108-113 HBsAg Gen Bılgesinin

HBsAg Gen Bölgesinin Böcek
(Trichiplusia ni) Hücre Kültüründe
Ekspresyonu
Mehmet YAPAR*, Çakır GÜNEY*, M. Ali SARAÇLI*, Abdullah KILIÇ**, Ayhan KUBAR*
* Gülhane Askeri Tıp Akademisi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,
** TSK Fizik Tedavi ve Rehabilitasyon Merkezi, ANKARA
ÖZET
Bu çal›flmada, hepatit B virüsü pozitif hastalar›n serumundan HBsAg gen bölgesi amplifiye edilmifl, bu amplikonlar önce Escherichia coli (E. coli) klonlama vektörüne aktar›lm›fl daha sonra bu vektörden al›nan gen bölgesi baculovirüsler için transfeksiyon vektörü olan pMelBac plazmidine klonlanm›flt›r. Elde edilen rekombinant
vektör, böcek (Trichiplusia ni) hücre kültürüne (High Five Cell) transfekte edilmifltir. Daha sonra hücre kültürü içinden, rekombine olan hücreler seçilmifl ve HBsAg ürettikleri ELFA ile gösterilmifltir.
Anahtar Kelimeler: HBsAg, Ekspresyon, Böcek hücre kültürü
SUMMARY
Expression of HBsAg Gene in Insect (Trichiplusia ni) Cell Culture
In this study HBsAg genomic region of HBV was amplified from HBV positive patients sera. The amplified products, amplicons, were at first cloned to E. coli cloning vector and then the genomic region which was
taken from E. coli cloning vector was cloned to pMelBac plasmid to prepare transfection vector of baculovirus. The obtained recombinant vector was transfected to Trichiplusia ni cell culture. And then recombinant
cells were selected from the cell culture and the production of HBsAg by these cells was displayed by ELFA.
Key Words: HBsAg, Expression, Insect cell culture
Hepatit B infeksiyonu özellikle Uzak Doğu Asya’da ve Tropikal Afrika’da olmak üzere tüm dünyada epidemiyolojik önemini sürdürmektedir. Anılan
bölgelerde ve ülkemizde popülasyonun yaklaşık
%10’unun veya daha fazlasının kronik taşıyıcı oldu108
ğu tahmin edilmektedir. Tüm dünyada 400 milyondan fazla HBV taşıyıcısı olduğu bilinmektedir[1].
Medikal tedavisi kısıtlı olan hepatit B infeksiyonlarının tanınmasında veya immünizasyonunda kullanılacak antijenin hazırlanması amacıyla hepatit B viFlora 2001;6(2):108-113
HBsAg Gen Bölgesinin Böcek (Trichiplusia ni)
Hücre Kültüründe Ekspresyonu
Yapar M, Güney Ç, Saraçlı MA, Kılıç A, Kubar A.
rüsünün (HBV) üretilmesi mümkün olmadığından,
daha basit ve ucuz yolla elde edilmesi için çeşitli metodlar geliştirilmiştir. Sözkonusu yöntemlerden en
önemlisi rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak,
hepatit B virüsü yüzey antijeninin (HBsAg) çeşitli sistemlerde ekspresyon yoluyla bol miktarlarda elde
edilmesidir[2-9]. Bu amaçla ilk olarak Escherichia coli (E. coli) olmak üzere prokaryotik hücreler sık kullanılmıştır[5,9]. Ancak bu şekilde elde edilen antijen
tanısal amaçlar için uygun olsa bile aşı hazırlanmasında uygun bulunmamıştır. Çünkü ökaryotik metabolizmalarda yapılan proteinler sentez sonrası da bazı değişikliklere uğramaktadırlar[10,11]. Bu değişiklikler de proteinin fonksiyon, antijenite, stabilite gibi
bazı özelliklerini etkilemektedir. Bu nedenle özellikle
tedavi amaçlı ürün elde edilmesinde, prokaryotik sistemler yerine mayalar ve hücre kültürleri gibi ökaryotik sistemlerde ekspresyon çalışmaları yapılmıştır.
