BYM613 Genetik Mühendisliği Mutasyonlar ve Doğal Gen Transfer Mekanizmaları Hacettepe Üniversitesi Biyomü Biyomühendislik Bö Bölümü 20122012-2013 Gü Güz Dö Dönemi Dr. Eda Çelikelik-AKDUR [email protected] MUTASYON bir canlı canlının genomu içindeki DNA ya da RNA diziliminde meydana gelen kalı kalıcı değ değişimlerdir. Mutasyonlar geri dö dönüşümsü msüzdü zdür. Spontane veya uyarı uyarılmış lmış olabilir Mutasyona sahip bir organizma mutant olarak adlandı adlandırılır. 2 1 Sessiz mutasyon → fenotipte etkisi olmayan veya anlamsı anlamsız (dur kodonu oluş oluşur) mutasyonlar → kodlanan proteinin amino asit dizisinde değ değişiklikler oluş oluşur, ölüme bile neden olabilir. Yanlış Yanlış anlamlı anlamlı Oksitlenme, alkilleyeci hasarlar hasarlar hariç hariç ajanlar gibi DNA’ DNA’da meydana gelen Biyoteknolojik yö yöntemlerle mutasyonlar oluş oluşturulabilir ve mutant suş suşlar elde edilebilir 3 Mutasyonlar Nasıl Gerçekleşir ? Nokta Mutasyonları = Tek baz değ değişimi Bir bazı bazın (A, T, G, C) baş başka bir bazla yer değ değiştirmesi Zincire bir ya da daha çok bazı bazın eklenmesi Zincirdeki bazları bazların eksilmesi Replikasyon hatası E. coli’deki spontan mutasyon oranı, replikasyon sırasında zincire eklenen1010 bazda yaklaşık bir bazdır. Ör: 4 2 Çerçeve Kayması Mutasyonları Çerç erçeve kayması kayması mutasyonu bir genin protein kodlayan kı kısmı smında ya birkaç birkaç baz çiftinin girmesi ya da çıkması kması ile oluş oluşan mutasyon çeşididir. Bu girme ya da çıkma noktası noktasından itibaren kodonları kodonların doğ doğru okuma çerç erçevesinde bir kayma olur, protein farklı farklı kodlanı kodlanır. 5 Geri Mutasyon - Reversiyon Mutantlar, kendi DNA'ları DNA'larında oluş oluşan bazı bazı mutasyonlar sonucu tekrar orijinal (parental) veya doğ doğal formları formlarını kazanabilirler (geri mutasyon). Bu olguda, değ değişen amino asit tripleti, geri mutasyonla tekrar orijinal amino asiti kodlayan triplet haline gelebilir. Canlı Canlılar tekrar orijinal fenotipik karakterlerine kavuş kavuşabilir. Bö Böyle durumlara, aynı aynı gende oluş oluşan supresö supresör mutasyonlar (intragenik) veya kromozom üzerinde baş başka gende meydana gelen mutasyonlar (ekstragenik supresö supresörler) yol aç açabilirler. 6 3 İndüklenmiş ve/veya Yapay Mutasyonlar Eğer hü hücreler mutajenik ajanlara (kimyasal, fiziksel, biyolojik, vs.) maruz kalı kalırsa (doğ (doğada veya labda), mutantlar meydana gelebilir. Mutajenler spesifik değ değildir. 7 Mutajenler Sıcaklık, manyetik ve elektriksel alan, UV, proton, nötron ışınlamaları gibi etkenler genellikle baz çifti değişimlerine yol açarlar. Sıcaklığın her 100°C yükseltilmesiyle organizmalarda mutasyon oranı ~ 5 kat artar. X ve γ ışınları gibi iyonlaştırıcı ışınlar kuvvetli fiziksel mutagenlerdir. Çoğunlukla büyük, bazen de nokta mutasyonlar meydana getirirler. Bazı kimyasal maddeler, hücrenin yaşam çevriminin herhangi bir evresinde, DNA’yı doğrudan etkileyerek bazların kimyasal yapısını değiştirebilirler. 8 4 Spontan Mutasyonlar Belirli bir dış etki olmaksızın, normal hücresel etkinlikler ya da ortamla gelişi güzel etkileşimlerin sonucunda ortaya çıkan mutasyonlar. Mutasyonların kendiliğinden meydana gelme olasılığı çok düşük. Genelde, tek bir gende kendiliğinden mutasyon olasılığı her dölde (her replikasyon sırasında) hücre başına ~10-5 -10-10. Uyarı Uyarılmış lmış Mutasyonlar Mutajen adı verilen kimyasal veya fiziksel etkenlerle meydana gelen mutasyonlardır. Mutajenlerin kullanılması mutasyon meydana gelme olasılığını çok artırır. DNA da bazı bölgelerde (sıcak bölge) mutasyon oranı daha yüksek olabilir. Bir mutajenin etkinliği, arka planın üzerine, mutasyon derecesini ne kadar yükselttiğiyle değerlendirilir. Mutajenler genellikle genler üzerinde fark gözetmeden etkili genelde genlerin yapay mutasyona uğrama 9 şansları eşittir. ⇒ Mutantlar… hücre fizyolojisinin anlaşı labilmesi iç anlaşılabilmesi için araç araç endü endüstriyel organizmalar kadar değ değerli - kapasite üstü stü üretim iç için kullanı kullanılma şansı ansına sahip Mutasyonun uyarı uyarılması lması ve mutant seç seçimi bioproses uygulamaları