Tam büyüklükteki hepatitis B virüs genomunun polimeraz zincir

Tam büyüklükteki hepatitis B virüs genomunun polimeraz
zincir reaksiyonuyla gösterilmesi
Aykut Özdarendeli
Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Elazığ
Amaç: Hepatitis B virüsü (HBV) hakkındaki çalışmalar polimeraz zincir reaksiyonuyla (PZR) çoğaltılan
subgenomik ya da tam uzunluktaki HBV genomu kullanılarak yapılmaktadır. Hepatitis B virüsü hücre kültürlerinde
üretilememektedir. Tam uzunluktaki HBV genomu klonlama vektörlerine yerleştirilerek düşük titrede olsa bile
hücre kültürlerinde üretilebilmekte ve aynı zamanda HBV genomu üzerinde çalışmalar yapılabilmektedir. Yöntem:
Bu çalışmada 15 kronik hepatitis B hastası çalışma kapsamına alınmış ve 9 hastanın 3200 baz çifti
uzunluğundaki HBV genomunun PZR ile çoğaltılması optimize edilmiştir. Bulgular ve sonuç: Enzim kesim
deneyi yapılarak çoğaltılan PZR ürünlerinin HBV genomuna ait olduğu tespit edilmiştir.
Anahtar kelimeler: Hepatitis B virus, polimeraz zincir reaksiyonu, enzim kesim deneyi
Detection of whole hepatitis B virus genom with polymerase chain reaction
Objective: Current knowledge of hepatitis B virus (HBV) is based on either amplified subgenomic HBV fragments
or whole HBV genomes. HBV can not be proliferate in cell culture. However, whole HBV genome placed into
cloning vector proliferates in the cell culture at low level titres and allows us to research on the HBV genome.
Methods: Fifteenth chronic hepatitis B patients included in this study. Whole HBV genome 3200 base pair in
length was amplified by polymerase chain reaction (PCR) in 9 patients. Results and conclusion: Enzyme
digestion assay indicated that the PCR products belong to HBV genome.
Key words: Hepatitis B virus, polymerase chain reaction, enzyme digestion assay
Genel Tıp Derg 2004;14(1):19-22
Hepatitis B virüsü (HBV) karaciğerde akut ve kronik
enfeksiyonlara sebep olmaktadır. Akut enfeksiyonlar
% 1 oranında öldürücü ve fulminan hepatitise sebep
olurken, kronik enfeksiyonların yaklaşık % 25’i
karaciğer kanseriyle sonuçlanmaktadır (1,2). Dünya
genelinde her yıl ortalama olarak 1 milyonun
üzerinde hepatitis B virüsüne bağlı karaciğer
kanserinden ölüm görülmektedir (1-4). Ülkemizde de
HBV enfeksiyonu yaygın olarak bulunmakta ve insan
sağlığını tehdit etmektedir (5).
Hepatitis B virüsü hepadnaviridae ailesine ait
yaklaşık 3.2 kb uzunluğuna sahip kısmen çift iplikli
bir DNA virüsüdür (4). Genom replikasyonuna
Yazışma adresi: Aykut Özdarendeli, Fırat Üniversitesi Tıp
Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,
Elazığ.
tersine, transkriptaz enziminin eşlik etmesi diğer
DNA virüslerinden HBV replikasyonunu farklı
kılmaktadır. RNA’ya bağlı DNA sentez mekanizması
üzerine yapılan çalışmalar özellikle HBV’nin yaşam
siklusu ve viral genomun hücre nükleusuna
integrasyonunu açıklamaya yöneliktir (4,6). Bununla
birlikte HBV’nin hücre kültüründe üretilememesi,
gerek aşı üretilmesinde gerekse viral yaşam siklusu
üzerinde yapılan çalışmalarda polimeraz zincir
reaksiyonunu (PZR) ön plana çıkarmıştır. Hepatitis B
virüsüne karşı geliştirilmiş aşılar rekombinant aşılar
olup çoğunlukla PZR metoduyla çoğaltılan
immunojen genlerin çeşitli açıklama vektörlerine
klonlanması sonucu elde edilmektedir (6-8).
