Replikasyon

DNA REPLIKASYONU
Bölüm 12
DNA
Kendi kopyasını yapabilir,
 Tamir edilebilir,
 Rekombinasyon geçirebilir.

Alternatif DNA replikasyon modelleri
Watson & Crick azotlu bazlarin
yerleşimi ve doğasından dolayı DNA
ikili sarmalının her bir zincirinin
tamamlayıcı zincir sentezi için kalıp
oluşturabileceğini tahmin etmiştir.
Fig. 12.1
1958: Matthew Meselson & Frank Stahl’s Experiment
Semiconservative model of DNA replication (Fig. 3.2)
Yarı saklı replikasyon için beklenen sonuçlar; Fig. 12.4
Equilibrium density gradient centrifugation (Box 3.1)
I
1955: Arthur Kornberg
E. Coli ile çalıştı
DNA sentez mekanizmasını keşfetti
İhtiyaç duyulan 4 ana bileşen
1.
dNTP’ler: dATP, dTTP, dGTP, dCTP
(deoxyribonucleoside 5’-triphosphates)
(şeker-baz + 3 fosfat)
2.
DNA kalıbı
3.
DNA polimerazI (Kornberg enzimi olarak da bilinir)
(DNA polimeraz II & III daha sonra bulundu)
4.
Mg
2+
(DNA polimeraz aktivitesi için gerekli)
1959: Arthur Kornberg (Stanford University) & Severo Ochoa (NYU)
DNA sentezinin 3 ana basamağı:
1.
DNA polimeraz I, deoksiribozun 3’-OH grubu ile dNTP’nin 5’fosfat grubu arasındaki fosfodiester bağının oluşumunu
katalizler.
Bu reaksiyon için gerekli olan enerji
NTP + (NMP)n  (NMP)n+1 + P~P reaksiyonu ile
karşılanır.
2.
Zincir uzaması DNA polymeraz I’in komplementer dNTP’ları
yapıya eklemesi ile sürer.
•
•
rate ≤ 800 dNTPs/second
Düşük hata oranı
3.
Sentez yönü 5’  3’
TANIMLAR



Replikasyon orijini: Replikasyonun başlangıç noktası
Replikasyon çatalı: Kromozom üzerinde replikasyonun olduğu
noktada sarmala ait zincirlerin açılmasıyla ortaya çıkan
bölgedir. Önce sentezin orijin noktasında meydana gelir ve
replikasyon devam ettikçe ilerler.Replikasyon çift yönlü ise,
orijinden itibaren zıt yöne doğru ilerleyen iki replikasyon
çatalı oluşur.
Replikon: bir orijinden bir replikasyon başladıktan sonra
replike olan DNA’nın uzunluğunun bir birim olduğunu
belirtmek için kullanılan terimdir.
Replikasyon orijini (prokaryotik):

Çift zincirli DNA molekülünün denatüre olarak açılması ve
bazların serbest kalması ile başlar.

replication bubble formunun oluşmasını sağlayan bu işlemden
sonra replikasyon iki yönlü olarak devam eder.
~245 bp in E. coli
REPLIKASYON ORIJINI (PROKARYOTIK):



E. coli’de replikasyon 245 bç
uzunluğunda olan ve oriC olarak
adlandırılan tek bir orijinden
başlamaktadır.
Bakteri ve bakteriyofajlarda
replikasyon tek bir noktadan
başladığından kromozomun tümü
replikondur.
Replikasyon oriC’den heri iki yöne
doğru hareket eder. Replikasyon
ilerledikçe ayrı yönlere doğru
birbirlerinden uzaklaşan iki
replikasyon çatalı oluşur. Çatallar
tüm kromozom replike olduktan sonra
ter olarak adlandırılan sonlanma
bölgesinde birbiriyle birleşir.
Replikasyon orijini (ökaryotik):
ÇOKLU REPLIKASYON ORIJINI (ÖKARYOTLARDA)
1.
Ökaryotlarda birden çok replikasyon orijini (yeast 250-400, memelilerde
25,000’den fazla replikon) bulunur.
* Daha fazla DNA içerirler (maya e.coli’den 4 kat drosophiladan ise 100 kat
fazla DNA içerir)
*Ökaryotik DNA pol’ın sn’de 50 nt olan sentez hızı bakteriyal
polimerazlardan 20 kat daha yavaştır.




