MBKY II-2. Hibridizasyon Yöntemleri

advertisement
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II
NÜKLEİK ASİTLERİN İŞARETLENMESİ VE HİBRİDİZASYON (MELEZLEME) YÖNTEMLERİ
NÜKLEİK ASİTLERİN İŞARETLENMESİ VE HİBRİDİZASYON (MELEZLEME) YÖNTEMLERİ
İstenilen nükleik asit dizisinin n. asit molekülü
içinde bulunması;
• Moleküler biyoloji ve
• Rekombinant DNA çalışmalarının vazgeçilmez
işlemlerinden biridir.
NÜKLEİK ASİTLERİN İŞARETLENMESİ VE HİBRİDİZASYON (MELEZLEME) YÖNTEMLERİ
•
•
•
•
Gen yapısı incelemeleri
Gen anlatımı analizi
Haritalama
Gen aktarımı çalışmalarında transformantların
analizi çalışmalarında kullanılır.
NÜKLEİK ASİTLERİN İŞARETLENMESİ VE HİBRİDİZASYON (MELEZLEME) YÖNTEMLERİ
• MELEZLEME’nin esası,
Tek iplikli nükleik asitlerin tamamlayıcı nükleik
asitlerle (PROB) eşleşerek melez moleküller
oluşturmalarına dayanır.
• Melezlemeler: DNA/DNA, RNA/RNA, RNA/DNA
arasında olabilir.
• Melezlemeler; DNA ya da moleküller üzerinde belli
bölgeleri belirlemek için gerçekleşebilir.
NÜKLEİK ASİTLERİN İŞARETLENMESİ VE HİBRİDİZASYON (MELEZLEME) YÖNTEMLERİ
• Melezleme için PROB kullanımına gereksinim vardır.
PROB: Araştırılan nükleik asit dizisine tamamlayıcı,
radyoaktif ya da radyoaktif olmayan bir belirleyici ile
işaretli, tek iplikli nükleik asitlerdir.
Bu dizilerin radyoaktif veya radyoaktif olmayan bir
belirleyici ile işaretlenmesi neticesinde hibridizasyon
reaksiyonu sonucu oluşan çift iplikli molekül
görülebilir hale gelir.
PROBUN HAZIRLANMASI VE İŞARETLENMESİ
• Prob hazırlamak, istenilen DNA fragmentinin
kalıp olarak kullanılması ve ona tamamlayıcı
DNA zincirinin in vitro sentez edilmesi
demektir.
• Probların işaretlenmesi, probun cinsine göre
farklı şekillerde yapılır.
Radyoaktif olmayan işaretleme ve belirleme sistemi
• Digoksigenin-­‐ anti-­‐ digoksigenin sistemi
• Yabanturpu (Armoracia lapathifolia) peroksidaz
sistemi ve
• Biotin-­‐streptavidin
Melezlenmiş probun belirlenmesi
• Kromogenik (kolorimetrik)
• Kemoluminogenik
IŞIK
substratlar kullanılarak gerçekleştirilir. Digoksigenin (DIG) sistemi
• Digoksigenin; prob sentezi sırasında işaretleyici olarak kullanılır.
• Prob hazırlama in vitro DNA sentezidir. Sentez
sırasında
– dATP
– dTTP
– dGTP
– dCTP
– Digoksigenin-­‐11-­‐dUTP (DIG-­‐11-­‐dUTP) kullanılır
SONUÇ: Kalıptaki her A’ya karşılık ya dTTP ya da DIG-­‐11-­‐
dUTP prob yapısına girer
İŞARETLİ PROB SENTEZLENİR.
Digoksigenin-­‐ anti-­‐ digoksigenin sistemi
• İşaretleme için kimyasal bir madde=bir bitkisel
sekonder metabolit (Digitalis lanata’dan elde edilen
digoksigenin) kullanılır.
• Prensibi otoradyografi
• Radyoaktivite kullanılmaz.
• Kolay uygulanabilirlik
• Hızlı
• Özgül ve duyarlı
• Probların uzun zaman kullanılabilmesi (1 yıl kadar)
Probların hazırlanması-­‐işaretlenmesi
• DNA probları; aşağıdaki yöntemlerle işaretlenir.
1. ‘Random primed’ işaretleme: In vitro DNA sentezi sırasında
yeni sentez edilen probun yapısına rastgele biçimde DIG-­‐11-­‐
dUTP’ler girer.
2. ‘Nick translation’: DNaz I enzimi ile çift iplikli DNA’nın tek
ipliğinde kesikler oluşturma esasına dayanır. E. coli DNA
polimeraz I enziminin 5’-­‐3’ ekzonükleaz aktivitesi ile tek iplik
üzerinde kesik noktalar genişletilir ve boşluklar aynı anda
enzimin 5’-­‐3’ polimeraz aktivitesi ile ve DIG işaretli dNTP’lerle
doldurulur.