Ökaryotik sistemlerden elde edilen HBsAg’nin konak hücrelerde viral infeksiyon sırasında yapılan
HBsAg’ye daha yakın olduğu görülmüş ve elde edilen ürün aşı yapımında kullanılmıştır. Bu yöntemle
üretilen birkaç aşı çeşidi mevcuttur[12,13].
HBV DNA pozitif hasta serumlarından 10 adedi
toplanarak bir havuz oluşturulmuştur. PCR reaksiyonu için; 500 µL’lik ependorf tüpüne 50 pmol primer
1, 50 pmol primer 2, 2 µL dNTP (10 mM), 5 µL
template, 4 µL MgCl2 (25 mM), 5 µl 10 xTaq buffer, 2 Ü Taq polimeraz, 30 µL distile su konularak
“thermal cycler”de 20 siklüs yapılmıştır. PCR ürünü
olarak 709 bp uzunluğunda bir HBsAg inserti elde
edilmiştir. Elde edilen HBsAg, pürifiye edilerek plazmide klonlamak için “TOPO TA Cloning Kit” (Invitrogen, Hollanda) kullanılmıştır. Bu amaçla 4 µL PCR
ürünü, 2 µL PCR-TOPO plazmid, 4 µL steril distile
su karışımı hazırlanarak oda ısısında 5 dakika bekletildikten sonra transformasyon için kullanılmıştır.
Günümüzde de henüz etkin bir tedavi ajanının olmaması nedeniyle hepatit B’den aşı ile korunma yolu önemini korumaktadır. Rekombinant DNA teknolojisi ile geliştirilen aşılar halen başarıyla uygulanmakta ve yeterli koruma sağlamaktadır[13].
Bundan sonraki basamakta, elimizdeki plazmidten bol miktarda HBsAg inserti elde edilerek Bac-NBlue DNA’sı ile rekombinasyon için pMelBac ekspresyon vektörüne klonlama yapılmıştır.
Biz de bu çalışmada, tanısal veya korunma amaçlı olarak daha ileriki çalışmalarda kullanılmak üzere
ucuz ve kolay bir metodla HBsAg elde etmeyi amaçladık.
PCR + HBsAg vektöründen HBsAg inserti elde
etmek için mikrofüj tüpüne 2 µL EcoRI, 2 µL BamHI, 2.7 µL SuRE/Cut Buffer (Boehringer Mannheim, Almanya) ve 20 µL plazmid konularak 37°C’de
bir gece bekletilmiştir. Ertesi gün örnekten 2 µL alınarak %0.8 agaroz jelde yürütülmüş ve plazmidin
kesilip kesilmediği kontrol edilmiştir. Kalan örneğin
tümü jele yüklenerek yürütülmüş ve jel üzerinde ayrılan HBsAg insertleri dikkatli bir şekilde jelden kesilerek alınmıştır. Jelden HBsAg DNA parçalarını izole etmek için “Prep-A Gene DNA Purification
Systems” kiti kullanılmıştır.
MATERYAL ve METOD
HBsAg PCR Ürününün Hazırlanması
Klonlanacak HBsAg ürününü elde edebilmek
amacıyla GenBank’ta bulunan HBV genomları alınmıştır. Bu genomlar üzerinde HBsAg bölgesini kodlayan bölümler tespit edilmiş ve daha sonra bu veriler hazırladığımız bilgisayar programına yüklenerek
en uygun primer dizileri çıkartılmıştır.
Buna göre elde edilen HBsAg primerleri şunlardır;
Primer 1 (157.baz) 5’ GGATCCATGGAGAACATCACATCAGG 3
Primer 2 (834. baz) 5’ GAATTCTTTGTTTTGTTAGGGTTTAA 3’
Baz numaraları GenBank’tan alındığı şekilde verilmiştir. Birinci primerin 5’ ucuna BamHI, 2. primerin 5’ ucuna da EcoRI dizileri eklenmiştir. Polimeraz
zincir reaksiyonu (PCR) için laboratuvarımıza gelen
Flora 2001;6(2):108-113
PCR + HBsAg Vektörünün E. coli’ye
Transformasyonu
Transformasyon için CaCl2 metodu kullanılmıştır. LB agara ekim sonrası elde edilen rekombine kolonilerden aşağıdaki protokol uygulanarak plazmidler toplanmıştır. Bu işlem için “Prep-A-Gene DNA
Purification Systems” (BioRad, ABD) kiti kullanılmıştır.
