Toxoplasma gondii tayinine yönelik voltametrik DNA biyosensörü

Toxoplasma gondii tayinine yönelik voltametrik DNA biyosensörü
Proje yürütücüleri:
* Doç. Dr.Gültekin Gökçe ([email protected])
**Prof. Dr. Arzum Erdem Gürsan ([email protected], [email protected])
Proje Ekibi:
Gültekin Gökçe a,b*, Arzum Erdem Gürsanb** , Çağdaş Ceylana ve Müslüm Akgözc
b
a Cumhuriyet Universitesi, Eğitim Fakültesi, İlköğretim Bölümü, 58140 Sivas
Ege Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Analitik Kimya Anabilim Dalı, Bornova, 35100, İzmir
c TUBITAK Ulusal Metroloji Enstitusu, Bioanalysis Laboratory, Gebze, 41470 Kocaeli
ÖZET
Toxoplasma gondii (T. gondii) bir parazittir. Çiğ ya da az pişmiş kırmızı et ve işlenmiş ürünlerinden, hayvan dışkısı ile kirlenmiş ve iyi yıkanmamış yeşilliklerden insanlara kolaylıkla bulaşabilir;
sonrasında beyinde görülen hasarın yanısıra, şiddetli baş ağrısı, görme bozukluğu ve sinir sistemi rahatsızlıklarına sebep olur. Çalışmada, T. gondii tayinine yönelik tek kullanımlık DNA
biyosensörünün geliştirilmesi hedeflenmiştir. Hibridizasyon öncesi ve sonrasında guanin yükseltgenme sinyali Diferansiyel Puls Voltametri (DPV) tekniği ile ölçülerek DNA hibridizasyonu tayin
edilmiştir. Optimum deneysel koşullarda geliştirilen biyosensörün seçimliliği diğer DNA dizilerine karşı test edilmiş; ayrıca T. gondii'nin PCR amplikonlarında tayini başarılı ve seçimli bir şekilde
gerçekleştirilmiştir.
Voltammetric DNA biosensor for Toxoplasma gondii
ABSTRACT
Toxoplasma gondii (T. gondii) is a parasit that could contaminate to human by raw or undercooked meat, and unwashed greens; then it causes brain damage as well as severe headaches, vision
defect etc. In this study, it is aimed to develop a disposable DNA biosensor for detection of T. gondii. The DNA hybridization was detected before and after hybridization by measuring the
guanine oxidation signal in combination with differential pulse voltammetry (DPV). Under the optimum experimental conditions, the selectivity of this biosensor was tested against to other DNA
sequences. The DNA detection on T. gondii was also performed in a good selectivity successfuly in PCR amplicons.
1. GİRİŞ
Şekil 3. Toxoplasma gondii tayinine yönelik voltametrik DNA biyosensörü ile ölçüme yönelik deneysel şema
Şekil 1. Toxoplasma gondii’nin yaşam döngüsü [1]
T. gondii, insanların da içinde bulunduğu hemen hemen tüm memeliler ve kanatlılarda
yerleşen zoonotik bir parazittir. İnsanın en duyarlı olduğu yaş fetus dönemidir.
Günümüzde AIDS, organ transplantasyonları ve bağışıklık sistemini baskılayan ilaçların
kullanılması T. gondii’nin daha ağır bir enfeksiyon şeklinde karşımıza çıkmasına yol
açmış ve önemini artırmıştır. T. gondii takiozitleri (trofozoit), yay biçiminde, zorunlu
hücre içi parazitidir. Ana konağı kedigiller, ara konağı ise başta insan olmak çeşitli
canlılardır. Ookistler yalnızca kedi dışkısında bulunurken, takizoit ve bradizoitler son
konak kedi de dahil, T.gondii ile enfekte olabilen bütün canlılarda görülür.
Şekil 4. Farklı prob immobilizasyon sürelerinde ölçülen guanin
yükseltgenme sinyalleri[(A):Voltamogramlar;(B): Histogramlar]
Şekil 5. T. gondii’ye spesifik
hedef DNA’nın farklı
derişimlerinnde gerçekleşen DNA hibridizasyonunda
ölçülen
guanin
yükseltgenme
sinyalleri
[(A):
Voltamogramlar; (B): Histogramlar; a: kontrol sinyali]
● Doku kisti içeren hayvan etlerinin çiğ veya az pişmiş tüketilmesi ile,
● Enfekte kedilerin dışkısı ile atılan ve toprakta olgunlaşan ookistlerin bulaştığı
yiyecek ve içeceklerin ağız yoluyla alınması ile,
● Akut toxoplazmozun parazitemi döneminde tüm vücut salgıları ile,
● Kan ve doku nakilleri ile bulaşma görülebilir [2].