ARSs (autonymously replicating sequences-özel replike olan diziler): 11 bç.
Uzunluğundaki maya replikasyon orijinidir. Sentezin etkin başlamasını sağlayan
kısa dizileri içerir. 20-80 replikon kümesi sıra ile aktive olur.
Polimeraz çok büyük DNA dizilimi içinde ARS dizilerini, hücre döngüsünün S
fazında başlayan bir mekanizma ile bulur.
Hücre döngüsünün G1 fazında tüm ARS dizilerine bazı proteinler bağlanır
(mayada 6 tane) ve orijin tanıma kompleksi(Origin Recognition Complex, ORC)
oluşur.
Kinazlar sentez aşamasında fosforilasyonda görev alan enzimlerdir. ORC’ye
bağlanırlar ve DNA pol bağlanması için ön replikasyon kompleksi (pre-RC)
oluştururlar.Kinazlar aktive olduklarında DNA sentezini tetiklerler ve her
replikonda DNA sentezi tamamlanana kadar tekrar pre_RC oluşumunu
engelleyerek kopyalanan ve kopyalanmamış DNA’ları birbirinden ayırırlar.
Hücre döngüsü sırasında oluşan ve
ökaryotlarda çok sayıda replikasyon orijini
oluşumunu kontrol eden olaylar
Fig. 12.16
DNA POLIMERAZ
ENZIMLERI
BAKTERILERDE DNA SENTEZINDE 3 POLIMERAZ VE DIĞER
ENZIMLER GÖREV ALIR
1957, Kornberg ve ark. E. coli’den in vitro olarak DNA
sentezini yönlendiren bir enzim saflaştırmış ve DNA
polimeraz I olarak isimlendirmiştir.
İn vitro DNA sentezi için enzimin ihtiyaçları;
1.
4 tip nükleotid trifosfat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP=
dNTP)
2.
DNA kalıbı
•
4 dNTP’den herhangi biri eksik ise yada ortamda
NTP’lar yerine nükleotitler ve nükleotid difosfatlar varsa
sentez olmamaktadır.
•
Kalıp DNA olmazsa sentez çok büyük oranda
azalmaktadır.
Kornberg’in izole ettiği enzim ile yapılan sentez şu şekildedir:

DNA polimeraz I’in katalizlediği kimyasal reaksiyonun
Her basamağında dNTP’ler yapıya eklenir.
Uzayan DNA zincirine her bir nükleotidin katılım şekli DNA pol I’in
özgüllüğüne bağlıdır.
Öncü dNTP’de d-ribozun 5’ karbonuna bağlı fosfat grubu, ekleneceği dribozun 3’-OH grubuna kovalent bağla bağlanır.
Fig. 12.8
DNA ZINCIRININ UZAMASI
Ancak DNA pol I’in biyolojik
fonksiyonu Kornberg tarafından
tam olarak aydınlatılamamıştı,
çünkü
1. Enzimin in vitro sentez hızı
in vivo ya göre çok yavaştı
2. Tek zincirli DNA’yı çift
zincirli DNA’dan daha etkin
biçimde kopyalamaktaydı
3. DNA’yı sentezlediği gibi aynı
anda yıkabilmekteydi.
Kornberg- “DNA pol I in viro
ortamda biyolojik olarak aktif
DNA
sentezleyebiliyorsa,
hücre
içinde
de
DNA
sentezinin başlıca katalizörü
olmalıdır”
1967, Goulian, Kornberg, ve
Sinsheimer showed that DNA
pol I’in biyolojik olarak aktif
DNA
sentezi
yaptığını
göstermişlerdir.
Fig. 12.9
DNA POL I’IN BIYOLOJIK ROLÜ HALEN ŞÜPHELI
IDI
1969 Delucia ve Cairns- DNA pol I aktivitesine
sahip olmayan mutant bir E. coli suşu bulmuştur.
Mutasyon polA1 olarak isimlendirilmiştir.
 Ancak mutant suş onarım yeteneği bakımdan
oldukça yetersizdir. Bu gözlemlerden sonra


Sonuç:
1. E. coli de in vivo replikasyon için en az bir pol
daha olmalı
2. DNA pol I in vivo ikincil bir işlevi olmalıdır
DNA POL II VE III







