özel ege lisesi ağır metallerin sebzeler üzerinde yarattığı lipid

Lİ
SE
Sİ
ÖZEL EGE LİSESİ
Ö
ZE
L
EG
E
AĞIR METALLERİN
SEBZELER ÜZERİNDE YARATTIĞI
LİPİD PEROKSİDASYON DÜZEYİNİN
BELİRLENMESİ
HAZIRLAYAN ÖĞRENCİ:Umutcan YAĞAN 9-B
DANIŞMAN ÖĞRETMEN:Rüçhan ÖZDAMAR
2005
İZMİR
Lİ
SE
Sİ
İÇİNDEKİLER
Ö
ZE
L
EG
E
Serbest Radikal-Hidroksil Radikali............................................................................................2
Hidroksil Radikali Reaksiyonları................................................................................................2
Serbest Radikal Hasarları......................................................................................................... 3
Çalışmamız................................................................................................................................4
Malondialdehid Tayini................................................................................................................4
Sonuçlar ve Tartışma................................................................................................................5
Kaynakça..................................................................................................................................8
1
AĞIR METALLERİN SEBZELER ÜZERİNDE YARATTIĞI LİPİD
PEROKSİDASYON DÜZEYİNİN BELİRLENMESİ
Lİ
SE
Sİ
Yüzyılımızda endüstri ve teknoloji alanında meydana gelen gelişmeler, doğal dengelerin
bozulmasına, hava, su ve toprak kirliliğini de beraberinde getirmiştir.Çevre kirliliği açısından
güncel bir sorun da ağır metal kirliliğidir. Ağır metallerin havayı, yüzey, göl ve deniz
sularını ve toprağı kirletmeleri doğrudan veya gıda zinciri yoluyla insan sağlığının etkilenmesi
sonucunu doğurmaktadır.
Bu çalışmada marul bitkisi farklı konsantrasyonda krom metaline maruz bırakılarak sebzede
yarattığı lipit peroksidasyon düzeyinin saptanması amaçlanmıştır. Çalışmamızda, yardım ve
desteğini göz ardı edemeyeceğimiz Ege Üniversitesi öğretim üyelerinden Yrd.Doç.Dr.Şenay
BAYSAL’a teşekkür ederiz.
EG
E
Cr(VI) deri endüstrisi, boya sanayi, kağıt sanayi gibi endüstrilerin sanayi atıklarında geniş
miktarda varolan toksik bir metaldir ve maruz kalan kişilerde deri yaralarına, akciğer
kanserine, adale ve kas rahatsızlıklarına yol açar. Cr(V) ve Cr(IV) gibi reaktif ara ürünler
askorbat, glutatyon, NADPH bağımlı flavoenzimler gibi intraselüler redüktantlar tarafından
daha kararlı olan Cr(III)’ e indirgenirler. Bu indirgenme prosesi aynı zamanda Fenton veya
Haber-Weiss tipi reaksiyonlar yoluyla reaktif oksijen türlerinin oluşumuna neden olur.
Ağır metallerin çoğunun su, gıda zinciri yoluyla vücuda girerek ciddi problemlere yol açtığı
bilinmektedir. Vücuda alınan bazı metaller hidrojen peroksit varlığında hidroksil radikali
oluşumuna neden olmaktadırlar.
SERBEST RADİKAL-HİDROKSİL RADİKALİ
Ö
ZE
L
Serbest radikaller dış yörüngelerinde bir veya daha fazla ortaklanmamış elektron taşıyan
yüklü veya yüksüz olabilen atom veya moleküllerdir.Hidroksil radikalleri en reaktif serbest
radikallerdir ve vücuttaki serbest radikal hasarının en önemli sorumlularındandırlar. Hidroksil
radikalleri özellikle hücresel moleküllerle etkileşerek ikincil bir radikal oluştururlar.