3. Taq DNA polimeraz ile işaretleme: PCR ile prob DNA’sı
çoğaltılırken Taq DNA polimeraz enziminin diğer dNTP’lerin
yanısıra DIG işaretli dNTP’leri de kullanmasıyla işaretleme
gerçekleştirilir.
Random-­‐primed işaretleme
Probların İşaretlenmesi
• RNA probları; T3, T7 ve SP6 RNA polimerazları
ile in vitro transkripsiyon reaksiyonu ile
sentezlenirken ortama katılan DIG-­‐11-­‐dUTP ile
işaretlenir.
• Oligonükleotit problar; terminal transferaz
enzimi ile ya 3’ uca bir DIG-­‐11-­‐dUTP veya DIG-­‐
11-­‐dUTP’den oluşan bir kuyruk eklenmesi ile
ya da digoksigeninNHS-­‐esterin 5’ uca
eklenmesi ile işaretlenir.
NÜKLEIK ASIT HIBRIDIZASYONU
REAKSIYONUNUN TEMELLERI
• Çift iplikli bir nükleik asitin dayanıklılığı onun
erime(melting
temperature=Tm)
sıcaklığını
hesaplayarak belirlenir. Bu değer her bir organizma
için farklıdır.
• Hibrid molekül ne kadar dayanıklı ise, Tm derecesi o
kadar yüksektir, yani ipliklerin ayrılması için gereken
enerji o oranda fazladır.
HIBRID NÜKLEİK ASİTLERİN DAYANIKLILIĞI BİR TAKIM FAKTÖRLERE BAĞLIDIR.
1.Guanin-­‐sitozin oranı (%GC): GC çiftleri, 3 H bağı
içerdiğinden, AT çiftlerine göre daha sağlamdır. Bu
nedenle yüksek GC içeriğine sahip olan DNA, AT
bakımından zengin olan DNA’ya nazaran daha
dayanıklıdır ve iki ipliği ayırmak için daha çok enerji
gereklidir.
2.Hibrid molekülün boyu: Genellikle uzun bir nükleik
asit molekülü, kısa olana göre daha sağlamdır. Çünkü
içerdiği hidrojen bağı sayısı daha fazladır. Böylece iki
ipliği ayırmak için daha çok enerji gerekir.
3.Nükleik asitlerin içinde bulunduğu ortam:
Hibridizasyon karışımı ve hibridizasyon sonrası yıkama
solüsyonlarında, tek değerlikli katyonları içeren iyonik
bir tuz tamponu içinde formamid bulunur. Formamid
hidrojen bağlarını bozarak çift iplikli nükleik asitlerin
çözülmesini kolaylaştırır. Bunun tersine Na+ gibi tek
değerlikli katyonların konsantrasyonunu artırmak
hibridleri sağlamlaştırır. Organik çözücülerin çift iplikli
polinükleotitlerin ısıya dayanıklılığını azaltarak daha
düşük sıcaklıklarda hibridizasyona olanak vermesi bu
problemi çözümlemiştir. Formamid bu amaçla
kullanılan organik bir çözücüdür; DNA/DNA ve
DNA/RNA çift ipliklerinin ayrılma sıcaklığını azaltır.
Böylece hibridizasyon, %50 formamid varlığında 30-­‐
45°C’da gerçekleştirilebilir.
• 4. Nükleik asit hibridinin çeşidi: RNA/RNA
hibridleri DNA/DNA hibridlerine göre ısıya
daha dayanıklıdır. DNA/RNA hibridleri ise orta
dayanıklılıktadır.
• 5. Yanlış eşleşen hibridlerin varlığı: Yanlış
eşleşen nükleotitler (A-­‐T yerine T-­‐T vb.)
hibridin dayanıklılığını azaltır. Çünkü bunlar
arasında hidrojen bağları oluşamaz. Yanlış
eşleşmenin dayanıklılığı azaltan etkisi, kısmen
prob uzunluğuna bağlıdır. Çift iplikli hibrid ne
kadar uzun ise yanlış eşleşmiş bir çiftin, hibrid
dayanıklılığına etkisi o kadar azdır.
Hibridizasyon ve Belirleme
1-­‐ Probların işaretlenmesi
2-­‐ Taranacak DNA büyük ise RE’leri ile kesilir (genomik/plazmit
DNA’sı).
3-­‐ Kesilmiş parçalar agaroz jele yüklenir, parçalar ayrılır.
4-­‐ Nitroselüloz membrana aktarım yapılır (blotting).
5-­‐ DIG işaretli prob ile hibridizasyona bırakılır.
