Boyama Analiz KROMOZOM BOYAMA (bantlama)

GENETİK TANI YÖNTEMLERİ
Doç.Dr. Zerrin Yılmaz Çelik
Tıbbi Genetik AbD
19. 10. 2011
Amaç;
Bir hastalığın genetik bozukluğa bağlı olup olmadığını
belirlemek.
Olası genetik bozukluğu göstererek hastalığın tanısını
koymak.
Bir sonraki kuşakta tekrarlama riskini belirlemek ve
tekrarlamaması için önlem almak.
ÖNCEKİ BİLDİKLERİNİZ:
GENETİK YAPI NEDİR? NORMAL - NORMAL VARYANT
ANORMAL
GENETİK BOZUKLUKLARIN YERİ VE SONUÇLARI
(KİŞİSEL, AİLESEL ve TEKRARLAMA RİSKLERİ?)
ÖĞRENECEKLERİNİZ:
TANIDA HANGİ YÖNTEMLER KULLANILIR?
YÖNTEM SEÇİMİ

HANGİ YÖNTEM NE ZAMAN KULLANILIR ?
Genetik bilgi hücrede farklı zamanlarda farklı şekillerde
bulunur.
GENETİK HASTALIKLARI
HATIRLAYALIM
KROMOZOM BOZUKLUKLARI
TEK GEN BOZUKLUKLARI
POLİGENİK BOZUKLUKLAR
MİTOKONDRİYEL DNA BOZUKLUKLARI
SOMATİK HÜCRENİN GENETİK HASTALIĞI- KANSER
HASTAYA (DANIŞANA)
YAKLAŞIM
1. GENETİK DANIŞMA
AİLE HİKAYESİ VE PEDİGRİ ANALİZİ
YÖNTEM SEÇİMİ
Hastanın yazılı onayının alınması!!
2. TANI
KLASİK VE MOLEKÜLER SİTOGENETİK YÖNTEMLER
 MOLEKÜLER GENETİK YÖNTEMLER
3. GENETİK DANIŞMA
SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ VE ÖNERİLER
Pedigri; bir ailenin bütün kuşaklarının gösterildiği şematik
bir analiz yöntemidir.
*genetik özelliklerin hastalık oluşumuna etkisi
*kalıtım tipinin belirlenmesi
*aktarılma olasılığının değerlendirilmesi
Otozomal dominant kalıtım
Otozomal resesif kalıtım
SİTOGENETİK
Kromozomların çeşitli boyama yöntemleri ile
boyanarak morfolojik yapısı ve sayısı bakımından
incelenmesidir.
SİTOGENETİK ÇALIŞMA ENDİKASYONLARI
A. Postnatal endikasyonlar
B. Prenatal endikasyonlar
POSTNATAL TANI ENDİKASYONLARI 1
1.Erken dönemde büyüme ve gelişme bozuklukları
 Gelişme geriliği, boy kısalığı
 Dismorfik yüz görünümü
 Çok sayıda malformasyon
 Belirsiz (Ambigius) genitalya
 Mental motor retardasyon
Tek neden veya birden fazla neden bir arada olabilir.
2. Ölü doğum ve neonatal ölüm
Nedeni belirlemek ve kromozom bozukluğunu dışlamak için yapılmalıdır.
POSTNATAL TANI ENDİKASYONLARI 2
3. Fertilite problemleri
 Amenore
 prematür menopoz
 İnfertilite
 Tekrarlayan gebelik kayıpları
4. Aile öyküsü
Yakın akrabaların birinde bilinen kromozom bozukluğu veya şüphesi.
5. Neoplaziler
Tanısal ve prognostik bilgi sağlar.
