bölüm1 virüslerin morfolojik ve kimyasal yapıları
advertisement
BÖLÜM1 VİRÜSLERİN MORFOLOJİK VE KİMYASAL YAPILARI Virüs terimi ilk kez 1599 yılında zehir anlamında kullanılmıştır. İlk yazılı kayıt milattan önce bir hiyeroglif olup çocuk felci nedeniyle bacağında deformasyonun resmedildiği Mısır rahibini gösterir. Viroloji biliminde ilk önemli keşif 1796 yılında Jenner tarafından çiçek aşısı olarak inek çiçeği virüsünün kullanılması olup, bunu 1885 yılında Pasteur tarafından geliştirilen kuduz aşısı izlemiştir 19. yüzyılın sonlarına doğru bazı hastalık etkenlerinin bakterilerden çok farklı olduğu ve bakterilerin geçemediği filtrelerden geçtiği keşfedilince bunlara ‘filtre edilebilen virüsler’ adı verilmiş. Tütün yapraklarındaki hastalık etkeni TMV virüsünü ilk defa 1892 de tanımlayan Iwanowski, virolojinin babası olarak kabul edilir. Daha sonra virüslerin civciv embriyosunda üretilmesi, ilerleyen yıllarda hücre kültürlerinin yapılması, mikroskobik yöntemlerin geliştirilmesi ve günümüde moleküler yöntemlerin geliştirilmesiyle virüslerin tanımlanması sağlanmıştır. VİRÜSLERİN GENEL ÖZELLİKLERİ • • • Virüsler diğer mikroorganizmalar(mikoplazma, klamidya ve riketsiyalar da dahil olmak üzere bakteriler, funguslar ve protozoa) gibi hücresel bir organizasyon göstermezler. Yanlız başlarına enerji üretebilecek veya makromolekül sentez edebilecek yapıları yoktur. Bu nedenle virüsler, tamamıyla enfekte ettikleri hücrenin sistemlerinden yararlanırlar ve zorunlu hücre içi parazittirler. Virüsler canlı hücre dışında inerttirler, yani herhangi bir aktivite göstermezler. Diğer mikroorganizmalar ikiye bölünerek (binary fission) çoğalırken, virüsler hücre içinde replikasyon (nükleik asidin kopyasının çıkarılması) yoluyla çoğalırlar. Virüslerin en önemli özelliklerinden birisi de tek tip nükleik asit(DNA ya da RNA) içermeleridir. Bu özellik, sınıflandırmada iki büyük grubun oluşmasını sağlamaktadır. Virüslerin ayrıca makromolekül sentezini yönetecek hücresel organelleri(ribozom, mitokondri, E.R vb.) yoktur. Virüsler diğer mikroorganizmaların etkilendikleri antimikrobiyallere(antibiyotik, antifungal vb.) duyarlı değildir. Bu özellikleri de yapısal ve çoğalma farklılığından kaynaklanmaktadır. Virüsler hücreyi enfekte ettikten sonra hücresel bir proteinin sentezini uyarırlar. Antiviral etkiye sahip interferon adı verilen bu maddeye virüsler duyarlı iken, diğer mikroorganizmalar(klamidya hariç) duyarlı değildir. Dolayısıyla Lwoff un 1957 de önerdiği tanımlama dikkate alınırsa virüsler, • Zorunlu hücre içi parazit olan, • Replikasyon yolu ile çoğalan, • Tek tip nükleik asit içeren, • Enerji üretebilecek veya makromolekül sentez edebilecek organelleri bulunmayan • Antibiyotiğe dirençli, interferona duyarlı en küçük enfeksiyon etkenleridirler. Virüslerin orjini ile ilgili üç temel teori ileri sürülmektedir 1. Regresif (gerileme/azalma) teoriye göre önceleri bakreriye benzer yapıda olan virüsler, daha sonra bunların sahip olduğu birçok fonksiyonu kaybetmiş ve parazitliklerini sürdürebilmek için sadece genetik bilgilerini koruyabilmiş dejenere yaşam formlarıdır. 2. Hücresel köken(kaçış) teorisine göre virüsler, hücrede bulunan makromoleküllerin(hareketli genetik elemanlar gibi) fonksiyonel olarak bir araya gelmesi ve hücreden kaçması onucu ortaya çıkmışlardır. 