tüberküloz tanısında pcr

21. Yüzyılda Tüberküloz Sempozyumu ve II. Tüberküloz Laboratuvar Tanı Yöntemleri Kursu, Samsun
TÜBERKÜLOZ TANISINDA PCR
Doç. Dr. Cafer EROĞLU
Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi
Klinik Mikrobiyoloji ve İnfeksiyon Hastalıkları Anabilim Dalı, Samsun
Moleküler
biyolojik
çalışmaların
temeli
başlandığı
için
kültürde
üretilemeyen
Watson ve Crick’in 1953 yılında DNA
mikroorganizmaların saptanmasıdır.
molekül
tanımlamalarına
Mycobacterium’lar tarih boyunca olduğu
dayanmaktadır. DNA yapısı tanımlandıktan
gibi günümüzde de salgınlara yol açmakta,
sonra İlerlemeler baş döndürücü bir hızla
yeni epidemiyolojik tipler veya ilaçlara
gelişmiştir. Ters
dirençli
mikroorganizmalar
complementary DNA yapımı) enzimlerinin
karşımıza
çıkmaktadır.
tanımlanması,
kontrolü
yapısını
transkriptaz (RNA’dan
restriksiyon
endonükleaz
için
erken
olarak
Tüberkülozun
teşhis
esastır.
enzimlerinin keşfi, klonlama teknolojisinin
Günümüzde tüberküloz tanısında en kolay
gelişmesi, DNA dizi analizinin başarılması,
ve hızlı metot aside dirençli basillerin Erlich
DNA
Ziehl
probları
Reaction
ve
(PCR)
Polymerase
gibi
Neelsen
geliştirilmesi
ve yayma mikroskopisi için ml’de 500010000
konmuştur
edilmemiş
bakteri
gerekmektedir.
hastalarda
yapılan
Tedavi
çeşitli
özellikle
diğer
farklı
olarak
çalışmalarda tüberküloz hastalarının % 50-
taşıdığı potansiyel nedeniyle daha yaygın
80’inde yayma pozitifliği gösterilebilmiştir
kullanım alanı bularak hemen hemen her
(2).
moleküler laboratuara girmiştir.
kültürdür. Kültür balgam, bronş lavajından
Moleküler yöntemler, özellikle mikroskopi
başka beyin omurilik sıvısı ve idrar gibi
ile görülmesi, kültürde üretilmesi uzun
solunum
zaman
olanaksız
rahatlıkla kullanılabilmektedir. Kültür aynı
saptanmasında
şekilde yaklaşık yaymadan 500 kez daha
önemli rol oynamaktadır. Bu yöntemlerin
duyarlıdır ve duyarlılık saptanması gibi
tanı amacıyla bir başka kullanım alanı,
daha ileri araştırmalar için bakteriyi de
hastaneye
sağlar. Mikroskopi ve kültür gibi klasik tanı
moleküler
PCR
boyasıyla
gösterilmesidir. Bununla beraber boyama
hızlı bir şekilde bir biri ardına ortaya
(1).
(EZN)
asit
nükleik
amplifikasyon tekniklerinin
Chain
yöntemlerden
alan,
zor
mikroorganizmaların
gelmeden
veya
önce
tedavi
Günümüzde
yöntemleri
sistemi
hala
dışı
altın
standart
örneklerde
mycobacterium’lara
de
bağlı
Cafer Eroğlu
infeksiyonların tanısında önemini eskisi gibi
Ortama konmuş ve sadece çoğaltılmak
korumakla
zaman
istenen DNA bölgesine özgül iki primer,
etkenlerin
sıcaklığın (50-70°C' ye) düşürülmesiyle, ilk
tanımlanmasında yetersiz kalabilmektedir.
basamakta ayrılmış olan kalıp DNA’nın
Moleküler yöntemler oldukça hızlı olmaları
özgül
ve
genişliği
Üçüncü basamak primerlerin uzamasıdır
nedeniyle mycobacterium infeksiyonlarının
(sentez = extension). Ortama konmuş ve
tanısında
optimum sentez sıcaklığı 72-74 °C olan
birlikte
almakta
daha
ve
uzun
yeni
tanımlama
aralıklarının
da
yaygın
kullanım
alanı
oldukları
bölgelerine
bağlanırlar.