6-­‐ Prob tamamlayıcı bölge ile hibridlenir.
7-­‐ Anti-­‐ DIG ile (alkalen fosfataz bağlı DIG antikoru) muamele edilir.
8-­‐ dUTP’lere bağlı DIG ile anti-­‐DIG arasında antijen-­‐antikor
kompleksi kurulur.
9-­‐ Alkalen fosfataz substratları olan NBT ve X-­‐fosfat eklenir.
10-­‐ Enzim aktivitesi sonucu mavi renkli ürün oluşumu hibridizasyon
gösterir.
Hibridizasyon ve Belirleme
Belirleme
MELEZLEME
• İzole edilip, jel elektroforezi ile ayrılan ve
nitrosellüloz/naylon membrana aktarılan;
• DNA moleküllerinin (Southern blotting-­‐emdirim)
veya
• RNA dizilerinin (Nouthern blotting) veya
• hücre ve dokulardaki DNA ya da RNA’nın
belirlenmesinde (in situ melezleme) kullanılır.
I. SOUTHERN BLOTTİNG (SOUTHERN EMDİRİMİ)
•
•
•
•
E. Southern tarafından 1975’de tanımlandı.
Southern blotting’in temeli,
istenilen DNA fragmentinin problar ile melezlenmesi
ve
melezlemenin
ardından
belirleyicinin
özelliğine
göre
radyoaktif,
immünolojik,
kimyasal
yada
fluoresan yöntemlerle
görünür
hale
getirilmesidir.
ELECTROBLOTTİNG İLE SOUTHERN AKTARIMI
• DNA parçalarının, özellikle de
restriksiyon
enzim
kesimi
uygulaması ile oluşan, boyutları
birbirine çok yakın ve çok sayıda
olanların, agaroz jeldeki bantları
kısa
sürede
difüzyonla
kaybolabileceğinden
ve/veya
agaroz
jel
kolayca
kırılıp
parçalanabileceğinden
hibridizasyon
amacıyla
jeli
kullanmak uygun değildir.
• Bu nedenle agaroz jeldeki DNA
parçaları electroblotting ile bir
membrana (örneğin nitroselüloz
membrana) aktarılır. Böylece DNA
parçaları membran üzerinde
tutuklanmış (immobilize edilmiş)
olur.
BLOTTİNG MACHINE
SOUTHERN BLOTTİNG (SOUTHERN EMDİRİMİ)
• Probların işaretlenmesinde son yıllara kadar belirleyici olarak – P32
– S35 ve – H3 radyoizotopları yaygın bir biçimde kullanılmış ve bu nedenle de teknik, otoradyografi olarak adlandırılmıştır. • Otoradyografi
– hızlı sonuç vermesi avantaj
– güvenilirliği
– radyoaktif maddelerle çalışma zorluğu dezavantaj
– tehlikeler en önemli SOUTHERN BLOTTİNG -­‐ Otoradyografi-­‐
Southern blotting ile restriksiyon fragmenti analizi
•Örn; üç farklı bireyden alınan DNA örneklerinin karşılaştırılmasında;
a) Test edilecek DNA örnekleri uygun olan kaynaklardan elde edilir,
DNA’dan restriksiyon fragmentleri oluşturulur.
b) Her bir örneğe ait restriksiyon fragment karışımı elektroforezle
ayrılır. Her bir örnek karakteristik bir bant modeli meydana getirir.
c) Alkali bir solüsyon, jelin üst tarafına doğru kapiller etkiyle çekilir
ve DNA denatüre halde jelin üstünde bulunan nitroselüloz kağıt
tabaka üzerine aktarılır. Tek zincirli DNA’lar tamamen jeldeki
konumlarında kağıt üzerine tutunurlar.
d) Kağıt blot, radyoaktif olarak işaretlenmiş prob içeren bir solusyona
maruz bırakılır. Prob, istenen DNA dizisine komplementer dizinin
restriksiyon fragmentlerine baz eşleşmeleriyle bağlanır.
c) Transfer
Film
e) Bir tabaka fotoğraf filmi kağıt üzerine yerleştirilir. Bağlanan probdaki
radyoaktivite özgül DNA bantlarının karşısında görüntü oluşturmak üzere
filmi ışınlar-­probla baz eşleşmesini yapan DNA’yı içeren bantlar. Örneğin 1
ve 2’nin band modelleri birbirinin aynısıdır, fakat 3 farklıdır.
II. NORTHERN BLOTTİNG
• İlgilenilen genin transkripsiyon ürünü olan RNA’nın
analizinin
yapılmasında
kullanılan
başlıca
yöntemlerden biri DNA-­‐RNA hibridizasyonudur.
