GENETİK YÖNTEMLER

GENETİK TANI
YÖNTEMLERİ
Yrd.Doç.Dr.Ayşe Gül ZAMANİ
Selçuk Üniversitesi Meram Tıp Fakültesi
Tıbbi Genetik AD, KONYA
1
GENETİK TANI YÖNTEMLERİ
1- Sitogenetik ve Moleküler Sitogenetik Tanı Yöntemleri
I. Sitogenetik Tanı Yöntemleri
1. Klasik Sitogenetik Tanı Yöntemleri
2. Özelleşmiş Sitogenetik Tanı yöntemleri
a. Kardeş kromatid değişimi (Sister Chromatid Exchange= SCE)
b. Mikronükleus (MN)
c. Frajil bölge tayini
II. Moleküler Sitogenetik Tanı Yöntemleri
1.Akış karyotiplemesi(Flow karyotyping)
2. Floresans in situ hibridizasyon (FISH)
3. Fiber FISH
4. Multicolor-FISH
a. Spectral karyotyping (SKY)
b. Multiplex-FISH (M-FISH)
c. R-FISH
d. Cobra-FISH
e.Komparatif genomik hibridizasyon(CGH)
2. Moleküler Genetik Tanı Yöntemleri
I. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR)
II. Allel-özgü oligonükleotid analizi (Allele-specific oligonucleotid= ASO)
III. DNA dizi Analizi
IV. Mikroarray Analizi
2
Kromozomlar Ö mitotik/mayotik metafaz
Spontan olarak bölünen
dokularda
Kültürde bölünmeleri için
uyarılan hücrelerde
3
Spontan olarak bölünen hücreler:
Kemik iliği
Lenf nodülleri
Solid tumorler
Bazı plevral ya da asidik sıvılar
Fetal asitler
Kistik higroma
Fetus ya da yeni doğan kanı
4
Spontan olarak bölünme hızı düşük olan
hücreler:
Kan lenfositleri
Amniyon sıvısı
Koryonik villuslar
Deri ve fibroblast içeren diğer dokular
5
HÜCRE (DOKU) KÜLTÜRÜ
•
•
Kısa süreli kültür (24-72, bazen 96 saat)
Örn: Kemik iliği, kan …
Uzun süreli kültür (1-3 hafta)
Örn: Amniyon sıvısı, deri ve diğer
dokular ...
6
Doku Kültüründen kullanılan besi yerleri ve katkı
maddeleri (Kültür Ortamı):
1. Besi Yerleri (=Vasat)
Dengelenmiş tuz solüsyonu ile hazırlanırlar
Hanks ya da HBSS→ozmotik basınç ve pH kontrolü
Glukoz→hücreler için enerji
Medyumlar
TC Medium 199
Minimal Esential Medium (MEM)
McCoy’s 5A
Nutrient Ham’s F-10
RPMI-1640 … gibi
Daha spesifik besi yerleri. Örn: Chang
Leibovitz L15
7
Doku Kültüründen kullanılan besi yerleri
ve katkı maddeleri (Kültür Ortamı):
2. Antibiyotik
Penicillin
streptomycin
BAKTERİ
amphotericin
nystatin
MANTAR
3. Serum
Dana serumu (FBS)
Sığır fetusu serumu (FCS)
Hücre büyüme faktörleri, adhezyon faktörleri,
iz elementler, hormonlar,vitaminler
4. L-Glutamin
Çoğunlukla besi yerinin içinde hazır
8
5. Mitoz uyaranı
=Mitojen: EBV(Epstein Bar Virus),
Pokeweed mitojen (PWM),
Phorbol ester (TPA)
En çok kullanılan mitojen :
Phytohemagglutinin Ö insan periferik kan
kültüründeki olgun lenfositleri uyararak onları
bölünmeye teşvik eder.