Hidroksil Radikali Reaksiyonları:
1-Hidrojen abstraksiyonu
H3 C − CH2 − OH + HO ⋅ → H3 C − C ⋅ H − OH + H2 O
2-Çift bağlara çapraz katılım
R 2 C = CR 2 + HO ⋅ → R 2 (OH)C − C ⋅ R 2
3-Halojen iyonlarıyla reaksiyon
Cl − + OH ⋅ → Cl ⋅ + HO Serbest Radikal Hasarları:
İkincil radikaller diğer moleküllerle reaksiyona girerler ve radikalik reaksiyonlar zincirleşerek
devam eder. Zincirleme peroksidasyon sonucu son ürün olarak aldehitler oluşur ve reaksiyon
sona erer. Oluşan aldehit yapılarından biri de malondialdehittir. Oluşan malondialdehit
2
proteinlere, DNA’ya saldırarak yapıları bozar. Malondialdehit düzeyinin belirlenmesi oluşan
lipid peroksidasyonunun belirlenmesini sağlar.
DNA onarım
enzimlerinde
bozulma
DNA
denaturasyonu
Serbest Radikallerin Protein Üzerine Etkileri:
Lİ
SE
Sİ
Serbest Radikallerin DNA Üzerine Etkileri:
Yeniden
düzenlenme
Baz çifti
mutasyonları
EG
E
*Özellikle histidin, tirozin, fenilalanin gibi amino asitlerle karbonil grubu oluşumu
*Proteinlerde fragmantasyon ve çapraz bağ oluşumu
*Protein fonksiyonunda bozulma
*Bağışıklık sistemini uyarabilecek antijenik değişiklikler
Ö
ZE
L
Hücre dışında oluşan serbest radikaller, hücre bileşenleri ile etkileşebilmek için hücre
membranını geçmek zorundadırlar. Bu durumda hücre membranı kritik bir hedef oluşturur.
Serbest Radikallerin Lipidler Üzerine Etkileri
Enerji açığa çıkmazsızın lipidler okside olunca doymamış lipidler moleküler oksijenle
doğrudan reaksiyona girdiklerinden oksidatif bozulmaya uğrarlar. Bu proses lipid
peroksidasyonu olarak adlandırılır.
Lipid peroksidasyonunun mekanizması 1940 yılında aydınlatılmıştır. Lipid peroksidasyonu
zincirleme bir şekilde devam ettikten sonra sitotoksik son ürünler olan aldehitlerin oluşumu ile
sonlanmaktadır.
3
ÇALIŞMAMIZ
Bu çalışmada marul bitkisi farklı konsantrasyonda krom metaline maruz bırakılarak sebzede
yarattığı lipit peroksidasyon düzeyinin saptanması amaçlanmıştır.
Materyal ve Yöntem
Lİ
SE
Sİ
Çalışmamızda kullanılan tiyobarbütirik asit Merck firmasından temin edildi. Kullanılan diğer
kimyasallar analitik saflıktadır.
Temin edilen marul fideleri eşit büyüklükteki saksılara ekilerek iki hafta sonra 100 mg/l,
250 mg/l ve 500 mg/l derişiminde krom metali ile sabit hacimde uygulamanın ardından belirli
zaman aralıklarında marul yaprakları toplandı. Kontrol grubu da dahil her bir örnek pH 7,0
50 mM fosfat tamponunda homojenize edilerek santrifüjlendi. Santrifüjlemenin ardından üst
fazları malondialdehit düzeyinin saptanması amacıyla –20 0C de depolandı. Her bir örnekte
malondialdehit düzeyi tiyobarbütirik asit reaktifi kullanılarak spektrofotometrik olarak
belirlendi. MDA miktarının hesaplanmasında 0-15 µM konsantrasyon aralığında
1,1,3,3-tetrametoksipropan ile çizilen standart grafik kullanıldı.
Malondialdehid (MDA) Tayini
Reaktifler:
EG
E
Marul örneklerinde lipid peroksidasyon düzeylerinin belirlenmesi, oluşan MDA’ nın TBA
reaktifi kullanılarak spektrofotometrik tayinine dayanmaktadır. Oluşan MDA, TBA ile
kompleks oluşturur.
Oluşan renkli kompleksin absorbans şiddeti 532 nm’ de belirlendi. MDA miktarının
hesaplanmasında 0-15 µM konsantrasyon aralığında 1,1,3,3-tetrametoksi propan ile çizilen
standart grafiği kullanıldı.
