705427
51306798
51705389
19
SNTG1
NM_018967
chr8
-
52232136
52722005
52232450
52721904
23
PXDNL
NM_144651
157
EK 2 devamı Aile 2’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
chr8
-
52730139
52811735
52732910
52773711
6
PCMTD1
NM_052937
chr8
-
53023391
53322439
53025757
53126817
26
ST18
NM_014682
chr8
-
53446596
53478021
53451002
53477816
5
FAM150A
NM_207413
chr8
-
53535017
53627026
53536341
53598029
24
RB1CC1
NM_014781
chr8
+
53852467
53853454
53852467
53853454
1
NPBWR1
NM_005285
chr8
-
54138275
54164194
54141856
54163597
4
OPRK1
NM_000912
chr8
-
54628102
54755871
54628523
54754250
14
ATP6V1H
NM_015941
chr8
+
54764367
54871863
54764459
54871018
6
RGS20
NM_170587
chr8
-
54879115
54935008
54880663
54934685
10
TCEA1
NM_006756
chr8
-
54958937
55014577
54960624
55014383
9
LYPLA1
NM_006330
chr8
+
55047780
55061074
55047843
55060279
5
MRPL15
NM_014175
chr8
+
55370494
55373456
55370698
55372555
2
SOX17
NM_022454
chr8
+
55528626
55543394
55533526
55542913
4
RP1
NM_006269
chr8
+
56015016
56438710
56015048
56436786
3
XKR4
NM_052898
chr8
-
56651319
56685885
56652690
56675518
6
TMEM68
NM_152417
chr8
+
56685790
56738005
56686177
56737262
13
TGS1
NM_024831
chr8
+
56792385
56925006
56854418
56922669
13
LYN
NM_001111097
chr8
-
56980738
56987140
56982296
56986942
6
RPS20
NM_001146227
chr8
-
57025500
57026541
57025500
57026541
1
MOS
NM_005372
chr8
-
57073467
57123859
57078801
57080828
5
PLAG1
NM_002655
chr8
+
57124314
57131176
57125409
57129064
5
CHCHD7
NM_001011667
chr8
-
57212569
57233241
57214038
57228906
7
SDR16C5
NM_138969
chr8
-
57353512
57359282
57353830
57358512
4
PENK
NM_001135690
chr8
-
57870487
57906430
57876351
57906144
5
IMPAD1
NM_017813
chr8
+
58907112
59062277
59058789
59059902
5
FAM110B
NM_147189
chr8
+
59323822
59364060
59323944
59360110
8
UBXN2B
NM_001077619
chr8
-
59402736
59412720
59404033
59412657
6
CYP7A1
NM_000780
chr8
+
59465727
59495419
59477592
59494299
9
SDCBP
NM_001007070
chr8
-
59496063
59572404
59496664
59572190
31
NSMAF
NM_003580
chr8
-
59717976
60031767
59720305
60031546
9
TOX
NM_014729
chr8
-
61101422
61193954
61121343
61193706
9
CA8
NM_004056
chr8
+
61429468
61536203
61429766
61533328
8
RAB2A
NM_002865
chr8
+
61591323
61780586
61653991
61778492
38
CHD7
NM_017780
chr8
+
62200524
62414204
62212386
62412101
6
CLVS1
NM_173519
chr8
-
62413114
62627199
62415917
62626930
25
ASPH
NM_004318
158
EK 2 devamı Aile 2’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
chr8
+
63161500
63903628
63161632
63902788
6
NKAIN3
NM_173688
chr8
-
63927638
63951610
63927890
63951327
9
GGH
NM_003878
chr8
-
63972047
63998612
63973810
63998580
5
TTPA
NM_000370
chr8
+
64081120
64125346
64081436
64122264
5
YTHDF3
NM_152758
chr8
+
65492794
65496191
65493347
65494493
1
BHLHE22
NM_152414
chr8
-
65508528
65711348
65509198
65711144
6
CYP7B1
NM_004820
chr8
-
66514690
66546452
66516628
66539633
7
ARMC1
NM_018120
chr8
+
66556887
66622798
66582187
66621279
8
MTFR1
NM_014637
chr8
-
66626568
66753969
66631524
66753743
13
PDE7A
NM_001242318
chr8
+
66933790
67012755
66963782
67012266
6
DNAJC5B
NM_033105
chr8
+
67039277
67087718
67039503
67086716
11
TRIM55
NM_033058
chr8
-
67088611
67090846
67089121
67089712
2
CRH
NM_000756
chr8
+
67341262
67342968
67341366
67342464
1
RRS1
NM_015169
chr8
+
67344717
67381044
67344751
67380587
14
ADHFE1
NM_144650
chr8
+
67405490
67430759
67405883
67428311
6
C8orf46
NM_152765
chr8
-
67474409
67525480
67476931
67525073
16
MYBL1
NM_001080416
chr8
-
67542487
67579452
67546735
67579193
3
VCPIP1
NM_025054
chr8
+
67579786
67774257
67705971
67771816
19
C8orf44-SGK3
NM_001204173
chr8
+
67579786
67593377
67589943
67592189
3
C8orf44
NM_019607
chr8
+
67624652
67774257
67705971
67771816
17
SGK3
NM_001033578
chr8
+
67687415
67774257
67705971
67771816
17
SGK3
NM_013257
chr8
+
67782983
67834283
67786375
67831404
15
MCMDC2
NM_173518
chr8
-
67858735
67874825
67860285
67874000
4
TCF24
NM_001193502
chr8
-
67900366
67940786
67900617
67929982
6
PPP1R42
NM_001013626
chr8
-
67955314
67974562
67955467
67974231
8
COPS5
NM_006837
chr8
+
67976602
68108849
67976633
68107828
29
CSPP1
NM_024790
chr8
-
68109883
68255912
68111168
68255522
39
ARFGEF1
NM_006421
chr8
-
68334404
68658620
68334738
68658364
11
CPA6
NM_020361
chr8
+
68864602
69143897
68864629
69143613
40
PREX2
NM_024870
chr8
+
69242956
69731258
69243247
69730481
14
C8orf34
NM_052958
chr8
+
70405027
70573147
70476210
70570770
23
SULF1
NM_001128205
chr8
-
70584567
70747299
70585103
70744908
10
SLCO5A1
NM_030958
chr8
-
70963885
70983562
70964311
70982095
8
PRDM14
NM_024504
chr8
-
71024266
71316020
71025866
71128980
23
NCOA2
NM_006540
chr8
-
71485452
71520694
71487166
71520434
11
TRAM1
NM_014294
159
EK 2 devamı Aile 2’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
chr8
-
71549500
71581447
71550094
71581355
7
LACTB2
NM_016027
chr8
+
71581599
71648177
71593293
71646659
5
XKR9
NM_001011720
chr8
-
72109667
72274467
72111574
72267140
18
EYA1
NM_000503
chr8
-
72753776
72756731
72754895
72756413
2
MSC
NM_005098
chr8
-
72933485
72987819
72935140
72987644
27
TRPA1
NM_007332
chr8
+
73449625
73850584
73479969
73850326
3
KCNB2
NM_004770
chr8
+
73921096
73959987
73921121
73958372
10
TERF1
NM_017489
chr8
-
73976777
74005507
73979575
74005302
5
SBSPON
NM_153225
chr8
-
74153658
74171737
74153691
74171693
4
LOC100130301
NM_001243237
chr8
-
74202873
74205869
74203278
74205847
7
RPL7
NM_000971
chr8
+
74206836
74237520
74207524
74235271
6
RDH10
NM_172037
chr8
-
74332603
74659162
74333606
74621380
15
STAU2
NM_001164380
chr8
-
74702839
74791110
74706336
74791057
7
UBE2W
NM_001001481
chr8
-
74857372
74884143
74858864
74872003
6
TCEB1
NM_001204861
chr8
+
74903563
74941307
74903677
74941289
5
LY96
NM_015364
chr8
-
75146938
75233562
75149457
75233522
6
JPH1
NM_020647
chr8
+
75262617
75279335
75262696
75276602
6
GDAP1
NM_018972
chr8
+
75736771
75767264
75737484
75761488
6
PI15
NM_015886
chr8
+
75896707
75946793
75898222
75944477
15
CRISPLD1
NM_031461
chr8
+
76452202
76479061
76452227
76476331
10
HNF4G
NM_004133
chr8
+
77593514
77779521
77616323
77776801
11
ZFHX4
NM_024721
chr8
-
77892493
77913280
77895496
77896414
5
PEX2
NM_001172086
chr8
+
79428335
79517502
79510619
79514056
4
PKIA
NM_006823
chr8
+
79578281
79631997
79578383
79629728
9
ZC2HC1A
NM_016010
chr8
-
79645006
79717758
79645947
79717157
6
IL7
NM_000880
chr8
+
80523048
80578410
80523430
80577051
6
STMN2
NM_001199214
chr8
-
80676244
80680098
80677422
80679898
5
HEY1
NM_012258
chr8
-
80831094
80942506
80831214
80942483
3
MRPS28
NM_014018
chr8
-
80947104
81083836
80950350
81083678
8
TPD52
NM_001025253
chr8
+
81398447
81434610
81399045
81431763
6
ZBTB10
NM_023929
chr8
-
81540685
81787016
81553600
81733829
9
ZNF704
NM_001033723
chr8
-
81880045
82024303
81888778
81905462
9
PAG1
NM_018440
chr8
+
82192717
82197012
82192830
82196802
4
FABP5
NM_001444
chr8
-
82352563
82359719
82355632
82359621
4
PMP2
NM_002677
chr8
-
82370617
82373758
82370617
82373758
4
FABP9
NM_001080526
160
EK 2 devamı Aile 2’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
chr8
-
82390731
82395473
82391099
82395402
4
FABP4
NM_001442
chr8
-
82437280
82443550
82437280
82443550
4
FABP12
NM_001105281
chr8
-
82569150
82598589
82571585
82598150
10
IMPA1
NM_001144878
chr8
-
82569150
82598589
82571585
82593795
9
IMPA1
NM_005536
chr8
-
82605890
82607207
82605890
82607207
1
SLC10A5
NM_001010893
chr8
-
82613565
82633539
82614929
82633516
8
ZFAND1
NM_001170796
chr8
+
82644687
82671748
82644861
82670779
5
CHMP4C
NM_152284
chr8
-
82711817
82754521
82713731
82752221
9
SNX16
NM_022133
chr8
-
82711817
82754521
82713731
82752221
7
SNX16
NM_152837
chr8
+
85095452
85834078
85441556
85833146
10
RALYL
NM_001100392
chr8
+
86019322
86058314
86019530
86057746
19
LRRCC1
NM_033402
chr8
+
86089618
86126753
86089655
86126097
8
E2F5
NM_001083588
chr8
-
86126287
86132643
86126794
86129728
5
C8orf59
NM_001099672
chr8
+
86157715
86196302
86158057
86193578
7
CA13
NM_198584
chr8
-
86240457
86290342
86240788
86253864
9
CA1
NM_001738
chr8
-
86568694
86575726
86573698
86575726
1
REXO1L1
NM_172239
chr8
-
87060690
87081851
87060690
87081851
3
PSKH2
NM_033126
chr13
-
75858808
76056250
75860927
76055903
21
TBC1D4
NM_014832
chr13
-
76099349
76111991
76100724
76111941
5
COMMD6
NM_203497
chr13
+
76123926
76180068
76123956
76179948
9
UCHL3
NM_006002
chr13
+
76194569
76434006
76195829
76432079
30
LMO7
NM_005358
chr13
+
76445173
76457948
76445262
76457238
4
LOC729420
NM_001257995
chr13
-
77454303
77460540
77459305
77460283
1
KCTD12
NM_138444
chr13
+
77526623
77532776
77526623
77532120
4
IRG1
NM_001258406
chr13
+
77566058
77576652
77566086
77575104
4
CLN5
NM_006493
chr13
-
77579388
77601331
77581279
77595995
5
FBXL3
NM_012158
chr13
-
77618791
77901177
77619512
77900910
83
MYCBP2
NM_015057
chr13
+
78109808
78219398
78130010
78218409
33
SCEL
NM_144777
chr13
+
78271988
78338377
78272048
78337355
7
SLAIN1
NM_001242868
chr13
+
78273015
78338377
78273058
78337355
7
SLAIN1
NM_001040153
chr13
-
78469615
78493903
78472334
78493750
8
EDNRB
NM_001201397
chr13
-
79173229
79177695
79175549
79177461
2
POU4F1
NM_006237
chr13
-
79188420
79233314
79189714
79233255
6
RNF219
NM_024546
chr13
-
79894099
79979923
79894755
79979909
21
RBM26
NM_022118
chr13
+
80055258
80130212
80055338
80125255
8
NDFIP2
NM_001161407
chr13
-
80910111
80915086
80910892
80911840
2
SPRY2
NM_005842
chr13
-
84451342
84456528
84453551
84455642
1
SLITRK1
NM_052910
161
EK 2 devamı Aile 2’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
chr13
-
86366921
86373483
86368117
86370643
2
SLITRK6
NM_032229
chr13
+
88324869
88331870
88327643
88330520
2
SLITRK5
NM_015567