Thermus aquaticus (Taq) polimerazı (ya da
bulmuştur (3).
Mycobacterium
tanısında
infeksiyonlarının
kullanılan
moleküler
ısıya dayanıklı başka polimerazlar) bu
ısıda hedef DNA’ya yapışmış primerlerin 3’
yöntemlerin amacı, şu ana başlıklar
ucundan
altında toplanabilir:
bölgesinin sentezini yapar. Bu üç basamak
1.
Mycobacterium’ların klinik örneklerde
3.
oluşturur
DNA
ve
her
veya
özgül DNA parçası çoğaltılarak iki katına
kültürde üretilen bakterilerin türlerinin
çıkarılmış olur. Yeni sentezlenen DNA da
saptanması veya tiplendirilmesi.
bir sonraki döngüde kalıp olarak kullanılır
Klinik
örneklerde
bulunan
Mycobacterium’ların
ilaçlara
karşı
antimikrobiyal
dirençli
olup
Moleküler epidemiyolojik araştırmalar
ile
Mycobacterium
ve bu DNA parçaları geometrik olarak
artar. Teoride özgül DNA parçası; siklus
sayısı (n) ve başlangıçtaki hedef sayısına
olmadıklarının araştırılması.
4.
döngüyü
istenen
tekrarlanışında iki primer arasında kalan
varlığının saptanması.
2.
bir
başlayarak
infeksiyonlarının
kaynağının ortaya çıkartılması.
n
(t) bağlı olarak yaklaşık tx2
sayısına
ulaşır. Hedef sayısı, enzim, dNTP, primer
konsantrasyonu
birikmesi
gibi
ve
çoğaltılan
nedenlerle
bölgenin
ürün
miktarı
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
formüldeki sayıya ulaşmaz. Fakat yinede
(Polymerase Chain Reaction, PCR)
milyonlarca kopyalık çok yüksek yoğunluğa
ulaşan hedef DNA molekülünün PCR
PCR ilk defa Kary Mullis tarafından 1985
sonrası agaroz jel elektroforezi gibi bir
yılında tanımlanmıştır (1). Bu yöntemde
yöntemle gösterilmesi oldukça kolaydır
çoğaltılması (replikasyon) istenen DNA
(4,5).
örneği,
replikasyon
için
gereken
maddelerle birlikte bir tüpe konarak, üç
PCR’ın ticari olarak ilk defa Roche firması
değişik ısıda bir döngü (siklus) içerisinde
tarafından kullanılmıştır. Roche firmasının
tutulur.
Amplicor sisteminde tüberküloz tanısıda
İlk
basamak
denatürasyonudur.
94-95
DNA’nın
°C'ye
ısıtılan
mümkündür.
DNA' nın iki zinciri birbirinden ayrılır
(denatürasyon).
bağlanmadır
312
İkinci
(yapışma
basamak
=
annealing).
PCR’ın
farklı
firmalar
tarafından
kullanılmasının ve geliştirilmesinin lisans ile
Tüberküloz Tanısında PCR
sınırlanması
nedeniyle
diğer
firmalar
laboratuarında
karşılaşılan
sorunlar
tarafından alternatif amplifikasyon teknikleri
aşılamamıştır. Daha güvenilir, standart,
geliştirilmiştir.
uygulaması kolay, az emek ve maliyet
gerektiren
Transcription mediated amplification (TMA)
retroviral
replikasyona
benzer
tekniklere
şekilde
En
TMA izotermaldir ve thermal cycler cihazı
Sıralanmıştır.
Bu
metot
uygulamada
büyük ihtiyaç vardır (1,3).
PCR’dan farklı olarak RNA’yı hedef alır.
gerektirmez.
rutin
sık
karşılaşılan
Sorunlar
Aşağıda
tüberküloz
teşhisinde kullanılmak üzere Gen-Probe
1. Yalancı pozitif ve negatiflik
firmasında mevcuttur.