HBsAg İnserti Elde Edilmesi
HBsAg İnsertinin pMelBac Vektörü ile
Rekombinasyonu
HBsAg DNA’sı, önceden EcoRI ve BamHI ile
restrikte edilmiş pMelBac vektörü ile “Fast-Link
DNA Ligation Kit”i (Epicentre, ABD) kullanılarak,
rekombine edilmiştir. Bu amaçla mikrofüj tüpüne;
1.5 µL 10x Fast-Link Ligation Buffer, 1.5 µL ATP
(10 mM), 1 µL Fast-Link DNA Ligase, 5 µL pMelBac vektörü, 6 µL HBsAg inserti konularak toplam
15 µL’lik bir ligasyon reaksiyonu sağlanmıştır. Karışım 5 dakika oda ısısında bekletildikten sonra örnek-
109
HBsAg Gen Bölgesinin Böcek (Trichiplusia ni)
Hücre Kültüründe Ekspresyonu
Yapar M, Güney Ç, Saraçlı MA, Kılıç A, Kubar A.
ten 2 µL alınıp %0.8 agaroz jelde kontrol yapılmıştır. Ligate olan pMelBac + HBsAg vektörünü bol
miktarda elde edebilmek amacıyla PCR + HBsAg
vektöründe yapılan TOP10F’ E. coli’ye transforme
işlemleri pMelBac + HBsAg için de tekrarlanmıştır.
Sonuçta elde edilen plazmid agaroz jelden tekrar
pürifiye edilmiş ve elimizde çok miktarda pMelBac +
HBsAg plazmidi bulunması sağlanmıştır. Daha sonraki basamakta pMelBac + HBsAg plazmidi, Bac-N
- Blue DNA’sı için transfer vektörü olarak kullanıma
hazırlanmıştır.
Trichiplusia ni Hücre Kültürüne
Transfeksiyon İşlemi
Bu amaçla Bac-N-Blue DNA’sı, pMelBac +
HBsAg plazmidi ve “Insectin Plus” lipozomları,
“Grace’s Insect Media” içinde karıştırılıp yeni ekilmiş
böcek hücreleriyle (High Five Cell) inkübe edilmiştir.
Transfeksiyon işlemi için mikrofüj tüpüne 10 µL (0.5
µg) Bac-N-Blue DNA’sı, 4 µL (4 µg) pMelBac +
HBsAg plazmidi, 1 mL “Grace’s Insect Medium” ve
20 µL “Insectin Plus” lipozom konularak vortekslenmiş ve karışım oda ısısında 15 dakika bekletilmiştir.
Bu arada hücre kültürünün mediumu dikkatli bir şekilde uzaklaştırılarak yerine 2 mL “Grace’s Insect
Media”sı ilave edilmiştir (suplementsiz veya FBS’siz).
Bu şekilde, transfeksiyonu etkileyebilecek proteinler
ortamdan uzaklaştırılmıştır. Kültürdeki medium tekrar atılarak yerine transfeksiyon karışımı konmuş ve
plağın her yerine iyice yayılması sağlanmıştır. Plaklar oda ısısında 2 siklüs/dakika çalkalanarak 4 saat
bekletilmiştir. Dört saat sonunda plaklara 1 mL
TNM-FH medium ilave edilmiş ve 27°C’de 72 saat
inkübasyona bırakılmıştır.
Yetmişiki saat sonunda üreyen virüsler ortama
salınacağından süpernatan alınarak daha sonraki
plak deneylerinde kullanılmıştır.
X-gal’li) 42°C’lik benmariye yerleştirilmiştir. Kültür
plaklarından medium tamamen aspire edilmiştir.
Steril bir pipetle benmarideki agarozdan alınıp kültür
plaklarının yüzeyine dikkatli bir şekilde yayılmıştır.