3. Bağımsız birimler (birlikte evrim) teorisi ise, virüslerin hücresel organizmalar ile birlikte ,onlarla paralel olarak kendiliğinden replike olan moleküllerden evrimleştiğini savunmaktadır. • • Virüslerin morfolojik yapılarının incelenmesinde elektron mikroskobu kullanılır. virüslerin büyüklükleri 20 ile 300 nm arasında değişmektedir. En büyük virüs(çiçek virüsü) en küçük bakteri (klamidya) ile benzer boyutlardadır.(200-300 nm) Virüslerin elektron mikroskobisi(EM) yöntemi ile incelenmesi negatif boyamayla yapılır. Bu yöntemde kullanılan uranil asetat ve potasyum fosfotungustat gibi elektron-yoğun özelliğe sahip maddeler, virüsün yüzeyindeki kıvrımlara giderek siyah-beyaz(negatif)detaylı bir görüntü ortaya çıkarırlar. Ancak klasik EM de rezolüsyon 50-75 A° ile sınırlı olduğundan daha detaylı inceleme için rezolüsyonu 10-20 A° olan kriyoü EM tercih edilmektedir. Kriyo-EM ile virüslerin üç boyutlu yapısı incelenmesi mümkündür. Viral proteinlerinin incelenmesi ise X-ışını kristalografisi ile yapılır. Uygun kristal oluşturmayan kompleks yapılı virüsler için X-ışını difraksiyonu kullanılır. Çok yönlü nükleer manyetik rezonans yöntemi de polipeptid zincirlerde atomlar arası mesafenin saptanması ve viral proteinlerin dah a ayrıntılı olarak incelenmesi için kullanılır. • VİRÜSLERİN KONAK ÖZGÜLLÜĞÜ Virüslerin üreme için canlı hücrelere gereksinim duymaları ,tüm hücresel yapıları enfekte edebilen virüslerin olduğunu gösterir. virüs ile konak hücre arasındaki özgüllük iki önemli faktörün varlığına bağlıdır; 1. Konak hücre yüzeyinde özgül reseptör varlığı, virüsün hücreye tutunması ve girebilmesi için gereklidir. 2. Konak hücre içindeki olanakların (enzimler, metabolik yolaklar, biyokimyasal mekanizmalar) uygunluğu, virüsün hücre içinde çoğalması ve yayılması için gereklidir. Bazı virüsler çok çeşitli hücre tiplerini enfekte eder. Bunlar geniş konak spektrumuna sahiptir. Bazı virüsler ise kısıtlı konak spektrumuna sahiptir. Sadece belli türlerin ya da akraba türlerin hücrelerinde üreyebilir. Hatta bazı virüsler sadece belirli bir hücre/dokusunu enfekte edebilir. Örneğin, influenza tip A virüsleri,kuş, domuz,at, insan hücrelerini enfekte edebilirken , poliovirüsler sadece insan bağırsak ve sinir hücrelerini enfekte edebilir. Bu özellik virüsün tropizmini belirler ve virüs tropizmi, virüsün enfekte edebileceği konak, doku veya hücre tiplerini ifade eder. Virüsler konak özgüllüğüne göre üç grupta toplanır 1. Hayvan virüsleri 2. Bitki virüsleri 3. Bakteri ve diğer mikroorganizmaların(fungus,protozoa, vb.) virüsleri Bir virüs çok geniş konak spektrumuna sahip olsada genel olarak alemler arası sınırı geçemez. Ancak günümüzde bazı virüs gruplarının (bunyavirüsler ,reovirüsler, rabdovirüsler , vb) hem hayvan hem bitkileri enfekte ettiği bilinmekte ve bu durumun evrimleşme süreci ile ilgili olduğu düşünülmektedir. VİRÜS PARTİKÜLÜNÜN GENEL YAPISI • • Basit olarak bir virüs, genetik şifreyi taşıyan bir nükleik asit (DNA veya RNA) ve onu çevreleyen bir protein kılıftan oluşur. Bu protein kılıfa kapsid adı verilir. Viral nükleik asit ve kapsidin oluşturduğu kompleks ise nükleokapsid olarak isimlendirilir. Kapsid bir veya birkaç viral proteinin en ekonomik (aynı polipeptidin tekrar tekrar kullanımı) ve en fonksiyonel(alt üniteler arasında max temas sağlayan ve kovalan olmayan bağlantılar) şekilde dizilimiyle oluşur. Kapsidin dayanıklılığı sahip olduğu simetrik yapılar sayesinde sağlanır. Kapsid kapsomer adı verilen alt ünitelerden, kapsomerler ise protomer adı