9
KROMOZOM ELDESİ ve PREPARATLARIN
HAZIRLANMASI
(HARVESTING)
* 2 saat önce Kolşisin ya da
Demekolsin
(mitozu durdurmak için)
sıvı faz
* Santrifüj
hücre fazı
* Hipotonik Muamelesi
0.075 M KCl ,
% 0.95’lik Na Sitrat
* Fiksatif Muamelesi:
(3 Metanol : 1 Asetik Asit) X 3
kere
* Lamlara yayma ve kurutma
10
G-Bandlama
„
„
„
Most common method used
Chromosomes treated with
trypsin
– denatures protein
Giemsa stain
– each chromosome
characteristic light and dark
bands
– 400 bands per haploid
genome
– Each band corresponds to
5-10 megabases
– Dark bands are gene poor
11
İdiyogram
12
ISCN
„
„
„
„
International System for
Human Cytogenetic
Nomenclature
Kromozomların herbir
bölgesinin
numaralandırılması
Sentromere (proximal) en
yakın bölgeler için en küçük
Sentromere (distal) en uzak
bölgeler için en büyük
numaralar
13
HRB-Bandlama
– Yüksek çözünme
– 800 band
prometafaz
kromozom
– Metotreksat ve
Kolşisin kullanılır
14
Q-Bandlama
„
„
„
Özellikle Y kromozomu
anomalilerinde ve
mozaisizim tanısında
kullanılır
G-band benzeri bandlar
elde edilir.Fakat
polimorfizmler
saptanamaz
Floresans mikroskop
gereklidir.
15
R-Bandlama
„
„
„
X kromozom
anomalilerini
tanımlamak için
kullanılır
Kromozomlar giemsa
ile bandlanmadan önce
ısıya tabii tutulur
Açık ve karanlık
renkteki bandlar terstir.
16
C-Bandlama
„
„
Sentromerleri ve
heterokrometini
tanımlamak için
kullanılır.
Heterokromatik
bölgeler
– Tekrarlayan diziler
içerir
– Oldukça kondanse
kromatin fiberleridir.
17
NOR-Bandlama
„
„
Gümüş
(NOR)boyama:
Nukleolar
organizasyon bölgeleri
ve akrosentrik
kromozomların ikincil
boğumları boyanır.
18
Kardeş kromatid değişimi
„
„
„
İki hücre döngüsü boyunca
kromatidleri ayırma fırsatı
veren BrdU (bromo-deoxyuridine) kültür ortamına
eklenir.
Sadece bir zincirde DNA
BrdU almışsa normal
karanlık Giemsa boyaması
olur, diğer zincir daha açık
renkle boyanır.
Eğer değişim
gerçekleştiyse, kromatid
parça parça açık ve koyu
renklerde görülür:
"harlequin kromozomları“.
19
Kardeş kromatid değişimi
20
Mikronükleus tekniği
21
Frajil bölge tesbiti
22
Akış Karyotiplemesi
Ultrasonik titreşim başlığı
Hücre süspansiyonu
Koruma sıvısı
dedektörler
pozitif
yüklü tek floresan
hücre içeren
damlalar
ANALİZÖR
Nonfloresan negatif
yüklü
tek hücre içeren
damlalar
Hücre toplayıcı
Hücre toplayıcı
23
Kromozom sayısı
Akış Karyotiplemesi
Floresan oranı
24
Floresans In Situ
Hibridizasyon FISH
Hedefin hazırlanması
Probun hazırlanması
Denaturasyon
Hibridizasyon
Hibridizasyon sonrası yıkama
Kromozomların boyanması
Floresans mikroskobi
25
Tüm Kromozom Boyama Probları
(Kromozom Painting Prob )
Chromosome 8 painting probe
26
Sentromer Spesifik
Problar
● kromozom 7 sentromer spesifik signal
● kromozom 8 sentromer spesifik signal
27
Lokus Spesifik Problar
Tek Gen Probları
DiGeorge Sendromu (22 de mikrodelesyon)
● 22q13’e özgü kontrol sinyali
● 22q11.2’ye özgü DiGeorge probu
SRY lokus spesifik prob kullanılarak yapılmış FISH örneği.
SRY/X probu kullanıldı.