Plaklar 27°C’de 5-6 gün inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda mavi koloniler seçilmiştir.
Elde edilen kolonilerden daha sonra tekrar kültür
pasajları yapılmıştır. Hücre kültür sıvısında ELFA
(Bio Merieux HBsAg kiti, Fransa) ile HBsAg bakılmış ve sonuçların pozitif olduğu gözlenmiştir.
BULGULAR
Hepatit B virüsü S bölgesini klonlamak amacıyla
hazırlanmış primerler kullanılarak gerçekleştirilen
PCR sonucu elde edilen ürün fotoğrafı Resim 1’dedir. Burada 2, 4 ve 5. yollarda pozitif hasta serumları kullanılarak elde edilmiş amplikonlar görülmektedir. Birinci yol “PCR size marker (Sigma)” yoludur.
Üçüncü yol negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Pozitif serumların tümünden de markerle uyumlu olarak yaklaşık 700 bp uzunluğunda ürün elde edilmiştir.
PCR + HBsAg vektörünün enzimlerle kesilmesinden sonra elde edilen jel fotoğrafı Resim 2’de görüldüğü gibidir. Burada 1. yol PCR marker’i, 6. yol
ise “supercoil marker”ı göstermektedir. İkinci, üçüncü ve beşinci yollarda çeşitli metodlarla elde edilmiş
PCR + HBsAg plazmidi (4.6 kb) dördüncü yolda ise
BamHI ve EcoRI ile kesilmiş PCR + HBsAg plazmidi görülmektedir. Enzimlerle kesim sonrası PCR
markerin 700 bp’lik alanına uyumlu olarak HBsAg
insertinin ayrıldığı 4. yolda açık şekilde görülmektedir.
Resim 3’te HBsAg insertinin pMelBac vektörüne
klonlanması ve transformasyon sonrası elde edilen
Plak Testi
Doğal virüslerin hücreleri, rekombinant virüslerden daha fazla infekte edebilme yeteneği olduğu için
ayrımın yapılabilmesi amacıyla plak testi kullanılmıştır.
Plaklar TNM-FH ile ıslatılarak log fazındaki hücrelerden konulmuştur. Hücrelerin plağın her yerine
yayılması amacıyla 10 dakika oda ısısında çalkalanarak (8 siklüs/dakika) bekletilmiştir. Hücrelerin yapışması için 30 dakika bekletilmiştir. Bu arada viral
stoktan 10 kat dilüsyonlar hazırlanmıştır. Hazırlanan
hücre kültürlerinin üzerine 1 mL viral dilüsyondan
konulmuştur. Plaklar oda ısısında 2 siklüs/dakika
çalkalamayla 1 saat inkübe edilmiştir. TNM-FH solüsyonuyla hazırlanan %2.5’lik agaroz (150 g/mL
110
SM
PS
NK
PS
PS
2000 bp
750 bp
300 bp
50 bp
Resim 1. P1 ve P2 kullanılarak yapılmış HBV S gen
bölgesinin PCR ürünü jel fotoğrafı. SM: Size marker;
PS: Pozitif serum; NK: Negatif kontrol.
Flora 2001;6(2):108-113
HBsAg Gen Bölgesinin Böcek (Trichiplusia ni)
Hücre Kültüründe Ekspresyonu
SM
2
3
4
Yapar M, Güney Ç, Saraçlı MA, Kılıç A, Kubar A.
5
SM
5012 bp
3990 bp
2972 bp
2067 bp
2000 bp
750 bp
300 bp
Hücre kültürü süpernatanından yapılan ELFA ile
HBsAg pozitif bulunmuştur. ELFA’nın cutoff değeri
0.13 iken bizim materyalimizde sonuç 18.37 çıkmıştır. Dilüsyon çalışması yapılmamıştır. Sadece proteinin varlığını göstermekle yetinilmiştir. Proteinin
özellikleri hakkında ileriye yönelik çalışmalar halen
devam etmektedir.
TARTIŞMA
50 bp
Resim 2. PCR + HBsAg vektörünün enzimlerle kesilmesinden sonra elde edilen jel fotoğrafı. SM: Size
marker.