TCA: %20’ lik trikloroasetik asit
TBA: %20’ lik (w/v) TCA içinde %0.8’ lik(w/v) tiyobarbütirik asit
Ö
ZE
L
Yöntem:
Deney tüpüne 1 ml örnek 1 ml distile su konulup üzerine 2 ml TBA reaktifi eklendi,
vortexlemenin ardından 95 oC’ de 30 dakika inkübe edildi. İnkübasyonun ardından tüpler
soğutularak 532 nm’ de suya karşı absorbans değerleri kaydedildi.
SONUÇLAR VE TARTIŞMA
Eşit kaplara 4’ er adet olmak üzere dikilen marul fideleri belirli periyod ve miktarlarda
sulanarak iki hafta boyunca hiçbir uygulama yapılmadı. Resim 1’ de uygulama öncesi marul
içeren saksılar görülmektedir.
Belirli büyüklüğe ulaşan marul fideleri süre sonunda 100 mg/l,
250 mg/l ve 500 mg/l
derişiminde krom metali içeren sulu çözeltiyle muamele edilerek haftada bir olmak üzere
marul yaprağı örnekleri toplandı (Resim 2). Toplanan marul yaprakları(Resim 3) tartılarak
malondialdehid tayini yapılmadan önce -20oC’ de depolandı.
Ağır metale maruz bırakılmamış kontrol grubu da dahil her bir örnekte malondialdehit
düzeyinin belirlenmesi amacıyla ayırılan marul yaprakları tartılarak pH 7,0 50 mM fosfat
tamponunda homojenizasyonun ardından 5000 rpmx30 dak santrifüjün ardından üst fazlar
MDA tayini için stoklandı. MDA düzeyi çizilen standart grafik yardımıyla belirlendi.
4
Lİ
SE
Sİ
EG
E
Resim 1: Uygulama Öncesi Örnek
Ö
ZE
L
Resim 2: Farklı Konsantrasyonlarda Metal Uygulama
Resim 3: Marul Yapraklarının Toplanması
5
Çizilen standart grafik, denklemi y=0,106x olarak hesaplandı. grafikte 0-15 µM
konsantrasyon aralığında 1,1,3,3-tetrametoksipropan kullanılarak ile çizilen standart grafik
verildi(Grafik 1).
2
1,5
1
0,5
0
0
5
Lİ
SE
Sİ
A (532n m)
Bilinmeyen örnekler de 532 nm de okunan absorbans değerleri denklemde yerine konularak
her bir örnekte MDA düzeyi saptandı.
10
15
20
EG
E
C (µM)
Grafik 1: MDA Standart Grafiği
Ö
ZE
L
Farklı dozlarda ağır metale maruz bırakılmış marul örneklerinde 3 haftalık uygulama sonrası
marul kütleleri de dikkate alınarak saptanan MDA düzeyleri grafik 2’ de görülmektedir. Krom
uygulamanın 3 haftalık periyod boyunca marul yapraklarında çok fazla bozulma yaratmadığı
saptanmış olup 3. uygulama sonrası MDA düzeyleri her bir doz için sırasıyla 2.158 µM/mgmarul, 2.321 µM/mg-marul, 3.071 µM/mg-marul gibi düşük değerdedir.
Resim 4:Metal Uygulama Sonrasında Marul Fideleri
6
3
2
1
0
1
100 mg
2
Lİ
SE
Sİ
MDA(µ M/mg-marul)
4
3
250 mg
Hafta
4
500 mg
Ö
ZE
L
EG
E
Grafik 2: Krom uygulanmış Marullarda MDA Düzeyleri
7
KAYNAKÇA
1-Touati D., in: Scandalios J.G. (Ed.), Oxidative Stress and the Molecular Biology of
Antioxidant Defenses,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1997, 447–493.
Ö
ZE
L
EG
E
Lİ
SE
Sİ
2-Özdemir, G., Hamarat Baysal, Ş., “Chromium and alımınum biosorption on Chrysomonas
luteola” , Applied Microbiology and Biotechnology, 64, 599-603, 2004.
8