DNA
pol
ı
aktivite
içeren
normal
hücrelerden elde edilen özgün enzimlerdir.
DNA pol I, II ve III kalıptan DNA sentezi
başlatamaz ve ancak primer adı verilen, var
olan bir DNA zincirini kalıp boyunca
uzatabilirler.
3’5’
ekzonükleaz
aktivitesi:
enzimin
polimerizasyonu tek yönde gerçekleştirme,
bir an duraksayıp, geri dönerek ilave edilen
nt’leri çıkarabilme özelliğidir.
5’->3’ ekzonükleaz aktivitesi : DNA pol I’in
özelliğidir. Enzim, sentezin başladığı uçtan
itibaren nükleotitleri kesebilir ve sonra
sentez yönünde işlemine devam edebilir. Bu
nedenle DNApol I RNA primerini de
uzaklaştırabilir. Ortamda pol III den daha
fazla bulunur.
Pol I primeri uzaklaştırır ve oluşan
boşlukları doldurur.
Pol II-> U.V hasarı nedeniyle oluşan
mutasyonların
tamirinde
rol
aldığı
düşünülmektedir.
Pol III -> polimerizasyondan aslı sorumlu
olan enzimdir.
Properties
DNA Pol
I
Initiation of chain synthesis
5’-3’ polymerization
+
3’-5’ exonuclease activity
+
5’-3’ exonuclease activity
+
Molecules of polymerase/cell
400
DNA Pol
II
+
+
?
DNA Pol
III
+
+
15
DNA POLIMERAZ I’IN KLENOW FRAGMANI
DNA polimeraz I’in 5′  3′ ekzonükleaz
domain’i çıkarıldığı zaman geri kalan
fragmana Klenow veya büyük
fragman denir. Bu fragman
polimerizasyon ve
proofreading
aktivitelerini
korur.
DNA POLIMERAZ I’IN 3′ 
5′ EKZONUKLEAZ
AKTIVITESI ILE HATALARI
DÜZELTMESI
DNA
Pol
III’ün
holoenzim
olarak
adlandırılan aktif formu, iki takım, 10
farklı polipeptit zincirinden meydana
gelmiş bir dimerdir.
 M. A 600.000 daltondur.
 Core
(çekirdek)
enzim
holoenzimin
polimerizasyon
aktivitesi
gösteren
kısmıdır.




g kompleks olarak adlandırılan ikinci
bölgede
5
alt
birim
bulunur
ve
replikasyon çatalında enzimin kalıba
oturtulmasında görev alır.
b alt birimi, polimerizasyon sırasında
enzimin kalıptan kopmamasını sağlar.
P
(pi),
iki
çekirdek
replikasyon
çatalında
tutunmasını sağlar.
polimerazın
bir
arad
REPLİZOM Holoezim ve diğer proteinlerin
replikasyon çatalında oluşturdukları büyük
kompleks.
E.coli polimeraz III’ün iki β altünitesi
YUKARIDAN
BAKIŞ
Prokaryotik enzimler 3 çeşittir:
Polymerase
Polymerization (5’-3’)
Exonuclease (3’-5’)
Exonuclease (5’-3’)
#Copies
I
Yes
Yes
Yes
400
II
Yes
Yes
No
?
III
Yes
Yes
No
10-20
•Polimeraz I & III 5’->3’ yönünde replikasyon
•Polimeraz II rolü tam olarak bilinmiyor
•3’ -> 5’ exonükleaz aktivitesi= zincirin 3’ ucundan nükleotidlerin
uzaklaştırılması
•proofreading mekanizması olmadan hata oranı (mutasyon oranı)
yaklaşık 1 x 10-6
•Proofreading ile hata oranı yaklaşık 1 x 10-9
6 farklı ökaryotik DNA polimeraz vardır
DNA polimeraz α, δ (delta) ve ε ökaryotik çekirdek DNA’sı replikasyonu
için gereklidir.
DNA polimeraz b ve ζ (zeta) DNA tamirinde rol aldığı düşünülüyor.
DNA polimeraz g (gama) mtDNA sentezinde rol alır.
Prokaryotik/ökaryotik modeller
(circular/linear kromozomlar)
DNA REPLIKASYONU SIRASINDA BIRÇOK
KARMAŞIK OLAY ÇÖZÜLMELIDIR
DNA Sarmalı
Açılmalıdır
Replikasyon orijini (oriC) 9 ve 13
merden oluşan 245 bç lik bir
bölgedir. DnaA ilk basamakta 9
mer’lik bu bölgeye bağlanarak
sarmalın
açılmasından
sorumludur.
•Bu bağlanma, sarmalın daha
fazla
açılmasında
ve
kararlılığında rol alan DnaB ve
DnaC
proteinlerinin
bağlanmasını kolaylaştırır.
•H bağlarını ATP enerjisi
kullanarak kıran ve DNA’yı
denatüre
eden
enzimlere
HELİKAZ lar denir. SSBP’ler bu
yapıyı tek zincire bağlanarak
daha kararlı kılar.
•Sarmal açıldıkça replikasyon
çatalının önünde oluşan süpercoil
yapı DNA gyrase (topoisomerase)
tarafından gevşetilir.
Fig. 12.10
Supercoiled DNA relaxed by gyrase & unwound by helicase + proteins:
5’
SSB Proteins
Okazaki Fragments
ATP
1
Polymerase III
Lagging strand
2
3
Helicase
+
Initiator Proteins
3’
primase
Polymerase III
base pairs
5’
RNA primer replaced by polymerase I
& gap is sealed by ligase
RNA Primer
3’
Leading strand
PRIMING DISCOVERY: TUNEKO
OKAZAKI: 1985
1. RNA polimeraz nükleotid ekler,
DNA polimeraz yapamaz
5’ T
G
ACA T T G C T C A
3’ A
C
UG U A A C G A G 5’
2. DNA polimerazın primer ihtiyacı vardır
DNA Sentezinin Başlaması İçin RNA Primerine Gereksinim Vardır
•DNA pol III’ün polinükleotid zincirini uzatması için 3’ OH grubuna ihtiyacı vardır.
•Kalıp DNA üzeirnde DNA’ya komplementer olan RNA parçası (5-15 nt) PRİMAZ enzimi
•( RNA pol) tarafndan sentezlenir.
•RNA primeri DNA pol I tarafından uzaklaştırılır ve zincir tamamlanır.
•evrensel (virusler->prok->euks)
Fig. 12.11
DNA SENTEZI 5′  3′ YÖNÜNDE
İLERLER
Eğer zincir her zaman 5′  3′ yönünde ilerlerse her iki
zincir nasıl aynı anda sentez edilebilir?
 Bu soru 1960’larda Reiji Okazaki ve ark. tarafından
çözüldü.
 Okazaki fragmanları, bir DNA zincirinde sentez edilen
kısa DNA parçaları.
 Leading strand (öncül zincir): 5′  3′ yönünde sürekli
sentezin yapıldığı zincir
 Lagging strand (sonradan gelen zincir): Karşı zincirde
5′  3′ yönündeki sentezin hücre tipine bağlı olarak
birkaç yüz ile birkaç bin baz çiftli fragmanlar halinde
sentez edildiği zincir