PRENATAL TANI ENDİKASYONLARI 1
1. İleri anne yaşı (en sık)
2. Önceki çocukta kromozom bozukluğu
3. Anne- babada kromozomal translokasyon ya
da diğer yapısal ve sayısal bozukluklar
4. Etiyolojisi bilinmeyen mental retardasyon ve/
veya konjenital malformasyon öyküsü
PRENATAL TANI ENDİKASYONLARI 2
5. Reprodüktif öyküde 2 veya daha fazla spontan
abortus ve ölü doğumlar
6. Ultrasonografik taramada anomali saptanması
7. Yüksek maternal tarama testi
8. Sosyal endikasyon
KROMOZOM ELDESI
Çekirdekli ve bölünebilen hücreler gerekir.
Alınan materyal uygun koşullarda ve steril olarak laboratuvara gönderilmelidir.
* periferik kan lenfositleri
* kemik iliği
(HEPARİNLİ TÜP/ ENJEKTÖR)
* deri fibroblastları (cild biyopsisi)
* solid tümör biyopsisi
* tahliye materyali
* koryon villus biyopsisi
* amniyosit hücreleri
* plevral sıvı
(TAŞIMA MEDYUMU
İÇİNDE)
(STERİL ENJEKTÖRDE)
(STERİL KAP İÇİNDE)
Hücreler uygun besi yerine (medyum) ekilerek kültür hazırlanır.
Fitohemaglutinin, amino asit ve antibiyotik içeren medyum içinde
72 saat 37°C de bekletilir.
68 - 70. saatte kolşisin eklenir.
Hipotonik (tuz çözeltisi – çoğunlukla KCL)
Fiksatif çözeltisi
(1 Asetik asit; 3 Metanol)
Yayma (soğuk ve nemli lam üzerine)
Boyama
Analiz
KROMOZOM BOYAMA (bantlama) YÖNTEMLERİ
Rutin uygulananlar:
• Giemsa Bantlama Yöntemi
• Yüksek rezolusyon bantlama
• Floresan Bantlama Yöntemi
• Revers Bantlama Yöntemi
Özel durumlar için kullanılanlar:
•Sentromerik heterokromatin Bantlama Yöntemi
• Nükleolar Oluşum Bölgesi (NOR) Bantlama Yöntemi
• Kardeş Kromatin Bantlama Yöntemi (SCE)
• DEP testi
Giemsa Tripsin bantlama yöntemi, GTG :
Sitogenetik laboratuvarlarında en sık kullanılan yöntemdir.
Kromozomların elde edilen bant özellikleri hem fonksiyonel
hem de yapısal kompozisyonu yansıtmaktadır.
Koyu bantlar genel olarak DNA ları S evresinin geç dönemlerinde replike olan
bölgeleri gösterir.
Buralar A+T bazlarınca zengindir, içerdikleri aktif gen sayısı azdır.
Sayısal analiz için en az 20 metafaz, yapısal analiz için en az
5 metafaz değerlendirildikten sonra rapor verilebilir.
450 bant gözlenir,
Işık mikroskobu ile 5-10 Mb kadar olan dengesiz yapısal kromozom
bozuklukları saptanabilir.
–A 1-3
–B 4-5
–C 6-12 + X
–D 13-15
–E 16-18
–F 19-20
–G 21-22 +Y
Yüksek rezolusyon bantlama, HRB:
Prometafazda elde edilen kromozomlar incelenir.
Bant sayısı 550-850 arasındadır.
5 Mb lık değişimler saptanabilir.
Floresans bantlama yöntemi
Q bant
Revers bantlama yöntemi
R bant
Toplumda %30 oranında kromozom yapısında, tekrarlayan DNA
miktarına bağlı ışık mikroskopu ile görülebilecek kadar belirgin
farklılıklar bulunabilmektedir.
Bu bölgeler aktif gen içermemektedir.
Buna “heteromorfizm” denmektedir, normal varyant olarak
raporda bildirilir.