• Northern hibridizasyonu olarak adlandırılan bu
yöntemde önce total RNA agaroz jelde yürütülerek
RNA moleküllerinin ayrılması sağlanır. Daha sonra jelde
ayrılmış RNA molekülleri membrana aktarılır ve
RNA’nın membran üzerine sabit şekilde bağlanması
sağlandıktan sonra uygun problarla hibridizasyon işlemi
gerçekleştirilir. Otoradyogram yoluyla ortaya çıkarılan
bantlar ilgilenilen genin mRNA varlığı ve boyutu
hakkında bilgi verir.
NORTHERN BLOTTİNG
• Membranlar; genellikle naylon veya nitroselüloz
yapıdadır.
• Nötr, negatif veya pozitif yüklü olabilirler.
• Northern hibridizasyon için genellikle tercih edilen
naylon membrandır, fakat organik çözücüler etkisinde
bırakıldığında küçülebilir veya katlanabilir.
• Nitroselüloz membranlar ise fiksasyon işlemindeki
fırınlama sırasında yanabilir ve/veya yıkama sırasında
kolayca yırtılabilir.
YÖNTEM;
GEREKLİ MALZEMELER
1. Denatürasyon çözeltisi: NaOH 50 mM, NaCl
10 mM
2. Nötralizasyon çözeltisi: Tris pH 7,5 100 mM
3. Melezleme öncesi çözelti: SDS %7’lik,
Sodyumfosfat 50 mM pH 7, foramid %50,
bloklama ajanı %2’lik, 5X SSC, laurilsarkosin,
prob .
YÖNTEM 1. RNA jelde yürütülür .
2. Bu jel alınır ve denatürasyon solüsyonuyla 30 dk
muamele edilir. DEPC’li suyla yıkanır.
3. Nötralizasyon çözeltisiyle muamele edilir ve tekrar
DEPC’li suyla yıkanır.
4. Membran alınır nitroselüloz veya naylon olabilir.
(Naylon membran küçülebilir nitroselüloz membran ise
yırtılabilir.) DEPC’li suyla yıkanır ve 10 X SSC’ de
bekletilir.
5. Membranın görüntüsü alınır (blotlamadan sonra
yorum yapılması için önemlidir).
YÖNTEM 6. En alta filtre kağıdı onun üzerine membran onun
üzerine de jel ve jelin üzerine de tekrar filtre kağıdı
koyulur. Bunların üzerine ağırlık koyulur ve bir gece
bekletilir.
7. Membran alınır. UV’de bakılır, önceden DEPC’li suyla
yıkanmış streç dosyaya koyulur ve 4 derecede saklanır.
8. Melezleme tamponundan 1000 mikrolitre alınır ve
bu streç dosyaya koyulur oluşan kabarcıklar yok edilir.
9. Melezleme fırınında 1 gece 50◦C’de bekletilir.
10. Hazırlanan prob 100◦C’de 10 dk denatüre edilir ve
melezleme solusyonuyla karıştırılır.
YÖNTEM 11. Streç dosyadan çıkarılan membran 6 ml melezleme
tamponuyla muamele edilir ve tekrar streç dosyada 1 gece
bekletilir.
12. Membran alınıp 2 kez 5’er dk. oda sıcaklığında 5’er dk.
yıkanır.
13. 2 kez 15’er dk da %1’lik yıkama solüsyonuyla 68 ◦C’de
çalkalanır.
14. Membran streç dosyaya tekrar alınır ve 5 ml CDP-­‐star ile
muamele edilir, 1 gece karanlıkta röntgen filmi üzerine
koyulmuş şekilde bekletilir.
15. Röntgen film 5’er dk 2 kez solüsyonda yıkanır.
16. Film görüntüsü alınır.
III. IN SiTU HIBRIDIZASYON
• In situ hibridizasyon (ISH), nükleik asit dizilerinin (DNA
ve RNA) morfolojik olarak korunmuş kromozomlar,
hücreler veya doku kesitlerinde saptanarak
gösterilmesini sağlayan ve temel olarak çift iplikli
nükleik asit oluşumu kinetiğini kullanan güçlü bir
tekniktir.
• In
situ
hibridizasyonun
diğer
hibridizasyon
yöntemlerinden (Southern veya Northern Blotting)
farkı nükleik asitlerin kendi hücresel ortamlarında
tanınarak gösterilmesidir. Böylece hedef nükleik asit
dizisinin hücredeki yeri belirlenmiş olur.
IN SiTU HIBRIDIZASYON
Nükleik asitlerin bulundukları yerde saptanması; • Kromozomların fiziksel haritalarının yapılmasında,
• Kromozom yapı ve hatalarının analizinde,
• Kromozomların ve genomun yapı, işlev ve evriminin
araştırılmasında,
• Gen anlatımının belirlenmesinde,
• Eşey tayininde,
• Dokudaki virüs ve bakterilerin tanısında,
• Transformasyon dizilerinin ve onkogenlerin yerlerinin
belirlenmesinde önemlidir.