☞ Düşük veya ölü doğum,
☞ Körlüğe kadar ilerleyebilen korioretinit,
☞ Serebral kalsifikasyonlar,
☞ Hidrosefali veya mikrosefali,
☞ Zeka geriliği,
☞Konvulsiyonlar,
☞ Hepatosplenomegali, karaciğer yetmezliği
toxoplasmosiste görülebilen bulgulardır [3].
Şekil 2. Toxoplasma gondii’nin bulaşma yolları [3]
Toksoplazmoz teşhisine yönelik olarak geliştirilen bazı PCR teknikleri de mevcuttur. Bu
tekniklerde amniyotik sıvı [4], kan [5] serebrospinal sıvı [6] ve doku biyopsisi [7] gibi
klinik türler kullanılmıştır. Söz konusu PCR teknikleri içinde en hassas olanı yuvalanmış
(nested) PCR kullanılarak PCR ürünlerinin hibridizasyonunun yapıldığı yöntemdir. Ancak,
deneylerin uzun zaman alması ve kantitatif veriler elde edilememesi gibi dezavantajları
da vardır.
Çalışmamızda [8], T. gondii tayinine yönelik tek kullanımlık DNA biyosensörü
geliştirilmiştir. Hibridizasyon öncesi ve sonrasında guanin yükseltgenme sinyali
Diferansiyel Puls Voltametri (DPV) tekniği ile +1,00 V’da ölçülerek DNA hibridizasyonu
tayin edilmiştir. Optimum deneysel koşullarda geliştirilen biyosensörün seçimliliği diğer
DNA dizilerine karşı test edilmiş; ayrıca T. gondii'nin PCR amplikonlarında tayini
başarılı ve seçimli bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Elektrokimyasal DNA biyosensörü ile
elde edilen sonuçlar, PCR yöntemi ile tayin edilmiş sonuçlarla karşılaştırıldığında daha
az maliyetli bir yöntemle, daha kısa sürede daha güvenilir sonuçlar elde edildiği
saptanmıştır.
2. DENEYSEL BÖLÜM ve BULGULAR
Çalışmada, T. gondii’ye spesifik
hedef DNA’daki guanin
bazlarına spesifik
yükseltgenme sinyalleri, AUTOLAB PGSTAT 302N potansiyostat sisteminde DPV
tekniği ile ölçüldü (şekil 3). Elektrokimyasal ölçümler, voltametrik hücrede asetat
tampon çözeltisinde (pH=4,8), üçlü elektrot sistemi ile [çalışma elektrodu: aktive
edilmiş kalem gafit elektrot (PGE), referans elektrot: Ag/AgCl/ 3M KCl, karşı
elektrot: Pt tel) ile 50 mV/s tarama hızında yapıldı. Optimizasyon ve seçimlilik
çalışmalarında sentetik DNA dizileri kullanıldı.
Şekil 6. T. gondii'ye spesifik tek sarmal DNA dizisi (prob)
immobilize edilmiş PGE yüzeyinde sentetik hedef dizileriyle
hibridizasyon sonrası elde edilen guanin yükseltgenme
sinyalleri [ H (Hibrid): hedef dizi; MM (Mismatch): hedef
diziden bir bazı farklı olan dizi; NC (Non-complementary):
sırası hedef diziden tamamen farklı olan dizi; Prop:
Hibridizasyon öncesi kontrol ölçümü; prob ve hedef dizi
derişimleri sırasıyla, 24 ve 40 µg/mL]
Şekil 7. T. gondii'ye spesifik tek sarmal DNA dizisi
(prob) immobilize edilmiş PGE yüzeyinde PCR dizilerinin
10 dakikalık hibridizasyonu sonrası elde edilen guanin
yükseltgenme sinyalleri [(a): termal olarak denatüre
edilmiş T. gondii PCR amplikonu; (b) PCR kontrol çözeltisi
(c) hedef dizi içermeyen kontrol çözeltisi]
3. SONUÇLAR
☞
Toksoplazmoz teşhisine yönelik geliştirilen bazı PCR teknikleri de mevcuttur; söz konusu PCR teknikleri
içinde en hassas olanı yuvalanmış (nested) PCR kullanılarak PCR ürünlerinin hibridizasyonunun yapıldığı
yöntemdir. Ancak, deneylerin uzun zaman alması ve beklenen hassasiyette kantitatif veriler elde edilememesi
gibi dezavantajları da vardır. Özellikle tüketilen hayvansal ürünlere dayalı gıdalarda istenmeyen türlere
karşı güvenliğin kontrolü açısından, T. gondii ile benzer patojenlerin daha az maliyetli bir yöntemle hızlı,
güvenilir ve duyarlı bir şekilde tayinine yönelik araştırmaların sayısının son yıllarda giderek arttığı
görülmektedir. Bu kapsamda projemizde
T. gondii tayinine yönelik tek kullanımlık voltametrik DNA
biyosensörü geliştirilmiştir [8].