verilen yapısal alt ünitelerin simetrik şekilde diziliminden oluşur. • • • • Protomorler, β-zincirleri ve bu zincirleri birbirine bağlayan ilmeklerden(loop) oluşan bir yapıya sahiptir. β-zincirleri fıçı şeklinde bir yapı kazanırken, ilmek bölgelri fıçının her iki ucu arasındaki bağı sağlar. Bu yapı jelly rool motifi olarak adlandırılır. Basit virüslerde kapsid genellikle tekrarlayan tek tip polipeptidden oluşmakta, bazı kapsidlerde ise birden fazla tip polipeptidden oluşan yapısal üniteler bulunmaktadr. Bu yapıya ek olarak baz ı virüsler kapsidi çevreleyen bir membran yapısına(zarf) sahiptirler. Zarf ile çevrili olanlar zarflı virüs, zarf yapısına sahip olmayan çıplak virüs olarak adlandırılır. Bir virüsün çıplak ya da zarflı oluşu konak hücreden çıkış şekline bağlıdır. Çıplak virüsler üredikleri hücreden otoliz ile olgunlaşırken ,zarflı virüsler hücre membranından tomurcuklanarak olgunlaşırlar. Ancak zarflı virüsler hücre membranlarından kılıf alarak çıkmadan önce daha önceden sentez ettikleri virüse özgül yapısal proteinleri hücre membranı yapısına birleştirerek kendilerine özgü antijenik bir özellik kazanırlar. Zarfta bulunan ve virüse özgül olan glikoprotein yapısındaki bu ünitelere peplomer adı verilir. Zarflı virüslerde zarf ile nükleokapsid arasındaki mesafe ise tegüment olarak adlandırılır. • • • Çıplak virüsler sadece protein ve nükleik asit içeririken ,zarflı virüsler bu yapılara ek olarak hücre membranından kılıf aldıkları için lipid, kolesterol ve karbonhidrat da içermektedir. Zarfta lipid varlığı, bu virüslerin lipid çözücülere(eter, kloroform, sodyum deoksikolat) duyarlı olmasına yol açar. Çıplak ya da zarflı olsun bütün yapıları tam olan bir virüs partikülü virion olark adlandırılır. Virion virüsün genetik materyalini zarar görmeden hücreler arsında transfer eden ve yeni hücrelere girişini sağlayan stabil bir yapıdır. Aynı zamanda bu yapı, hücreye girdikten sonra nükleik asidin serbestleşmesi i.in kolayca parçalanma özelliğine sahiptir. Virüsler, konak hücre membranlarındaki özgül reseptörlerine tutunma proteinleri (attachment protein=AP) adı verilen ve konak hücre reseptörü ile daha iyi temas edebilmek için genellikle çıkıntı şeklinde yerleşen yapılarla bağlanırlar. Çıplak virüslerlerde kapsomerler, zarflı virüslerde ise peplomerler AP görevi görmektedir. PROTOMER YAPISI VE KAPSİD ÜNİTELERİNİN DİZİLİMİ VİRAL KAPSİD Viral kapsidin fonksiyonları; 1. Virüs partikülüne morfolojik özelliğini verir. 2. Viral nükleik asidi çevresel etkilerden korur.(nükleazlar) 3. Viral nükleik asidin paketlenmesi için uygun bir kılıf oluşturur. 4. Virüse antijenik özelliği verir. 5. Virüsün konak hücreye olan özgüllüğünü belirler. Virüsler kapsid morfolojilerine göre üç grupta toplanır Kübik(ikozahedral) simetrili virüsler Heliksel(sarmal) virüsler Kompleks(karmaşık) yapılı virüsler İnsanları enfekte eden virüsler arasında, çıplak-ikozahedral RNA veya DNA virüsleri, zarflı-ikozahedral veya zarflı-heliksel RNA virüsleri bulunmaktadır. Ancak heliksel simetri, DNA molekülünü paketleyemediği için bu tür virüse rastlanmaz. Ayrıca enfeksiyon yapan heliksel simetrili RNA virüslerinin hepsi zarflıdır. Kübik(ikozahedral) simetri • Kübik simetrinin çeşitli formları bulunmakla birlikte en tipik morfoloji ikozahedron yapıdır. Bu yapı birbirine benzer 20 eşkenar üçgen yüz ve 12 köşeden oluşur.Bu tür virüsler ikozahedral simetrili virüsler olarak adlandırılır.