Antiparalel zincirlerde DNA
sentezi kesintili ve kesintisiz
olarak gerçekleşir.
•Kesintisiz (leading)
•Kesintili (lagging)
•(Okazaki fragments)
1000-2000 nt
uzunluğunda
•DNA pol I RNA
primerinin uzaklaştırılması
ve nt tatmamlanmasını
yapar.
•DNA ligaz fragmentleri
birleştirir.
Fig. 12.12
DNA ligase seals the gaps between Okazaki fragments with a
phosphodiester bond (Fig. 3.7)
Sentez kesintili ve kesintisiz zincirlerde aynı anda yapılır
Fig. 12.13
I
PROOFREADING (HATA OKUMA) VE DÜZELTME DNA
REPLIKASYONUNUN AYRILMAZ PARÇASIDIR
Exonuclease proofreading (DNA polymerase I &
III 3’->5’ ekzonükleaz aktivitesine sahiptir)
 DNA pol III’ün Epsilon altünitesinin işlev
göremediği mutant E. coli suşlarında DNA
sentezi sırasında hata hızı önemli ölçüde artar.

Prokaryotlarda DNA Replikasyon Modeli
Fig. 12.14
DNA REPLIKASYONUNDA BIRÇOK ENZIM VE PROTEIN
FAKTÖR ROL OYNAR






E. coli replikasyonunda, DNA polimeraz dışında 20’den fazla
sayıda farklı enzim ve protein rol alır. Bu kompleksin tümünü
DNA replikaz sistemi veya replizom denir.
Replikasyonun başlaması için ikili sarmalı ayrılmasını sağlayan
enzimler helikaz’lardır.
Zincir ayrılması ile oluşan topolojik stress topoizomerazlar
ile giderilir.
Ayrılmış zincirler DNA bağlayan proteinler ile stabilize edilir.
Primazlar, genellikle kısa RNA parçacıkları olan primerleri
sentezler.
RNA primeri çıktıktan sonra boşluk DNA ligaz ile kapatılır.
ÖKARYOTIK DNA SENTEZI PROKARYOTIK DNA
SENTEZINE BENZER ANCAK DAHA KARMAŞIKTIR

Temel gereksinimleri benzerdir ancak
ÇOKLU REPLIKASYON ORIJINI
1. Ökaryotlarda birden çok replikasyon orijini (yeast 250-400, memelilerde
25,000’den fazla replikon) bulunur.
* Daha fazla DNA içerirler (maya e.coli’den 4 kat drosophiladan ise 100 kat
fazla DNA içerir)
*Ökaryotik DNA pol’ın sn’de 50 nt olan sentez hızı bakteriyal
polimerazlardan 20 kat daha yavaştır.