1.Y kromozomu uzun kol heterokromatin bölgesi
2.Sentromerik heterokromatin (1, 9, 16)
3.Satellit bölgeleri
4.Frajil bölgeler
Sentromerik heterokromatin bantlama
(C-Band)
N1
16qh+
N16
1qh+
NOR bantlama
Akrosentrik kromozomlardaki polimorfizmlerin gösterilmesinde
kullanılır.
DEB testi
• 24 saatlik rutin lenfosit kültürü
sonrasında DEB (diepoksibütan)
eklenmesi
• 48 saat daha inkübasyon, 72 saat
sonunda standart çıkarım ve Giemsa
boyama sonrasında analiz yapılır.
• 50-100 hücrede kırık sayılır.
• % hesaplanır, hastanın normal kültürü
ve eş zamanlı yapılan pozitif ve negatif
kontrollerle beraber değerlendirilir.
Fankoni Anemisi
Kardeş kromatid bantlama(SCE)
Normal
6-10 E/hc
Bloom Sendromu
>50 E/hc
Kardeş kromozomlar arasındaki parça değişiminin artması,
toksik ajanlara maruz kalınması ile artar!
7 der7
10 der10
t(7;10)(p13;q11.2)
dup(1)(q22q32)
Duplike 1
N1
45,XY,rob(13;14)
MOLEKÜLER SİTOGENETİK YÖNTEMLER
1. İN SİTU HİBRİDİZASYON (FISH)
2. FLOW SİTOMETRİ
3. KARŞILAŞTIRMALI GENOMİK HİBRİDİZASYON(CGH)
4. ARRAY CGH
Nükleik asid probları, komplementer DNA ve RNA ların
hibridizasyon yöntemi ile belirlenmesi için kullanılan
İşaretli dizileridir.
*Radyoizotopik işaretleme
125I, 32P, 35S, 3H
işaretlenip X-ray otoradyografi ile saptanır
*Nonizotopik işaretleme
1.Biyotin veya digogsigeninle işaretlenip uygun antikorlarla
saptanır.
2. Floresan işaretleme
kırmızı, mavi, yeşil, sarı floresans veren florokrom
maddeler kullanılarak floresan mikroskopta incelenir
FISH yönteminin uygulandığı örnekler;
* Fikse edilmiş kromozomlar
* İnterfaz nukleusu üzerindeki çalışmalar
* Uzatılmış tek zincirli DNA molekülleri
* Nukleus ve alt ünitelerinin incelenmesi
* Formalinle fikse edilmiş doku, kan ya da kemik
iliği preparatları (parafin blok kesitleri)
Floresan Insitu hibridizasyon (FISH)
1. Kromozom preperatlarının hazırlanması.
2. Probların hazırlanması (işaretleme).
3. İn situ hibridizasyon
A. Prob denaturasyonu ve hibridizasyon karışımı.
B. Kromozom denaturasyonu.
C. Hibridizasyon.
4. Mikroskobik inceleme.
Floresan işaretli Prob Çeşitleri:
1. Sentromer probları( satellit DNA tekrar dizisi)
2. Tüm kromozoma ait prob
3. LSI (lokus spesifik) prob
4. Telomerik Problar
CEPX yeşil
CEPY turuncu
Sentromer probları(tekrarlayan DNA dizi probları)
- Kromozomu tanımak
- Interfaz nukleuslarında kromozom anöploidilerini
göstermek
TRİZOMİ 13
TRİZOMİ 18
ish22qdel
lokusa spesifik prob (LSI)
 Anöploidi tanısı
LSI 21 (21q22.13-q22.2) (Down Sendromu)
 Mikrodelesyon tanısı
(del 22q11.2, Di George Sendromu)
Tüm kromozoma ait prob (WCP)
-Translokasyonların gösterilmesi
-Marker kromozomların tanımlanması
47,XY,+ mar
47,XY,+idic(15)(q10q10)
FISH Kullanım Alanları :
Klinik sitogenetik
•İnterfaz nukleusunda kromozomal anomaliler
• Yapısal kromozomal anomaliler
• Kromozomal anöploidi taramaları
• Preimplantasyon genetik tanı/ tarama
• Prenatal tanı
• Kanser sitogenetiği
• Mikrodelesyon sendromları
Gen Haritalanması
*hedef genin kromozomal lokalizasyonunun
belirlenmesi
*Gen expresyon incelenmesi
Prenatal Tanı
-Direkt amniyositlerin interfaz nükleuslarının incelenmesi
-Amniyosentez veya CVS materyallerinin doku kültürü
sonrası incelenmesi
Preimplantasyon Tanı
Embriyo biyopsi materyalinin (Blastomer) incelenmesi.