chr13
+
92050934
93519487
92051300
93518692
8
GPC5
NM_004466
chr13
+
93879077
95060273
93879709
95055471
9
GPC6
NM_005708
chr17
-
70642084
71088853
70643722
71084903
10
SLC39A11
NM_001159770
chr17
+
71161159
71168062
71165458
71166568
2
SSTR2
NM_001050
chr17
+
71189172
71204645
71189208
71204590
14
COG1
NM_018714
chr17
-
71203491
71228533
71205667
71228445
4
FAM104A
NM_001098832
chr17
+
71228775
71245095
71231621
71243480
6
C17orf80
NM_017941
chr17
-
71244587
71258019
71244632
71257957
6
CPSF4L
NM_001129885
chr17
-
71279762
71308143
71281568
71282639
2
CDC42EP4
NM_012121
chr17
-
71330522
71640227
71334725
71640227
45
SDK2
NM_001144952
chr17
+
72199794
72206019
72200094
72205968
5
RPL38
NM_000999
chr17
+
72209695
72258157
72209726
72256348
14
TTYH2
NM_032646
chr17
+
72270385
72311023
72277956
72310355
14
DNAI2
NM_023036
chr17
+
72322350
72351959
72322488
72351451
20
KIF19
NM_153209
chr17
-
72352554
72357958
72352795
72357958
3
BTBD17
NM_001080466
chr17
+
72363644
72368739
72363644
72368739
4
GPR142
NM_181790
chr17
+
72427666
72443568
72428177
72443167
4
GPRC5C
NM_022036
chr17
+
72462521
72480937
72462842
72480265
7
CD300A
NM_007261
chr17
-
72517312
72527613
72518876
72527600
4
CD300LB
NM_174892
chr17
-
72537246
72542282
72537727
72541921
4
CD300C
NM_006678
chr17
-
72576110
72588370
72576140
72588341
4
CD300LD
NM_001115152
chr17
+
72581056
72590348
72588185
72588917
3
C17orf77
NM_152460
chr17
-
72606021
72619897
72608791
72619760
4
CD300E
NM_181449
chr17
+
72667255
72743474
72667725
72741550
9
RAB37
NM_175738
chr17
-
72690451
72709108
72691234
72709005
7
CD300LF
NM_139018
chr17
+
72732958
72743474
72733148
72741550
9
RAB37
NM_001163989
chr17
+
72744750
72765499
72744985
72764795
6
SLC9A3R1
NM_004252
chr17
-
72766685
72772470
72767862
72771837
7
NAT9
NM_015654
chr17
+
72772621
72835922
72773469
72832826
10
TMEM104
NM_017728
chr17
-
72838167
72856007
72838573
72851231
13
GRIN2C
NM_000835
chr17
-
72858618
72869156
72858938
72869069
13
FDXR
NM_001258013
chr17
-
72873472
72889705
72874459
72889693
6
FADS6
NM_178128
chr17
-
72912175
72919351
72914167
72919168
3
USH1G
NM_173477
chr17
+
72920369
72930006
72920727
72929640
7
OTOP2
NM_178160
chr17
+
72931896
72945511
72931896
72945511
7
OTOP3
NM_178233
162
EK 2 devamı Aile 2’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
chr17
-
72946838
72968900
72947664
72968751
19
C17orf28
NM_030630
chr17
+
72983726
73001892
72984138
73000169
5
CDR2L
NM_014603
chr17
+
73008779
73017356
73008781
73017100
6
ICT1
NM_001545
chr17
-
73034954
73043074
73035026
73038745
6
ATP5H
NM_006356
chr17
+
73043278
73061981
73043345
73059142
6
KCTD2
NM_015353
chr17
+
73084054
73102248
73089731
73102128
7
SLC16A5
NM_004695
chr17
+
73106081
73126360
73106383
73125133
3
ARMC7
NM_024585
chr17
-
73126319
73127890
73126582
73127802
5
NT5C
NM_014595
chr17
-
73131343
73150774
73132196
73144684
6
HN1
NM_001002033
chr17
-
73163824
73179098
73164433
73178929
4
SUMO2
NM_006937
chr17
+
73201596
73231854
73201856
73231774
19
NUP85
NM_024844
chr17
+
73257748
73262457
73257981
73262004
5
MRPS7
NM_015971
chr17
-
73262309
73267311
73262820
73266276
7
MIF4GD
NM_020679
chr17
-
73269060
73285530
73269531
73282845
8
SLC25A19
NM_021734
chr17
-
73314156
73401789
73316448
73389709
6
GRB2
NM_002086
chr17
+
73452663
73496533
73467986
73495415
32
KIAA0195
NM_014738
chr17
-
73496341
73511627
73497160
73509885
20
CASKIN2
NM_020753
chr17
+
73512608
73520820
73512641
73520493
11
TSEN54
NM_207346
chr17
+
73521782
73571290
73539507
73570959
26
LLGL2
NM_001031803
chr17
-
73622924
73663269
73623501
73662637
20
RECQL5
NM_004259
chr17
+
73629513
73637486
73636281
73636977
3
C17orf109
NM_001162995
chr17
-
73645793
73663269
73646719
73662637
9
RECQL5
NM_001003715
chr17
+
73663398
73704139
73663452
73702601
11
SAP30BP
NM_013260
chr17
+
73717515
73753899
73720783
73753636
40
ITGB4
NM_000213
chr17
-
73754017
73761280
73754136
73761217
8
GALK1
NM_000154
chr17
-
73772514
73775860
73774675
73775255
4
H3F3B
NM_005324
chr17
+
73780919
73821886
73780961
73820498
16
UNK
NM_001080419
chr17
-
73823307
73840798
73824045
73840418
32
UNC13D
NM_199242
chr17
-
73841779
73851501
73842814
73851378
8
WBP2
NM_012478
chr17
-
73870244
73874656
73870563
73874629
6
TRIM47
NM_033452
chr17
-
73885040
73893084
73886859
73893018
6
TRIM65
NM_173547
chr17
-
73894723
73901181
73894930
73900956
9
MRPL38
NM_032478
chr17
-
73906617
73937119
73906803
73934230
29
FBF1
NM_001080542
chr17
-
73937588
73975515
73942828
73975154
14
ACOX1
NM_004035
chr17
+
73975297
73996667
73982273
73996343
4
TEN1
NM_001113324
163
EK 2 devamı Aile 2’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
chr17
+
73996986
74002080
73997506
74001504
8
CDK3
NM_001258
chr17
-
74002926
74023507
74003183
74023279
22
EVPL
NM_001988
chr17
-
74034855
74068607
74035786
74068572
16
SRP68
NM_014230
chr17
+
74070891
74073573
74070964
74073512
2
GALR2
NM_003857
chr17
+
74075262
74078885
74075345
74078734
9
ZACN
NM_180990
chr17
-
74077085
74099868
74079728
74099773
20
EXOC7
NM_001145299
chr17
-
74132414
74137380
74133433
74136476
3
FOXJ1
NM_001454
chr17
-
74138533
74236390
74141315
74236321
19
RNF157
NM_052916
chr17
+
74261285
74267379
74261586
74266586
3
FAM100B
NM_182565
chr17
-
74270129
74303761
74270316
74303581
19
QRICH2
NM_032134
chr17
-
74306867
74350230
74307622
74349784
10
PRPSAP1
NM_002766
chr17
+
74380689
74383941
74381186
74383667
6
SPHK1
NM_182965
chr17
-
74385612
74449288
74387023
74449223
18
UBE2O
NM_022066
chr17
+
74449432
74466199
74462254
74466052
7
AANAT
NM_001166579
chr17
-
74466974
74497509
74467714
74477606
19
RHBDF2
NM_024599
chr17
-
74523429
74533987
74524659
74533624
4
CYGB
NM_134268
chr17
-
74561460
74582145
74562185
74581890
9
ST6GALNAC2
NM_006456
chr17
-
74620844
74639894
74621411
74639720
9
ST6GALNAC1
NM_018414
chr17
-
74671808
74707056
74673669
74707028
4
MXRA7
NM_001008528
chr17
-
74675650
74707056
74679975
74707028
5
MXRA7
NM_001008529
chr17
-
74714524
74722881
74714810
74722557
6
JMJD6
NM_015167
chr17
+
74722911
74729962
74725792
74729768
5
METTL23
NM_001080510
chr17
+
74732646
74775336
74734434
74774434
14
MFSD11
NM_001242534
chr17
+
74864797
74946471
74865111
74944920
17
MGAT5B
NM_001199172
chr17
+
75084724
75213181
75139678
75212646
20
SEC14L1
NM_001204408
chr17
+
75085234
75213181
75139678
75210105
18
SEC14L1
NM_001204410
chr17
+
75137004
75213181
75139678
75212646
18
SEC14L1
NM_001039573
chr17
+
76000317
76104916
76045143
76100926
22
TNRC6C
NM_001142640
chr17
-
76108998
76128488
76109228
76122913
20
TMC6
NM_007267
chr17
+
76126858
76139049
76127669
76137193
16
TMC8
NM_152468
chr17
+
76142433
76162364
76142488
76162127
5
C17orf99
NM_001163075
chr17
+
76164670
76169009
76164697
76168017
4
SYNGR2
NM_004710
chr17
-
76170159
76183285
76170839
76183075
7
TK1
NM_003258
chr17
+
76183397
76203782
76183451
76203018
11
AFMID
NM_001010982
chr17
+
76210276
76221716
76210397
76219635
5
BIRC5
NM_001012271
164
EK 2 devamı Aile 2’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
chr17
+
76227390
76237068
76228104
76235873
6
TMEM235
NM_001204210
chr17
-
76352858
76356158
76354498
76355176
2
SOCS3
NM_003955
chr17
+
76374734
76420639
76374746
76415746
10
PGS1
NM_024419
chr17
-
76419777
76573476
76419986
76571139
81
DNAH17
NM_173628
chr17
-
76670129
76778376
76672172
76778305
13
CYTH1
NM_017456
chr17
-
76792964
76836969
76794501
76832445
20
USP36
NM_025090
chr17
-
76849058
76921472
76851748
76921170
5
TIMP2
NM_003255
chr17
-
76886661
76899299
76886719
76897910
3
LOC100653515
NM_001243540
chr17
-
76967334
76976061
76967657
76973273
6
LGALS3BP
NM_005567
chr17
-
76987797
77005899
76989631
76993704
6
CANT1
NM_001159772
chr17
+
77019015
77045870
77040050
77044170
4
C1QTNF1
NM_153372
chr17
+
77071018
77084685
77071026
77082431
14
ENGASE
NM_001042573
chr17
-
77085426
77478563
77086964
77111797
14
RBFOX3
NM_001082575
chr17
+
77704881
77716021
77704901
77711845
6
ENPP7
NM_178543
chr17
+
77751976
77761449
77752034
77758841
5
CBX2
NM_005189
chr17
+
77751976
77756331
77752034
77755948
4
CBX2
NM_032647
chr17
-
77768175
77770915
77768433
77770797
5
CBX8
NM_020649
chr17
-
77806954
77813213
77807757
77813050
5
CBX4
NM_003655
chr17
-
77913818
78009647
77914657
77987346
12
TBC1D16
NM_019020
chr17
+
78010430
78074412
78010461
78073574
20
CCDC40
NM_017950
chr17
+
78075354
78093679
78078385
78093130
21
GAA
NM_001079803
chr17
-
78109012
78120982
78109288
78120760
12
EIF4A3
NM_014740
chr17
-
78183078
78194199
78184250
78194112
8
SGSH
NM_000199
chr17
+
78194199
78227308
78195359
78226515
18
SLC26A11
NM_001166347
chr9
-
116230
118417
116799
118119
1
FOXD4
NM_207305
chr9
-
121037
179075
121466
177768
16
CBWD1
NM_001145355
chr9
-
213107
215893
214508
215396
1
C9orf66
NM_152569
chr9
+
214864
465259
214976
464219
48
DOCK8
NM_203447
chr9
+
470293
746106
676972
745235
16
KANK1
NM_001256876
chr9
+
841689
969090
841838
968139
5
DMRT1
NM_021951
chr9
+
976963
991732
977001
991005
2
DMRT3
NM_021240
chr9
+
1050353
1057554
1051613
1055774
6
DMRT2
NM_001130865
chr9
+
2015341
2193623
2029022
2192739
34
SMARCA2
NM_003070
chr9
+
2621792
2654485
2622189
2653868
19
VLDLR
NM_003383
chr9
+
2717525
2730037
2717739
2729727
2
KCNV2
NM_133497
165
EK 2 devamı Aile 2’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
chr9
-
2804154
2844130
2804330
2838507
18
KIAA0020
NM_014878
chr9
-
3224646
3525983
3225041
3395588
18
RFX3
NM_134428
chr9
-
3824127
4300035
3828271
4286425
11
GLIS3
NM_001042413
166
EK 3 Aile 3’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
(UCSC veri tabanının Şubat 2009 tarihli güncelleştirmesi baz alınmıştır.)