SM
2
3
4
5
14174 bd
3990 bd
2972 bd
2067 bd
Prokaryotik ve ökaryotik çeşitli genlerin değişik
sistemlerde ekspresyonu yönünde birçok çalışma yapılmış ve halen de bu konudaki araştırmalar devam
etmektedir. Özellikle tıp alanında tedavi amaçlı heterolog proteinlerin yapımı konusunda bu sistemler
ucuz ve bol protein elde edilebilen yöntemler olarak
çok faydalı sonuçlar vermiştir. Başlangıç çalışmalarında Pumpen ve arkadaşları HBsAg genini E. coli’de eksprese etmişler, Korec ve arkadaşları da E.
coli’de HBsAg genini klonlamayı ve ekspresyonunu
başarmışlardır[5,9]. Hepatit B yüzey antijeni, sadece
bakteri hücresinin sitoplazmasında eksprese edilmiş
ve ortama sekrete edilmemiştir. Diğer taraftan prokaryotik sistemlerde posttranslasyon modifikasyonların birçoğunun mümkün olmaması nedeniyle ekspresyon için mayalar kullanılmıştır. Birçok araştırıcı
tarafından, çeşitli maya hücrelerinde başarılı bir şekilde HBsAg ekspresyonu gerçekleştirilmiştir[3-6].
Çeşitli proteinlerin üretilmesinde böcek larvalarının kullanılması hücre kültürlerine tercih edilmektedir. Bunun nedeni larvalardaki ekspresyon düzeylerinin kültürlere oranla 10 kat daha fazla olabilmesidir.
Yapılan bir çalışmada larvadan 3.6 mg polihedrin/insulin benzeri growth faktör II (IGF-II) elde edilirken hücre kültüründen 0.3 mg/mL protein elde
edilebilmiştir[11].
Resim 3. HBsAg geninin pMelBac plazmidine klonlanması ve enzimlerle restriksiyonu sonrası çekilen jel fotoğrafı. SM: Size marker.
pMelBac + HBsAg plazmidinin enzimlerle restriksiyonu sonrası elde edilen jel bulguları görülmektedir.
Burada 1. yolda “supercoil size marker”, 2. yolda
rekombine olmuş 5.5 kb büyüklüğündeki pMelBac +
HBsAg vektörü, 3. yolda HBsAg inserti, 4. yolda
BamHI ve EcoRI ile restrikte edilmiş pMelBac +
HBsAg vektörü görülmektedir. Şekilde de görüldüğü
gibi enzimlerle restriksiyon sonrası plazmide sokulan
HBsAg inserti ayrılmış ve önde gitmiştir. Beşinci yolda ise enzimlerle kesilen pMelBac bulunmaktadır.
Transfeksiyon sonrası yapılan plak testinde 8-10
mavi koloni gözlenmiş ve bunlardan pasaj yapılmıştır.
Flora 2001;6(2):108-113
Diğer taraftan memeli orjinli genlerin ekpresyonunda elde edilecek ürünün biyolojik olarak aktif olması da önem taşımaktadır[14]. Ökaryotik proteinlerde biyolojik aktiviteyi etkileyen birçok etmen tanımlanmıştır. Posttranslasyonel modifikasyonlar (glikozilasyon, proteolizis, fosforilasyon, ADP-ribozilasyon,
acilasyon, sülfasyon gibi), tersiyer yapı (disülfid bağlarının oluşumu gibi) ve kuaterner yapı (oligomerizasyon veya kompleks oluşumları gibi) bu etmenlerden başlıcalarıdır[11,15].
Böcek hücreleri memeliye ait sinyal dizilerini tanımlayabilmekte ve bu proteinleri aynen memeli
hücresinin yaptığı gibi endoplazmik retikulumda kesebilmektedir. İnsan alfa ve beta interferonları ve interlökin-2 (IL-2) ve interlökin-3 (IL-3) insan hücresindeki gibi tanınmakta ve kesilmektedir. Bu olay tüm
proteinlerde olmasa bile eksprese edilen çoğu prote111
HBsAg Gen Bölgesinin Böcek (Trichiplusia ni)
Hücre Kültüründe Ekspresyonu
Yapar M, Güney Ç, Saraçlı MA, Kılıç A, Kubar A.
in için geçerlidir. Yine baculovirüs kökenli üretilen
proteinlerden bazılarında spesifik proteolitik kesmeler de gözlenmistir. Örneğin Kurado ve arkadaşları
yaptıkları bir çalışmada influenzae virüsüne ait hemaglütinin proteininin kesildiğini göstermişlerdir.