Kanser sitogenetiği
Örn 9. Kromozomun abl geni ile 22. Kromozomun bcr
geni bcr/abl dual color prob ile analiz (Ph kromozomu)
Sitogenetikte avantajları
 Kromozom eldesi olmasa da nukleus
incelenerek kromozomlar hakkında bilgi
edinilebilir.
 Analiz için eski preparatlar, aylar yıllar sonra
kullanılabilir.
 Kısa sürede sonuç verilir, uzun dönem kültür
gerektirmez.
 Mozaikliğin belirlenmesinde kolaylık sağlar.
 Marker kromozomların kaynağı belirlenebilir.
 Kromozomal mikrodelesyon sendromları
belirlenebilir.
dezavantajları
 Sadece incelenen kromozom hakkında bilgi sağlar.
 Hibridizasyon başarısı düşükse değerlendirmek zor.
 Yanlış pozitiflik oranı %10-15
 Prob sayısı kısıtlı, aynı anda 5-6 kromozom sayısal
olarak incelenebilir.
Geliştirilmiş FISH tenikleri
1. Multicolor (M-FISH)
2. Spectral karyotipleme
(SKY FISH)
3. Fiber FISH
4. Primed İn Situ hibridizasyon (PRİNS)
Vaka sunumu
 10 yıllık evli çift kaybettikleri iki çocukta multiple
konjenital anomali nedeniyle yeni gebelik için
risklerini öğrenmek için danışıyor,
 Kadın 29, erkek 30 yaşında, akraba değiller
 Ailede benzer durum yok, pediri analizinde kalıtım
kalıbına uyan veya ailesel geçiş gösterilen bir durum
yok
 İlk çocuk erkek, 3 yaşında ölmüş: Lisensefali
o El ayak deformitesi
o Solunum güçlüğü
o Mental retardasyon
 İkinci çocuk erkek, 1 yaşında ölmüş: Lisensefali
o El ayak deformitesi
o Solunum güçlüğü
öneriler
 Multiple konj anomali nedenini açıklayabilir miyiz?
her iki eşten kromozom analizi
 Dismorfik bozukluklar ve malformasyonlar açısından
bir sendrom ile ilişki kurabilir miyiz?
Sendrom databazlarında tarama(possum, OMIM vb.),
hasta çocukların yapılan testleri ve bulgularının
yeniden değerlendirilmesi için pediatri konsültasyonu
46,XX
450 bant
46, XY
Sonuçların değerlendirilmesi
 Sitogenetik analiz sonucu normal
 Pediatri konsultasyonu ve sendrom taraması, her iki
çocukta da benzer bulgular var, lisensefali ile giden
sendromlar incelenmeli
o Miller dieker sendromu olabilir
o Bu sendrom LIS 1 genini içeren 17p13 del ile birlikte
o FISH ile mikrodelesyon taraması
Sonuç:
Annede sitogenetik olarak saptanamayan 8q ve 17p arasında
gizli resiprokal translokasyon saptandı.
Bu translokasyona bağlı olarak gelişen dengesiz gametlerin
döllenmesi ile oluşan 17p13 delesyonu ve 8q trizomisi
önceki çocuklarda saptanan bulguları açıklıyor.