2. Deneyimli personel ve hassas çalışma
Strand displacement amplification (SDA)
gerektirme
amplikonun
3. Uzun süre ve iş yoğunluğu
tek
zincirli
kopyalarının
çoğaltılmasına dayanır ve izotermaldir. Bu
4. Özel laboratuar alt yapısı ve ekipman
metotu kullanan sistem Backton-Dickenson
gerektirme
firması tarafından sağlanabilir.
5. Sonuçların deneyimli kişiler tarafından
yorumlanması
Ligase chain reaction (LCR) Abbott firması
6. Standardizasyon gerekliliği
tarafından
7. Maliyet
geliştirilmiştir.
LCR
PCR’ye
benzer şekilde sikluslar kullanır. LCR hedef
DNA’ya özgü probların birleştirilebilmesi
Bu
sorunların
çözümü
veya
en
aza
için termostabil ligaz enzimini kullanır. Bu
indirilebilmesi için örnek alımından PCR’nin
işlemin sikluslar şeklinde tekrarlanmasıyla
son aşamasına kadar bir dizi uyarı ve
her siklusta yeni hedef DNA’lar elde
önlemlere sıkı bir şekilde uyulmalıdır.
edilmiş olur.
Örnek Alma, Taşıma ve İşleme
PCR için vücut sıvı (serum, vb.) ve
PCR ve bu yeni amplifikasyon tekniklerinin
sekresyonları veya dokular gibi her türlü
rutin uygulamalardaki değeri (teşhis için
materyal
gereken
hemoglobin ve heparin gibi inhibitörlerden
sürenin
kısalması)
bir
çok
çalışmada gösterilmiştir (6,8)
bir
örnek
olabilir.
Fakat
mümkün olduğu kadar kaçınılmalıdır. PCR
için en uygun örnekler; etkenin yoğun
PCR Uygulamasında Karşılaşılan Sorunlar
PCR’deki sorunların ana nedeni testin
yüksek duyarlılığı; ideal şartlarda bir tek
genomu (bakteri veya virüs,...vb.) dahi
tespit
edebilmesine
dayanmaktadır.
Hassas çalışma metotları ile dahi PCR
bulunduğu, elde edilmesi kolay, en az
kompleks
ve
yeterli
edilebilen
örneklerdir.
miktarda
Örnek
elde
usulüne
uygun olarak alındıktan sonra; uygun örnek
kabına (mümkünse RNAse ve DNAse
bulunmayan)
konularak
taşınmalı
ve
saklanmalıdır. Bazı örneklere gerekirse
313
Cafer Eroğlu
dekontaminasyon
ve
homojenizasyon
(alkali lizis metodu) özgüllüğü ve DNA
kalitesini azaltabilir. Kullanılan malzemeler
işlemleri uygulanabilir.
(pipet, nükleaz bulunmayan tüp ve filtreli
uç) kaliteli olmalıdır. Primer, prob ve
Nükleik Asitlerin İzolasyonu
nükleotitler
mümkünse
High
Pressure
Liquid Chromatography ile pürifiye edilmiş
Bir örneğin PCR işleminde kullanılabilmesi
olmalıdır. Kaliteli enzimler (taq polimeraz)
için DNA veya RNA’nın izole edilmesi yani
mümkünse oda ısısında inaktif olan ve
diğer maddelerden ayrılarak saflaştırılması
ısıtıldığında
(pürifikasyon) gerekir. Bu işlemde izole
polimerazlar kullanılmalıdır.
aktifleşen
modifiye
taq
edilecek hedefe (DNA veya RNA) uygun
metot
kullanılmalıdır.
Hedef
RNA
ise
Alet ve Alt Yapı
RNase inhibitörü ve RNase bulunmayan
su,
tamponlar
kullanılmalıdır.
ve
Bu
sarf
malzemeleri
aşamada
örnekten
(idrar, balgam ve hemoglobin,.. vb.) veya
metottan kaynaklanan inhibitörler (fenol,
SDS) elimine edilmelidir. Basit, etkili, hızlı
ve güvenilir metotlar tercih edilmelidir.