Kullanıldığı Yerler
• İn situ melezleme belirli bir mRNA’nın doku içinde
nerede bulunduğunu görmemize yarar. Bu metod
inceleyenin ilgilendiği mRNA’nın normal yerini
görmesine olanak sağlar.
• In situ melezleme oldukca kolay bir tekniktir ve
histolojik dokulardaki hedef mRNA’nın işaretlenmis
nükleik asit probuna hibridizasyonunu sağlayarak
dengeli hibridler oluşturur ve böylece probun yeri
görülür.
• Bu teknoloji ayrı türlerdeki hücre populasyonlarında
gen anlatımı calısmak için kesin bir metoddur. Çünkü
tek bir hücre çözünürlüğünde hedef mRNA’nın
bulunmasına izin verir.
Kullanılan prob tipleri
• DNA probları:
Yüksek
spesifik
aktivite
gösterir.
Prob olarak kullanılmadan önce denatüre edilmelidir.
• RNA probları:
RNA-­‐RNA hibridleri en stabil hibridlerdir.
RNA probları düsük stabilite gösterir ve RNaz’larla
kolaylıkla yok edilebilirler.
• Oligonükleotid probları (15-­‐50 nükleotid):
Dizi hedef diziye tamamlayıcı olarak tasarlanır. Problar
çok stabildir. Küçuk̈ boyutundan dolayı hedefe kolayca
girebilir.
Prob işaretleri
IN SiTU HIBRIDIZASYON
• In situ hibridizasyonun anlaşılması moleküler biyoloji,
genetik, immünokimya ve histokimya bilgilerini
gerektirmektedir.
• Yöntemin başlıca aşamaları;
ü Biyolojik materyalin hazırlanması & Probun
işaretlenmesi,
ü Prob ve materyalin denatürasyonu,
ü Hibridizasyon,
ü Yıkama,
ü Saptama,
ü Görünür hale getirme.
IN SiTU HIBRIDIZASYON
• ISH yöntemi ilk kez 1969’da birbirinden bağımsız
olarak çalışan iki grup araştırıcı tarafından (John ve
ark., Pardue ve Gall) uygulandı.
• İlk uygulamalarda nükleik asitleri işaretlemede
radyoizotoplar
kullanılmaktaydı;
buna
göre
hibritleşmiş dizileri göstermek için başvurulan tek
yöntem otoradyografiydi.
• Ayrıca, o sıralarda moleküler klonlama mümkün
olmadığından ISH sadece biyokimyasal metotlar ile
saflaştırılabilen ve izole edilebilen dizilere (fare satellit
DNA’sı,
viral
DNA,
ribozomal
RNA
vb.)
uygulanabiliyordu.
IN SiTU HIBRIDIZASYON
• Nükleik asitlerin moleküler klonlaması ve radyoaktif
işaretleme tekniklerindeki gelişmeler bu tabloyu
önemli derecede değiştirdi.
• Öte yandan, radyoaktif olmayan işaretleyici ile
hazırlanmış nükleik asit problarının ISH’da
kullanılması radyoaktif yöntemin getirdiği zorlukları
ortadan kaldırdı.
• Radyoaktif olmayan ISH ilk kez 1970’lerin sonunda
uygulandı (Rudkin ve Stollar, 1977; Bauman ve ark.,
1980). O günden beri radyoaktif olmayan in situ
hibridizasyonun (NISH) biyomedikal araştırmalarda
ve klinik tanıdaki uygulamaları büyük bir hız
kazanmıştır.
IN SiTU HIBRIDIZASYON
• Son yıllarda nükleik asitleri işaretlemek için birçok
yöntem
geliştirilmiştir.
Günümüzde,
biotin,
digoksigenin, dinitrofenil veya fluorokromlarla
enzimatik olarak işaretleme genellikle tercih
edilmektedir. Piyasada çeşitli prob işaretleme
kitlerinin bulunması, bu işlemleri oldukça
kolaylaştırmıştır.
• Rekombinant DNA preparasyonları ile birlikte saf
prob elde edilmesi sorunu çözülmüştür. Prob
seçimine bağlı olarak, belirli genom ve kromozomlar,
tekrarlanan DNA dizileri, tek kopyalı diziler, mRNA ve
viral diziler gibi farklı hedefler saptanabilmektedir.
IN SiTU HIBRIDIZASYON
• Çeşitli
sitokimyasal
saptama
yöntemlerinin
geliştirilmesi de ISH tekniğinin başarısını arttırmıştır.