Sonraki gebelikler için risk mevcut
öneri
 Spontan gebeliklerde Mikrodelesyon sendromuna özgü
prob ile prenatal tanı
 Yardımlı üreme teknikleri ile invitro oluşan
embriyoların Mikrodelesyon sendromuna özgü
prob ile incelenerek dengeli embriyonun seçimi sonrası
gebelik planlanması
Komperatif Genomik Hibridizasyon (CGH)
FISH’ den farklı olarak sağlıklı bireylerin metafaz kromozomları
üzerine normal ve hasta bireyin hücrelerinden hazırlanan DNA
probları kullanılarak hibridizasyon yapılmaktadır.
Bir kaç baz çiftinden 10 Mb’ a kadar DNA parça kayıp
ve /veya kazanımlarını saptayabilir.
Uygulama sonucu elde edilen floresan görüntüleri mikroskopla
değerlendirilemediği için görüntüler uygun kamera sistemi ile
bilgisayarlara aktarılır.
CGH yazılımları ile histogramda normale karşılık hasta hücresinin
DNA kayıp ve /veya kazanımları değerlendirilir. Aynı anda tüm
kromozomları inceleyebilir.
hasta DNA sı
Kontrol DNA
Delesyon
Delesyon, amplifikasyon gibi dengesiz yapısal anormallikleri
saptar. Dengeli yapısal bozuklukları ve mozaikliği saptayamaz.
ARRAY CGH
Klasik CGH den farklı olarak
metafaz plağına değil cam preparat
üzerine yerleştirilmiş DNA parçaları
(oligonükleotitler) ile hibridizasyon yapılır.
Array CGH kullanım alanları
*Kanser sitogenetiği
*MR da subtelomerik delesyonların belirlenmesi
CGH den daha duyarlı (1- 2 Mb)
Aynı anda tüm genom taranır.
Dez avantaj:
Dengeli yapısal kromozom bozukluklarını saptayamaz
Düşük oranlı mozaikliği saptayamaz
Pahalı
MOLEKÜLER GENETİK
DNA ve RNA molekülünün temel yapısı üzerindeki
değişikliklerle veya bu yapının kendisiyle ilgilenir.




Tek gen hastalıkları
Mitokondriyel hastalıklar
Üçlü Baz Tekrar hastalıkları
Genomik yapıya ait polimorfizmler (SNP,VNTR,CNV)
Metilasyon profilleri
İfadelenme analizleri
MOLEKÜLER GENETİK YÖNTEMLER
DNA
(Gen mutasyonları ve polimorfizmleri)
Hibridizasyona dayalı yöntemler
SOUTHERN BLOTLAMA
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
MUTASYON ANALİZLERİ
Mikrodizilim (DNA çip)
RNA
(Transkripsiyon izleme yöntemleri)
Hibridizasyona dayalı yöntemler
NORTHERN BLOT
IN-SİTU HBİRİDİZASYON YÖNTEMİ
“Reverse Transkriptaz” RT-PCR
Mikroçip
Genomik DNA,
çekirdekli hücreler içeren herhangi bir insan doku örneğinden ya da
10ml kadar venöz kandaki lenfositlerden kolayca elde edilebilir.
Ayrıca postmortem doku parçaları steril kuru bir tüpe alınarak sıvı
azot içersinde aniden dondurulur ve DNA elde etmek üzere -80C
de saklanabilir.
Blastomer, saç teli, sperm gibi tek hücrelerden, veya kurumuş kan
örneği gibi az miktarda hücreden de DNA eldesi mümkündür.
DNA eldesi için alınan kan ve ki örnekleri EDTA lı tüpe konularak
Laboratuvara iletilmelidir.
Elde edilen DNA miktarının belirlenmesi için
spektrofotometre veya jel elektroforez kullanılabilir.
Böylece DNA eldesinin başarılı olup olmadığı ve
DNA kalitesi belirlenir.
