Genetik Mühendisliği - Hacettepe Üniversitesi

advertisement
BYM613
Genetik Mühendisliği
Mutasyonlar ve Doğal Gen Transfer Mekanizmaları
Hacettepe Üniversitesi
Biyomü
Biyomühendislik Bö
Bölümü
20122012-2013 Gü
Güz Dö
Dönemi
Dr. Eda Çelikelik-AKDUR
[email protected]
MUTASYON bir canlı
canlının genomu içindeki DNA ya da RNA
diziliminde meydana gelen kalı
kalıcı değ
değişimlerdir.
Mutasyonlar geri dö
dönüşümsü
msüzdü
zdür.
Spontane veya uyarı
uyarılmış
lmış olabilir
Mutasyona sahip bir organizma mutant olarak adlandı
adlandırılır.
2
1
Sessiz mutasyon
→ fenotipte etkisi olmayan
veya anlamsı
anlamsız (dur kodonu oluş
oluşur) mutasyonlar
→ kodlanan proteinin amino asit dizisinde değ
değişiklikler oluş
oluşur,
ölüme bile neden olabilir.
Yanlış
Yanlış anlamlı
anlamlı
Oksitlenme, alkilleyeci
hasarlar
hasarlar hariç
hariç
ajanlar gibi DNA’
DNA’da meydana gelen
Biyoteknolojik
yö
yöntemlerle mutasyonlar oluş
oluşturulabilir ve mutant
suş
suşlar elde edilebilir
3
Mutasyonlar Nasıl Gerçekleşir ?
Nokta Mutasyonları
= Tek baz değ
değişimi
Bir bazı
bazın (A, T, G, C)
baş
başka bir bazla yer
değ
değiştirmesi
Zincire bir ya da daha çok
bazı
bazın eklenmesi
Zincirdeki bazları
bazların
eksilmesi
Replikasyon hatası
E. coli’deki spontan mutasyon oranı, replikasyon
sırasında zincire eklenen1010 bazda yaklaşık bir bazdır.
Ör:
4
2
Çerçeve Kayması Mutasyonları
Çerç
erçeve kayması
kayması mutasyonu bir genin protein
kodlayan kı
kısmı
smında ya birkaç
birkaç baz çiftinin girmesi ya da
çıkması
kması ile oluş
oluşan mutasyon çeşididir.
Bu girme ya da çıkma noktası
noktasından itibaren
kodonları
kodonların doğ
doğru okuma çerç
erçevesinde bir kayma
olur, protein farklı
farklı kodlanı
kodlanır.
5
Geri Mutasyon - Reversiyon
Mutantlar, kendi DNA'ları
DNA'larında oluş
oluşan bazı
bazı
mutasyonlar sonucu tekrar orijinal (parental)
veya doğ
doğal formları
formlarını kazanabilirler (geri
mutasyon). Bu olguda, değ
değişen amino asit
tripleti, geri mutasyonla tekrar orijinal amino
asiti kodlayan triplet haline gelebilir.
Canlı
Canlılar tekrar orijinal fenotipik karakterlerine
kavuş
kavuşabilir. Bö
Böyle durumlara, aynı
aynı gende
oluş
oluşan supresö
supresör mutasyonlar (intragenik)
veya kromozom üzerinde baş
başka gende
meydana gelen mutasyonlar (ekstragenik
supresö
supresörler) yol aç
açabilirler.
6
3
İndüklenmiş ve/veya Yapay Mutasyonlar
Eğer hü
hücreler mutajenik ajanlara (kimyasal, fiziksel,
biyolojik, vs.) maruz kalı
kalırsa (doğ
(doğada veya labda),
mutantlar meydana gelebilir.
Mutajenler spesifik değ
değildir.
7
Mutajenler
Sıcaklık, manyetik ve elektriksel alan, UV, proton, nötron
ışınlamaları gibi etkenler genellikle baz çifti değişimlerine yol
açarlar.
Sıcaklığın her 100°C yükseltilmesiyle organizmalarda
mutasyon oranı ~ 5 kat artar.