Birden fazla prob işaretleme ve saptama yönteminin
birlikte kullanılması aynı hücre preparatında iki veya
daha çok nükleik asit dizisinin farklı renklerde
gösterilmesini sağlamıştır.
• Ayrıca
radyoaktif
olmayan
ISH
ile
immünositokimyasal yöntemin birlikte kullanılması
gen topografisi ile gen aktivitesi arasındaki ilişkinin
DNA, mRNA ve protein düzeyinde ortaya
konulmasına olanak vermiştir.
Yöntemin Uygulanması
• Problar hazırlandıktan sonra hibridizasyon için istenilen DNA
parçası açısından taranacak DNA, eğer plazmid DNA’sı ya da
genomik DNA gibi kompleks özellikte ise önce bir
restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesilerek daha küçük
parçalara bölünmelidir.
• DNA parçaları, agaroz jel elektroforezi ile birbirinden
ayrıldıktan sonra nitroselüloz membrana aktarılır.
• Daha sonra da hazırlanan DIG işaretli probla hibridizasyona
bırakılır.
• Probla nitroselüloz membran üzerindeki DNA parçalarından
tamamlayıcısı olan arasında H bağları oluşumu ile çift zincirli
DNA parçası meydana gelir.
• Bundan sonraki aşamada prob ile hibritlenmiş DNA
parçasının belirlenmesi gerekir.
Yöntemin Uygulanması
• Bir hapten olduğu daha önce belirtilen digoksigenine karşı
özgül digoksigenin antikoru, alkalin fosfataz enzimi ile bağlı
olarak bulunur.
• Hibridizasyon işleminin ardından ortama eklenen
antidigoksigenin
(digoksigenin
antikoru),
probların
yapısında bulunan dUTP’lere bağlı digoksigenin ile bir
antijen-­‐antikor kompleksi oluşturur.
• Bu kompleksin oluşumunu takiben ortama katılan ve alkalin
fosfataz enziminin substratları olan ‘nitroblue tetrazolium’
tuzu (NBT) ve 5-­‐bromo-­‐4-­‐kloro-­‐3-­‐indolil fosfat (X-­‐fosfat)
varlığında enzim aktivite gösterir.
• Sonuçta mavi renkli bir ürün oluşumu sayesinde istenilen
DNA parçası belirlenmiş olur.
ISH
• FISH (Floresanlanmış nükleotid analoglarının
direkt ve indirekt ISH (In Situ Hibridizasyon)
yöntemlerinde kullanılması (1991),
• GISH (Genomik İn situ Hibridizasyon)
• CGH (Komparatif Genomik Hibridizasyon)
• CISH (Kromogenik in situ hibridizasyon)
FISH (Floresan In Situ Hibridizasyon)
• Moleküler sito-­‐genetikteki hızlı ilerlemeler, bantlama ve
boyama tekniklerinin hızlı gelişimiyle sağlanmıştır.
• Standart bantlama teknikleri yalnızca bir denemede bir hücre
için tüm genomu sorgulamada yetersiz kalmaktayken,
Fluoresan
in
situ
hibridizasyon
(FISH),
genleri ve kromozomları
boyamada
fluoresan
moleküllerin kullanıldığı
bir
yöntem
olarak
bantlama teknikleriyle
birlikte
iyi
bir
değerlendirme aracıdır.
A) Tanısal amaçlı kullanılan
FISH
1. Klinik sitogenetik
a.
Prenatal
tanı
b.
İnterfaz
sitogenetiği
c.
Mikrodelesyon
sendromlarının tanısı
d. Kanser
sitogenetiği
2.
Dokuda
enfeksiyon ajanlarının tanısı
3.
Dokuda
mRNA
düzeyinde
onkogenlerin
değerlendirilmesi
B) Araştırma
amaçlı
FISH
1.
Gen
haritalaması
2.
Tümör
biyolojisi
3.
Mikrobiyoloji/viroloji
4.
Gen
ekspresyon analizi
5. Somatik
hücre
hibrit
analizleri
6.
Mayoz/mitoz analizleri
7. Hücre
tanımlaması
FISH
FISH
• FISH, Southern blot tekniğinin analogudur.
• FISH, fluoresan işaretlerle etiketlenen, tamamlayıcı
DNA’ya, bu DNA dizilerinin yerleşimini görebilmek için
hibridizasyona uğrayan veya bağlanan tek zincirli DNA
(prob) kısa dizilerini gerektiren bir yöntemdir.
• Floresan in situ hibridizasyon çoklu, sayı, yapı ve
mikrodelesyon gibi kromozom anomalilerini saptamak
için kullanılan bir metodtur.
Üstünlükleri
• Sonuca hızlı ulaşılır.
