Epigenetik modifikasyonlarla çalışma yöntemleri
advertisement
Epigenetik modifikasyonlarla çalışma yöntemleri www.plantcell.org/cgi/doi/10.1105/tpc.110.tt0110b Epigenetik modifikasyonlarla çalışma yöntemleri • DNA metilasyonu– bisülfit dizileme TTCGCCGACTAA TTCGCCGAuTAA • Histon modifikasyonu • kromatin immunopresipitasyonu (ChIP) • DNA adenosin metilasyon tayini (DamID) • siRNA üretimi– derin dizileme Bisülfit uygulaması sitosin ve metil sitosini ayırır NH2 NH2 N N O CH3 N ~ 5-metilsitosin Bisülfit uygulaması O NH2 N O CH3 N N ~ urasil O TTCGCCGACTAA N O ~ sitosin Metilsitosin N ~ 5-metilsitosin Uygulama yok TTCGCCGACTAA DNA’ya bisülfit uygulandığında, metillenmemiş sitosinler urasile dönüşür. Metil sitosin etkilenmez. Bisülfit uygulaması TTCGCCGAuTAA Bisülfit uygulaması sitosin ve metil sitosini ayırır Metilsitosin Bisülfit uygulamasından sonra C ler T olarak okunur ve uygulamalı ve uygulamasız örneklerde farklıdırlar. Buna karşın metil-C ise ayni örnekte C olarak okunur. TTCGCCGACTAA Uygulama yok TTCGCCGACTAA TTCGCCGACTAA Bisülfit uygulaması TTCGCCGAuTAA TTCGCCGATTAA Kromatin immünopresipitasyonu(ChiP) Modifiye histon (örn.. H3K4me) DNA nın histona çapraz bağlanışı Kromatin immünopresipitasyonu (ChiP) DNA nın histona çapraz bağlanışı DNA’yı ufak parçalara ayır ve modifiye histona özgün antikor ekle, affinite saflaştırması ile antikor ve bağlı histon kompleksini ayır. Kromatin immünopresipitasyonu (ChiP) DNA nın histona çapraz bağlanışı Çapraz bağlantıyı yok et, DNA’yı saflaştır ve PCR, dizileme veya mikroarray ile analiz yap. DNA’yı ufak parçalara ayır ve modifiye histona özgün antikor ekle, affinite saflaştırması ile antikor ve bağlı histon kompleksini ayır. DNA adenin metilasyonu ID (DamID) Bir füsyon proteini Dam ve ilgilenilen bir protein Dam metilaz (E. Coli’den) İlgilenilen protein (örn. LHP1) Dam bir adenine metiltransferaz ve GATC dizi özgüllüğü vardır. Füsyon proteini kromatinin seçilen bölgesine (örn. H3K27me3) bağlanır ve GATC bölgesi yakınındaki metiller. adeninleri Metilasyon metilasyona duyarlı enzimlerle tanımlanabilir. Bağlanma bölgesi yakınında olamayan yer GATC GATC DpnII restriksiyon endonukleaz sindirimi (metilasyon duyarlı) GATC GATC PCR amplifikasyonu GATC ÜRÜN YOK GATC ÜRÜN OLUŞUR Bağlanma bölgesi yakınındaki yer Derin dizileme “gelecek generasyon” DNA dizileme yöntemleri “Klasik ” DNA dizileme – Bir seferde bir molekül dizilenir. “Gelecek generasyon” DNA dizileme– one milyonlarca molekül bir seferde dizilenir. Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE copyright 2005. Margulies, M., et al., (2005) Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437: 376-380. Klasik DNA dizileme G Base + T Dört standart dNTPs Fluorescently-labeled ddNTPs + + Primer Template strand DNA Polimeraz 5’CCGGTTAA 3’GGCCAATTAAGCGGCTGATT A C Klasik DNA dizileme Primer Template strand 5’CCGGTTAA 3’GGCCAATTAAGCGGCTGATT Primer Template strand 5’CCGGTTAAT 3’GGCCAATTAAGCGGCTGATT Primer Template strand 5’CCGGTTAATTC 3’GGCCAATTAAGCGGCTGATTT DNA polimeraz etiketlenmemiş dNTPlere veya etiketli ddNPTlere bağlanır, sonuçta etiketli farklı boyutta moleküller oluşur. Klasik DNA dizileme DNA molekülleri elektroforez ile ayrılır. Detektör Laser TTCGCCGACTAA Gelecek generasyon dizileme yöntemleri: Pyrodizileme Primer Template strand 5’CCGGTTAA 3’GGCCAATTAAGCGGCTGATT T Primer Template strand 5’CCGGTTAAT 3’GGCCAATTAAGCGGCTGATT Pyrodizilemede etiketli nuklotidler ve ddNTPler kullanılmaz. Pyrophosphate nukleotid eklenmesi ile açığa çıkar ve substrat... Pyrodizileme - Kimya PYROPOSFAT + Adenosin 5’ posfat sulfat ATP Sulfurilaz ....veya ATP sufurilaz, ATP Oluşturur .... ATP Pyrodizileme - Kimya ATP luciferaz tarafından ışık uyarımını tetikler. LUCIFERAEZ ATP Sulfurilaz PYROFOSFAT + Adenosin 5’ fosfat sulfat ATP + Luciferin Işık oluşumu Pyrodizileme - Kimya T T Pyrodizileme – data değerlendirilmesi 5’CCGGTTAA 3’GGCCAATTGAGC.... dTTP Reaksiyon yok dTTP dNTPs eklenir ve eklenme ışık oluşumu ile izlenir. 5’CCGGTTAAT 3’GGCCAATTACGA... PPi ATP BİRİNCİ DÖNGÜ Pyrosequencing – data değerlendirilmesi 5’CCGGTTAAC 3’GGCCAATTGAGC.... İKİNCİ DÖNGÜ dCTP PPi ATP dCTP dNTPs eklenir ve eklenme ışık oluşumu ile izlenir. 5’CCGGTTAAT 3’GGCCAATTACGA... No Reaction Pyrodizileme– data değerlendirilmesi dTTP dGTP dCTP dATP TIME AG Her bir noktadan ışık oluşumu (flowgram) DNA AC dizilerini açıklar. dTTP dGTP dCTP dATP A pyrodizileme flowgram Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE copyright 2005. Margulies, M., et al., (2005) Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437: 376-380. Diğer “gelecek generasyon” dizileme yöntemleri ‘high throughput’, ve ‘massive parallelism’ yöntemler işgücünü ve kimyasal kullanımını azaltmaktadırlar. Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE Biotechnology Copyright 2008. Shendure, J., and Ji, H. (2008) Next-generation DNA sequencing. Nature Biotech. 26: 1135-1145. Gelecek generasyon dizileme ile , epigenetik modifikasyonlar da tüm genom düzeyinde incelenebirler: EPİGENOMİKS GREEN = H3K27me3 PURPLE = methylcytosine Abundance of siRNAs Kasschau KD, Fahlgren N, Chapman EJ, Sullivan CM, Cumbie JS, et al. 2007 Genome-Wide Profiling and Analysis of Arabidopsis siRNAs. PLoS Biol 5(3): e57. Zhang, X., Clarenz, O., Cokus, S., Bernatavichute, Y.V., Pellegrini, M., Goodrich, J., Jacobsen, S.E. (2007) Whole-genome analysis of histone H3 lysine 27 trimethylation in Arabidopsis. PLoS Biol. 5: e129.