İkozahedral simetri viral nükleik asitlerin paketlenmesinde maksimal iç hacim ve dayanıklılık sağlayan en ekonomik ve en fonksiyonel kapsid yapısıdır. Bu nedenle ikozahedral yapı hem DNA hem RNA molekülünü paketleyebilir. Büyük genomlu virüslerde kapsid yapısı daha fazla (60 ın katları) alt ünite içermektedir.Bu durumda rotasyonel simetrinin korunması için aynı tip alt üniteler simetrik olmayan bir pozisyonda yerleşmelidir. Bu dizilim yarı-eşitlik teorisi ile açıklanmıştır. İkozahedral bir virüsün 12 köşesi olduğundan köşelerde yer alan kapsomerler 5 komşu kapsomerle çevrilidir ve penton olarak isimlendirirlir. Eşkenar üçgenlerin yüzeyinde yer alan diğer kapsomerler ise 6 komşu kapsomerle çevrilidri ve hekzon adını alır. Bazı virüslerde penton ve hekzon kapsomerleri farklı tip polipeptidlerden oluşabilir. Heliksel(sarmal)simetri • Heliksel simetride kapsomerler bir eksen etrafında sarmal yapı oluşturacak şekilde dizilmişlerdir. Birbirine benzeyen kapsomerler polipeptidleri oluşturacak şekilde kurdale biçiminde bir yapı kazanırlar. • Heliksel yapılı virüslerin kapsomerleri tek bir polipeptidden oluşmaktadır. • Heliksel simetrili kapsidler sadece RNA molekülünü paketleyebilir.Bu yapının özelliği, hacmi ne olursa olsun RNA yı sarmal uzunluğu boyunca paketleyebilmesidir. Bu açık bir yapıdır, oysa bunun aksine ikozahedral simetride iç kısım sabittir.(kapalı) • TMV gibi heliksel simetrili bazı bitki virüsleri çıplak yapıda olabilirler, ancak insanlarda enfeksiyon oluşturan bütün heliksel simetrili virüsler zarflıdır. Kompleks(karmaşık) yapı Virion zarfı, en dışta bulunan ve üzerinde protein yapıdaki yüzey tübüllerini(filamentler) taşıyan kalın bir dış membran ve onun hemen altında yer alan ince bir iç membrandan oluşur. İç kısmında ise çift iplikli DNA ve proteinlerin yer aldığı kor bölgesi ve bikonkav disk şeklinde görülen iki adet lateral cisimcik bulunmaktadır. Kor bölgesi, çok sayıda lipoprotein tabakadan oluşan kalın bir kor duvarı ile çevrilidir. Kor duvarı içinde nükleoprotein sarmalını çevreleyen ve enine kesit alındığında üç adet silindir şeklinde görülen fibriller yer alır. Nükleoprotein yapı sıkıca paketlenmiş büyük bir büyük bir DNA molekülü ile onu süper sarmal olarak organize eden en az dört farklı proteinden oluşmuştur. Kompleks yapıya sahip virüsler arasında bakteriyofajlar ve poksvirüsler örnek verilebilir. Örneğin kuyruklu fajların morfolojisi ,ikozahedral simetrili bir Baş ile heliksel simetrili kuyruk kısımlarıın kombinasyonu sonucu oluşan kompleks yapılardır. VİRAL ZARF Zarflı virüsler, zarflarını hücre membranlarından tomurcuklanırken kazanırlar. Bu nedenle zarf yapısı, hücre membranına ait fosfolipid tabakası ve virüse özgül glikoproteinlerden oluşmaktadır. Lipid içeriği zarflı virüsleri eter ve kloroform gibi lipid çözücülere duyarlı hale getirir.Her zarflı virüs kompozisyonu tomurcuklandığı hücre tipine göre farklı olabilir. Viral zarfta yer alan proteinler 2 gruba ayrılır • Yüzey glikoproteinleri • Matriks proteinleri Yüzeyde çıkıntılı olarak bulunan viral glikoprroteinler (peplomer) transmembran proteinlerdir.Bunlar membrana gömülü olup oligosakkaridler ile kovalent olarak bağlıdırlar.Glikoproteinlerin yapısında yer alan disülfit bağları ve karbonhidrat molekülleri, translasyondan sonra viral zarf proteinlerinin hücre membranına taşınması sırasında eklenir. Dış kısmındaki büyük kangal ile iç kısımdaki küçük kangal