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds
başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
chr15
-
66187633
66546075
66190271
66420741
23
MEGF11
NM_032445
chr15
+
66585632
66626236
66587435
66625650
17
DIS3L
NM_133375
chr15
-
66629007
66649054
66629295
66645285
8
TIPIN
NM_017858
chr15
+
66679210
66783882
66679685
66782953
11
MAP2K1
NM_002755
chr15
-
66782665
66790146
66786773
66790069
4
SNAPC5
NM_006049
chr15
-
66791652
66797193
66791744
66797128
10
RPL4
NM_000968
chr15
-
66840536
66857835
66840827
66857703
13
LCTL
NM_207338
chr15
+
67358194
67487533
67358492
67482874
9
SMAD3
NM_005902
chr15
-
67493366
67547074
67495158
67546969
10
AAGAB
NM_024666
chr15
+
67547137
67794142
67547234
67793084
21
IQCH
NM_001031715
chr15
+
67813521
67819641
67813586
67818883
2
C15orf61
NM_001143936
chr15
+
67835020
68099455
67835673
68099088
22
MAP2K5
NM_145160
chr15
+
68112041
68126174
68112041
68126174
15
SKOR1
NM_001258024
chr15
+
68346571
68480404
68346664
68480173
14
PIAS1
NM_016166
chr15
-
68483042
68498448
68486352
68497714
5
CALML4
NM_033429
chr15
-
68499329
68522080
68500477
68521922
7
CLN6
NM_017882
chr15
+
68570140
68583640
68570755
68583580
2
FEM1B
NM_015322
chr15
-
68594041
68724492
68595396
68724405
30
ITGA11
NM_001004439
chr15
+
68871307
69020144
68871601
69018313
12
CORO2B
NM_006091
chr15
-
69070874
69113261
69072419
69113090
7
ANP32A
NM_006305
chr15
+
69222838
69239150
69222992
69238926
2
SPESP1
NM_145658
chr15
+
69452972
69564544
69548145
69561583
5
GLCE
NM_015554
chr15
+
69591293
69699976
69652419
69696161
9
PAQR5
NM_017705
chr15
+
69606741
69699976
69652419
69696161
9
PAQR5
NM_001104554
chr15
+
69706626
69740764
69706804
69740146
23
KIF23
NM_138555
chr15
+
69745158
69747884
69745287
69747846
4
RPLP1
NM_001003
chr15
-
70340542
70390256
70342435
70389137
20
TLE3
NM_005078
chr15
-
70946892
71055850
70949394
71055746
19
UACA
NM_018003
chr15
-
71123888
71146498
71124390
71146427
3
LARP6
NM_018357
chr15
-
71173680
71184772
71174792
71184611
3
THAP10
NM_020147
chr15
+
71185018
71342436
71190733
71341951
17
LRRC49
NM_001199018
chr15
-
71402582
71407839
71403489
71404621
4
CT62
NM_001102658
chr15
+
71433787
72075722
71433866
72069713
17
THSD4
NM_024817
chr15
+
72102893
72110597
72103083
72110025
9
NR2E3
NM_014249
chr15
-
72118360
72410440
72118920
72338904
42
MYO9A
NM_006901
167
EK 3 devamı Aile 3’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds
başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
chr15
+
72409191
72433311
72431964
72432603
chr15
-
72452146
72490136
72454349
72490112
chr15
-
72491369
72523727
72491990
72523328
chr15
-
72533521
72563628
72533795
chr15
-
72577067
72612525
chr15
-
72635777
chr15
+
chr15
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
3
SENP8
NM_001172109
12
GRAMD2
NM_001012642
12
PKM
NM_001206796
72559818
23
PARP6
NM_020214
72579605
72612215
13
CELF6
NM_052840
72668520
72636417
72668313
14
HEXA
NM_000520
72690667
72700708
72690667
72700234
5
TMEM202
NM_001080462
+
72766666
72878896
72766980
72875633
14
ARIH1
NM_005744
chr15
+
72947037
72959738
72947078
72958683
18
GOLGA6B
NM_018652
chr15
-
73043707
73076126
73044681
73076032
7
ADPGK
NM_031284
chr15
+
73344824
73597547
73345016
73595037
29
NEO1
NM_002499
chr15
-
73612199
73661605
73614821
73660611
8
HCN4
NM_005477
chr15
+
73735498
73852353
73735526
73852257
6
C15orf60
NM_001042367
chr15
-
73852343
73925753
73854250
73925556
9
NPTN
NM_001161363
chr15
+
73976621
74006859
73991980
74005297
10
CD276
NM_001024736
chr15
+
73976621
74006859
73991980
74005297
8
CD276
NM_025240
chr15
-
74032140
74043816
74032257
74043471
2
C15orf59
NM_001039614
chr15
+
74165967
74181556
74166050
74181442
11
TBC1D21
NM_153356
chr15
+
74218788
74244478
74219124
74244178
7
LOXL1
NM_005576
chr15
-
74275558
74284689
74276277
74283162
8
STOML1
NM_001256677
chr15
+
74287013
74340155
74287153
74337349
9
PML
NM_033238
chr15
-
74362197
74374891
74363250
74374850
18
GOLGA6A
NM_001038640
chr15
+
74421714
74429143
74425095
74427333
4
ISLR2
NM_001130136
chr15
+
74466904
74469212
74467199
74468486
2
ISLR
NM_201526
chr15
-
74471807
74501371
74472420
74494608
19
STRA6
NM_001142619
chr15
+
74528666
74628482
74529060
74628394
19
CCDC33
NM_025055
chr15
-
74630102
74658553
74630312
74637535
9
CYP11A1
NM_001099773
chr15
-
74701629
74726299
74702964
74726259
14
SEMA7A
NM_003612
chr15
-
74738317
74753510
74738430
74751208
11
UBL7
NM_032907
chr15
+
74833547
74890472
74836277
74888115
9
ARID3B
NM_006465
chr15
+
74907334
74922542
74907795
74922224
13
CLK3
NM_001130028
chr15
-
74922898
74988386
74924952
74967465
10
EDC3
NM_001142443
chr15
-
75011882
75017877
75012829
75015438
7
CYP1A1
NM_000499
chr15
+
75074424
75095539
75090638
75094854
14
CSK
NM_001127190
chr15
+
75105193
75118099
75105195
75117946
14
LMAN1L
NM_021819
chr15
+
75118950
75124136
75119044
75122695
3
CPLX3
NM_001030005
chr15
-
75128458
75135552
75129568
75135446
16
ULK3
NM_001099436
chr15
-
75137196
75165670
75137423
75165596
9
SCAMP2
NM_005697
168
Ekzon
sayısı
EK 3 devamı Aile 3’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds
başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
chr15
+
75182409
75190565
75182414
75190071
chr15
-
75192327
75199462
75194959
75199141
chr15
-
75212616
75230495
75215997
chr15
-
75247442
75249775
chr15
+
75287875
chr15
+
chr15
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
8
MPI
NM_002435
5
FAM219B
NM_020447
75230355
5
COX5A
NM_004255
75248324
75248924
1
RPP25
NM_017793
75313836
75304180
75311324
8
SCAMP5
NM_001178112
75315926
75343067
75320659
75341576
6
PPCDC
NM_021823
+
75494220
75504510
75498389
75503457
3
C15orf39
NM_015492
chr15
+
75550898
75565796
75550939
75562540
18
GOLGA6C
NM_001164404
chr15
+
75575181
75588148
75575216
75586816
18
GOLGA6D
NM_001145224
chr15
+
75628373
75632614
75628430
75632346
8
COMMD4
NM_017828
chr15
-
75648132
75660968
75648246
75660924
26
MAN2C1
NM_006715
chr15
-
75661719
75748124
75664319
75722716
21
SIN3A
NM_001145357
chr15
-
75759461
75871625
75761109
75871117
13
PTPN9
NM_002833
chr15
-
75890423
75918719
75890698
75913392
9
SNUPN
NM_001042588
chr15
-
75931425
75932664
75931954
75932509
1
IMP3
NM_018285
chr15
+
75941347
75950968
75941443
75949556
2
SNX33
NM_153271
chr15
-
75966662
76005189
75967890
76005096
10
CSPG4
NM_001897
chr15
+
76016318
76020027
76016540
76019881
4
ODF3L1
NM_175881
chr15
+
76135621
76193388
76136007
76191799
13
UBE2Q2
NM_173469
chr15
+
76196199
76227608
76196304
76225443
7
FBXO22
NM_147188
chr15
-
76234327
76304785
76235978
76303571
6
NRG4
NM_138573
chr15
+
76352298
76497304
76426604
76496656
11
C15orf27
NM_152335
chr15
-
76508628
76603810
76508899
76603729
12
ETFA
NM_000126
chr15
+
76629146
76634816
76629224
76634176
6
ISL2
NM_145805
chr15
-
76640526
77154285
76640973
77085607
32
SCAPER
NM_001145923
chr15
+
77223961
77242601
77224182
77241563
7
RCN2
NM_002902
chr15
+
77287464
77329671
77287914
77329517
15
PSTPIP1
NM_003978
chr15
-
77336359
77363570
77339176
77363296
6
TSPAN3
NM_001168412
chr15
-
77336359
77363570
77339176
77363296
7
TSPAN3
NM_005724
chr15
-
77400497
77712446
77406497
77474268
8
PEAK1
NM_024776
chr15
+
77713242
77777945
77750749
77771657
11
HMG20A
NM_018200
chr15
-
77905368
77924709
77906385
77924657
2
LINGO1
NM_032808
chr15
-
78287326
78369994
78290501
78369994
13
TBC1D2B
NM_144572
chr15
+
78384926
78396393
78384926
78395857
6
SH2D7
NM_001101404
chr15
-
78396990
78423878
78397652
78423557
6
CIB2
NM_006383
chr15
+
78441718
78462884
78441745
78461347
11
IDH3A
NM_005530
chr15
-
78463186
78527049
78463785
78526843
14
ACSBG1
NM_015162
169
EK 3 devamı Aile 3’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds
başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
chr15
+
78556486
78574538
78556655
chr15
-
78575577
78591940
78575773
chr15
+
78632665
78640572
chr15
+
78730517
chr15
+
chr15
Ekzon
sayısı
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
78572802
8
DNAJA4
NM_018602
78588028
11
WDR61
NM_025234
78632770
78640319
4
CRABP1
NM_004378
78793798
78730679
78790485
22
IREB2
NM_004136
78799905
78829715
78805430
78829643
5
AGPHD1
NM_001083612
+
78832746
78841563
78834269
78841286
9
PSMA4
NM_001102667
chr15
+
78857861
78887611
78858061
78885595
6
CHRNA5
NM_000745
chr15
-
78916635
78933587
78917474
78933475
6
CHRNB4
NM_000750
chr15
-
79051544
79103773
79051762
79103562
24
ADAMTS7
NM_014272
chr19
-
281043
291169
281387
291066
6
PPAP2C
NM_177543
chr19
-
305574
344791
306689
344782
14
MIER2
NM_017550
chr19
-
362056
376013
362199
375970
8
THEG
NM_016585
chr19
-
405442
409170
407095
408361
2
C2CD4C
NM_001136263
chr19
-
416582
460996
418927
460996
13
SHC2
NM_012435
chr19
-
463345
474983
463843
474747
4
ODF3L2
NM_182577
chr19
+
496489
505343
496499
504965
5
MADCAM1
NM_130760
chr19
+
507496
519654
507506
519423
2
TPGS1
NM_033513
chr19
+
531732
542087
531931
541552
5
CDC34
NM_004359
chr19
+
544033
549920
544071
549791
5
GZMM
NM_005317
chr19
+
572453
583493
572634
582577
9
BSG
NM_001728
chr19
+
589892
617159
589945
616474
8
HCN2
NM_001194
chr19
-
617222
633568
617273
633512
21
POLRMT
NM_005035
chr19
+
639925
643604
639925
643604
3
FGF22
NM_020637
chr19
-
647525
663233
648127
663121
9
RNF126
NM_194460
chr19
+
676388
683392
676423
681708
5
FSTL3
NM_005860
chr19
-
685545
695461
685715
695430
5
PRSS57
NM_214710
chr19
+
708952
748330
709146
746814
9
PALM
NM_002579
chr19
+
708952
748330
709146
746814
8
PALM
NM_001040134
chr19
+
751145
764318
756946
763590
5
C19orf21
NM_173481
chr19
+
797391
812327
797497
810826
15
PTBP1
NM_002819
chr19
-
812487
821952
812569
821559
8
LPPR3
NM_001270366
chr19
+
827830
832017
827846
831877
5
AZU1
NM_001700
chr19
+
840984
848175
841008
847969
5
PRTN3
NM_002777
chr19
+
852290
856246
852328
856164
5
ELANE
NM_001972
chr19
+
859664
863610
859689
863238
5
CFD
NM_001928
chr19
-
867961
893218
868100
891131
16
MED16
NM_005481
chr19
-
896502
913225
897436
913157
8
R3HDM4
NM_138774
170
EK 3 devamı Aile 3’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds
başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
chr19
+
917341
921015
917502
920748
chr19
+
926036
972803
929528
972065
chr19
+
984327
994569
984353
chr19
+
1000436
1009723
chr19
-
1009649
chr19
+
chr19
chr19
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
5
KISS1R
NM_032551
9
ARID3A
NM_005224
994343
10
WDR18
NM_024100
1000436
1009601
9
GRIN3B
NM_138690
1021141
1010348
1020995
11
C19orf6
NM_001033026
1026297
1039064
1026660
1037899
7
CNN2
NM_004368
+
1040101
1065570
1041360
1065424
47
ABCA7
NM_019112
+
1065921
1086627
1066024
1086005
23
HMHA1
NM_001258328
chr19
-
1086577
1095391
1089484
1095314
8
POLR2E
NM_002695
chr19
+
1103935
1106787
1104042
1106639
7
GPX4
NM_001039847
chr19
-
1107632
1174282
1108218
1154275
32
SBNO2
NM_014963
chr19
+
1205797
1228434
1206912
1226646
10
STK11
NM_000455
chr19
-
1229946
1237990
1230891
1236099
9
C19orf26
NM_152769
chr19
+
1241748
1244824
1241849
1244436
5
ATP5D
NM_001001975
chr19
+
1248551
1259142
1250295
1257271
8
MIDN
NM_177401
chr19
+
1275519
1279243
1275548
1278776
3
C19orf24
NM_017914
chr19
+
1286152
1301429
1286167
1299944
4
EFNA2
NM_001405
chr19
+
1354975
1378430
1356388
1376575
14
MUM1
NM_032853
chr19
+
1383882
1395588
1383925
1395487
8
NDUFS7
NM_024407
chr19
-
1397024
1401569
1397357
1401475
6
GAMT
NM_000156
chr19
+
1407583
1435682
1407772
1433826
13
DAZAP1
NM_170711
chr19
+
1438362
1440492
1438424
1440461
4
RPS15
NM_001018
chr19
+
1450147
1473243
1453000
1470212
15
APC2
NM_005883
chr19
-
1473199
1479228
1475030
1478902
3
C19orf25
NM_152482
chr19
-
1481426
1490407
1481757
1490345
15
PCSK4
NM_017573
chr19
+
1491164
1497924
1491268
1497210
5
REEP6
NM_138393
chr19
-
1505016
1513188
1506013
1510942
12
ADAMTSL5
NM_213604
chr19
+
1524072
1535455
1526995
1535249
14
PLK5
NM_001243079
chr19
-
1554667
1568057
1555329
1568057
3
MEX3D
NM_001174118
chr19
-
1576677
1592652
1578338
1592630
6
MBD3
NM_003926
chr19
-
1597153
1605483
1599438
1605408
3
UQCR11
NM_006830
chr19
-
1609288