X ve γ ışınları gibi iyonlaştırıcı ışınlar kuvvetli fiziksel
mutagenlerdir. Çoğunlukla büyük, bazen de nokta
mutasyonlar meydana getirirler.
Bazı kimyasal maddeler, hücrenin yaşam çevriminin
herhangi bir evresinde, DNA’yı doğrudan etkileyerek bazların
kimyasal yapısını değiştirebilirler.
8
4
Spontan Mutasyonlar
Belirli bir dış etki olmaksızın,
normal hücresel etkinlikler
ya da ortamla gelişi güzel
etkileşimlerin sonucunda
ortaya çıkan mutasyonlar.
Mutasyonların kendiliğinden
meydana gelme olasılığı çok
düşük.
Genelde, tek bir gende
kendiliğinden mutasyon
olasılığı her dölde (her
replikasyon sırasında) hücre
başına ~10-5 -10-10.
Uyarı
Uyarılmış
lmış Mutasyonlar
Mutajen adı verilen kimyasal veya
fiziksel etkenlerle meydana gelen
mutasyonlardır.
Mutajenlerin kullanılması mutasyon
meydana gelme olasılığını çok artırır.
DNA da bazı bölgelerde (sıcak bölge)
mutasyon oranı daha yüksek olabilir.
Bir mutajenin etkinliği, arka planın
üzerine, mutasyon derecesini ne
kadar yükselttiğiyle değerlendirilir.
Mutajenler genellikle genler üzerinde
fark gözetmeden etkili
genelde
genlerin yapay mutasyona uğrama
9
şansları eşittir.
⇒
Mutantlar…
hücre fizyolojisinin anlaşı
labilmesi iç
anlaşılabilmesi
için araç
araç
endü
endüstriyel organizmalar kadar değ
değerli - kapasite
üstü
stü üretim iç
için kullanı
kullanılma şansı
ansına sahip
Mutasyonun uyarı
uyarılması
lması ve mutant seç
seçimi
bioproses uygulamaları
uygulamaları için önemlidir
Ölümcü
mcül mutasyon => mutantı
mutantı inceleyemeyebiliriz
10
5
Örnek
Cynthia Kenyon, 2011.
http://www.ted.com/talks/cynthia_kenyon_experiments_that_hint_of_longer_lives.html
Seç
Seçilebilir Mutasyon
Mutant hü
hücrelerin
yaş
yaşayabileceğ
ayabileceği
önceden belirlenmiş
belirlenmiş
çevre koş
koşulları
ulları vardı
vardır.
Mutant suş
suş, bu
koş
koşullarda yaş
yaşamayı
amayı
baş
başarı
arırken doğ
doğal suş
suş
ölür; bu sayede
mutant seç
seçimi
yapı
yapılmış
lmış olur.
11
Seç
Seçilemeyen Mutasyon
Doğ
Doğal ve mutant suş
suşları
ların
ayı
ayırt edilebileceğ
edilebileceği bir
kültü
ltür ortamı
ortamı
hazı
hazırlanamaz.
Mutant hü
hücreler hü
hücre
hücre denenerek tespit
edilir.
HighHigh-throughput
screening ?!
12
6
Direk veya Dolaylı Seçim
Ör:
Antibiyotik resistansı -> direk
Lizin oksotrof (auxotroph) -> dolaylı
Sıcaklığa duyarlı -> koşullu
13
Replicate Plating
Belli bir suş
suş soyunun,
belli bir metabolit iç
için
oksotrof
olup olmadığı
nı
olmadığın
anlamaya yarayan hı
hızlı
zlı
bir gö
görüntü
ntüleme
tekniğ
tekniğidir.