birbirine hidrofobik aminoasitlerle bağlanmıştır.Lipid tabakayı geçebilecek uzunlukta hidrofobik α-heliks aminoasit zincirleri, büyük ve küçük kangalı birleştirir.Dış kısımdaki oligosakkarid içeren kangallar, hem majör antijenik determinantları oluşturmakta hem de penetrasyon sırasında hücre membranıyla füzyonu sağlamaktadır. Glikoprotein alt üniteleri tek bir proteinin çoklu kopyasından veya iki ya da daha fazla proteinden oluşabilir. Viral glikoproteinlerin çok önemli fonksiyonları vardır: • Virionun konak hücreye tutunmasını(adsorbsiyon) ve içeriye alınmasını(penetrasyon) sağlarlar. • Örneğin kuduz virüsünde bulunan glikoproteinler asetilkolin reseptörlerine bağlananrak nörotoksik etki gösteririrler. • Birçok zarf glikoproteini,eritrositlere bağlanarak onalrı aglutine ederve virüse hemaglütinasyon yapma özelliği kazandırır. Bu tip glikoproteinlere hemaglutinin adı verilir.Bazı virüslerde ise füzyon ve hemolitik etki gösteren glikoproteinler bulunmaktadır. • İnfluenza ve parainfluenza gibi bazı virüslerde zrfta nörominidaz aktivitesi gösteren glikoproteinler mevcuttur.Nöraminidaz, hücre yüzeyinde bulunan oligosakkaritlerin terminal sialik asit ünitelerini parçalar ve hücrenin çıkışını ve yayılımını kolaylaştırır. Zarfın integral proteinleri matriks(M) proteinleri ise; • Lipid membrana gömülü olmayıp, virüs tipine göre zarf membranı ya da hem lipid hem de glikoprotein komponentleri ile ilişkidedirler. • Her bir M molekülü,, α-heliksler,membrana bağlanma için gerekli olan pozitif yüklü aminoasitleri içeren bir β-zinciri ile sarılmıştır. • Bazı virüslerde M proteinleri transmembran özellik gösterirve iyon kanalı olarak rol oynaarlar. • M proteinleri, zarflı virüslerin hücre membranından tomurcuklnma yoluyla olgunlaşmasında önemli rol oynamaktadırlar. zarf basit yapıda olan pozitif iplikli RNA virüslerinde (örn. Alfavirüslr) zarftaki transmembran α-heliks aminoasit zincirleri karboksi uçlarıyla kapsid proteinlerine bağlıdırlar. Negatif iplikli RNA virüslerinde ise;integral ribonükleoproteinler matriks proteini tarafından zarfa sıkıca birleştirilmektedir. Kapsid veya nükleokapsidlerin zarf ile doğrudan temas etmediği kompleks yapılı zarf içeren virüslerde(örn. HIV,influenza) de zarfın nükleokapsid ile bağlantısı membranla ilişkili M proteini tarafından sağlanır. Büyük yapılı zarflı virüsler olan herpesvirüslerde,nükleokapsidin çevresi düzgün sferik bir yapı olan ve tegüment adı verilen amorf protein tabaka ile çevrilidir. Tegüment proteinleri; • Nükleokapsidin yapısal üniteleriyle doğrudan temas halindedir. • Virüsün tipine bağlı olarak tegüment içinde yaklaşık20-40 arasında viral protein bulunduğu saptanmıştır. • Tegüment proteinleri herpesvirüslerin morfogenez ,olgunlaşma ve hücreden çıkış aşamalarında önemli rol oynarlar; ayrıca bazılarının konak immün yanıtından kaçışta etkili olduğu belirlenmiştir. VİRAL NÜKLEİK ASİTLER • • • • Viral nükleik asitlerin yapılarının incelenmesi,replikasyon mekanizmların anlaşılması açısından önemlidir. Bazı nükleik asitler tek iplili iken bazıları çift iplikli olabilir ya da bazıları lineer yapıda iken bazıları çembersel yapı gösterir. Parvovirüsler ve anellovirüsler hariç diğer bütün DNA virüsleri çift iplik içerirken;reovirüs grubu hariç diğer bütün RNA virüsleri tek ipliklidir. DNA virüsleri içinde anellovirüs, polyomavirüs, papillomavirüs ve hepadnavirüslerin nükleik asitleri çembersel yapı gösterirken, bütün RNA virüslerinin nükleik asitleri doğal yapı olan lineer özelliktedir. Çift iplikli çembersel DNA, virion içerisinde süper-sarmal şekilde yer alır. Bazı RNA virüsleri, replikasyonları sırasında kendi RNA larını m RNA olarak kullanır ve doğrudanvirl protein sentezi yaparlar. Bu nedenle RNA ya bağımlı RNA polimeraz(RbBp) enzimine gereksinimi yoktur ve virion içinde bu enzimi taşımazlar .Parental RNA sı m RNA ile aynı polaritede olan bu virüslere pozitif polariteli virüsler adı verilir.