1652328
1611705
1650247
19
TCF3
NM_003200
chr19
+
1753661
1775444
1753661
1775444
2
ONECUT3
NM_001080488
chr19
-
1782073
1812236
1783026
1811576
29
ATP8B3
NM_001178002
chr19
-
1815244
1848452
1816064
1848357
16
REXO1
NM_020695
chr19
-
1852397
1863564
1854457
1863496
2
KLF16
NM_031918
171
EK 3 devamı Aile 3’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds
başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
chr19
-
1876974
1885518
1877198
1881565
6
FAM108A1
NM_031213
chr19
+
1905372
1926012
1915018
1924283
7
SCAMP4
NM_079834
chr19
+
1905416
1913446
1912094
1913150
2
ADAT3
NM_138422
chr19
+
1941160
1981336
1969771
1980202
12
CSNK1G2
NM_001319
chr19
-
1985446
2015702
1986486
2015702
9
BTBD2
NM_017797
chr19
-
2037469
2051243
2037737
2050850
14
MKNK2
NM_017572
chr19
-
2071034
2096269
2073393
2078559
5
MOB3A
NM_130807
chr19
+
2096867
2099583
2096944
2099344
10
IZUMO4
NM_001039846
chr19
-
2100986
2151556
2102171
2151333
32
AP3D1
NM_001261826
chr19
-
2233154
2236328
2233838
2236247
6
PLEKHJ1
NM_018049
chr19
+
2236815
2248678
2243417
2248545
9
SF3A2
NM_007165
chr19
+
2249112
2252072
2249331
2251956
5
AMH
NM_000479
chr19
-
2252249
2256422
2252327
2255313
7
JSRP1
NM_144616
chr19
+
2269519
2273487
2269597
2273107
5
OAZ1
NM_004152
chr19
-
2274630
2282181
2275678
2280930
4
C19orf35
NM_198532
chr19
-
2289773
2308156
2289996
2291775
2
LINGO3
NM_001101391
chr19
-
2321519
2328614
2321678
2328565
4
LSM7
NM_016199
chr19
+
2328628
2355100
2328708
2351613
15
SPPL2B
NM_001077238
chr19
+
2389783
2426086
2389783
2426086
17
TMPRSS9
NM_182973
chr19
-
2425621
2427875
2426945
2427531
3
TIMM13
NM_012458
chr19
-
2428162
2456966
2430908
2456931
12
LMNB2
NM_032737
chr19
+
2476122
2478257
2476356
2477599
4
GADD45B
NM_015675
chr19
-
2511217
2702746
2515019
2520686
5
GNG7
NM_052847
chr19
-
2714564
2721390
2717207
2717804
2
DIRAS1
NM_145173
chr19
-
2732522
2740074
2732748
2737255
3
SLC39A3
NM_144564
chr19
-
2754711
2783354
2757340
2769066
12
SGTA
NM_003021
chr19
+
2785505
2813599
2785660
2813274
13
THOP1
NM_003249
chr19
+
2819871
2836733
2820069
2834850
5
ZNF554
NM_001102651
chr19
+
2841432
2860472
2841570
2853950
4
ZNF555
NM_001172775
chr19
+
2867332
2878501
2867419
2878327
4
ZNF556
NM_024967
chr19
+
2900895
2918474
2901043
2918287
4
ZNF57
NM_173480
chr19
-
2933215
2944969
2933486
2944838
4
ZNF77
NM_021217
chr19
+
2977535
2995182
2978231
2995002
17
TLE6
NM_001143986
chr19
-
2997635
3029165
2997845
3028902
20
TLE2
NM_003260
chr19
-
3052907
3062371
3053816
3062198
7
AES
NM_001130
chr19
+
3094407
3121454
3094649
3121177
7
GNA11
NM_002067
chr19
+
3136190
3163766
3136448
3163017
7
GNA15
NM_002068
chr19
+
3178735
3180330
3178790
3179945
1
S1PR4
NM_003775
Kromozom
172
EK 3 devamı Aile 3’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds
başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
chr19
+
3185874
3209573
3186028
3207686
chr19
+
3224700
3297073
3224737
3293444
chr19
+
3359560
3469215
3359680
chr19
-
3474404
3480540
chr19
-
3490818
chr19
+
chr19
chr19
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
15
NCLN
NM_020170
13
CELF5
NM_021938
3462767
11
NFIC
NM_205843
3474840
3480461
4
C19orf77
NM_001136503
3500621
3491489
3496812
5
DOHH
NM_031304
3506294
3536755
3522987
3534834
14
FZR1
NM_016263
-
3538262
3557571
3542778
3557401
11
MFSD12
NM_021731
+
3539154
3544028
3539175
3544008
4
C19orf71
NM_001135580
chr19
-
3544196
3557571
3544707
3557401
10
MFSD12
NM_174983
chr19
+
3572942
3579081
3573307
3578519
10
HMG20B
NM_006339
chr19
+
3585568
3593539
3585595
3590188
6
GIPC3
NM_133261
chr19
-
3594503
3606831
3594833
3600632
4
TBXA2R
NM_201636
chr19
-
3610642
3626813
3611920
3626760
11
CACTIN
NM_021231
chr19
-
3630178
3700477
3633164
3700388
18
PIP5K1C
NM_012398
chr19
+
3708334
3750811
3728430
3750682
21
TJP3
NM_001267560
chr19
-
3750770
3761673
3751023
3760262
11
APBA3
NM_004886
chr19
+
3762664
3767563
3762698
3767391
3
MRPL54
NM_172251
chr19
-
3769088
3772219
3770618
3771740
3
RAX2
NM_032753
chr19
-
3777966
3801810
3778180
3789345
14
MATK
NM_002378
chr19
-
3804021
3869027
3805946
3869015
19
ZFR2
NM_015174
chr19
+
3880617
3928080
3885765
3924590
13
ATCAY
NM_033064
chr19
+
3933100
3942414
3933669
3942271
8
NMRK2
NM_170678
chr19
-
3958451
3969826
3959098
3969733
8
DAPK3
NM_001348
chr19
-
3976053
3985461
3976551
3985378
15
EEF2
NM_001961
chr19
+
4007748
4038067
4007758
4037873
11
PIAS4
NM_015897
chr19
-
4045215
4066816
4047749
4055230
3
ZBTB7A
NM_015898
chr19
-
4090319
4124126
4090595
4123872
11
MAP2K2
NM_030662
chr19
+
4153628
4173048
4153744
4171966
10
CREB3L3
NM_032607
chr19
-
4174105
4182596
4174613
4182536
8
SIRT6
NM_016539
chr19
+
4183350
4224811
4186422
4224502
22
ANKRD24
NM_133475
chr19
+
4229539
4237524
4229547
4237085
5
EBI3
NM_005755
chr19
+
4247110
4269085
4247143
4268693
8
CCDC94
NM_018074
chr19
+
4278597
4290720
4280060
4290630
6
SHD
NM_020209
chr19
-
4292224
4302428
4292595
4302382
5
TMIGD2
NM_144615
chr19
+
4304590
4323843
4304743
4323640
13
FSD1
NM_024333
chr19
-
4324039
4338847
4324129
4338750
13
STAP2
NM_017720
chr19
+
4343523
4360083
4343590
4359999
12
MPND
NM_032868
chr19
-
4360363
4400565
4361596
4400365
10
SH3GL1
NM_003025
173
EK 3 devamı Aile 3’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds
başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
Gen adı
chr19
+
4402659
4443394
4402759
4443022
15
CHAF1A
NM_005483
chr19
-
4445002
4455295
4445494
4454014
11
UBXN6
NM_001171091
chr19
+
4472254
4502222
4472347
4502022
17
HDGFRP2
NM_032631
chr19
-
4502191
4517716
4504470
4517716
6
PLIN4
NM_001080400
chr19
-
4522543
4535208
4523539
4534086
8
PLIN5
NM_001013706
chr19
-
4537226
4540036
4537951
4540025
2
LRG1
NM_052972
chr19
-
4542599
4559771
4543612
4558469
17
SEMA6B
NM_032108
chr19
+
4639526
4655580
4651881
4652442
2
TNFAIP8L1
NM_152362
chr19
-
4657556
4670415
4658016
4670346
6
C19orf10
NM_019107
chr19
-
4675243
4723855
4676575
4719918
22
DPP9
NM_139159
chr19
+
4679293
4685960
4682870
4683856
3
LOC100131094
NM_001242901
chr19
+
4791727
4795571
4791866
4793876
1
FEM1A
NM_018708
chr19
-
4815935
4831754
4816250
4818389
2
TICAM1
NM_182919
chr19
-
4838345
4867780
4839203
4861406
8
PLIN3
NM_005817
chr19
-
4890448
4902879
4891057
4902879
3
ARRDC5
NM_001080523
chr19
+
4909509
4962165
4910897
4960814
17
UHRF1
NM_001048201
chr19
+
4969123
5153608
5032901
5151522
23
KDM4B
NM_015015
chr19
-
5205518
5340814
5206784
5286151
38
PTPRS
NM_002850
chr19
+
5455425
5456867
5455502
5456792
1
ZNRF4
NM_181710
chr19
-
5587009
5622938
5587253
5622726
21
SAFB2
NM_014649
chr19
+
5623045
5668489
5623216
5668302
21
SAFB
NM_002967
chr19
-
5678432
5680911
5678561
5680497
4
C19orf70
NM_205767
chr19
+
5680775
5688534
5684043
5687956
9
HSD11B1L
NM_001267868
chr19
+
5690271
5691678
5690518
5691632
4
RPL36
NM_033643
chr19
-
5691844
5720176
5692042
5720143
18
LONP1
NM_004793
chr19
+
5720687
5778742
5720748
5778687
22
CATSPERD
NM_152784
chr19
-
5782970
5784776
5782988
5784671
3
PRR22
NM_001134316
chr19
-
5785152
5791249
5785213
5791152
13
DUS3L
NM_020175
chr19
+
5823817
5828335
5824176
5828184
2
NRTN
NM_004558
chr19
-
5830636
5839742
5831498
5832578
3
FUT6
NM_000150
chr19
-
5842898
5851485
5843764
5844850
3
FUT3
NM_001097639
chr19
-
5865836
5870551
5866611
5867736
2
FUT5
NM_002034
chr19
+
5904851
5910263
5904901
5909153
2
VMAC
NM_001017921
chr19
+
5914192
5916222
5914417
5915333
5
CAPS
NM_080590
chr19
-
5916151
5978320
5917620
5978093
17
RANBP3
NM_003624
chr19
-
5993174
6110664
5994845
6047507
18
RFX2
NM_000635
chr19
+
6135709
6193112
6141554
6190668
15
ACSBG2
NM_030924
chr19
-
6210391
6279959
6213052
6279795
12
MLLT1
NM_005934
chr19
-
6306509
6333640
6306724
6333562
6
ACER1
NM_133492
174
Transkriptin
RefSeq numarası
EK 3 devamı Aile 3’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kromozom
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds
başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
chr19
+
6361462
6368915
6361585
6368721
chr19
+
6372443
6375261
6372831
6374984
chr19
-
6375304
6375860
6375304
chr19
-
6379579
6393291
chr8
-
74153658
chr8
-
chr8
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
6
CLPP
NM_006012
4
ALKBH7
NM_032306
6375860
2
PSPN
NM_004158
6380291
6393006
13
GTF2F1
NM_002096
74171737
74153691
74171693
4
LOC100130301
NM_001243237
74202873
74205869
74203278
74205847
7
RPL7
NM_000971
+
74206836
74237520
74207524
74235271
6
RDH10
NM_172037
chr8
-
74332603
74659162
74333606
74621380
15
STAU2
NM_001164380
chr8
-
74702839
74791110
74706336
74791057
7
UBE2W
NM_001001481
chr8
-
74857372
74884143
74858864
74872003
6
TCEB1
NM_001204861
chr8
+
74903563
74941307
74903677
74941289
5
LY96
NM_015364
chr8
-
75146938
75233562
75149457
75233522
6
JPH1
NM_020647
chr8
+
75262617
75279335
75262696
75276602
6
GDAP1
NM_018972
chr8
+
75736771
75767264
75737484
75761488
6
PI15
NM_015886
chr8
+
75896707
75946793
75898222
75944477
15
CRISPLD1
NM_031461
chr8
+
76452202
76479061
76452227
76476331
10
HNF4G
NM_004133
chr8
+
77593514
77779521
77616323
77776801
11
ZFHX4
NM_024721
chr8
-
77892493
77913280
77895496
77896414
5
PEX2
NM_001172086
chr8
+
79428335
79517502
79510619
79514056
4
PKIA
NM_006823
chr8
+
79578281
79631997
79578383
79629728
9
ZC2HC1A
NM_016010
chr8
-
79645006
79717758
79645947
79717157
6
IL7
NM_000880
chr21
+
37536838
37666572
37537031
37665869
37
DOPEY2
NM_005128
chr21
+
37692486
37748944
37692562
37747594
17
MORC3
NM_015358
chr21
+
37757688
37789125
37758434
37788664
14
CHAF1B
NM_005441
chr21
-
37832919
37948867
37833273
37833993
3
CLDN14
NM_001146077
chr21
+
38071990
38122510
38072046
38120393
11
SIM2
NM_005069
chr21
-
38123188
38362545
38126546
38311183
12
HLCS
NM_000411
chr21
+
38378862
38391958
38379072
38390507
4
DSCR6
NM_018962
chr21
+
38445570
38575408
38459557
38573875
46
TTC3
NM_001001894
chr21
-
38595725
38639833
38597844
38639595
8
DSCR3
NM_006052
chr21
+
38739858
38887679
38792676
38878610
13
DYRK1A
NM_101395
chr21
-
38996784
39288741
38997460
39212984
4
KCNJ6
NM_002240
chr21
-
39426312
39493454
39426948
39493349
3
DSCR4
NM_005867
chr21
+
39628663
39673746
39671183
39672311
4
KCNJ15
NM_002243
chr21
-
39739182
40033618
39739556
39947624
12
ERG
NM_001243432
chr21
+
40177230
40196878
40177270
40194813
11
ETS2
NM_001256295
chr21
-
40547371
40555440
40547515
40555311
7
PSMG1
NM_003720
175
EK 3 devamı Aile 3’in otozigot bloklarının içerisinde yer alan genler
Kodlayan
zincir
Genin
başlangıç
pozisyonu
Genin bitiş
pozisyonu
cds
başlangıç
pozisyonu
cds bitiş
pozisyonu
Ekzon
sayısı
chr21
-
40557403
40685712
40558951
40685417
chr16
+
84402132
84497793
84402221
84497338
chr16
-
84509965
84538288
84513518
chr16
-
84599203
84651669
chr16
+
84682130
chr16
+
chr16
Gen adı
Transkriptin
RefSeq numarası
42
BRWD1
NM_018963
27
ATP2C2
NM_014861
84531692
8
KIAA1609
NM_020947
84600450
84651520
4
COTL1
NM_021149
84695916
84684473
84695739
5
KLHL36
NM_024731
84733554
84813527
84733696
84812688
14
USP10
NM_005153
+
84853586
84943116
84872101
84940248
15
CRISPLD2
NM_031476
chr16
-
85008066
85045141
85009948
85024224
9
ZDHHC7
NM_001145548
chr16
+
85061409
85127828
85100677
85121931
13
KIAA0513
NM_014732
chr16
-
85131964
85146114
85132790
85145958
8
FAM92B
NM_198491
chr16
+
85646923
85709812
85646997
85706145
16
KIAA0182
NM_014615
chr16
-
85711279
85722588
85711817
85722504
5
GINS2
NM_016095
chr16
-
85741123
85784689
85741613
85768823
4
C16orf74
NM_206967
chr16
-
85812230
85833148
85813313
85832901
5
EMC8
NM_006067
chr16
+
85833172
85840607
85834811
85840480
5
COX4I1
NM_001861
chr16
+
85932773
85956211
85936621
85954888
9
IRF8
NM_002163
chr16
+
86544132
86548070
86544175
86546691
2
FOXF1
NM_001451
chr16
+
86600856
86602537
86600941
86602447
1
FOXC2
NM_005251
chr16
+
86612114
86615304
86612329
86613367
1
FOXL1
NM_005250
Kromozom
176
KAYNAKLAR
Adzhubei, I. A., Schmidt, S., Peshkin, L., Ramensky, V. E., Gerasimova, A., Bork, P.,
Kondrashov, A. S.,Sunyaev, S. R. 2010. A method and server for predicting
damaging missense mutations. Nat Methods, 7 (4); 248-249.