Yüksek ısı (kaynatma metodu) veya pH
PCR
uygulaması
mümkünse
fiziksel
yapılacak
olarak
alan
birbirinden
ayrılmış dört odaya ayrılmalıdır. 1. Reajant
hazırlama odası, 2. Ekstraksiyon odası, 3.
Nestet
PCR
yapılacaksa
2.
PCR’nin
pipetajının yapılacağı oda ve 4. Kirli oda
(agaroz
jel
elektroforezinin
Mg+
yapılacağı oda). Eğer imkanlar yetersiz
konsantrasyonları,
ise 3 oda da yeterli olabilir. Termal
polimeraz miktarı, uygulanacak siklus
Cycler; hızlı, kapaktan da ısıtmalı, elektrik
sayısı, denatürasyon, bağlanma, sentez
kesildiğinde
tekrar
süre ve sıcaklıkları belirlenmeli ve testin
başlayabilen, 0.2 ml ve 0.5 ml’lik blokları
duyarlılık alt sınırı kopya sayısı bilinen
değiştirilebilen aletler tercih edilmelidir.
standart
Reaktifler, diğer tampon sıvıları ve PCR
saptanmalıdır.
kaldığı
siklustan
karışımı
mümkünse
klas
kabinde
hazırlanmalıdır.
I
edilir.
Kabin
Örneklerden
yoksa
taq
kullanılarak
laminer
DNA izole edilirken klas II laminer kabin
tercih
örnekler
miktarı,
Görüntüleme Aşamasında Karşılaşılan
Sorunlar
hava
sirkülasyonu olmayan sadece bir yüzü
Agaroz jelde bant görülmemesi; etidyum
açık camekanlı bölmeler kullanılabilir.
bromid katılmamasına, UV lambasının
zayıflığına
Optimizasyon
veya
spesifik
ürünün
yokluğuna bağlı olabilir. Bu nedenle her
PCR uygulamasında sistemin çalıştığının
In house (ev yapımı) PCR yapıldığında;
gösterilmesi için mutlaka pozitif kontrol
izole edilen hedef DNA miktarı, primer
bulunmalıdır.
314
Cafer Eroğlu
Bantlar bozuk ise ürün fazlalığı
olabilir, agaroz jel iyi dökülmemiştir
Sorunlara Çözüm Olabilecek Yeni
veya elektrik şiddeti fazla
Teknikler
uygulanmıştır.
Bantlar zayıf görülüyor ise; ürün veya
PCR da yaşanan sorunların çözümü için
etidyum bromid azdır, elektrik şiddeti
Real-Time PCR teknikleri bir alternatif
fazladır.
olabilir. Yeni teknikler kapalı tüp veya
Fazla sayıda bant veya semear oluşumu;
kapiller
PCR optimize değil, agaroz jel ve elektrik
şiddeti uygun değil.
sistemi
içerdikleri
için
carry
over
kontaminasyon problemi en aza inmiştir.
System’inde
ve
Icycler’da
Taqman
teknolojisi kullanılabilmektedir (9).
Bazılarında Real-Time (her an izlenebilen)
olarak PCR ürününün artışı izlenebilir. Bu
Restriction Fragment Length
sistemlerde aynı anda kalitatif ve kantitatif
Polymorphism (RFLP)
değer elde edilebilmektedir. Ayrıca bu
sistemler
özel
mutasyonların
prob
dizaynı
belirlenmesi
ile
içinde
Restriksiyon
moleküler
enzimlerinin
metotların
(RE)
keşfi
gelişimini dahada
DNA
hızlandırmıştır. RE’leri çift zincirli DNA
izolasyonu dahil PCR 90-180 dakikada
dizisini belli nükleotit dizelerinden (ör.
tamamlanabilmektedir.