(pikornavirüsler, togavirüsler,kalisivirüsler) Pozitif polariteli RNA virüs grubu olanretrovirüslerde ise RbRp enzimi yerine RNA ya bağımlı DNA polimeraz (revers transkriptaz;RT) enzimi bulunmaktadır. Retrovirüsler hücreye girdikten sonra parental RNA larını bu enzim sayesinde DNA ya çevirir ve kromozoma entegre olurlar. Diğer bazı RNA virüsleri parental RNA sı ise mRNA olarak görev yapamaz; viral proteinlerin translasyonunu sağlayamaz. Bu tip virüsler parental RNA larına komplementer bir mRNA sentez etmek zorundadırlar ve bu nedenle virion içerisinde RbRp enzimi tşırlar. Bu tip virüslerde negatif polariteli virüsler olarak adlandırılır.(örn. Orto, paramiksovirüsler, rabdovirüsler,bunyavirüsler..) Çift iplikli RNA içeren(reovirüs) virüsler de,virion içinde RbRp enzimi taşımakta ve hücreye girdikten sonra gerçekleşen ilk olay RNA nın negatif ipliğinden mRNA transkripsiyonu olmaktadır. Viral nükleik asitler, virion içerisinde çoğunlukla tek bir molekül olarak bulunurlar; ancak bazı RNA virüslerinde genom parçacıklıdır.(reovirüsler 1012,ortomiksovirüsler(influenza) 8 bunyavirüs 3 RNA parçası içerir.) DNA virüslerinde parçalı genom bulunmamaktadır. Genomun parçacıklı olması, bu virüslerde yüksek sıklıkla rekombinasyon(yeniden birleşim) ve reasortman(yeniden karışım) oluşmasına yol açar. Viral nükleik asitlerin genom büyüklükleri de virionlar arasında oldukça farklılık gösterir.Örneğin, hepatit B virüsünün genomu en küçük DNA virüs genomu iken,herpesvirüs ve poksvirüs genomlar en büyüyk genomlar arasında yer alır. Birçok hayvan virüsünde nükleik asitlerin başlangıç baz içerikleri yer yer tekrar edilir. Bu tip nükleik asitlere ‘son tekrarı olan’ nükleik asitler adı verilir. Bazı virüslerde ise ‘çembersel tekrarlar’ bulunur. Bu durum daha çok bakteriyofajlarda bulunur. Nükleik asitlerin orgnizasyonu ve kapsidin paketlenmesi 3 temel mekanizmayla olur; 1. Genomun nükleokapsid veya kapsid proteinleri ile direkt teması ile(parvovirüs,alfavirüs,pikornavirüs) 2. Viral nükleik asit-bağlayan özelleşmiş proteinler ile( miksovirüs,rabdovirüs,retrovirüs..) 3. Hücresel DNA-bağlayan proteinler(histonlar) ile(polyomavirüs,papillomavirüs..) VİRAL PROTEİNLER • Virion içinde bulunan viral proteinleri çeşitli biyokimyasal yöntemlerle incelemek • • • mümkündür. Bu amaçla kullanılan en uygun yöntem, SDS ile proteinlerin viriondan saflaştırılması, molekül ağırlıklıklarına ve elektroforetik mobilitelerine göre poliakrilamid jel elektroforezinde ayrılmasıdır. SDS-PAGE adı verilen bu yöntem, virionda bulunan proteinlerin molekül ağırlıklarını ve sayılarını verir. Birçok virüs, yapısal proteinlerin yanı sıra yapısal olmayan proteinler de içerir.virüslerin yapısal proteinleri; nükleik asitlerle ilişkili proteinler(kor ya da özyapı proteinleri), özyapıyı çevreleyen kapsid proteinlerive zarflı virüsler için zarf glikoproteinleridir. Yapısal olmayan proteinler ise genellikle