Ahmed, Z. M., Masmoudi, S., Kalay, E., Belyantseva, I. A., Mosrati, M. A., Collin, R. W.,
Riazuddin, S., Hmani-Aifa, M., Venselaar, H., Kawar, M. N., Tlili, A., van der
Zwaag, B., Khan, S. Y., Ayadi, L., Riazuddin, S. A., Morell, R. J., Griffith, A. J.,
Charfedine, I., Caylan, R., Oostrik, J., Karaguzel, A., Ghorbel, A., Friedman, T. B.,
Ayadi, H.,Kremer, H. 2008. Mutations of LRTOMT, a fusion gene with alternative
reading frames, cause nonsyndromic deafness in humans. Nat Genet, 40 (11);
1335-1340.
Ahmed, Z. M., Morell, R. J., Riazuddin, S., Gropman, A., Shaukat, S., Ahmad, M. M.,
Mohiddin, S. A., Fananapazir, L., Caruso, R. C., Husnain, T., Khan, S. N., Griffith,
A. J., Friedman, T. B.,Wilcox, E. R. 2003a. Mutations of MYO6 are associated
with recessive deafness, DFNB37. Am J Hum Genet, 72 (5); 1315-1322.
Ahmed, Z. M., Riazuddin, S., Ahmad, J., Bernstein, S. L., Guo, Y., Sabar, M. F., Sieving,
P., Griffith, A. J., Friedman, T. B., Belyantseva, I. A.,Wilcox, E. R. 2003b.
PCDH15 is expressed in the neurosensory epithelium of the eye and ear and
mutant alleles are responsible for both USH1F and DFNB23. Hum Mol Genet, 12
(24); 3215-3223.
Ahmed, Z. M., Smith, T. N., Riazuddin, S., Makishima, T., Ghosh, M., Bokhari, S.,
Menon, P. S., Deshmukh, D., Griffith, A. J., Friedman, T. B.,Wilcox, E. R. 2002.
Nonsyndromic recessive deafness DFNB18 and Usher syndrome type IC are allelic
mutations of USHIC. Hum Genet, 110 (6); 527-531.
Ahmed, Z. M., Yousaf, R., Lee, B. C., Khan, S. N., Lee, S., Lee, K., Husnain, T., Rehman,
A. U., Bonneux, S., Ansar, M., Ahmad, W., Leal, S. M., Gladyshev, V. N.,
Belyantseva, I. A., Van Camp, G., Riazuddin, S.,Friedman, T. B. 2011. Functional
null mutations of MSRB3 encoding methionine sulfoxide reductase are associated
with human deafness DFNB74. Am J Hum Genet, 88 (1); 19-29.
Ain, Q., Nazli, S., Riazuddin, S., Jaleel, A. U., Riazuddin, S. A., Zafar, A. U., Khan, S. N.,
Husnain, T., Griffith, A. J., Ahmed, Z. M.,Friedman, T. B. 2007. The autosomal
recessive nonsyndromic deafness locus DFNB72 is located on chromosome
19p13.3. Hum Genet, 122 (5); 445-450.
Akar, N. . 1999. Klinik Moleküler Patolojiye Giris. Ankara, AÜTF Antıp AS Yayınlari.
Baris, I., Kilinc, M. O.,Tolun, A. 2001. Frequency of the 35delG mutation in the connexin
26 gene in Turkish hearing-impaired patients. Clin Genet, 60 (6); 452-455.
Barnes, P. M., Adams, P. F.,Schiller, J. S. 2003. Summary health statistics for the U.S.
population: National Health Interview Survey, 2001. Vital Health Stat 10, (217); 182.
177
Becker, J., Semler, O., Gilissen, C., Li, Y., Bolz, H. J., Giunta, C., Bergmann, C.,
Rohrbach, M., Koerber, F., Zimmermann, K., de Vries, P., Wirth, B., Schoenau,
E., Wollnik, B., Veltman, J. A., Hoischen, A.,Netzer, C. 2011. Exome sequencing
identifies truncating mutations in human SERPINF1 in autosomal-recessive
osteogenesis imperfecta. Am J Hum Genet, 88 (3); 362-371.
Bentley, D. R. 2006. Whole-genome re-sequencing. Curr Opin Genet Dev, 16 (6); 545552.
Berezin, C., Glaser, F., Rosenberg, J., Paz, I., Pupko, T., Fariselli, P., Casadio, R.,Ben-Tal,
N. 2004. ConSeq: the identification of functionally and structurally important
residues in protein sequences. Bioinformatics, 20 (8); 1322-1324.
Bitner-Glindzicz, M. 2002. Hereditary deafness and phenotyping in humans. Br Med Bull,
63; 73-94.
Bolz, H., von Brederlow, B., Ramirez, A., Bryda, E. C., Kutsche, K., Nothwang, H. G.,
Seeliger, M., del, C. Salcedo Cabrera M., Vila, M. C., Molina, O. P., Gal,
A.,Kubisch, C. 2001. Mutation of CDH23, encoding a new member of the cadherin
gene family, causes Usher syndrome type 1D. Nat Genet, 27 (1); 108-112.
Borck, G., Ur Rehman, A., Lee, K., Pogoda, H. M., Kakar, N., von Ameln, S., Grillet, N.,
Hildebrand, M. S., Ahmed, Z. M., Nurnberg, G., Ansar, M., Basit, S., Javed, Q.,
Morell, R. J., Nasreen, N., Shearer, A. E., Ahmad, A., Kahrizi, K., Shaikh, R. S.,
Ali, R. A., Khan, S. N., Goebel, I., Meyer, N. C., Kimberling, W. J., Webster, J.
A., Stephan, D. A., Schiller, M. R., Bahlo, M., Najmabadi, H., Gillespie, P. G.,
Nurnberg, P., Wollnik, B., Riazuddin, S., Smith, R. J., Ahmad, W., Muller, U.,
Hammerschmidt, M., Friedman, T. B., Leal, S. M., Ahmad, J.,Kubisch, C. 2011.
Loss-of-function mutations of ILDR1 cause autosomal-recessive hearing
impairment DFNB42. Am J Hum Genet, 88 (2); 127-137.
Bork, J. M., Peters, L. M., Riazuddin, S., Bernstein, S. L., Ahmed, Z. M., Ness, S. L.,
Polomeno, R., Ramesh, A., Schloss, M., Srisailpathy, C. R., Wayne, S., Bellman,
S., Desmukh, D., Ahmed, Z., Khan, S. N., Kaloustian, V. M., Li, X. C., Lalwani,
A., Bitner-Glindzicz, M., Nance, W. E., Liu, X. Z., Wistow, G., Smith, R. J.,
Griffith, A. J., Wilcox, E. R., Friedman, T. B.,Morell, R. J. 2001. Usher syndrome
1D and nonsyndromic autosomal recessive deafness DFNB12 are caused by allelic
mutations of the novel cadherin-like gene CDH23. Am J Hum Genet, 68 (1); 2637.
Charizopoulou, N., Lelli, A., Schraders, M., Ray, K., Hildebrand, M. S., Ramesh, A.,
Srisailapathy, C. R., Oostrik, J., Admiraal, R. J., Neely, H. R., Latoche, J. R.,
Smith, R. J., Northup, J. K., Kremer, H., Holt, J. R.,Noben-Trauth, K. 2011. Gipc3
mutations associated with audiogenic seizures and sensorineural hearing loss in
mouse and human. Nat Commun, 2; 201.
Chen, W., Kahrizi, K., Meyer, N. C., Riazalhosseini, Y., Van Camp, G., Najmabadi,
H.,Smith, R. J. 2005. Mutation of COL11A2 causes autosomal recessive nonsyndromic hearing loss at the DFNB53 locus. J Med Genet, 42 (10); e61.
178
Cohn, E. S.,Kelley, P. M. 1999. Clinical phenotype and mutations in connexin 26
(DFNB1/GJB2), the most common cause of childhood hearing loss. Am J Med
Genet, 89 (3); 130-136.
Collin, R. W., Kalay, E., Tariq, M., Peters, T., van der Zwaag, B., Venselaar, H., Oostrik,
J., Lee, K., Ahmed, Z. M., Caylan, R., Li, Y., Spierenburg, H. A., Eyupoglu, E.,
Heister, A., Riazuddin, S., Bahat, E., Ansar, M., Arslan, S., Wollnik, B., Brunner,
H. G., Cremers, C. W., Karaguzel, A., Ahmad, W., Cremers, F. P., Vriend, G.,
Friedman, T. B., Leal, S. M.,Kremer, H. 2008. Mutations of ESRRB encoding
estrogen-related receptor beta cause autosomal-recessive nonsyndromic hearing
impairment DFNB35. Am J Hum Genet, 82 (1); 125-138.
Dalca, A. V.,Brudno, M. 2010. Genome variation discovery with high-throughput
sequencing data. Brief Bioinform, 11 (1); 3-14.
del Castillo, I., Villamar, M., Moreno-Pelayo, M. A., del Castillo, F. J., Alvarez, A.,
Telleria, D., Menendez, I.,Moreno, F. 2002. A deletion involving the connexin 30
gene in nonsyndromic hearing impairment. N Engl J Med, 346 (4); 243-249.
Delmaghani, S., del Castillo, F. J., Michel, V., Leibovici, M., Aghaie, A., Ron, U., Van
Laer, L., Ben-Tal, N., Van Camp, G., Weil, D., Langa, F., Lathrop, M., Avan,
P.,Petit, C. 2006. Mutations in the gene encoding pejvakin, a newly identified
protein of the afferent auditory pathway, cause DFNB59 auditory neuropathy. Nat
Genet, 38 (7); 770-778.
Dryden, D. T., Murray, N. E.,Rao, D. N. 2001. Nucleoside triphosphate-dependent
restriction enzymes. Nucleic Acids Res, 29 (18); 3728-3741.
Du, X., Schwander, M., Moresco, E. M., Viviani, P., Haller, C., Hildebrand, M. S., Pak,
K., Tarantino, L., Roberts, A., Richardson, H., Koob, G., Najmabadi, H., Ryan, A.
F., Smith, R. J., Muller, U.,Beutler, B. 2008. A catechol-O-methyltransferase that
is essential for auditory function in mice and humans. Proc Natl Acad Sci U S A,
105 (38); 14609-14614.
Duman, D., Sirmaci, A., Cengiz, F. B., Ozdag, H.,Tekin, M. 2011. Screening of 38 genes
identifies mutations in 62% of families with nonsyndromic deafness in Turkey.
Genet Test Mol Biomarkers, 15 (1-2); 29-33.
Duman, D.,Tekin, M. 2012. Autosomal recessive nonsyndromic deafness genes: a review.
Front Biosci, 17; 2213-2236.
Eisen, M. D.,Ryugo, D. K. 2007. Hearing molecules: contributions from genetic deafness.
Cell Mol Life Sci, 64 (5); 566-580.
Finsterer, J.,Fellinger, J. 2005. Nuclear and mitochondrial genes mutated in nonsyndromic
impaired hearing. Int J Pediatr Otorhinolaryngol, 69 (5); 621-647.
Friedman, L. M.,Avraham, K. B. 2009. MicroRNAs and epigenetic regulation in the
mammalian inner ear: implications for deafness. Mamm Genome, 20 (9-10); 581603.
179
Friedman, T. B.,Griffith, A. J. 2003. Human nonsyndromic sensorineural deafness. Annu
Rev Genomics Hum Genet, 4; 341-402.
Gasparini, P., Rabionet, R., Barbujani, G., Melchionda, S., Petersen, M., BrondumNielsen, K., Metspalu, A., Oitmaa, E., Pisano, M., Fortina, P., Zelante, L.,Estivill,
X. 2000. High carrier frequency of the 35delG deafness mutation in European
populations. Genetic Analysis Consortium of GJB2 35delG. Eur J Hum Genet, 8
(1); 19-23.
Geiger, M. J., Bull, M., Eckels, D. D.,Gorski, J. 1993. Amplification of complementary
DNA from mRNA with unknown 5' ends by one-way polymerase chain reaction.
Methods Enzymol, 218; 321-335.
Gibbs, J. R.,Singleton, A. 2006. Application of genome-wide single nucleotide
polymorphism typing: simple association and beyond. PLoS Genet, 2 (10); e150.
Gilbert, W.,Maxam, A. 1973. The nucleotide sequence of the lac operator. Proc Natl Acad
Sci U S A, 70 (12); 3581-3584.
Green, G. E., Scott, D. A., McDonald, J. M., Woodworth, G. G., Sheffield, V. C.,Smith,
R. J. 1999. Carrier rates in the midwestern United States for GJB2 mutations
causing inherited deafness. JAMA, 281 (23); 2211-2216.
Grillet, N., Schwander, M., Hildebrand, M. S., Sczaniecka, A., Kolatkar, A., Velasco, J.,
Webster, J. A., Kahrizi, K., Najmabadi, H., Kimberling, W. J., Stephan, D., Bahlo,
M., Wiltshire, T., Tarantino, L. M., Kuhn, P., Smith, R. J.,Muller, U. 2009.