uygulamaları için önemlidir Ölümcü mcül mutasyon => mutantı mutantı inceleyemeyebiliriz 10 5 Örnek Cynthia Kenyon, 2011. http://www.ted.com/talks/cynthia_kenyon_experiments_that_hint_of_longer_lives.html Seç Seçilebilir Mutasyon Mutant hü hücrelerin yaş yaşayabileceğ ayabileceği önceden belirlenmiş belirlenmiş çevre koş koşulları ulları vardı vardır. Mutant suş suş, bu koş koşullarda yaş yaşamayı amayı baş başarı arırken doğ doğal suş suş ölür; bu sayede mutant seç seçimi yapı yapılmış lmış olur. 11 Seç Seçilemeyen Mutasyon Doğ Doğal ve mutant suş suşları ların ayı ayırt edilebileceğ edilebileceği bir kültü ltür ortamı ortamı hazı hazırlanamaz. Mutant hü hücreler hü hücre hücre denenerek tespit edilir. HighHigh-throughput screening ?! 12 6 Direk veya Dolaylı Seçim Ör: Antibiyotik resistansı -> direk Lizin oksotrof (auxotroph) -> dolaylı Sıcaklığa duyarlı -> koşullu 13 Replicate Plating Belli bir suş suş soyunun, belli bir metabolit iç için oksotrof olup olmadığı nı olmadığın anlamaya yarayan hı hızlı zlı bir gö görüntü ntüleme tekniğ tekniğidir. 14 7 Replicate Plating 15 SiteSite-Directed Mutagenesis Bölgesel Yö Yönlendirilmiş nlendirilmiş Mutasyon • Labda mutant yaratmak için kullanılan yöntemin temeli => • Hazır kitleri mevcut 16 8 BAKTERİLERİN DOĞAL GEN TRANSFER MEKANİZMALARI 1. Genetik Rekombinasyon 2. Transformasyon 3. Transdü Transdüksiyon 4. Epizomlar ve Konjugasyon 5. Transpozonlar: İç Gen Aktarı Aktarımı 17 1.Genetik Rekombinasyon DNA molekülüne ait parçaların (DNA dizilerinin) birbirlerine göre yerleşimlerinin çeşitli yollarla değişmesiyle meydana gelen yeni yerleşim düzenlemelerine rekombinasyon denir. Günümüzdeki tüm organizmaların DNA’ları rekombinanttır. Genomda şifrelenen ve aktiviteleri düzenlenen enzimler tarafından katalizlenen temel bir süreçtir. “Homolog rekombinasyon” gen aktarımında kullanılan bir tekniktir. 18 9 Homolog Rekombinasyon Bir bireyin sahip olduğu DNA moleküllerinin veya aynı türe (ya da yakın türlere) ait bireylerin DNA’larının homoloji (benzerlik) gösteren bölgeleri arasında parça hareketleridir. Ökaryotlarda crossing-over yoluyla, bakterilerde transformasyonla gerçekleşir. 19 2. Transformasyon Bakterilerde transformasyon, hücre veya proteinlerle beraber olmayan DNA'nın alınması sonucu meydana gelen istikrarlı kalıtsal değişiklik olarak ifade edilebilir. Bakterinin ortamdan yabancı DNA'yı içine alabilme özelliğine yetkinlik (competence) adı verilir. Yetkinliğin iki tipini ayırd etmek gerekir: Doğal Yetkinlik: Bu türler, DNA'nın hücre zarı içinden içeri taşınmasını sağlayan mekanizmalar için gereken genlere sahiptir. Yapay Yetkinlik: Yapay yetkinlik için gerekli proteinler hücrenin genleri tarafında kodlanmaz. Laboratuvar işlemleri ile, yani doğada normalde rastlanmayan şartlar altında, hücre zarı 'nın DNA'ya geçirgen olması sağlanır. 20 10 3. Transdüksiyon Bir bakteriden (verici) diğerine (alıcı) bir bakteriyofaj aracılığıyla DNA molekülü parçası taşınması olayıdır. İkiye ayrılır; 1. Genel (kı (kısıtlı tlı olmayan) transdü transdüksiyon : Virü Virüs DNA’ DNA’sı kromozoma entegre olmaz 2. Özel (kı (kısıtlı tlı ) transdü transdüksiyon: Virü Virüs DNA’ DNA’sı kromozoma entegre olur 21 22 11 4. Epizomlar ve Konjugasyon Epizom, konak organizmanın kromozom DNA’sı ile bütünleşebilen bir plazmiddir (Ör: F plasmid). Bu yüzden uzun süre bütünlüğünü koruyabilir, her hücre bölünmesinde kopyalanır ve genetik yapının bir parçası olarak varlığını sürdürür. Konjugasyon, bakteriler arası arasında direk temas ve kö köprü prü oluş oluşması ması suretiyle verici DNA segmentlerinin alı alıcı hücrelere geç geçmesidir. 23 5. Transpozonlar Transpozonlar bakteri DNA’sı, plazmidleri ve bakteriofajları arasında yer değiştiren DNA parçacıklarıdır. Yer değiştirdikleri için bunlara aynı zamanda “sıçrayıcı genler” de denir. Bakterilerde genelde antibiyotik Insanlarda da mevcuttur. Tranpozonların kimi kendini kopyalayarak, kimi kendini çevreleyen DNA'dan kesip çıkarak hareket eder. Bu özelliklerinden dolayı, bilim adamları transpozonları canlılardaki DNA'yı değiştirmek için bir araç olarak kullanırlar. 24 resistansını kodlarlar. 12