replikasyon için gerekli enzimlerdir.Bu enzimlerin hepsi viral genler tarafından kodlanmaktadır Viral nükleik asit sentezinde rol oynayan bazı enzimlerin konak hücrede benzerleri yoktur. Örneğin negatif iplikli RNA virüslerinin içerdiği RbRp ve retrovirüslerin içerdiği RT gibi enzimler normal konak hücresinde yer almamaktadır.Buna karşın poksvirüslerin içerdiği DNA ya bağımlı RNA polimeraz enzimi, hücresel RNA polimeraza benzerlik gösterir. Poksvirüsler ayrıca viral viral RNA transkriptlerinin modifikasyonu için çok sayıda enzimi virion içinde taşır ve bu özellikleri nedeniyle DNA virüsü olmallarına karşın hücre stoplazmasında replike olabilirler. Daha kompleks yapılı virionlar enzim olmayan başka proteinler de içerebilir. Herpesvirüslerin tegüment proteinleri bunlar arasında sayılabilir. Herpesvirüslerin diğer tegüment proteinleri de hücresel mRNA ların yıkımının uyarılması ve viral proteinlerin konak immun sistem hücrelerine sunumununn inhibasyonu gibi fonksiyonlara sahiptir. Benzer olarak HIV1 in sahip olduğu aksesuar proteinler (nef,vif,vpu,vpr) belirli tip hücrelerde replike olabilme , immun yanıttan kaçış ve enfektivite artışı gibi etkiler oluşturur. • Bazı virüsler kendi kodladıkları proteinlerden başka konak hücreden aldıkları bazı hücresel makromoleküller de taşıyabilirler. Örneğin polyoma ve papilloma virüslerinde, viral DNA ların paketlenmesinde rol oynayan hücreye ait histonlar bulunur. Bazı zarflı virüslerde hücreden tomurcuklanarak çıkarken hücresel protein ve makromolekülleri yanlarına alabilirler. Virüs partikülünün içine giren bu hücresel moleküller bazı durumlarda virüse yarar sağlamakta ve hücreye girşlerini ve replikasyonlarını kolaylaştırılmaktadır. Örneğin HIV1 virüsü hücreden çıkarken hücresel membran proteinlerini de zarfına inkorpore(birleştirmek) eder, dolayısıyla virüsün yeni bir hücreye tutunması ve girişi kolaylaşmış olur. Bir diğer örnek ise, retrovirüslerin yapısına giren hücresel bir tRNA molekülüdür. Viral genoma ve RT enzimine inkorpore olan bu hücresel tRNA molekülü, virüsün yeni bir hücreye girişinden sonra viral RNA nın ters transkripsiyonu sırasınd aprimer görevi görmektedir. VİRÜSLERİN FİZİKSEL VE KİMYASAL AJANLARA KARŞI DUYARLILIĞI ISI • Virüsler hücre dışında ısıya duyarlıdırlar; ancak bu virüsler arasında farklılık göstermektedir.Örneğin ikozahedral yapılı virüsler daha stabil olup 37°C de birkaç saat enfektivitelerini korurlar. Oysa zarflı virüsler ısıya oldukça duyarlıdır ve 37°C de kısa sürede titrede azalma saptanır.Bazı istisnalar dışında (Hepatit B virüsü,polyomavirüs) viral enfektivite genel olarak 50-60°C de 30 dk ısıtma ile yok olur. • Virüsler çok düşük ısılarda örneğin -80°C de veya sıvı nitrojen tankında (-196°C ) dondurularak saklanırlar. Ancak yine zarflı virüslerin enfektivileri -90°C de uzun süre saklandığında kaybolabilir. Dondurma-çözme işleminin sık tekrarlanması da virüslerin inaktive olmalarına yol açabilir. Isıya daynıklı virüsler ise liyofilize edilerek saklandığında 4°C de, hatta oda ısısında bile stabilitelerini korurlar. • Virüslerin ısıya dayanıklılığı ortama çeşitli tuzların eklenmesiyle artar; böylece proteinlerin denatüre olması engellenir. Bu şekilde virüsler 50°C de 60 dk ısıtmaya bile dayanabilirler. Bu özellik aşı hazırlanmasında önem kazanmaktadır.