Mutations in LOXHD1, an evolutionarily conserved stereociliary protein, disrupt
hair cell function in mice and cause progressive hearing loss in humans. Am J Hum
Genet, 85 (3); 328-337.
Harfe, B. D. 2005. MicroRNAs in vertebrate development. Curr Opin Genet Dev, 15 (4);
410-415.
Hedges, D. J., Guettouche, T., Yang, S., Bademci, G., Diaz, A., Andersen, A., Hulme, W.
F., Linker, S., Mehta, A., Edwards, Y. J., Beecham, G. W., Martin, E. R., PericakVance, M. A., Zuchner, S., Vance, J. M.,Gilbert, J. R. 2011. Comparison of three
targeted enrichment strategies on the SOLiD sequencing platform. PLoS One, 6
(4); e18595.
Hoffmann, K.,Lindner, T. H. 2005. easyLINKAGE-Plus--automated linkage analyses
using large-scale SNP data. Bioinformatics, 21 (17); 3565-3567.
Hone, S. W.,Smith, R. J. 2003. Genetic screening for hearing loss. Clin Otolaryngol Allied
Sci, 28 (4); 285-290.
http://genome.ucsc.edu/.
http://snp.gs.washington.edu/SeattleSeqAnnotation134.
180
Hubner, C. A.,Jentsch, T. J. 2002. Ion channel diseases. Hum Mol Genet, 11 (20); 24352445.
Jett, J. H., Keller, R. A., Martin, J. C., Marrone, B. L., Moyzis, R. K., Ratliff, R. L.,
Seitzinger, N. K., Shera, E. B.,Stewart, C. C. 1989. High-speed DNA sequencing:
an approach based upon fluorescence detection of single molecules. J Biomol
Struct Dyn, 7 (2); 301-309.
Kalay, E., Li, Y., Uzumcu, A., Uyguner, O., Collin, R. W., Caylan, R., Ulubil-Emiroglu,
M., Kersten, F. F., Hafiz, G., van Wijk, E., Kayserili, H., Rohmann, E.,
Wagenstaller, J., Hoefsloot, L. H., Strom, T. M., Nurnberg, G., Baserer, N., den
Hollander, A. I., Cremers, F. P., Cremers, C. W., Becker, C., Brunner, H. G.,
Nurnberg, P., Karaguzel, A., Basaran, S., Kubisch, C., Kremer, H.,Wollnik, B.
2006. Mutations in the lipoma HMGIC fusion partner-like 5 (LHFPL5) gene cause
autosomal recessive nonsyndromic hearing loss. Hum Mutat, 27 (7); 633-639.
Katoh, M. 2002. GIPC gene family (Review). Int J Mol Med, 9 (6); 585-589.
Kelsell, D. P., Dunlop, J., Stevens, H. P., Lench, N. J., Liang, J. N., Parry, G., Mueller, R.
F.,Leigh, I. M. 1997. Connexin 26 mutations in hereditary non-syndromic
sensorineural deafness. Nature, 387 (6628); 80-83.
Khan, S. Y., Ahmed, Z. M., Shabbir, M. I., Kitajiri, S., Kalsoom, S., Tasneem, S., Shayiq,
S., Ramesh, A., Srisailpathy, S., Khan, S. N., Smith, R. J., Riazuddin, S.,Friedman,
T. B. 2007. Mutations of the RDX gene cause nonsyndromic hearing loss at the
DFNB24 locus. Hum Mutat, 28 (5); 417-423.
Klug, A., Khan, A., Burger, R. M., Bauer, E. E., Hurley, L. M., Yang, L., Grothe, B.,
Halvorsen, M. B.,Park, T. J. 2000. Latency as a function of intensity in auditory
neurons: influences of central processing. Hear Res, 148 (1-2); 107-123.
Kobayashi, K., Matsuura, E., Liu, Q., Furukawa, J., Kaihara, K., Inagaki, J., Atsumi, T.,
Sakairi, N., Yasuda, T., Voelker, D. R.,Koike, T. 2001. A specific ligand for
beta(2)-glycoprotein I mediates autoantibody-dependent uptake of oxidized low
density lipoprotein by macrophages. J Lipid Res, 42 (5); 697-709.
Kokotas, H., Petersen, M. B.,Willems, P. J. 2007. Mitochondrial deafness. Clin Genet, 71
(5); 379-391.
Kurima, K., Peters, L. M., Yang, Y., Riazuddin, S., Ahmed, Z. M., Naz, S., Arnaud, D.,
Drury, S., Mo, J., Makishima, T., Ghosh, M., Menon, P. S., Deshmukh, D.,
Oddoux, C., Ostrer, H., Khan, S., Deininger, P. L., Hampton, L. L., Sullivan, S. L.,
Battey, J. F., Jr., Keats, B. J., Wilcox, E. R., Friedman, T. B.,Griffith, A. J. 2002.
Dominant and recessive deafness caused by mutations of a novel gene, TMC1,
required for cochlear hair-cell function. Nat Genet, 30 (3); 277-284.
Lander, E. S.,Botstein, D. 1987. Homozygosity mapping: a way to map human recessive
traits with the DNA of inbred children. Science, 236 (4808); 1567-1570.
181
Lewis, M. A., Quint, E., Glazier, A. M., Fuchs, H., De Angelis, M. H., Langford, C., van
Dongen, S., Abreu-Goodger, C., Piipari, M., Redshaw, N., Dalmay, T., MorenoPelayo, M. A., Enright, A. J.,Steel, K. P. 2009. An ENU-induced mutation of miR96 associated with progressive hearing loss in mice. Nat Genet, 41 (5); 614-618.
Li, X. C., Everett, L. A., Lalwani, A. K., Desmukh, D., Friedman, T. B., Green, E.
D.,Wilcox, E. R. 1998. A mutation in PDS causes non-syndromic recessive
deafness. Nat Genet, 18 (3); 215-217.
Li, Y., Pohl, E., Boulouiz, R., Schraders, M., Nurnberg, G., Charif, M., Admiraal, R. J.,
von Ameln, S., Baessmann, I., Kandil, M., Veltman, J. A., Nurnberg, P., Kubisch,
C., Barakat, A., Kremer, H.,Wollnik, B. 2010. Mutations in TPRN cause a
progressive form of autosomal-recessive nonsyndromic hearing loss. Am J Hum
Genet, 86 (3); 479-484.
Liu, X. Z., Walsh, J., Mburu, P., Kendrick-Jones, J., Cope, M. J., Steel, K. P.,Brown, S. D.
1997. Mutations in the myosin VIIA gene cause non-syndromic recessive deafness.
Nat Genet, 16 (2); 188-190.
Liu, X. Z., Xia, X. J., Xu, L. R., Pandya, A., Liang, C. Y., Blanton, S. H., Brown, S. D.,
Steel, K. P.,Nance, W. E. 2000. Mutations in connexin31 underlie recessive as well
as dominant non-syndromic hearing loss. Hum Mol Genet, 9 (1); 63-67.
Lüleci, M., Sakızlı, M., Alper, Ö. 2000. Renkli Genetik Atlası. İstanbul, Nobel Tıp
Kitapevi.
Mardis, E. R. 2008. Next-generation DNA sequencing methods. Annu Rev Genomics
Hum Genet, 9; 387-402.
Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E., Attiya, S., Bader, J. S., Bemben, L. A., Berka,
J., Braverman, M. S., Chen, Y. J., Chen, Z., Dewell, S. B., Du, L., Fierro, J. M.,
Gomes, X. V., Godwin, B. C., He, W., Helgesen, S., Ho, C. H., Irzyk, G. P., Jando,
S. C., Alenquer, M. L., Jarvie, T. P., Jirage, K. B., Kim, J. B., Knight, J. R., Lanza,
J. R., Leamon, J. H., Lefkowitz, S. M., Lei, M., Li, J., Lohman, K. L., Lu, H.,
Makhijani, V. B., McDade, K. E., McKenna, M. P., Myers, E. W., Nickerson, E.,
Nobile, J. R., Plant, R., Puc, B. P., Ronan, M. T., Roth, G. T., Sarkis, G. J.,
Simons, J. F., Simpson, J. W., Srinivasan, M., Tartaro, K. R., Tomasz, A., Vogt, K.
A., Volkmer, G. A., Wang, S. H., Wang, Y., Weiner, M. P., Yu, P., Begley, R.
F.,Rothberg, J. M. 2005. Genome sequencing in microfabricated high-density
picolitre reactors. Nature, 437 (7057); 376-380.
Maskos, U.,Southern, E. M. 1992. Oligonucleotide hybridizations on glass supports: a
novel linker for oligonucleotide synthesis and hybridization properties of
oligonucleotides synthesised in situ. Nucleic Acids Res, 20 (7); 1679-1684.
Maskos, U., Southern, E. M. 1993. A novel method for the analysis of multiple sequence
variants by hybridisation to oligonucleotides. Nucleic Acids Res, 21 (9); 22672268.
182
Maxam, A. M.,Gilbert, W. 1977. A new method for sequencing DNA. Proc Natl Acad Sci
U S A, 74 (2); 560-564.
Mburu, P., Mustapha, M., Varela, A., Weil, D., El-Amraoui, A., Holme, R. H., Rump, A.,
Hardisty, R. E., Blanchard, S., Coimbra, R. S., Perfettini, I., Parkinson, N., Mallon,
A. M., Glenister, P., Rogers, M. J., Paige, A. J., Moir, L., Clay, J., Rosenthal, A.,
Liu, X. Z., Blanco, G., Steel, K. P., Petit, C.,Brown, S. D. 2003. Defects in whirlin,
a PDZ domain molecule involved in stereocilia elongation, cause deafness in the
whirler mouse and families with DFNB31. Nat Genet, 34 (4); 421-428.
Meisel, A., Bickle, T. A., Kruger, D. H.,Schroeder, C. 1992. Type III restriction enzymes
need two inversely oriented recognition sites for DNA cleavage. Nature, 355
(6359); 467-469.
Mencia, A., Modamio-Hoybjor, S., Redshaw, N., Morin, M., Mayo-Merino, F.,
Olavarrieta, L., Aguirre, L. A., del Castillo, I., Steel, K. P., Dalmay, T., Moreno,
F.,Moreno-Pelayo, M. A. 2009. Mutations in the seed region of human miR-96 are
responsible for nonsyndromic progressive hearing loss. Nat Genet, 41 (5); 609613.
Montenegro, G., Powell, E., Huang, J., Speziani, F., Edwards, Y. J., Beecham, G., Hulme,
W., Siskind, C., Vance, J., Shy, M.,Zuchner, S. 2011. Exome sequencing allows
for rapid gene identification in a Charcot-Marie-Tooth family. Ann Neurol, 69 (3);
464-470.
Morton, C. C.,Nance, W. E. 2006. Newborn hearing screening--a silent revolution. N Engl
J Med, 354 (20); 2151-2164.
Murray, N. E. 2000. Type I restriction systems: sophisticated molecular machines (a
legacy of Bertani and Weigle). Microbiol Mol Biol Rev, 64 (2); 412-434.
Mustapha, M., Weil, D., Chardenoux, S., Elias, S., El-Zir, E., Beckmann, J. S., Loiselet,
J.,Petit, C. 1999. An alpha-tectorin gene defect causes a newly identified
autosomal recessive form of sensorineural pre-lingual non-syndromic deafness,
DFNB21. Hum Mol Genet, 8 (3); 409-412.
Nance, W. E. 2003. The genetics of deafness. Ment Retard Dev Disabil Res Rev, 9 (2);
109-119.
Naz, S., Giguere, C. M., Kohrman, D. C., Mitchem, K. L., Riazuddin, S., Morell, R. J.,
Ramesh, A., Srisailpathy, S., Deshmukh, D., Griffith, A. J., Friedman, T. B.,
Smith, R. J.,Wilcox, E. R. 2002. Mutations in a novel gene, TMIE, are associated
with hearing loss linked to the DFNB6 locus. Am J Hum Genet, 71 (3); 632-636.
Naz, S., Griffith, A. J., Riazuddin, S., Hampton, L. L., Battey, J. F., Jr., Khan, S. N.,
Wilcox, E. R.,Friedman, T. B. 2004. Mutations of ESPN cause autosomal recessive
deafness and vestibular dysfunction. J Med Genet, 41 (8); 591-595.
Ng, S. B., Bigham, A. W., Buckingham, K. J., Hannibal, M. C., McMillin, M. J.,
Gildersleeve, H. I., Beck, A. E., Tabor, H. K., Cooper, G. M., Mefford, H. C., Lee,
183
C., Turner, E. H., Smith, J. D., Rieder, M. J., Yoshiura, K., Matsumoto, N., Ohta,
T., Niikawa, N., Nickerson, D. A., Bamshad, M. J.,Shendure, J. 2010a. Exome
sequencing identifies MLL2 mutations as a cause of Kabuki syndrome. Nat Genet,
42 (9); 790-793.
Ng, S. B., Buckingham, K. J., Lee, C., Bigham, A. W., Tabor, H. K., Dent, K. M., Huff, C.
D., Shannon, P. T., Jabs, E. W., Nickerson, D. A., Shendure, J.,Bamshad, M. J.
2010b. Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder. Nat Genet,
42 (1); 30-35.
Ng, S. B., Turner, E. H., Robertson, P. D., Flygare, S. D., Bigham, A. W., Lee, C., Shaffer,
T., Wong, M., Bhattacharjee, A., Eichler, E. E., Bamshad, M., Nickerson, D.
A.,Shendure, J. 2009. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12
human exomes. Nature, 461 (7261); 272-276.
Noyan, A. . 1999. Yasamda ve Hekimlikte Fizyoloji. . Ankara, , Meteksan.
Öner, C. 2002. Genetik Kavramlar. Ankara, Pame Yayıncılık.
Ostergaard, P., Simpson, M. A., Brice, G., Mansour, S., Connell, F. C., Onoufriadis, A.,
Child, A. H., Hwang, J., Kalidas, K., Mortimer, P. S., Trembath, R.,Jeffery, S.
2011. Rapid identification of mutations in GJC2 in primary lymphoedema using
whole exome sequencing combined with linkage analysis with delineation of the
phenotype. J Med Genet, 48 (4); 251-255.
Ouyang, X. M., Xia, X. J., Verpy, E., Du, L. L., Pandya, A., Petit, C., Balkany, T., Nance,
W. E.,Liu, X. Z. 2002. Mutations in the alternatively spliced exons of USH1C
cause non-syndromic recessive deafness. Hum Genet, 111 (1); 26-30.