Polimeraz zincir reaksiyonuyla son yıllarda 3200 baz
çifti uzunluktaki HBV genomu çoğaltılmıştır. Elde
edilen HBV genomu çeşitli vektörlere klonlarak
hücre kültüründe üretilmiştir. Böylece HBV üzerinde
e-posta: [email protected]
Genel Tıp Derg 2004;14(1)
Hepatitis B, polimeraz zincir reaksiyonu-Özdarendeli
19
genetik düzeyde yapılacak çalışmalar için temel
oluşturulmuştur (7-9).
Bu çalışmada, kronik hepatitis B hastası olan 15
hastanın kan serumlarından elde edilen DNA’lar
kalıp
olarak
kullanılarak
HBV’nin
bütün
genotiplerinde korunmuş gen bölgesine özgül
primerlerle PZR uygulanmıştır. Polimeraz zincir
reaksiyonu sonucu 9 hastanın 3200 baz çifti
uzunluğunda HBV genomu elde edilmiştir. PZR
ürünleri Bam HI restriksiyon enzimi ile kesilerek
elde edilen kesim ürünlerinin HBV genomuna ait
olduğu teyit edilmiştir.
Yöntem
Hasta grubu: Bu çalışmada, Fırat Üniversitesi Fırat
Tıp Merkezi mikrobiyoloji ve klinik mikrobiyoloji
laboratuarında rutin olarak yapılan HBV-PZR sonucu
pozitif olarak tespit edilen 15 kronik hasta serumu
alınarak -20oC’de muhafaza edildi.
HBV genomunun çoğaltılması: Kalıp DNA’nın
elde edilmesi ve PZR daha önce tanımlandığı şekilde
yapıldı (9,10). Kısaca, PZR karışımı toplam 50 µl
olacak şekilde hazırlandı. Bunun için örnek başına
7.5 µl kalıp DNA, 5µl 10X reaksiyon buffer, 5 µl 25
mM MgCl2, 4 µl deoksinukleotidtrifosfat (2.5 mM
dNTP),
50
pMol
primer
1
(5’CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTCT
GCCTAATCA-3’)’den 2µl, 50pMol primer2 (5’CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCAAAAAGTTGCA
TGGTGCTGG-3’)’den 2 µl, 5 U/µl Taq
polimerazdan 1 µl ve 23 µl steril dH2O kullanıldı. Bu
karışımın üzerine birer damla mineral yağ ilave
edilerek örnekler 94oC’de 3 dakikalık ön ısıtmayı
takiben, 94oC’de 1 dakika. denatürasyon, 60oC’de 1
dakika bağlanma, 72oC’de 5 dakika uzatma olmak
üzere toplam 40 döngüde tutuldu. Elde edilen PZR
ürünleri 0.5 µg/ml etidyumbromid içeren % 1’lik
agaroz jelde ultraviole ışık altında incelendi.
Enzim kesim analizi: Polimeraz zincir reaksiyonu
sonucu elde edilen 3200 baz çifti uzunluğundaki PZR
ürünlerinin HBV genomuna ait olduğunu teyit etmek
için enzim kesim deneyi yapıldı. Bu amaçla
ülkemizde % 99 oranında görülen HBV genotip D,
BamH1 restriksiyon enzimiyle 1401 ve 2905
bölgelerinden kesildiği belirlendi. Polimeraz zincir
reaksiyonu sonucu HBV pozitif olduğu 9 hastanın
PZR ürünleri 37 oC’de 16 saat BamH1 restriksiyon
Genel Tıp Derg 2004;14(1)
20
enzimiyle kesildi. Kesim ürünleri 0.5 µg/ml etidyum
bromid içeren % 1’lik agaroz jelde ultraviole ışık
altında incelendi (11).