• Bütün doku tiplerine uygulanabilir (kan, ilik vb.)
• Standart sitogenetik metodlarla saptanamayan
delesyonları saptar.
Olumsuz yönleri
• Standart G-­‐bantlama çalışmalarının yerine geçemez,
fakat yanında kullanılabilir.
• Tüm kromozom için iyi olmasına rağ men sadece
birkaç kromozomal segmentle sınırlıdır.
• Kromozomların
çalışılmasında
kullanılan
birçok teknik, aktif olarak
bölünen
hücreleri
gerektirirken
(metafaz
kromozomları), FISH aynı
zamanda
bölünmeyen
hücrelere de uygulanabilir
(interfaz nukleusu).
• Metafaz
delesyonları
belirlemede kullanılır.
• Interfaz
genelde
kromozomların
yeniden
düzenlenmesinin
ve
kromozom
sayılarının
belirlenmesinde kullanılır.
Bu teknolojide ilk aşama;
floresan özelliği taşıyan
bir kimyasalın spesifik
DNA
dizilerini
tanıyabilecek
bir
molekülle
(prob)
bağlanmasıdır.
Kromozoma bağlı olan
işaretli
DNA
probu
kromozomlar UV ışığa
maruz bırakıldıklarında
ışıma yaparlar. Eğer
probda floresan ışıma
olursa gen mevcuttur,
floresan ışıma yok ise
delesyona uğramıştır.
Her prob kromozomun belli bir bölgesine ö zeldir ve
floresan molekülle işaretlenmiştir.
Her mikroskop lamı birçok metafaz içerir.
Her metafaz kromozomun tam bir setinden oluşur ve bu
setin küçuk̈ bir segmenti her bir prob tarafından aranır
ve prob buraya baglanır.
Prob hazırlama
FISH
• Lokusa özgü olan problar bir kromozomun belirli
bölgeleriyle hibridizasyona girer. Bu tip problar
ilgilenilen belirli bir genin hangi kromozom üzerinde
yerleşmiş olduğunu belirlemede kullanılır.
• Alfoid veya sentromerik tekrarlı
problar,
kromozomların
sentromerlerinde
bulunan
tekrarlayan dizilerden elde edilir. Kromozomlar
farklı renklerde boyanabildiği için, bu prob herhangi
bir bireyin doğru sayıda kromozoma sahip olup
olmadığının belirlenmesinde kullanılır.
FISH
• “ Whole chromosome ”
probları, herbiri tüm bir
kromozom boyunca farklı dizilerle hibridizasyona
girebilen küçük probların kolleksiyonudur. Bu şekildeki
bir prob kitaplığı taranarak tüm bir kromozom spektral
bir karyotip oluşturmak üzere boyanabilir. Bu teknik
kromozomal translokasyonların tanımlanmasında imkan
sağlar.
• FISH ile sitogenetik çalışmalara yardımcı olan ve iyi
tanımlanmış uygulamalar geliştirilmiş olmasına rağmen,
amaca uygun prob ve filtre seçimi doğru yapılmaz ise
hatalı ve zaman alıcı denemeler ortaya çıkmaktadır.
FISH-­‐ Uygulama
• İlk aşama çift iplikli kromozom DNA’sını ve prob
DNA’sını denatüre etmektir.
• Böylece prob ve kromozom DNA’sı birbirine
bağlanabilirler.
• Bu iş lem DNA’nın yüksek sıcaklıkta ısınmasıyla
gerçekleşir.
FISH-­‐ Uygulama
Prop lam üzerine konulduktan sonra üstüne
buharlaşmayı engellemek için lamel örtülür ve lamelin
kenarlari iyice kapatılır.
Lamel 37oC lik inkübatöre koyulur ve bir gece boyunca
bekletilir. Böylece prob hedef kromozomla hibridize olur.
Gece boyunca prob DNA spesifik kromozom üzerinde
hedef diziyi arar ve ona yapışır. FISH
Prosedür
• Metafaz kromozomları veya interfaz nukleusu
kullanılarak preparatların hazırlanması
• Etanol içinde dehidrasyon
• DNA’yı 70oC’de denatüre etme
• Etiketli probun denatürasyonu
• Hibridizasyon için 37oC ’ de, 4-­‐16 saat
inkübasyon
FISH
•FISH metodunu temel alan bazı uygulamalar
geliştirilmiştir.
• Multicolour-­‐FISH
1. Spectral Karyotyping
2. Multiplex FISH
3. Combined binary ratio FISH (COBRA-­‐FISH)
• Cross-­‐species colour FISH (R x FISH)
• Comparative Genomic Hibridizasyon
• Kromozom ve Lokus Spesifik FISH
FISH
• Spektral Karyotipleme
– Herbiri 5 florokromun farklı kombinasyonlarıyla
hazırlanmış
probların
24
kromozomla
hibridizasyonu ve tek bir filtreye sahip flüoresans
mikroskobu ile analizine dayalıdır.