14
7
Replicate Plating
15
SiteSite-Directed Mutagenesis
Bölgesel Yö
Yönlendirilmiş
nlendirilmiş Mutasyon
• Labda mutant yaratmak için
kullanılan yöntemin temeli =>
• Hazır kitleri mevcut
16
8
BAKTERİLERİN DOĞAL GEN TRANSFER
MEKANİZMALARI
1. Genetik Rekombinasyon
2. Transformasyon
3. Transdü
Transdüksiyon
4. Epizomlar ve Konjugasyon
5. Transpozonlar: İç Gen Aktarı
Aktarımı
17
1.Genetik Rekombinasyon
DNA molekülüne ait parçaların (DNA dizilerinin) birbirlerine
göre yerleşimlerinin çeşitli yollarla değişmesiyle meydana gelen
yeni yerleşim düzenlemelerine rekombinasyon denir.
Günümüzdeki tüm organizmaların DNA’ları rekombinanttır.
Genomda şifrelenen ve aktiviteleri düzenlenen enzimler
tarafından katalizlenen temel bir süreçtir.
“Homolog rekombinasyon” gen aktarımında kullanılan bir
tekniktir.
18
9
Homolog Rekombinasyon
Bir bireyin sahip olduğu DNA moleküllerinin veya
aynı türe (ya da
yakın türlere) ait bireylerin DNA’larının homoloji (benzerlik) gösteren
bölgeleri arasında parça hareketleridir.
Ökaryotlarda crossing-over yoluyla, bakterilerde transformasyonla
gerçekleşir.
19
2. Transformasyon
Bakterilerde transformasyon, hücre veya proteinlerle beraber
olmayan DNA'nın alınması sonucu meydana gelen istikrarlı
kalıtsal değişiklik olarak ifade edilebilir.
Bakterinin ortamdan yabancı DNA'yı içine alabilme özelliğine
yetkinlik (competence) adı verilir.
Yetkinliğin iki tipini ayırd etmek gerekir:
Doğal Yetkinlik: Bu türler, DNA'nın hücre zarı içinden içeri
taşınmasını sağlayan mekanizmalar için gereken genlere
sahiptir.
Yapay Yetkinlik: Yapay yetkinlik için gerekli proteinler
hücrenin genleri tarafında kodlanmaz. Laboratuvar işlemleri
ile, yani doğada normalde rastlanmayan şartlar
altında, hücre zarı 'nın DNA'ya geçirgen olması sağlanır.
20
10
3. Transdüksiyon
Bir bakteriden (verici) diğerine (alıcı) bir
bakteriyofaj aracılığıyla DNA molekülü
parçası taşınması olayıdır.
İkiye ayrılır;
1. Genel (kı
(kısıtlı
tlı olmayan) transdü
transdüksiyon :
Virü
Virüs DNA’
DNA’sı kromozoma entegre olmaz
2. Özel (kı
(kısıtlı
tlı ) transdü
transdüksiyon:
Virü
Virüs DNA’
DNA’sı kromozoma entegre olur
21
22
11
4. Epizomlar ve Konjugasyon
Epizom, konak organizmanın kromozom DNA’sı ile
bütünleşebilen bir plazmiddir (Ör: F plasmid).
Bu yüzden uzun süre bütünlüğünü koruyabilir,
her hücre bölünmesinde kopyalanır ve genetik yapının
bir parçası olarak varlığını sürdürür.
Konjugasyon, bakteriler arası
arasında direk temas ve kö
köprü
prü
oluş
oluşması
ması suretiyle verici DNA segmentlerinin alı
alıcı
hücrelere geç
geçmesidir.
23
5. Transpozonlar
Transpozonlar bakteri DNA’sı, plazmidleri ve bakteriofajları
arasında yer değiştiren DNA parçacıklarıdır.
Yer değiştirdikleri için bunlara aynı zamanda “sıçrayıcı
genler” de denir.
Bakterilerde genelde antibiyotik
Insanlarda da mevcuttur.
Tranpozonların kimi kendini kopyalayarak, kimi kendini
çevreleyen DNA'dan kesip çıkarak hareket eder.
Bu özelliklerinden dolayı, bilim adamları transpozonları
canlılardaki DNA'yı değiştirmek için bir araç olarak kullanırlar.
24
resistansını
kodlarlar.
12
Download