260nm / 280nm : 1.8- 2.0 ise DNA da protein
kontaminasyonu yoktur ve miktar olarak yeterlidir.
RESTRİKSİYON ENDONÜKLEAZLAR
Bakteriden elde edilen bu enzimler, DNA yı 4-6 baz
uzunluğunda özgül nükleotid dizilerinden tanıma ve kesme
yeteneğine sahiptir.
Bu enzimlerinin bulunması ile DNA dizi analizleri
yapılabilmiştir.
Enzimle kesim sonrasında elde edilen DNA parçalarına
restriksiyon parçaları adı verilmektedir.
Aynı DNA molekülü, belirli bir enzim kullanılarak kesildiğinde
her zaman aynı büyüklükte restriksiyon parçaları elde edilir.
Kesilen DNA parçalarının büyüklükleri birbirinden farklı
olduğu için agaroz jel elektroforezi kullanılarak birbirlerinden
ayırt edilmeleri mümkün olabilmektedir.
Southern Blot
•Genomik DNA nın bir veya daha fazla restriksiyon enzimi ile
kesimi
•Agaroz jel elektroforezi ile büyüklüklerine göre ayrımı
• DNA’nın nitro sellüloz membrana aktarılması,
•işaretli(radyoaktif maddelerle) probla ibridizasyonu,
•membranın yüksek ısıda kurutulması ve DNA bantlarının
immobilizasyonu
•en son aşamada otoradyografi ile görüntüleme şeklindedir.
DNA parçaları arasında büyüklük farkı nedenleri;
•
50-100 baz çiftlik insersiyon veya delesyon benzeri
herhangi bir genomik yeniden düzenlenme
•
Restriksiyon kesim noktasında oluşabilecek tek bir baz
değişimi sonucunda kesim noktasının ortadan kalkması
•
Mutasyonla yeni bir kesim noktası oluşumu
Tanı:
Elektroforezle elde edilen bantlar, normalleriyle
karşılaştırılarak mutasyonlar saptanır.
K
tK
K
K
H
E
H/E N/E K
K
Southern Blot ile FMR1 promotör bölgesindeki
CpG artışının metilasyon analizi ile gösterilmesi.
Normal DNA EcoR1 enzimi ile kesilirken,
Metile DNA Bst Z1 enzimi ile kesilir.
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); 1985 Kary Mullis
DNA replikasyonu in-vitro koşullarda yapılır
DNA çift zinciri yüksek ısı (95 C) ile birbirinden ayrılır
(denaturasyon),
sentetik oligonükleotidler hedef DNA’ya bağlanır 55-60C
(hibridizasyon)
ve zincir uzar (polimerizasyon, çift iplikli DNA sentezi)
72-76 C
Denaturasyon, hibridizasyon ve DNA sentezi
bir siklusu oluşturur.
PCR REAKSİYONU
1. DNA örneği, genellikle genomik DNA(25-50ng)
2. Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen
bir çift sentetik primer
3. dNTP’ler (dinükleotid trifosfatlar; A,T,G,C)
4. Isıya dayanıklı DNA – polimeraz enzimi
5. Uygun pH ve iyon koşulları(Mg+2) sağlayan tampon
karışımı
PCR KULLANIM ALANLARI
1. Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcı ve hastanın tanısı
2. Restriksiyon parçalarının uzunluk polimorfizmi
3. Prenatal /Preimplantasyon(PGD) genetik tanı
4. Adli tıp (DNA parmak izi)
5. Onkogenezis
6. Prob sentezi, klonlama ve gen ekspresyonu
7. DNA dizi analizi
PCR
 Genin varlığını ya da yokluğunu gösterebilir
 Nokta mutasyonları, üçlü tekrar artışlarını tanır
 Gen delesyon veya insersiyonlarını tanır
 Gen ifadelenmesi incelenebilir
 Gen dozajını belirleyebilir (real time PCR)
 Bilinen mutasyonların tanısında kullanılabilir
Aynı anda birden fazla gen incelenmesi için geliştirilmiş
teknikler gereklidir.