Petit, C. 2001. Usher syndrome: from genetics to pathogenesis. Annu Rev Genomics Hum
Genet, 2; 271-297.
Petit, C. 2006. From deafness genes to hearing mechanisms: harmony and counterpoint.
Trends Mol Med, 12 (2); 57-64.
Rao, V. B.,Mitchell, M. S. 2001. The N-terminal ATPase site in the large terminase
protein gp17 is critically required for DNA packaging in bacteriophage T4. J Mol
Biol, 314 (3); 401-411.
Rehman, A. U., Gul, K., Morell, R. J., Lee, K., Ahmed, Z. M., Riazuddin, S., Ali, R. A.,
Shahzad, M., Jaleel, A. U., Andrade, P. B., Khan, S. N., Khan, S., Brewer, C. C.,
Ahmad, W., Leal, S. M.,Friedman, T. B. 2011. Mutations of GIPC3 cause
nonsyndromic hearing loss DFNB72 but not DFNB81 that also maps to
chromosome 19p. Hum Genet, 130 (6); 759-765.
Rehman, A. U., Morell, R. J., Belyantseva, I. A., Khan, S. Y., Boger, E. T., Shahzad, M.,
Ahmed, Z. M., Riazuddin, S., Khan, S. N.,Friedman, T. B. 2010. Targeted capture
and next-generation sequencing identifies C9orf75, encoding taperin, as the
mutated gene in nonsyndromic deafness DFNB79. Am J Hum Genet, 86 (3); 378388.
184
Riazuddin, S., Ahmed, Z. M., Fanning, A. S., Lagziel, A., Kitajiri, S., Ramzan, K., Khan,
S. N., Chattaraj, P., Friedman, P. L., Anderson, J. M., Belyantseva, I. A., Forge,
A.,Friedman, T. B. 2006. Tricellulin is a tight-junction protein necessary for
hearing. Am J Hum Genet, 79 (6); 1040-1051.
Riazuddin, S., Anwar, S., Fischer, M., Ahmed, Z. M., Khan, S. Y., Janssen, A. G., Zafar,
A. U., Scholl, U., Husnain, T., Belyantseva, I. A., Friedman, P. L., Friedman, T.
B.,Fahlke, C. 2009. Molecular basis of DFNB73: mutations of BSND can cause
nonsyndromic deafness or Bartter syndrome. Am J Hum Genet, 85 (2); 273-280.
Robert, L., Nussbaum R., Huntington, R. M., Willard, F. 2005. Thompson & Thompson
Tıbbi Genetik. Istanbul, Güneş Tıp Kitabevi (Türkçe çeviri).
Saitoh, T., Mine, T.,Katoh, M. 2002. Molecular cloning and characterization of human
GIPC3, a novel gene homologous to human GIPC1 and GIPC2. Int J Oncol, 20
(3); 577-582.
Sanger, F.,Coulson, A. R. 1975. A rapid method for determining sequences in DNA by
primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol, 94 (3); 441-448.
Schraders, M., Oostrik, J., Huygen, P. L., Strom, T. M., van Wijk, E., Kunst, H. P.,
Hoefsloot, L. H., Cremers, C. W., Admiraal, R. J.,Kremer, H. 2010. Mutations in
PTPRQ are a cause of autosomal-recessive nonsyndromic hearing impairment
DFNB84 and associated with vestibular dysfunction. Am J Hum Genet, 86 (4);
604-610.
Schultz, J. M., Khan, S. N., Ahmed, Z. M., Riazuddin, S., Waryah, A. M., Chhatre, D.,
Starost, M. F., Ploplis, B., Buckley, S., Velasquez, D., Kabra, M., Lee, K., Hassan,
M. J., Ali, G., Ansar, M., Ghosh, M., Wilcox, E. R., Ahmad, W., Merlino, G., Leal,
S. M., Friedman, T. B.,Morell, R. J. 2009. Noncoding mutations of HGF are
associated with nonsyndromic hearing loss, DFNB39. Am J Hum Genet, 85 (1);
25-39.
Scott, H. S., Kudoh, J., Wattenhofer, M., Shibuya, K., Berry, A., Chrast, R., Guipponi, M.,
Wang, J., Kawasaki, K., Asakawa, S., Minoshima, S., Younus, F., Mehdi, S. Q.,
Radhakrishna, U., Papasavvas, M. P., Gehrig, C., Rossier, C., Korostishevsky, M.,
Gal, A., Shimizu, N., Bonne-Tamir, B.,Antonarakis, S. E. 2001. Insertion of betasatellite repeats identifies a transmembrane protease causing both congenital and
childhood onset autosomal recessive deafness. Nat Genet, 27 (1); 59-63.
Shabbir, M. I., Ahmed, Z. M., Khan, S. Y., Riazuddin, S., Waryah, A. M., Khan, S. N.,
Camps, R. D., Ghosh, M., Kabra, M., Belyantseva, I. A.,Friedman, T. B. 2006.
Mutations of human TMHS cause recessively inherited non-syndromic hearing
loss. J Med Genet, 43 (8); 634-640.
Shahin, H., Rahil, M., Abu Rayan, A., Avraham, K. B., King, M. C., Kanaan, M.,Walsh,
T. 2010. Nonsense mutation of the stereociliar membrane protein gene PTPRQ in
human hearing loss DFNB84. J Med Genet, 47 (9); 643-645.
185
Sirmaci, A., Edwards, Y. J., Akay, H.,Tekin, M. 2012. Challenges in whole exome
sequencing: an example from hereditary deafness. PLoS One, 7 (2); e32000.
Sirmaci, A., Erbek, S., Price, J., Huang, M., Duman, D., Cengiz, F. B., Bademci, G.,
Tokgoz-Yilmaz, S., Hismi, B., Ozdag, H., Ozturk, B., Kulaksizoglu, S., Yildirim,
E., Kokotas, H., Grigoriadou, M., Petersen, M. B., Shahin, H., Kanaan, M., King,
M. C., Chen, Z. Y., Blanton, S. H., Liu, X. Z., Zuchner, S., Akar, N.,Tekin, M.
2010a. A truncating mutation in SERPINB6 is associated with autosomal-recessive
nonsyndromic sensorineural hearing loss. Am J Hum Genet, 86 (5); 797-804.
Sirmaci, A., Spiliopoulos, M., Brancati, F., Powell, E., Duman, D., Abrams, A., Bademci,
G., Agolini, E., Guo, S., Konuk, B., Kavaz, A., Blanton, S., Digilio, M. C.,
Dallapiccola, B., Young, J., Zuchner, S.,Tekin, M. 2011. Mutations in ANKRD11
cause KBG syndrome, characterized by intellectual disability, skeletal
malformations, and macrodontia. Am J Hum Genet, 89 (2); 289-294.
Sirmaci, A., Walsh, T., Akay, H., Spiliopoulos, M., Sakalar, Y. B., HasanefendiogluBayrak, A., Duman, D., Farooq, A., King, M. C.,Tekin, M. 2010b. MASP1
mutations in patients with facial, umbilical, coccygeal, and auditory findings of
Carnevale, Malpuech, OSA, and Michels syndromes. Am J Hum Genet, 87 (5);
679-686.
Soukup, G. A. 2009. Little but loud: small RNAs have a resounding affect on ear
development. Brain Res, 1277; 104-114.
Soukup, G. A., Fritzsch, B., Pierce, M. L., Weston, M. D., Jahan, I., McManus, M.
T.,Harfe, B. D. 2009. Residual microRNA expression dictates the extent of inner
ear development in conditional Dicer knockout mice. Dev Biol, 328 (2); 328-341.
Teer, J. K.,Mullikin, J. C. 2010. Exome sequencing: the sweet spot before whole genomes.
Hum Mol Genet, 19 (R2); R145-151.
Tekin, M., Akar, N., Cin, S., Blanton, S. H., Xia, X. J., Liu, X. Z., Nance, W. E.,Pandya,
A. 2001a. Connexin 26 (GJB2) mutations in the Turkish population: implications
for the origin and high frequency of the 35delG mutation in Caucasians. Hum
Genet, 108 (5); 385-389.
Tekin, M.,Arici, Z. S. 2007. Genetic epidemiological studies of congenital/prelingual
deafness in Turkey: population structure and mating type are major determinants of
mutation identification. Am J Med Genet A, 143A (14); 1583-1591.
Tekin, M., Arnos, K. S.,Pandya, A. 2001b. Advances in hereditary deafness. Lancet, 358
(9287); 1082-1090.
Tekin, M., Bogoclu, G., Arican, S. T., Orman, M. N., Tastan, H., Elsobky, E., Elsayed,
S.,Akar, N. 2005. Evidence for single origins of 35delG and delE120 mutations in
the GJB2 gene in Anatolia. Clin Genet, 67 (1); 31-37.
186
Tekin, M., Duman, T., Bogoclu, G., Incesulu, A., Comak, E., Fitoz, S., Yilmaz, E., Ilhan,
I.,Akar, N. 2003a. Frequency of mtDNA A1555G and A7445G mutations among
children with prelingual deafness in Turkey. Eur J Pediatr, 162 (3); 154-158.
Tekin, M., Duman, T., Bogoclu, G., Incesulu, A., Comak, E., Ilhan, I.,Akar, N. 2003b.
Spectrum of GJB2 mutations in Turkey comprises both Caucasian and Oriental
variants: roles of parental consanguinity and assortative mating. Hum Mutat, 21
(5); 552-553.
Tlili, A., Mannikko, M., Charfedine, I., Lahmar, I., Benzina, Z., Ben Amor, M., Driss, N.,
Ala-Kokko, L., Drira, M., Masmoudi, S.,Ayadi, H. 2005. A novel autosomal
recessive non-syndromic deafness locus, DFNB66, maps to chromosome 6p21.222.3 in a large Tunisian consanguineous family. Hum Hered, 60 (3); 123-128.
Uyguner, O., Emiroglu, M., Uzumcu, A., Hafiz, G., Ghanbari, A., Baserer, N., YukselApak, M.,Wollnik, B. 2003. Frequencies of gap- and tight-junction mutations in
Turkish families with autosomal-recessive non-syndromic hearing loss. Clin
Genet, 64 (1); 65-69.
Verpy, E., Masmoudi, S., Zwaenepoel, I., Leibovici, M., Hutchin, T. P., Del Castillo, I.,
Nouaille, S., Blanchard, S., Laine, S., Popot, J. L., Moreno, F., Mueller, R. F.,Petit,
C. 2001. Mutations in a new gene encoding a protein of the hair bundle cause nonsyndromic deafness at the DFNB16 locus. Nat Genet, 29 (3); 345-349.
Walsh, T., Shahin, H., Elkan-Miller, T., Lee, M. K., Thornton, A. M., Roeb, W., Abu
Rayyan, A., Loulus, S., Avraham, K. B., King, M. C.,Kanaan, M. 2010. Whole
exome sequencing and homozygosity mapping identify mutation in the cell
polarity protein GPSM2 as the cause of nonsyndromic hearing loss DFNB82. Am J
Hum Genet, 87 (1); 90-94.
Walsh, T., Walsh, V., Vreugde, S., Hertzano, R., Shahin, H., Haika, S., Lee, M. K.,
Kanaan, M., King, M. C.,Avraham, K. B. 2002. From flies' eyes to our ears:
mutations in a human class III myosin cause progressive nonsyndromic hearing
loss DFNB30. Proc Natl Acad Sci U S A, 99 (11); 7518-7523.
Wang, A., Liang, Y., Fridell, R. A., Probst, F. J., Wilcox, E. R., Touchman, J. W., Morton,
C. C., Morell, R. J., Noben-Trauth, K., Camper, S. A.,Friedman, T. B. 1998.
Association of unconventional myosin MYO15 mutations with human
nonsyndromic deafness DFNB3. Science, 280 (5368); 1447-1451.
Waryah, A. M., Rehman, A., Ahmed, Z. M., Bashir, Z. H., Khan, S. Y., Zafar, A. U.,
Riazuddin, S.,Friedman, T. B. 2009. DFNB74, a novel autosomal recessive
nonsyndromic hearing impairment locus on chromosome 12q14.2-q15. Clin Genet,
76 (3); 270-275.
Weil, D., Kussel, P., Blanchard, S., Levy, G., Levi-Acobas, F., Drira, M., Ayadi, H.,Petit,
C. 1997. The autosomal recessive isolated deafness, DFNB2, and the Usher 1B
syndrome are allelic defects of the myosin-VIIA gene. Nat Genet, 16 (2); 191-193.
187
Wilcox, E. R., Burton, Q. L., Naz, S., Riazuddin, S., Smith, T. N., Ploplis, B.,
Belyantseva, I., Ben-Yosef, T., Liburd, N. A., Morell, R. J., Kachar, B., Wu, D. K.,
Griffith, A. J.,Friedman, T. B. 2001. Mutations in the gene encoding tight junction
claudin-14 cause autosomal recessive deafness DFNB29. Cell, 104 (1); 165-172.
Willems, P. J. 2000. Genetic causes of hearing loss. N Engl J Med, 342 (15); 1101-1109.
Williams, R. J. 2003. Restriction endonucleases: classification, properties, and
applications. Mol Biotechnol, 23 (3); 225-243.
Yasunaga, S., Grati, M., Cohen-Salmon, M., El-Amraoui, A., Mustapha, M., Salem, N.,
El-Zir, E., Loiselet, J.,Petit, C. 1999. A mutation in OTOF, encoding otoferlin, a
FER-1-like protein, causes DFNB9, a nonsyndromic form of deafness. Nat Genet,
21 (4); 363-369.
Zuchner, S., Dallman, J., Wen, R., Beecham, G., Naj, A., Farooq, A., Kohli, M. A.,
Whitehead, P. L., Hulme, W., Konidari, I., Edwards, Y. J., Cai, G., Peter, I., Seo,
D., Buxbaum, J. D., Haines, J. L., Blanton, S., Young, J., Alfonso, E., Vance, J.
M., Lam, B. L.,Pericak-Vance, M. A. 2011. Whole-exome sequencing links a
variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet, 88 (2); 201-206.