Bulgular
Çalışma kapsamına HBsAg ve HBV-PZR pozitif
bilinen 15 kronik hepatitis B hastası alındı. Tam
uzunluktaki (3200 baz çifti) HBV genomunu
çoğaltmak için, bilinen bütün HBV genotiplerinde
korunmuş bölgeye bağlanan primerlerin seçimi
Günther ve arkadaşları tarafından tanımlandığı
şekilde dizayn edildi. Hepatitis B virus genomunun
sadece iki primer kullanarak çoğaltılması için farklı
PZR parametreleri ve PZR karışımları hazırlandı. 100
µl serumdan ekstrakte edilen hedef DNA 25 µl dH2O
ile sulandırıldı ve bu karışımdan 2.5 µl kalıp DNA
olarak PZR için kullanıldığında beklenen HBV
genomuna özgül bantlar görülmedi. Kalıp DNA
miktarı 5 ve 7.5 µl olarak PZR karışımına
eklendiğinde beklenen bantlar elde edildi. Bovine
serum albumini PZR sonucunu pozitif ya da negatif
yönde etkilemediği görüldü. Hepatitis B virüs
genomu 3200 baz çifti olduğu için uzun PZR
ürünlerini elde etmekte kullanılan dimetilsulfoksit
(DMSO) ve gliserol PZR karışımına ilave edildi.
İlginç olarak PZR karışımına % 2 oranında DMSO
ilave edildiğinde beklenen bantlar görülmedi. % 4
oranında kullanılan gliserolün ise PZR sonucunu
etkilemedi.
Hepatitis B virüs genomunun PZR ile çoğaltılmasını
optimize etmek amacıyla farklı PZR parametreleri
uygulandı. Özellikle uzama aşaması ve toplam PZR
döngü
sayısının optimizasyonu için farklı
parametreler kullanıldı. Toplam döngü sayısı 25 ve
30 olarak kurgulandığında çok zayıf PZR ürünleri
elde edildi. Bununla beraber toplam döngü sayısı
40’a çıkarıldığında PZR ürünlerinde artış sağlandı.
Uzama aşaması her döngü için 3 dakika olarak
kurgulandığında zayıf PZR ürünleri elde edildiği
halde her döngü için 5 dakikalık uzama aşaması
optimal sonucu verdi. Optimize edilen PZR
parametreleriyle çoğaltılan HBV genom ürünü Şekil
1’de gösterilmiştir.
Polimeraz zincir reaksiyonuyla elde edilen
ürünlerinin HBV genomuna ait olduklarını
etmek amacıyla enzim kesim deneyi yapıldı.
önceki çalışmalarda ülkemizde % 99 oranında
PZR
teyit
Daha
HBV
Hepatitis B, polimeraz zincir reaksiyonu-Özdarendeli
D genotipi tespit edildiğinden enzim kesim bölgeleri
HBV genotip D gen dizilimi (Gen bankası A280817)
baz alınarak yapıldı. Hepatitis B virus genotip D’yi
1401 ve 2905 bölgelerinden kesen BamH1
restriksiyon enzimi seçildi. Kesim deneyi sonucu
1401, 1504 ve 305 baz çifti uzunluğundaki kesim
ürünleri görüntülendi (Şekil 2). Böylece PZR sonucu
elde edilen ürünlerin HBV genomuna ait olduğu teyit
edildi. PZR’de pozitif bulunan hastaların HBV
kantitatif değerleri, 9 hasta için sırasıyla; 14
pg,13357 pg, 18928 pg, 6039 pg, 267 pg, 125 pg,
10007 pg, 4107 pg ve 1588 pg olarak belirlenirken,
PZR’de negatif bulunan hastaların HBV değerleri de
27 pg, 4.8 pg,14 pg, 56.85 pg, 4.8 pg ve125 pg
olarak tespit edildi.
Tartışma ve sonuç
Hücre kültürlerinde üretilemeyen ya da düşük
titrelerde üretilebilen HBV genomunun PZR ile
çoğaltılarak klonlama vektörlerine yerleştirilmesi
büyük önem taşımaktadır (12-13). Klonlama
vektörüne yerleştirilmiş HBV genomunun hücre
kültürlerinde replikasyon etkinliği düşük seviyelerde
de olsa çoğaltılabildiği bilinmektedir. Birinci aşama
HBV genomunun PZR ile çoğaltılmasıdır. Bununla
beraber, hepatitis B virusunun kısmen çift iplikli
DNA genomuna sahip olmasından dolayı PZR ile
çoğaltılmasında teknik zorluklar bulunmaktadır.