 MLPA
 Quantitative Fluorescent PCR (QF PCR)
 Real Time PCR (RT PCR)
m
h
+k
h
hh
+k
-k
m
PCR ile çoğaltılan GAA tekrarlarının %1.5 agaroz jelde yürütülmesi sonucu analizi.
Quantitative Fluorescent PCR ( Q-F PCR)
13, 18, 21, X ve Y kromozomları üzerindeki mikrosatellit
(değişken sayıda tandem tekrarlayan dinükleotidler, AC-GT gibi)
kullanılarak allel dozajı belirlenir.
Yapısal anormallikleri gösteremez
Düşük oranlı mozaikliği gösteremez
Tarama için kullanılır, kısa sürede ön bilgi verir.
DNA Parmak izi
Adli Tıp uygulamaları, kriminal/ babalık testi
Değişken büyüklükte tekrarlayan DNA dizileri
Minisatellitler, kullanılır
(10-15
bç),
DNA dizi analizi
1970, Fred Sanger
Moleküler tanıda altın standart
Dideoksinukleotidler kullanılır.
Otomatik DNA dizi analizi,
Nukleotidler Floresan boyalarla boyanarak
Sonuçları bilgisayarda analiz edilir.
Genin içerdiği tüm mutasyonlar taranabilir.
Sadece dizisi bilinen genleri tarayabilir.
DNA mikrodizilim “Mikroarray”
Hem normal hem de bilinen ya da olması muhtemel tek
nükleotid değişikliklerini içeren 20-25bç lik oligonükleotidler
bir çip üzerine yerleştirilmiştir.
PCR ile çoğaltılan DNA, mutasyon analizi için Floresan boyalarla
işaretlenerek, mikroarray deki oligonükleotidlerle hibridize
edilir.
Sonuçlar bilgisayar programı ile analiz edilir.
“Mikrodizilim” teknolojisinin uygulama
alanları
•
•
•
•
•
•
Adli Tıp
İnsan genom araştırmaları
Kişisel tıp
Dizi analizi
Tek nükleotid polimorfizmi (SNPs)
Sitogenetik
RNA ELDESİ
Bir genin varlığını bilmek, onun fonksiyonel olduğunu göstermez
fonsiyonu göstermek için transkripsiyonu incelenmelidir.
DNA
mRNA
cDNA
Taze doku örnekleri
Arşiv materyali (parafin blok)
Northen Blotlama
İlgilenilen dokudan elde edilen mRNA lar kalıp olarak
kullanılmaktadır.
*mRNA agaroz jelde yürütülür
*filtreye aktarılır
*işaretli prob ile hibridize edillir
*İlgilenilen dokuda hedef genin ifadelenip İfadelenmediği,
*İfadelenme düzeyleri
*Hedef gende olan/olması muhtemel mutasyonlar sonucunda
oluşan mRNA daki büyüklük farklılıkları
Reverse Transkriptaz-PCR
RNA
cDNA
PCR
RNA eldesi için taze dokudan en kısa zamanda çalışma gerekli!
MİKROÇİP
Cam veya naylon yüzeyler üzerine kısa ve RNA sentezinde
hücrenin kullandığı hedef diziler dizilidir.
İncelenecek örnekten mRNA elde edilir ve RT ile cDNA’ya
çevrilir, radyoaktif veya floresan molekül ile işaretlenir.
Örnekler çip ile hibridize edilir.
Bağlantı analizi
Bilinmeyen gen ya da mutasyon varlığında kullanılır.
Rekombinant DNA teknolojisi ve hücresel klonlama
DNA- cDNA kütüphanelerinin hazırlanması, prob hazırlama
Genetik haritaların oluşturulması
Doğru bilgi
Doğru yöntem
Uygun danışmanlık
KAYNAKLAR: