Cisplatin AML Hücrelerinde URG4/URGCP Üzerinden DNA Tamir

Cisplatin AML Hücrelerinde URG4/URGCP Üzerinden DNA Tamir Mekanizmasını Düzenler Mi?
Doç. Dr. Yavuz Dodurga
Yavuz Dodurga1, Mücahit Seçme1, Levent Elmas1, Nazlı Şirin1, Yasemin Işık Balcı2
1Pamukkale Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji ve Genetik AD., Denizli, Türkiye
2Pamukkale Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Pediatrik Hematoloji BD., Denizli, Türkiye
Lökomogenez; Tüm kanserlerde olduğu gibi lösemilerde tek bir
mutant hücreden köken alan kemik iliği öncül hücrelerinin klonal bir
bozukluğu olarak tanımlanır.
Lösemiye Eğilim Yaratan Durumlar
Çevresel Faktörler
İyonize Radyasyon Kimyasal etmenler (pestisid, herbisid, petrol ürünleri, benzen, hidrokinon...) Hamilelikte alkol kullanımı Hamilelikte sigara, mariuana kullanımı Beslenme Enfeksiyonlar (Onkogenik retrovirüsler) Hastalıklar
Primer Trombositopeni Klonal Sitopeniler Aplastik Anemi MDS/Refrakter sitopeni Akkiz AA Genetik Bloom Sendromu Ataksi‐pansitopeni Down Sendromu Kostmann Sendromu Diskeratozis konjenita Fankomi anemisi Naksoz Sendromu Nörofibromatöz Noonan Sendromu Poland Sendromu Rothmund‐Thomson Sendromu Seckel Sendromu Shwachman Sendromu Werner Sendromu Akut myeloblastik lösemi (AML), hematopoetik malignitelerin heterojen bir grubu olup anormal lösemik
blastların ve normal kan hücrelerinin bozulmuş üretimi ile karakterizedir.
 Cisplatin, kemoterapide kanseri tedavi etmek için kullanılan
bir ilaçtır (solid tümörlerde).
Cisplatin, genomik DNA'ya bağlanarak yapısını bozan böylece
DNA'da hasar oluşturarak DNA replikasyonunu veya transkripsiyonu
engelleyerek kanser hücresinin ölümüne neden olan, sitotoksik
süreçleri tetikleyen bir bileşiktir.
Up-regulated Gene 4 (URG4)/
Upregulator of cell proliferation
(URGCP)
• Şatıroğlu-Tufan ve arkadaşları tarafından,
– Hepatit B Virus aracılı Hepatosellüler kanser gelişiminde rol
alan bir gen olarak tanımlanmış,
– “Up-Regulated-Gene-4 (URG4)” olarak isimlendirilmiş
– Amerika’daki National Center for Biotechnology
Information-Gen Bankasına (NCBI-GenBank, Entrez
GeneID: 55665 ve Entrez Nükleotid ID NM_017920) kayıt
edilmiştir.
URG4/URGCP
~3600 bç
8 ekzon
922 aa
104 kD
ATP / GTP bağlanma bölgesi
(690 ‐ 697 aa)
7. kromozomun kısa kolunda lokalizedir (7p13)
ve daha önce tanımlanan genler ile herhangi bir homoloji Ø.
Özgün ‐ Yeni bir gen
• Feitelson ve arkadaşları, URG4’ün hepatoselüler
karsinoma olgularının ön taramasında
kullanılabilecek güçlü bir preneoplastik marker
olabileceğini göstermiştir.
• Ekibimiz ve diğer araştırmacılar tarafından,
–
–
–
–
–
–
–
–
Lösemi,
Mide kanseri,
Osteosarkom,
Prostat kanseri,
Nöroblastom,
Akciğer kanseri, Gliom,
Medullar tiroid kanseri…
• Bu yeni çalışmalar ışığında URG4’ün lökomogenezde rol alabileceğini ve aynı zamanda kanser tedavisinde de umut verici bir terapötik hedef olabileceğini düşündürmüştür.
Amaç
• Bu çalışmamızda amaç, cisplatinin
hattı) hücre hatlarında,
Kasumi‐1 (AML hücre
– hücre proliferasyonuna etkisi,
– DNA tamiri ve hücre döngüsü ile ilişki genlerin ve özgün bir
onkogen olan URG4/URGCP geninin ekspresyon değişimlerine
etkisini
– DNA hasarı oluşumuna etkisini belirlemektir.
•
Leukemogenesis as a new approach to investigate the correlation between up regulated gene
4/upregulator of cell proliferation (URG4/URGCP) and signal transduction genes in leukemia. Dodurga
Y, Oymak Y, Gündüz C, Satıroglu‐Tufan NL, Vergin C, Cetingül N, Biray Avci C, Topçuoğlu N. Mol Biol
Rep. 2013 Apr;40(4):3043‐8. doi: 10.1007/s11033‐012‐2378‐1. Epub 2012 Dec 25.
•
Higher expression of the novel gene upregulated gene 4 in two acute lymphoblastic leukemia
patients with poor prednisolone response. Oymak Y, Dodurga Y, Turedi A, Yaman Y, Ozek G,
Carti O, Gunes BT, Erbudak E, Berber E, Avci CB, Vergin C. Acta Haematol. 2012;128(2):73‐6. doi:
10.1159/000338220. Epub 2012 Jun 6.
Materyal-Metod
• Kasumi‐1 hücre hattı çoğaltılması
• Sitotoksisite testleri
• Total RNA eldesi ve cDNA sentesi
• Real Time PCR ile analiz
• Komet assay yöntemi
• İstatistiksel analiz
Materyal-Metod
•
Kasumi‐1 hücre hattı RPMI1640 besi ortamında üretildi. (% 10 fötal sığır serumu
100IU/ml penisilin ve 100mg/ml streptomisin 25 mM L‐glutamin) (370C’de, %95
nemli ortamda % 5 CO2 ‘li etüvde inkübasyon)
Sitotoksisite Testleri
Cisplatinin
2,5
–
160
µM
aralığındaki dozları Kasumi‐1 lösemi
hücre hattına uygulanmış ve hücre
canlılığına
olan
zamana
bağlı
etkisi,
doz
olarak,
ve
canlı
hücrelerden ATP ölçümüne dayalı
hassas bir lüminometrik bir yöntem
olan Celltiter‐ Glo yöntemi ile
belirlenmiş (24, 48, 72 saat).
Total RNA İzolasyonu/cDNA Sentezi
 Genlerin ekspresyon düzeylerinin
tespiti için kontrol ve doz olmak
üzere her bir hücre gurubu
süspansiyonundan
izolasyonu
total
Trizol
RNA
ile
gerçekleştirilmiştir.
 cDNA
sentezi
transkripsiyon
için
revers
prosedürü,
Transcriptor First Strand cDNA
Synthesis
Kit
gerçekleştirilmiştir.
kullanılarak
Real‐Time PCR ile mRNA Ekspresyon Değişimlerinin Belirlenmesi
p53, ATM, ATR, CHECK1, CHECK2, CDC25A, CDC25C, ERCC1,
GADD45A, GADD45G, CCND1, CDK6, BAX, BCL‐2 ve
URG4/URGCP genlerinin mRNA düzeyindeki ekspresyon
değişimleri RT‐PCR yöntemiyle belirlenmiştir.
Komet Assay Analizi ile DNA Hasarının Belirlenmesi
Cisplatinin
belirlenmiştir.
Kasumi‐1
hücrelerinde
DNA
hasarına
olan
etkisi
İstatiksel Analiz
 Verilerin analizi ∆∆CT metodu kullanılarak bilgisayar programı ile kantitasyonu
yapıldı. Web tabanlı “RT² Profiler™ PCR Array Data Analysis“ programında bulunan,
Volcano Plot analizleri kullanıldı.
 Metodun amacı, iki ekspresyon sonucunun ±3SD karşılaştırılması esasına
dayanmaktadır. Böylelikle, gen ekspresyonunun karşılaştırılması yapılan durumlarda
kontrol ve doz grubu ilgili genlerin ekspresyon değerleri rölatif olarak belirlendi.
 Grupların karşılaştırılması “RT² Profiler™ PCR Array Data Analysis” programında
bulunan “Student t‐testi” analizi ile istatistiksel olarak değerlendirildi.
Bulgular/Sonuçlar
Sitotoksisite Testleri
Cisplatinin IC50 dozu; Kasumi‐1 lösemi hücre hattı için 48. saatte 160 µM
olarak hesaplanmıştır.
Bulgular/Sonuçlar
RT‐PCR Kontrol
grubu
ile karşılaştırıldığında,
cisplatin uygulanan Kasumi‐1 hücrelerinde
ATM,
CHECK
1,
CDC25C,
GADD45A,
GADD45G, CCND1, CDK 6, BCL‐2 ve
URG4/URGCP
istatistiksel
genlerinin
olarak
ekspresyonları
anlamlı
şekilde
azalmışken, p53 geninin ekspresyonunda
ise istatistiksel olarak anlamlı şekilde artış
gözlenmiştir (p<0,05).
Kontrol grubuna göre KASUMİ-1
hücrelerindeki ekspresyon değişimleri
Bulgular/Sonuçlar
Komet Assay
Kuyruk uzunluğu ve kuyruktaki DNA yüzdesi doz grubunda anlamlı olarak
arttığı analiz edildi (p<0,05)
Sonuç olarak;
 Yeni tanı AML hastaları (farklı kurumlarla işbirliği ile) ve farklı gen
profilleri değerlendirmek böylelikle ALL/AML olguların ayırıcı
tanısında ya da olguların tanı alabilmesinde kullanılabilecek aday
moleküler genetik belirteç olabileceğini düşünmekteyiz
 Yeni onkogen olan URG4’ ün lökomogenez’deki olası etki
mekanizmasını aydınlatması ile yeni gen profil modelleri ile
tedavinin takibi ve yeni tedavi protokollerinin etkinliğinin erken
dönemlerde anlaşılabilmesine katkıda bulunulabilecektir ve
kesin tanı almamış olgularda da tanıya moleküler genetik bir
yaklaşım getirilebilecektir
 Çocukluk çağı lösemilerde hücre sinyal ileti yolaklarında
görülen gen etkileşimlerindeki bozuklukların tanımlanması
için yapılan genetik çalışmalar;
Lökomogeneze ışık tutabilmesi ve prognoza yönelik yeni
hedef
sağaltım
gerekmektedir.
modellerinin
geliştirilmesi
için