Günther ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada (9)
bütün HBV genotiplerine bağlanabilen ve sadece 2
primer kullanılarak yapılan PZR ile tam uzunluktaki
HBV genomu çoğaltılmıştır.
Bu çalışmada, Günther ve arkadaşlarının (9)
kullandığı primerlerle tam uzunluktaki HBV
genomunun çoğaltılması ve PZR parametrelerinin
optimize edilmesi amaçlanmıştır. Çalışma kapsamına
15 kronik hepatitis B teşhisi konulan hastalar
alınmıştır. Toplam 15 hastanın 9’unda tam
uzunluktaki HBV genomu çoğaltılabilmiştir. Altı
hastadan tam uzunluktaki HBV genomunun
çoğaltılamaması tam olarak bilinmemekle beraber
serumdaki HBV DNA miktarının yeterli olmayışına
bağlanabilir.
Polimeraz
zincir
reaksiyonu
optimizasyon çalışmalarında toplam döngü sayısı,
her PZR döngüsündeki uzatma süresi ve kalıp DNA
miktarı optimize edilmiştir. Toplam 40 döngüden
oluşan ve 5 dakikalık uzatma süresi olan PZR
Genel Tıp Derg 2004;14(1)
Şekil 1. % 0,8’lik agaroz jelde tam büyüklükteki HBV
genom PZR ürünlerinin gösterilmesi. Marker (EcoR I
Hind III DNA ladder), Hat 1-3; Tam büyüklükteki
HBV genom PZR ürünleri.
Şekil 2. % 0,8’lik agaroz jelde BamHI enzim kesim
ürünleri. Marker (EcoR I Hind III DNA ladder), Hat
1; Tam büyüklükteki HBV genomunun BamHI enzimi
ile olusan kesim ürünleri Hat 2; Tam büyüklükteki
HBV genom PZR ürünü.
parametreleriyle
etkin
bir
amplifikasyon
gerçekleştirilmiştir. Ayrıca toplam 100 µl kan
serumundan elde edilen kalıp DNA 25 µl steril dH2O
ile sulandırılarak PZR karışımına 5 ya da 7.5 µl ilave
edildiğinde istenilen sonuçlar alınmıştır. İlginç olarak
büyük genoma sahip virus DNA’larını çoğaltmakta
yararlanılan DMSO kurguladığımız PZR’yi inhibe
ederken, gliserolün PZR etkinliği üzerinde değişiklik
yapmadığı görülmüştür. Buna sebep olarak her iki
maddenin miktar ve konsantrasyonlarının tam olarak
optimize edilememiş olması gösterilebilir (4,9,16).
Hepatitis B, polimeraz zincir reaksiyonu-Özdarendeli
21
Elde edilen PZR ürünlerinin HBV genomuna ait
olduğunu teyit etmek için enzim kesim deneyi
yapılmıştır. Bu amaçla, ülkemizde en yaygın olarak
görülen HBV genotip D gen dizilimi baz alınarak
enzim kesim bölgeleri çıkarılmış ve kesim enzimi
olarak BamH1 seçilmiştir (5). BamH1 enzimi HBV
genotip D’yi 1401 ve 2905 bölgelerinden
kesmektedir. Enzim kesim deneyi sonucu 1401, 1504
ve 305 baz çifti uzunluğundaki kesim ürünleri elde
edilerek PZR ürünlerinin HBV genomuna ait olduğu
teyit edilmiştir.
Sonuç olarak toplam 9 kronik hepatitis B hastasından
tam uzunluktaki HBV genomu PZR ile çoğaltılmış ve
PZR parametreleri optimize edilmiştir. Enzim kesim
deneyi yapılarak PZR ürünlerinin HBV D genotipine
ait oldukları teyit edilmiştir. Gelecekte, tam
büyüklükteki HBV genomunun klonlanarak HBV
patogenezi ve yaşam siklusu konusunda çalışmalar
planlanmaktadır.
Kaynaklar
1.
Thomas HC, Thurz MR. Pathogenesis of chronic hepatitis B.