Zwaenepoel, I., Mustapha, M., Leibovici, M., Verpy, E., Goodyear, R., Liu, X. Z.,
Nouaille, S., Nance, W. E., Kanaan, M., Avraham, K. B., Tekaia, F., Loiselet, J.,
Lathrop, M., Richardson, G.,Petit, C. 2002. Otoancorin, an inner ear protein
restricted to the interface between the apical surface of sensory epithelia and their
overlying acellular gels, is defective in autosomal recessive deafness DFNB22.
Proc Natl Acad Sci U S A, 99 (9); 6240-6245.
188
ÖZGEÇMİŞ
1.
2.
Kişisel Bilgiler
İsim
: Aslı SIRMACI
Doğum Tarihi
: 22 Nisan 1983
Uyruk
: TC
Cep Tel
: (0532) 620 6686
E-mail
: [email protected]
Ev Adresi
: Başkent Doktorlar Sitesi No:82 Çayyolu/ANK
Yabancı Dil
: İngilizce (akıcı)
Eğitim
2005-2008
Yüksek Lisans: Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü
Derece: 3, 33/4
Tez Başlığı: Sendromik Olmayan Otozomal Resesif
İşitme Kaybı Olan Beş Ailede Genom Boyunca
Genotipleme Analizi.
Danışmanı: Prof Dr Mustafa Tekin
2000-2004
Lisans: Ankara Üniversitesi, Fen Fakültesi
Biyoloji Bölümü
Degree: 85/100
3.
Yayınlar
Diaz-Horta, O., Duman, D., Foster II, J., Sirmaci, A., Gonzalez, M. A., Mahdie N.,
Fotouhi, N., Bonyadi, M., Cengiz, F. B., Menendez, I., Ulloa, R, H, Edwards,
Y.J.K., Züchner, S., Blanton, S., Tekinö M. Whole-exome sequencing efficientl
y detects rare mutations in autosomal recessive nonsyndromic hearing loss.
2012. PLOS one (kabul edildi, basım aşamasında)
Yariz, K. O.*, Duman, D.*, Seco, C. Z., Dallman, J., Hunag, M., Peters, T., Sirmaci,
A., Lu N., Schraders, M., Skromme, I., Oostrik, J., Tokgoz-Yilmaz, S.,
Konukseven, O., Shahin, H., Kanaan, M., Edwards, Y., Li, H., Atalay, S.,
Blanton, S., De Smidt, A., Liu X. Z., Penning, R., Lu, Z., Chen, Z. Y., Kremer,
H., Tekin, M. *(Co-authors) Mutations in OTOGL, encoding otogelin-like,
cause moderate sensorineural hearing loss. Am J Hum Genet. 2012 Nov
2;91(5):872-82. doi: 10.1016/j.ajhg.2012.09.011.
189
Riazuddin S, Belyantseva IA, Giese AP, Lee K, Indzhykulian AA, Nandamuri SP,
Yousaf R, Sinha GP, Lee S, Terrell D, Hegde RS, Ali RA, Anwar S, AndradeElizondo PB, Sirmaci A, Parise LV, Basit S, Wali A, Ayub M, Ansar M,
Ahmad W, Khan SN, Akram J, Tekin M, Riazuddin S, Cook T, Buschbeck EK,
Frolenkov GI, Leal SM, Friedman TB, Ahmed ZM. Alterations of the CIB2
calcium- and integrin-binding protein cause Usher syndrome type 1J and
nonsyndromic deafness DFNB48. Nat Genet. 2012 Sep 30. doi:
10.1038/ng.2426. Epub 2012 Sep 30
az-Horta O, Sirmaci A, Doherty D, Nance W, Arnos K, Pandya A, Tekin M.
GPSM2 mutations in Chudley-McCullough syndrome. Am J Med Genet A.
2012 Sep 14. doi: 10.1002/ajmg.a.35636. [Epub ahead of print] No abstract
available. PMID: 22987632
de la Luz Arenas-Sordo M, Menendez I, Hernandez E, Sirmaci A, Gutierrez D,
McGetrick M, Murphy P, Leyva X, Huesca F, Dominguez-Aburtio J, Tekin M.
Unique spectrum of GJB2 mutations in Mexico. Int J Pediatr Otorhinolaryngol.
2012 Aug 24. [Epub ahead of print]
Sirmaci A, Edwards JKY, Akay H, Tekin M. Challenges in Whole Exome
Sequencing: an Example from Hereditary Deafness. PLoS One.
2012;7(2):e32000. Epub 2012 Feb 21. PMID:22363784.
Sirmaci A, Spiliopoulos M, Brancati F, Powell E, Duman D, Abrams A, Bademci
G, Agolini E, Guo S, Konuk B, Kavaz A, Blanton S, Digilio MC, Dallapiccola
B, Young J, Zuchner S, Tekin M. Mutations in ANKRD11 cause KBG
syndrome, characterized by intellectual disability, skeletal malformations, and
macrodontia. Am J Hum Genet. 2011 Aug 12;89(2):289-94. Epub 2011 Jul 21.
PMID: 21782149.
Duman D, Sirmaci A, Cengiz FB, Ozdag H, Tekin M. Screening of 38 genes
identifies mutations in 62% of families with nonsyndromic deafness in Turkey.
Genet Test Mol Biomarkers. 2011 Jan-Feb;15(1-2):29-33. Epub 2010 Nov 30.
Erratum in: Genet Test Mol Biomarkers. 2011 Sep;15(9):663. PMID: 21117948.
Sirmaci A, Walsh T, Akay H, Spiliopoulos M, Sakalar YB, HasanefendioğluBayrak A, Duman D, Farooq A, King MC, Tekin M. MASP1 mutations in
patients with facial, umbilical, coccygeal, and auditory findings of Carnevale,
Malpuech, OSA, and Michels syndromes. Am J Hum Genet. 2010 Nov
12;87(5):679-86. Epub 2010 Oct 28.PMID:21035106.
Cengiz FB, Duman D, Sirmaci A, Tokgöz-Yilmaz S, Erbek S, Oztürkmen-Akay H,
Incesulu A, Edwards YJ, Ozdag H, Liu XZ, Tekin M. Recurrent and private
MYO15A mutations are associated with deafness in the Turkish population.
Genet Test Mol Biomarkers. 2010 Aug;14(4):543-50. PMID:20642360.
Sirmaci A, Erbek S, Price J, Huang M, Duman D, Cengiz FB, Bademci G, TokgözYilmaz S, Hişmi B, Ozdağ H, Oztürk B, Kulaksizoğlu S, Yildirim E, Kokotas
H, Grigoriadou M, Petersen MB, Shahin H, Kanaan M, King MC, Chen ZY,
Blanton SH, Liu XZ, Zuchner S, Akar N, Tekin M. A truncating mutation in
190
SERPINB6 is associated with autosomal-recessive nonsyndromic sensorineural
hearing loss. Am J Hum Genet. 2010 May 14;86(5):797-804. Epub 2010 May 6.
PMID:20451170.
Sirmaci A, Oztürkmen-Akay H, Erbek S, Incesulu A, Duman D, Taşir-Yilmaz S,
Ozdağ H, Tekin M. A founder TMIE mutation is a frequent cause of hearing
loss in southeastern Anatolia. Clin Genet. 2009 Jun;75(6):562-7. Epub 2009
May 5. PMID:19438934.
Yüksel-Konuk B, Sırmacı A, Ayten GE, Özdemir M, Aslan İ, Yılmaz-Turay Ü,
Erdoğan Y, Tekin M. Homozygous mutations in the 15-hydroxyprostaglandin
dehydrogenase gene in patients with primary hypertrophic osteoarthropathy.
Rheumatol Int. 2009 Nov;30(1):39-43. PMID:19306095.
Tekin M, Sirmaci A, Yüksel-Konuk B, Fitoz S, Sennaroğlu L. A complex TFAP2A
allele is associated with branchio-oculo-facial syndrome and inner ear
malformation in a deaf child. Am J Med Genet A. 2009 Mar;149A(3):427-30.
PMID:19206157.
Sirmaci A, Duman D, Oztürkmen-Akay H, Erbek S, Incesulu A, Oztürk-Hişmi B,
Arici ZS, Yüksel-Konuk EB, Taşir-Yilmaz S, Tokgöz-Yilmaz S, Cengiz FB,
Aslan I, Yildirim M, Hasanefendioğlu-Bayrak A, Ayçiçek A, Yilmaz I, Fitoz S,
Altin F, Ozdağ H, Tekin M. Mutations in TMC1 contribute significantly to
nonsyndromic autosomal recessive sensorineural hearing loss: a report of five
novel mutations. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2009 May;73(5):699-705.
Epub 2009 Feb 1. PMID:19187973.
Tekin M, Hişmi BO, Fitoz S, Ozdağ H, Cengiz FB, Sirmaci A, Aslan I, Inceoğlu B,
Yüksel-Konuk EB, Yilmaz ST, Yasun O, Akar N. Homozygous mutations in
fibroblast growth factor 3 are associated with a new form of syndromic deafness
characterized by inner ear agenesis, microtia, and microdontia. Am J Hum
Genet. 2007 Feb;80(2):338-44. Epub 2006 Dec 27.PMID:17236138.
Sirmaci A, Akcayoz-Duman D, Tekin M. The c.IVS1+1G>A mutation in the GJB2
gene is prevalent and large deletions involving the GJB6 gene are not present in
the Turkish population. J Genet. 2006 Dec;85(3):213-6. No abstract available.
PMID:17406097.
4.
Projeler
R01DC009645 (2010-2012) NIH (National Institute of Health). A collaborative
search for new genes for non-syndromic deafness
Görev: Araştırmacı (Researcher) (University of Miami/John P. Hussman Institute of
Human Genomics)
191
105S464 TEKIN (PI) (2006-2009). TUBITAK. Otozomal Resesif Sensorinöral
İşitme Kaybı Yapan Gen Değişimlerinin Ortaya Çıkarılması
Görev: Araştırmacı (Researcher) (Ankara Üniversitesi/Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları
ABD, Pediatrik Moleküler Genetik BD)
5.
Uluslar Arasi Bilimsel Toplantilarda Sunulan Ve Bildiri Kitabinda Basilan
Bildiriler
M. Tekin, O. Diaz-Horta, D. Duman, J. Foster II, A. Sirmaci, M. Gonzalez, N.
Mahdieh, M. Bonyadi, F. B. Cengiz, R. Ulloa, S. Zuchner, S. Blanton.Wholeexome sequencing for autosomal recessive non-syndromic deafness: 93% of
known genes covered and OTOGL and SLITRK6 are novel genes. 60th
American Society of Human Genetics Meeting, San Francisco, November
2012.
M. Tekin, A. Sirmaci, M. Spiliopoulos, F. Brancati, E. Powell, D. Duman, A.
Abrams, G. Bademci, E. Agolini, S. Guo, B. Konuk, A. Kavaz, S. Blanton,
M. C. Digilio, B. Dallapiccola, J. Young, S. Zuchner Mutations in
ANKRD11 cause KBG syndrome, a syndrome of intellectual disability,
skeletal malformations and macrodontia.(33) (05:45PM-06:00PM on Wed)
(Platform). 61th American Society of Human Genetics Meeting, Montreal,
Canada, October 2011.
Tekin M, Duman D, Sirmaci A, Yariz K, Edwards YJK, Tokgoz-Yilmaz S, Guo S,
Lu N, Chen Z, Skromne I, Dallman J, Blanton S. A novel deafness gene at
the DFNB84 locus. Presented at the 8th Molecular Biology of Hearing and
Deafness Conference. Hinxton, Cambridge, UK, July 6-9, 2011.
Tekin M, Cengiz FB, Duman D, Sirmaci A, Erbek S, Ozturkmen-Akay H, Ozdag H.
Unique spectrum of MYO15A mutations associated with autosomal recessive
deafness in Turkey. 59th Annual Meeting of the American Society of Human
Genetics (ASHG), Honolulu, Hawaii, October 2009.
M. Tekin, A. Sirmaci, H. Ozdag, D. Duman, H. Ozturkmen-Akay, S. Erbek, S.
Tasir-Yilmaz, A. Incesulu, B. Ozturk-Hismi, Z. S. Arici, B. Yuksel-Konuk,
F. B. Cengiz, I. Aslan.Mutations in TMC1 are Relatively Frequent Among
Families with Nonsyndromic Autosomal Recessive Deafness in Turkey. 58th
American Society of Human Genetics Meeting, Philadelphia, November
2008.
Tekin M, Sirmaci A, Ozdag H, Duman D, Ozturkmen-Akay H, Erbek S, TasirYilmaz S, Incesulu A, Ozturk-Hismi B, Arici ZS, Yuksel-Konuk B, Cengiz
FB, Aslan I. Mutations in TMC1 are Relatively Frequent Among Families
with Nonsyndromic Autosomal Recessive Deafness in Turkey. 58th
American Society of Human Genetics Meeting, Philadelphia, November
2008.
192
Tekin M, Ozdag H, Sirmaci A,Cengiz FB, Aslan I, Tasir-Yilmaz S, Duman D,
Ozturk-Hismi B, Arici ZS, Incesulu A, Erbek S, Yilmaz I. Significant locus
heterogeneity in Turkish families with autosomal recessive sensorineural
hearing loss. 57th American Society of Human Genetics Meeting, San Diego,
October 2007.
Yuksel-Konuk E, Sirmaci A, Simsek-Orhon F, Baltaci V, Kendirli T, Ince E, Tekin
M. Trisomy 9 mosaicism in an infant with failure to thrive. 6th European
Cytogenetics Conference, July 2007, Istanbul.
6.
Ulusal Kongrelerde Sunulan Bildiri
Sırmacı A, Akcayoz D, Tekın M. GJB6(connexin 26) geninde işitme kaybı yapan
büyük delesyonlar [Del(GJB6-D13S1830) ve Del(GJB6-D13S1854)] Türk
işitme engelli çocuklarda bulunmamaktadır. 41. Türk Pediatri Kongresi.
Haziran 2005, Ankara.
Ozturk Hismi B, Arıcı ZS, Sırmacı A, Yılmaz İ, Erbek S, Özdağ H, Tekin M.
Otozomal resesif sendromik olmayan işitmekaybında mikroarray ile genom
boyunca bağlantı analizi: TMIE geninde homozigot p.R84W mutasyonu.
42.Milli Pediatri Kongresi, Mayıs 2006, Antalya
193