Hemaglütinin kesilmesi füzyon aktivitesi ve viral patogenez açısından önemlidir. Benzer şekilde HIV
zarf proteini de başarılı bir şekilde bölünmüştür
[11,16].
Bir diğer önemli modifikasyon protein glikozilasyonudur. En sık rastlanan modifikasyon olan glikozilasyon, tüm proteinler için olmasa da bazı proteinlerin biyolojik aktivitesinde önemli rol oynamaktadır.
Proteinin stabilizasyonu, hücresel etkileşimi ve intraselüler protein lokalizasyonu için gereklidir. Endoplazmik retikulumda görülen bu olayda oligosakkarid,
fosfolipid bir taşıyıcı aracılığıyla asparagine bağlanır.
Yapılan bir çalışmada oligosakkaridin proteine bağlanma yerinin memeli hücresi ile böcek hücresinde
aynı olmasına karşın oligosakkarid yapısının farklı
olabildiği görülmüştür[15]. Glikozilasyondaki bu farklılık proteinin biyolojik aktivitesinde değişiklik yapmamaktadır. IL-2 böcek hücrelerinde glikozile olmamaktadır. Bununla birlikte memeli hücrelerindeki glikozilasyon paternleri de farklılık göstermektedir. T
hücre dizilerinden elde edilen IL-2’nin %40’ı glikozile olmamaktadır[11].
Yapılan çalışmalarda böcek hücrelerinden elde
edilen proteinlerden fosforile olanların doğal konak
hücrelerinden elde edilen proteinlerle aynı şekilde
fosforile oldukları gözlenmiştir[10,11]. Bir diğer çalışmada da sözkonusu sistemle sentez edilen HBsAg
miktarının diğer sistemlerle karşılaştırıldığında çok
daha fazla olduğu görülmüştür[7].
Bu çalışmada hedef olarak seçilen HBsAg ekspresyonunda elde edilmesi amaçlanan ürünün özellikle aşı çalışmalarında kullanılması istendiğinden biyolojik aktivitesinin ve antijenitesinin bozulmaması, doğala yakın olması ve bol miktarda elde edilebilmesi
önemlidir. Maliyetin ucuz olması da gözardı edilmemelidir.
Özellikle aşı gibi tedavi amaçlı kullanılacak ürünlerde emniyet önemli bir faktördür. Ürünün kullanımı ile görülecek yan etkilerin minimum olması gerekir. Bu nedenle elde edilen proteinin mümkün olduğu kadar saf olması istenir. Memeli hücre sisteminden elde edilen antijenin kullanımında potansiyel bir
risk, ürünün eldesi sırasında rezidüel hücresel DNA
ile kontamine olmasıdır. Baculovirüs-böcek hücre
sisteminde böyle bir risk bulunmamaktadır. Ayrıca
baculovirüslerin vertebralılar için patojen olmaması
112
sistemin diğer bir avantajıdır. Mayalardan elde edilen
ürünler oldukça saf olmasına karşın rezidüel maya
kontaminasyonları nedeniyle allerjik reaksiyonlar bildirilmiştir[17]. Baculovirüs sisteminde ise böyle bir olgu bildirilmemiştir.
Bizim çalışmamızda elde edilen protein ürün üzerinde ileri incelemeler yapılmamıştır. Ayrıca DNA
sekansı çıkarma imkanımız olmadığından bu çalışmada klonlama yapılan virüsle ilgili olarak tiplendirme yapılamamıştır. Bundan sonraki aşamada bu
proteinin anlatılan özellikleri üzerinde ve virüs tiplendirilmesi konusunda daha ileri araştırmalar planlanmaktadır.