In: Zuckerman AJ, Thomas HC, editors. Viral hepatitis. 2nd
ed. London: Churchill Livingstone; 1998. pp 217-26.
2.
Raimondo G, Burk RD, Lieberman HM, Muschel J,
Hadziyannis SJ, Will H, et al. Interrupted replication of
hepatitis B virus in liver tissue of HBsAg-carriers with
hepatocellular carcinoma. Virology 1988;166:103-12.
3.
Takahashi K, Akahane Y, Hino K, Ohta MS. Hepatitis B virus
genomic sequence in the circulation of hepatocellular
carcinoma patients: Comparative analysis of 40 full-length
isolates. Arch Virol 1998;143:2313-26.
4.
Seeger C, Mason SW. Hepatitis B biology. Microbiol Mol
Microbiol Rev 2000; 64:51-68.
5.
Bozdayı AM, Aslan N, Türkyılmaz AR. Hepatitis B virus
genotypes and subtypes, hepatitis C virus genotypes and
hepatitis delta virus genotypes in Turkish patients with
hepatitis virus infections. 2nd Molecular and Diagnostic
Microbiology Congress. 2002, Antalya, Turkey.
Genel Tıp Derg 2004;14(1)
22
6.
Yaginuma K, Kobayashi M, Yoshida E, Koike K. Hepatitis B
virus integration in hepatocellular carcinoma DNA:
Duplication of cellular quanking sequences at the integration
site. Proc Natl Acad Sci USA 1985; 82:4458-62.
7.
Lindh M, Andersson AS, Gusdal A. Genotypes, nt 1858
variants, and geographic origin of hepatitis B virus-large-scale
analysis using a new genotyping method. J Infect Dis
1997;175:1285-93.
8.
Kato H, Orito E, Gish RG, Sugauchi, F, Suzuki S, Ueda R, et
al. Characteristics of hepatitis B virus isolates of genotype G
and their phylogenetic differences from the other six
genotypes (A through F) Miyakawa, and Masashi Mizokami. J
Virol 2002;76: 6131-37.
9.
Günther S, Li BC, Miska S, Kriger HD, Meisel H, Will H. A
novel method for efficient amplification of whole hepatitis B
viral genomes permits rapid functional analysis and reveals
deletion mutants in immunosuppressed patients. J Virol
1995;69:5.
10. Aşçı Z, Akbulut A, Doymaz ZM, Felek S, Kılıç SS.
Evaluation of DNA of Hepatitis B virus in serum by PCR and
comparison with the serological parameters of HBV. Viral
Hepatit Derg 1996;2:6-9.
11. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook KJ. Molecular cloning: A
laboratory manual, 1st ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory
Press. 1982.
12. Sugauchi F, Orito E, Kato H, Suzuki S, Kawakita S, Sakamoto
Y, et al. Genotype, serotype, and phylogenetic
characterization of the complete genome sequence of hepatitis
b virus isolates from Malawian chronic carriers of the virus. J
Med Virology 2003;69:33-40.
13. Shan H, Niitsuma H, Nagasaki F, Cervantes JG, Ojima T,
Ueno, Y et al. Analysis of the entire nucleotide sequence of
hepatitis B virus: characteristics of HBeAg-positive
asymptomatic carriers, HBeAb positive asymptomatic carriers
and patients with liver cirrhosis. Hepatol Res 2002;23:251-64.
14. Niitsuma H, Ishii M, Saito Y, Miura M, Kobayashi K, Ohori
H, et al. Prevalence of precore-defective mutant of hepatitis B
virus in HBV carriers. J Med Virol 1995;46:397-402.
15. Barnes WM. PCR amplification of up to 35-kb DNA with
high fidelity and high yield from lambda bacteriophage
templates. Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91:2216-20.
16. Tellier R, Bukh J, Emerson US, Miller HR, Purcell HR. Long
PCR and its application to hepatitis viruses: amplification of
hepatitis A, hepatitis B, and hepatitis C virus genomes. J Clin
Microbiol. 1996;34:3085-91.
Hepatitis B, polimeraz zincir reaksiyonu-Özdarendeli