ARSs (autonymously replicating sequences-özel replike olan diziler): 11 bç.
Uzunluğundaki maya replikasyon orijinidir. Sentezin etkin başlamasını sağlayan
kısa dizileri içerir. 20-80 replikon kümesi sıra ile aktive olur.
Polimeraz çok büyük DNA dizilimi içinde ARS dizilerini, hücre döngüsünün S
fazında başlayan bir mekanizma ile bulur.
Hücre döngüsünün G1 fazında tüm ARS dizilerine bazı proteinler bağlanır (mayada
6 tane) ve orijin tanıma kompleksi(Origin Recognition Complex, ORC) oluşur.
Kinazlar sentez aşamasında fosforilasyonda görev alan enzimlerdir. ORC’ye
bağlanırlar ve DNA pol bağlanması için ön replikasyon kompleksi (pre-RC)
oluştururlar.Kinazlar aktive olduklarında DNA sentezini tetiklerler ve her
replikonda DNA sentezi tamamlanana kadar tekrar pre_RC oluşumunu engelleyerek
kopyalanan ve kopyalanmamış DNA’ları birbirinden ayırırlar.
BIDIRECTIONAL
REPLICATION
Eukaryotes vs. prokaryotes
Linear, multiple origins vs. circular, one origin
Theta mode
q
•2 replication forks
•In eukaryotes
Hücre döngüsü sırasında oluşan ve
ökaryotlarda çok sayıda replikasyon orijini
oluşumunu kontrol eden olaylar
Fig. 12.16
6 farklı ökaryotik DNA polimeraz vardır
DNA polimeraz α, δ (delta) ve ε ökaryotik çekirdek DNA’sı replikasyonu
için gereklidir.
DNA polimeraz b ve ζ (zeta) DNA tamirinde rol aldığı düşünülüyor.
DNA polimeraz g (gama) mtDNA sentezinde rol alır.
ÖKARYOTIK REPLIKASYON





Polimeraz alfa replikasyonun başlamasından sorumludur
(50,000/hücre)
Polimeraz alfanın iki alt ünitesi RNA primerini sentezleyen
primaz olarak işlev görür. Sonra diğer alt birim primerin ucuna
nt takarak sentezi sürdürür.
Pol a’nın işlev kapasitesi düşüktür. Bu nedenle RNA primerine
kısa bir DNA dizisi eklendikten sonra, polimeraz değişimi
olarak billinen işlem gerçekleşir. Pol a kalıptan ayrılır yerine
pol d (delta) geçer. Böylece sentez hızı 100 kat arta, ve 3’->5’
ekzonükleaz aktivitesi kazanılır.
Pol e, pol d (delta) ile aynı özelliklere sahiptir ancak değişik
hücre koşullarında çalıştığı düşünülür.
Tüm işlemler kesintili ve kesintisiz zincir için aynıdır.
Doğrusal kromozomların uçlarının replikasyonu so
•Kesintili zincirde
RNA primeri
uzaklaştırıldığında
kromozomun
ucunda serbest 3’OH grubunu
sağlayacak kalıp
zincir olmadığı için
sentez yapılamaz.
•Kromozom RNA
primerini boyu
kadar kısalır.
Çözüm: Telomer ve Telomeraz
•Tetrahymena’da
Telemorlerin çoğu 5’-TTGGG-3’
dizisi ile sonlanmaktadır.
Telomeraz
her
replikasyonda
telomerin kısalmasını önlemek için
TTGGGG
tekrar
dizilerini
kromozomun ucuna eklemektedir.
İlave edilen diziler “saç tokası” gibi
kıvrılır ve karşı karşıya gelen G’ler
arasında H bağı kurulur ve serbest
3’-OH grubu elde edilir.
DNA pol I boşluğu doldurur.Daha
sonra saç tokası kırılır ve DNA
kaybı engellenir.
Fig. 3.19 Synthesis of telomeric DNA by telomerase
Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.