KAYNAKLAR
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Taşyaran M. Epidemiyoloji. Kılıçturgay K. (Derleyen) Viral Hepatit 98. Deniz Ofset 1998:94.
Attanasio R, Lanford RE, Dilley D, et al. Immunogenicity
of hepatitis B surface antigen derived from the baculovirus expression vector system: A mouse potency study.
Biologicals 1991;19:347-53.
Imamura T, Araki M, Miyanohara A, et al. Expression of
hepatitis B virus middle and large surface antigen genes
in saccharomyces cerevisiae. J Virol 1987;61:3543-9.
Kniskern PJ, Hagopian A, Montgomery DL, et al. Unusually high-level expression of a foreign gene (hepatitis B
virus core antigen in saccharomyces cerevisiae). Gene
1986;46:135-41.
Korec E, Korcova J, Palkova Z, et al. Expression of hepatitis B virus large envelope protein in Escherichia coli and saccharomyces cerevisiae. Folia Bio (Praha)
1989;35:315-27.
Kuroda S, Itoh Y, Miyazaki T, Imai So, Fujisawa Y. Efficient expression of genetically engineered hepatitis B virus surface antigen P31 proteins in yeast. Gene
1989;78:297-308.
Lanford RE, Luckow V, Kennedy RC, Dreesman GR,
Notwall L, Summers MD. Expression and characterization of hepatitis B virus surface antigen polypeptides in Insect cells with A baculovirus expression system. J Virol
1989;63:1549-57.
McLachlan A, Milich DR, Raney AK, et al. Expression of
hepatitis B virus surface and core antigens: Influences of
Pre-S and precore sequences. J Virol 1987;61:683-92.
Pumpen P, Kozlovskaya TM, Borisava GP, et al. Expression of hepatitis B virus surface antigen gene in Escherichia coli. Gene 1984;30:201-10.
Glick BR, Pasternak JJ. Molecular Biotechnology Principles and Applications of Recombinant DNA. Washington DC: ASM press 1994.
Miller LK. Baculoviruses as gene expression vectors.
Ann Rev Microbiol 1988;42:177-99.
Heerman KH, Goldman U, Schwartz W et al. Large surface proteins of hepatitis B virus containing the Pre-S sequence. J Virol 1984;52:396-402.
Roels GL, Desombere I, Tollenaere GD, et al. Hepatitis
B vaccine containing surface antigen and selected pre
S1 and pre S2 sequences. Safety and immnogenicity in
young healthy adults. Vaccine 1997;15:1724-31.
Flora 2001;6(2):108-113
HBsAg Gen Bölgesinin Böcek (Trichiplusia ni)
Hücre Kültüründe Ekspresyonu
Yapar M, Güney Ç, Saraçlı MA, Kılıç A, Kubar A.
14. Luckow VA, Summer MD. Trends in the development of
Baculovirus expression vectors. Bio/Technology 1998;
6:47-55.
15. Hsieh P, Robbins PW. Regulations of asparagine-linked
oligosaccharide processing. J Biol Chem 1984;259:
2375-82.
16. Hu S, Kowoski SG, Schaaf KF. Expression of envelope
glycoprotein of human immunodeficiency virus by an insect virus vector. J Virol 1987;61:3617-20.
17. Hammond GW, Parker J, Mimms L, Tate R, Sekla L, Minuk G. Comparison of immunogenicity of two yeast-derived recombinant hepatitis B vaccines. Vaccine 1991;9:
97-100.
Yazışma Adresi:
Dr. Mehmet YAPAR
Gülhane Askeri Tıp Akademisi
Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji
Anabilim Dalı
06018, Etlik - ANKARA
Makalenin Geliş Tarihi: 12.09.2000
Kabul Tarihi: 22.03.2001
UGH 2001
18. Ulusal Gastroenteroloji Haftas›
25-30 Ekim 2001
Dedaman, ANTALYA
Bilimsel Sekreterya
Türk Gastroenteroloji Derneği
Bay›nd›r Sokak, No: 17/7
06420 Yenişehir/ANKARA
Tel: 0312 435 43 73 Fax: 0312 431 80 40
e-mail: [email protected]
Flora 2001;6(2):108-113
113