Örneği stabilize edilmemiş oral polio aşısının dondurularak saklanma ve taşınma zorunluluğu varken,stabilize edilmiş poliovirüs aşıları tropikal bölgelerde bile çevre ısısında haftalarca etkinliğini korumaktadır. ASİDİTE • Virüsler genellikle 5 ile 9 arasındaki p H değerlerinde stabilitelerini korurlar. Bazı virüsler (örn.enterovirüs) aside dirençlidir ve mide asiditesini geçerek intestinal sistem enfeksiyonlarına yol açar. Buna karşın bütün virüsler yüksek p H da kolayca inaktive olmaktadır. RADYASYON • • ultraviyole, X-ışını ve yüksek enerjili partiküller virüsleri inaktive eder. İyonize olan ve olmayan radyasyon viral nükleik asitleri parçalayarak etki gösterir, ancak inaktivasyon için gereken radyasyon dozu virüslere göre farklılık gösterir. Bazı vital boyalar(nörtal kırmazısı,tolidin mavisi,proflavin) virüslere farklı düzeylerde penetre olma özelliği taşımaktadır. Bu boyalar viral nükleik asitler ile kompleks oluşturur ve görünür ışık varlığında virüslerin inaktive olmasınayol açar. Bu olaya fotodinamik inaktivasyon denir. Bu özellik, bir viral enfektive saptama testi olan ‘plak yöntemi’nde nötral kırmızısı boyasının kulanılmasına olanak sağlamıştır. ETER VE DETERJANLAR • • Zarflı virüsler, yapısındaki lipid membrana nedeniyle eter, kloroform,sodyum deoksikolat, gibi lipid çözücülere ve deterjanlara çok duyarlıdırlar. Bu nedenle DMSO içinde saklanırlar Etere duyarlılık, virüslerin zarflı ve çıplak olarak ayrımında önem taşır. İyonik olmayan deterjanlar(örn. Trion X-100) zarf membranındaki lipidlerin erimesine yol açar. Anyonik deterjanlar(örn. SDS) ise hem viral zarfı eritmekte hem de kapsid yapısını parçalamktadır. FORMALDEHİT • • • • Formaldehit, nükleik asit ile doğrudan reaksiyona girerek virüsleri inaktive eder. Tek iplikli genomu olan virüsler, çift iplikli genomu olanlaragöre daha kolay inaktive olurlar. Formaldehit, viral proteinlerin antienik yapısını bozmadığından inaktive virus aşılarının hazırlanmasında kullanılır. Fenollü dezenfektanlar nükleik asitlere etki etmediklri için virüs dezenfeksiyonunda önerilmemektedir. Halojenler(özellile hipoklorit)ise virüslere karşı oldukça etkilidir. ANTİBİYOTİKLER VE ANTİBAKTERİYEL AJANLAR • • • Antibiyotikler ve sülfonamidler virüslere karşı etkisizdir. Ayrıca kuarterner amonyum bileşikleri ve organik iyot bileşikleri devirüsler üzerinde etki göstermez. Virüslerin inaktivasyonunda, bakterileri öldürmek için gerekli olandan çok daha yüksek klor konsantrasyonları kullanılmalıdır. İzopropanol ve ve etanol gibi alkoller bazı virüslere (örn. Pikarnovirüsler) karşı etkisizdir. VİRÜSLERİN İNAKTİVASYONU Virüslerin inaktivasyonu, laboratuvar cihaz ve gereçlerinin sterilizasyonu, deri ve cansız yüzeylerin dezenfeksiyonu , su kaynaklarının güvenirliği ve virüs aşılarının hazırlanması amacıyla, çeşitli yöntem ve kimyasallar kullnılarak yapılmaktadır. • • • • Sterilizasyon amacıyla basınçlı buhar, kuru ısı,etilen oksit ve gama ışınları kullanılmaktadır. Mikroorganizmaların ısı ile sterilizasyonunda kullanılan genel uygulamalr virüsler içinde geçerlidir. Nemli ısı(otoklavlama;120°C de 15-20 dk) ya da kuru ısı (pastör fırını ; 180°C de 60-90 dk)tüm virüslere karşı etkilidir. Yüzey dezenfeksiyonunda sodyum hipoklorit , gluteraldehit, formaldehit ve perasetik asit; cilt dezenfeksiyonunda ise klorhekzidin, %70 lik ve iyodaforlar kullanılır. İnaktive aşıların hazırlanmasında kullanılan ajanlar olarak da formaldehit, betapropiolakton, psoralen+ultraviyole ışınları veya deterjanlar (alt üniteaşıları için) sayılabilir.