– Kansere neden olan genomik değişikliklerin standart
bantlama yöntemlerinden daha iyi anlaşılmasını
sağlar.
FISH
• M-­‐FISH (Multicolor FISH)
–5
florokromun çeşitli kombinasyonlarıyla
hazırlanmış probların hibridizasyonu ve farklı
flouresans sinyalleri ile analizine dayalı bir
yöntemdir.
• COBRA-­‐FISH
FISH
– Diğer FISH yöntemlerine benzer. Ancak 4 florokrom
kullanılır. 24 kromozomun 12si bir gruba diğer 12si diğer
gruba ayrılır. İlk grup 3 florokromla hibridleştirilirken, 2.
gruba ek olara dördüncü florokrom uygulanır.
– Bu metod, 5. florokrom için, kollara özgü boyama veya M-­‐
FISH ile locus-­‐specific proba geçiş için kullanılmıştır.
• R x FISH
– Gibbon kromozomlarının prob olarak kullanılır. Gibbon ve
insan kromozomlarının homolojisi yaklaşık % 98 dir.
– RxFISH ile yalnızca kromozom arası parça değişimleri
değil, aynı zamanda kormozom içi
değişimler de
belirlenebilmektedir. (delesyon, inversiyon). G-­‐bantlama
tekniği ile birlikte kullanıldığında 400 kat daha hassas
sonuçlar vermektedir.
GISH (Genomik in situ Hibridizasyon) • Türler arası hibritlerde, parental genomların
ayrılmasına olanak tanıyan genomik boyama
tekniğidir.
• Uygulama alanı genellikle hibritlerdeki
ebeveynlerin kromozom analizidir.
• Başarılı çaprazların belirlenmesi açısından çok
önemlidir.
GISH (Genomik in situ Hibridizasyon) Temeli
CGH (Karşılaştırmalı Genomik Hibiridizasyon)
-­‐ Genom boyunca tüm kromozomları, DNA dizisindeki
kopya
sayısı
değişimlerini,
DNA
kayıplarını,
amplifikasyonlarını yada DNA miktarındaki değişiklikleri
karşılaştırılmalı olarak inceleyen floresan moleküler
sitogenetik bir tekniktir.
-­‐ Bu teknik, kazanım (duplikasyon, insersiyon veya
amplifikasyon) veya net kayıp (materyalde delesyon) gibi
kromozom anomalilerinin sınıflandırılmasına olanak
sağlar. Yalancı-­‐negatif ve yalancı-­‐pozitif sonuç verme
olasılığının FISH tekniğinden çok daha düşük olması
nedeniyle çok daha güvenilirdir. örn; embriyolarda-­‐
gebelik kusurlarında
CGH Yöntemin avantajları:
-­‐ Temel avantaj DNA örneklerinin kullanılarak tüm
genomun tek bir deneyde görüntülenebilmesi
-­‐ iki renkli görüntüleme sistemi kullanılması sonucunda
kromozom anomalilerinin daha güvenilir saptanması
-­‐ Az miktarlarda DNA örneğinin yeterli olması
-­‐ Test örneği için metafaz kromozomları gerekli değil
-­‐ Katı tümörlerin çalışılmasında da elverişlidir.
CGH • CGH niceliksel 2 renk floresan in situ hibridizasyonuna
dayanır. Eşit miktardaki farklı işaretlenmiş tumör
genomik DNA ve normal referans DNA’sı karıştırılır ve
hibridize edilir. Işaretlenmiş problar iki farklı floresan
ile belirlenir.
• Referans metafaz alanındaki kromozomlar boyunca
floresan yoğunluklarındaki farklılıklar, tumor DNA’daki
kopya numara değişikliklerine karşılık gelir.
• Tek bir deneyde tüm genomları analiz edebilir.
• Özellikle Sitogenetik analiz için yeterli metafaz
vermeyen tümörlerin incelenmesi iç in kullanılabilir ve
donmuş veya taze dokulara uygulanabilir.
CGH (Karşılaştırmalı Genomik Hibiridizasyon)
CISH
(Kromogenik in situ hibridizasyon ) • CISH pratik, etkili ve FISH’a alternatif bir metottur.
• FISH ile karşılaştırıldığında üç önemli avantajı vardır:
1) Parafin bölgelerin histolojik ayrıntıları aydınlık alanda
genellikle daha iyi gözlenir.
2) Morfolojik ayrıntılar düşük güçlü mercekle kolaylıkla
görülebilir.
3) Prob sinyalleri hızlı solmazlar.
Download