ATGC gibi) tanıyan ve kesen enzimlerdir.
kullanılabilir.
Sistemine
göre
Alet
maliyet
katılmazsa test maliyeti klasik PCR ile
RE’leri
aynıdır. Ayrıca yeni sistemler daha az
DNA’laradn
flouresan boya kullandıkları için çevreyi
enzimlerdir.
daha az kirletmektedirler. Yeni sistemlerin
tanımlayan Aber W, Smith H ve Nathans D
dezavantajı ise çoğunlukla cihaz ve sarf
nobel ödülü kazanmışlardır. Günümüzde
malzemesi bağımlı olmaları ve henüz tam
yaklaşık
standardize edilememeleridir. Real-Time
sınıflandırılmıştır. Sınıflandırmada ilk üç
PCR
olanlar;
harf enzimin kaynağı olan bakteriyi ve
Detection
rakamda tanımlandıkça 1, 2 ve 3 gibi
tekniklerinden
Perkin
Elmer’ın
System
(5700,
ülkemizde
Sequence
bakterilerin
kendilerini
korumasını
1978
1200
yılında
RE
yabancı
sağlayan
RE’lerini
tanımlanmış
ilk
ve
Roche
numarayı ifade eder. Örneğin PvuI enzimi
Diagnostics’in Lightcycler sistemi, Biorad’ın
Proteus vulgaris’ten elde edilen ilk RE’ni
Icycler sistemidir. Bu sistemlerin hepsinde
ifade eder. RE’lerinin DNA analizinde
bir flouresan boya olan SYBR Green I’in
kullanılması ile ayrım gücü oldukça yüksek
nükleik asitlere bağlanmasına dayanan
bir teknik olan RFLP yöntemi geliştirilmiştir.
SYBR
kullanılabilir.
Bu yöntemin temeli tüm kromozomal DNA
SYBR Green’e ek olarak Lightcycler’da
veya PCR sonrası elde edilen DNA’nın
flouresans
RE’leri ile kesilerek
Gren
I
7000,
7700)’i,
teknolojisi
rezonans
energy
transfer
(FRET) teknolojisi, Sequence Detection
agaroz
jelde
DNA parçalarının
büyüklüklerine
göre
2
Cafer Eroğlu
ile
üzerinde tutulmalıdır. Her enzimin optimum
boyanarak değerlendirilmesine dayanır. Bu
tamponu üretici firma tarafından enzimle
yöntem oldukça spesifiktir ve komple DNA
birlikte verilmektedir. PCR ürünü, enzim ve
analizlerine alternatif olabilir (3). Genomik
tamponu
DNA’nın RE’leri ile kesilmesinde oldukça
karıştırıldıktan
uzun ve değerlendirmesi zor olan bu
sıcaklıkta belirli bir süre (enzime göre
yöntem
değişir) tutulmalıdır. Sonra ise kesilen ürün
ayrıldıktan
sonra
PCR
etidyum
sonrası
bromid
uygulamalarda
enzime
uygulanabilir (10). Bu yöntemin avantajı
RFLP tekniği insan genetik çalışmaları
çok az DNA ile çalışılması, kısa sürede
(allelerin ayrımı vb.) başta olamk üzere
sonuç
madde
birçok genetik çalışmada kullanılmakta ve
kullanılmamasıdır. Yöntemin dezavantajları
her geçen gün yeni Re’leri keşfedilmektedir
ise
(3).
genomda
ve
radyoaktif
ortaya
kesim
çıkan
doğal
bölgelerinin
değiştirebilmesi ve bazen kısmi kesimlerin
olmasıdır. RE’leri genellikle 10 ünite/ml
konsantrasyonunda ve % 50 gliserollü
tamponda – 20
o
C’de tutulur. Enzimler
oldukça pahalı olduğu için steril ortamlarda
çalışılmalı ve enzimle çalışılırken buz
yürütülebilir.
uygun
agaroz
vermesi
jelde
sonra
konsantrasyonda
nispeten daha kolay ve kısa sürede
mutasyonların
2
uygun
Günümüzde