Herhangi bir
kimyasal ajanla ekstra etiketlemenin yapılmadığı veya
elektroaktif bir indikatörün
kullanılmadığı T. gondii ‘nin tayinine seçimli ve duyarlı elektrokimyasal DNA biyosensörü ile tayin sınırı 1.78
µg/mL olarak bulunmuştur.
Optimum deneysel koşullarda geliştirilen biyosensörün seçimliliği hedef DNA dizisinden farklı dizilime sahip
diğer DNA dizilerine karşı test edilmiş; ayrıca T. gondii'nin PCR amplikonlarında seçimli tayini başarılı bir
şekilde gerçekleştirilmiştir. Elektrokimyasal DNA biyosensörü ile elde edilen sonuçlar, PCR yöntemi ile elde
edilmiş sonuçlarla karşılaştırıldığında, daha kısa sürede daha güvenilir, seçimli ve duyarlı analizlerin daha az
maliyetli bir yöntemle elde edildiği saptanmıştır
Geliştirilen tek kullanımlık
DNA biyosensörünün
hibridizasyon aşamasında herhangi harici bir
hibridizasyon indikatörü gerektirmeden kolayca tasarımlanmış olması, ayrıca sensörün boyutlarının
küçültülebilir olması, maliyetinin oldukça düşük ve daha kısa sürede T. gondii‘ spesifik DNA tayinini mümkün
kılması gibi önemli üstünlüklere sahiptir.
☞
☞
☞
4. TEŞEKKÜR
Çalışmamıza, EGT 022 no’lu projemiz kapsamında sağladığı maddi ve manevi desteklerinden dolayı Cumhuriyet
Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğü’ne teşekkür ederiz.
KAYNAKLAR
[1] David H. M. Joynson and Tim G. Wreghitt, Toxoplasmosis: a comprehensive clinical guide, Cambridge University Press, 2005; [2] Cristina, N., H. Pelloux, C. Goulhot, J. P. Brion, P. Leclercq, and P. Ambroise- Thomas. 1993. Detection of Toxoplasma gondii in AIDS patients by the polymerase
chain reaction. Infection 21:150–153; [3] (a) Desmonts, G., and J. Couvreur. 1974. Congenital toxoplasmosis: a prospective study of 378 pregnancies. N. Engl. J. Med. 290:1110–1116; (b) www.jinekolojivegebelik.com (erişim tarihi: 25/04/2016); [4] Costa, J. M., M.-L. Darde´, B. Assouline, M.
Vidaud, and S. Bretagne. 1997. Microsatellite in the beta-tubulin gene of Toxoplasma gondii as a new genetic marker for use in direct screening of amniotic fluids. J. Clin. Microbiol. 35:2542–2545; [5] Bergstrom, T., A. Ricksten, N. Nenonen, M. Lichtenstein, and S. Olofsson. 1998. Congenital
Toxoplasma gondii infection diagnosed by PCR amplification of peripheral mononuclear blood cells from a child and mother. Scand. J. Infect. Dis. 30:202–204; [6] Roberts, T. C., and G. A. Storch. 1997. Multiplex PCR for diagnosis of AIDS-related central nervous system lymphoma and
toxoplasmosis. J. Clin. Microbiol. 35:268–269; [7] Johnson, J. D., P. D. Butcher, D. Savva, and R. E. Holliman. 1993. Application of the polymerase chain reaction to the diagnosis of human toxoplasmosis. J. Infect. 26:147–158; [8] Gokce G, Erdem A, Ceylan C, Akgöz M, Voltammetric detection
of sequence-selective DNA hybridization related to Toxoplasma gondii in PCR amplicons, Talanta 149 (2016) 244–249.