● X kromozomu
● SRY
28
Telomerik Problar:
29
Fiber FISH
30
Spektral Karyotipleme
(SKY)
31
Multiplex FISH
„
Akciğer kanseri hücre dizilerinde 5-florokrom M-FISH karışımı ile
hibridizasyon sonrası A)gerçek renk metafazı, B) sınıflandırılmış renk
sunumu
32
Multiplex FISH
C). Karyotip
33
Cobra FISH
„
„
„
İnsan COBRA–FISH prob
setİ ile elde edilen 12-renk
imajı.
Sadece üç adet florokrom
kullanılarak yapılan oranlı
işaretleme(DEAC, Cy3 and
Cy5 ).
Beyaz ok klasik sitogenetik
yöntemlerle tesbit
edilemeyen bir
translokasyonu
göstermektedir.
v1/n1/full/nprot.2006.41.html
„www.nature.com/.../
34
R x FISH=Cross-species
colour FISH
v1/n1/full/nprot.2006.41.html
„www.nature.com/.../
35
Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon=
comparative genomic hybridization (CGH):
36
Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon(CGH):
Hasta dokunun DNA’sı
(TEST)
Normal doku DNA’sı
(KONTROL)
İşaretleme
(Yeşil floresan)
İşaretleme
(Kırmızı Floresan)
Normal metafaz kromozomu
ile hibridizasyon
-2
0
2
(log2 ratio)
Amplifikasyon
Delesyon
37
Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon
(CGH):
CGH-metafaz plağı
Test DNA’sı ile hibridizasyon
*Test DNA
FITC/yeşil
*Referans DNA
Rhodamine/kırmızı
38
Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon
(CGH):
CGH- karyotip
Aynı metafazın CGH karyogramı(bir önceki slayt
39
Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon
(CGH):
CGH idiyogramları
40
Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon
(CGH):
normal
kazanım
kayıp
41
Polimeraz zincir reaksiyonu(PZR)
Çift zincir DNA
Isıyla
zincirlerin Primerlerin
ayrılması hibridizasyonu
1.basamak
DNA polimeraz
+dATP,
Primerlerden
+dGTP,
DNA sentezi
+TTP,
+dCTP
2.basamak
3.basamak
Birinci siklus
Ayrılan DNA zincirleri
bağlanan primer
Ayrılan DNA zincirleri
bağlanan primer
DNA
sentezi
DNA
sentezi
Ayrılan DNA zincirleri
bağlanan primer
DNA
sentezi
DNA oligonükleotid
primerler
Amplifiye edilecek olan
cift zincirli kromozomal
DNA bölgesi
(hedef bölge)
Birinci siklus
İki adet cift sarmal DNA molekülü sentezlenir
İkinci siklus
Dört adet cift sarmal DNA
molekülü sentezlenir
Üçüncü siklus
Sekiz adet cift sarmal DNA
molekülü sentezlenir
42
PZR'nin genetikte kullanım
alanları:
„
„
„
„
„
„
„
„
„
„
„
„
Onkogenezis araştırmaları,
Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı (mutasyon
analizi),
Prenatal tanı,
Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanması,
Adli tıp (DNA parmak izi araştırması,vb),
Prob oluşturulması/klonlama/gen ekspresyon arastırmaları,
DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin
oluşturulmasında,
Bilinmeyen dizilerin tayininde,
Geçmiş DNA'nın incelenmesinde,
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) analizinde,
Invitro fertilizasyon yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi
genetik testlerin yapılması,
DNA protein interaksiyonunun araştırılmasında (footprinting)
kullanılabilir.
43
Allel-özgü oligonükleotid (ASO)
Hibridizasyon
Hatalı eşleşme
Hibridizasyon yok
Genotip
Hatalı eşleşme
Hibridizasyon yok
Hibridizasyon
Genotip
44
Allel-özgü oligonükleotid
(ASO)
hastalar
heterozigot
Homozigot
Homozigot
Homozigot
Homozigot
heterozigot
heterozigot
heterozigot
45
DNA Dizi Analizi:
46
DNA Dizi Analizi:
47
Mikroarray Analizi
Hedef mRNA
hazırlanması
RT/PCR
Floresan boyalarla
işaretleme
Microarray oluşturulması
Eşit
oranda
birleştirme
Hedef karışım
mikroarray ile
hibridize edilir
tarama
Verinin
analizi
48
Mikroarray analizi
49
Mikroarray analizi
50