kanser kök hücre - Lenfoma Myeloma Derneği
advertisement
Prof. Dr. Mustafa ÇETİN Erciyes Üniversitesi GENKÖK Araştırma Merkezi • Kanser Kök Hücre: Kendini yenileme ve tümor hücrelerini oluşturabilme yeteneğine sahip hücrelerdir. • Kendini yenileme kabiliyeti (self renewal) : kök hücrenin kuluçka ortamı (niş) içindeki bir takım medyatörlerin uyarısı ile hücre içinde meydana gelen genetik ekspresyonlar tarafından yönetilir. • Kuluçka ortamı (niş): kök hücrelerin desteklenmesi, gerekliliklerin idamesi ve fonksiyonlarının düzenlenmesine uygun ortamlardır. Kök Hücreler Kök hücreler kendini yenileyebilme ve farklı hücrelere değişebilme kapasitesine sahiptir. Tümör hücresinin özelliklleri Kanser Kök Hücre • Normal Hücrelerde oldukça sıkı kontrol edilen mekanizmalar bozulmuştur. – Büyüme↑, Apopitozis ↓, Proliferasyon ↑ , Farklılaşma ↓ • Genetik mutasyonlar ve epigenetik değişiklikler • Normal hücre büyümesi ve fonksiyonları kanser hücreleri tarafından bozulmuş Tümör & Heterojenite • Tümörler morfoloji, yüzey işaretleyicileri,genetik bozukluklar ve tedaviye cevap açısından farklılıklar gösterir. • Tümör kitlesindeki tüm kanser hücreleri homojen ve eşit değildir. Kendi içinde dahi çok farklı genetik ve epigenetik bozukluklar, değişik büyüme ve farklılaşma kapasitesi gösterirler. • Bu farklılaşma tümör ilerledikçe veya tedavi sonrası nükslerde çok daha kompleks bir o kadar karmaşık bir yapı arzeder Kanser Kök Hücrelerin Özellikleri • Kanser Kök hücreler: Kendini yeniyebilme ve kanser kitlesini oluşturan hücrelere dönüşebilme kapasitesine sahip bir grup tümör hücresidir. • Tümorojenezin devamlılığı ve sürekliliğini sağlayan özellik self-renew kapasitesidir. • KKH’lerde unilineage differasyon kapasitesi hakimdir, multilineage kapasite zorunlu değildir. Tümör gelişim modelleri Klonal gelişim modeli Kanser kök hücre modeli Klonal gelişim modeli Tümörler mutasyona uğramış normal hücre hatlarından oluşurlar.. Kanser Kök Hücre Modeli Kanser kök hücrelerin bir tanesi hiyerarşik olarak kanseri başlatmasürdürme-çoğaltma kapasitesine sahiptir. Non-stem kanser modeli (Skolastik Model): Tümör içindeki her hücre yeni bir kanseri başlatır Kök hücre modeli (Hiyerarşik Model): Lösemi hücreleri hücresel olarak heterojen yapıya sahip olmasına rağmen, tümör oluşumu tek bir hücreden kaynaklanmakta ve klonal özellik göstermektedir. Kanser dokusu içindeki nadir hücreler kanseri başlatabilir Kanser Kök Hücre Yüzey İşaretçileri Tümör Tipi CSC ayırmada kullanılan işaret AML B-preALL Myeloma SC CML SC MEME PROSTAT BAŞ BOYUN (Skuamoz h.ca.) KOLON PANKREAS Mezenkimal Akciğer KARACİĞER MELANOM OVER GLİOBLASTOM CD34+ CD38- CD123+ CD34+ CD38CD19+ CD138- CD19+ CD20+ CD27+ CD34+ CD38(Ph+) CD44+ CD24ESA+ ALDH1 veya CD133+ hi CD44+ a2b1 CD133+ CD44+ linESAhi CD44+ CD133+ ALDH1+ CD166+/ESA+ CD44+ CD24+ ve/veya CD133+ SP CD133+ ALDH1+ SP-C+ CD90+ CD133+ EpCAM ABCG2+ CD133+ CD20+MCAM+ CD44+ CD117+ CD133+ CD133+ NESTİN+ SP: Side Population, ESA/EpCAM: Epidermal Surface Ag ALDH: Aldehid Dehidrogenaz ABC: ATP Binding Casette SP-C: Surfactant protein -C İnsan AML Hücrelerinden Lösemi Gelişmesi CD34+/ CD38Lösemi Gelişmekte AML hastasından alınmış blastlar NOD/ SCID fare CD34+/ CD38+ Lösemi yok John Dick and Dominique Bonnett LKH’nin kendisini yenileme modeli: FACS AML hücreleri 5 x 103 CD34+/CD38- Sublethal doz NOD/SCID Model Lapidot T et al. Nature 1994;367: 645-8. Kanser hücrelerinde ortaya çıkan kromozomal değişiklikler Deletion Terminal Deletion Reciprocal translocation Duplication Insertion Inversion Ring Chromosome Robertsonian Translocation Isochromosomes Kanser hücreleri genomunda nükleotid değişiklikleri Nucleotide Deletions Nucleotide Insertions Nucleotide Substitutions Self-renewal sinyal sistemleri Pluripotensinin Moleküler yolakları Kanser & Trofoblast Hipotezi Plesantal implantların annne dokusuna invazyon ve implantasyonu kanser dokusuna benzemektedir. Gametogenesis & Tumorigenesis Germ (eşey) hücre & Kanser Kök Hücre Cancer cells Germ cells Stem cells Cancer cells Germ cells Stem cells Somatic/Germ Cells Sperm Somatic Cells Farklılaşma Çoğalma Çoğalma ve Farklılaşma aktivitesi Kanser Biyomarkerleri olarak germline kök hücre proteinleri Hipotetik Model Somatic stem cells Germ cells Somatic cells Germline stem cells Cancer stem cells Tumor Tumor niche Germline stem cells Germ cell niche Somatic cell niche Germline stem cells Epithelial Mesenchymal Transition (EMT) Hipotetik Model: Kanserin hücresel orjini Germ Cell Origin Germ Cell Transition Germline stem cells Somatic stem cells ICM (ES) Trophoblast Cancer stem cells Somatic niche Tumor Tumor niche Cancer stem cells Germline stem cells Tumor ICM (ES) Trophoblast MikroRNA Küçük, protein kodlamayan RNA parçaları olup, gen ifadesinin posttranskripsiyonel regülatörüdürler. Hücre proliferasyonu, farklılaşma, apoptozis gibi fonksiyonlardan sorumludur. LKH’lerinin kendi-kendilerini yenileme ve farklılaşma fonksiyonlarından sorumlu bulunmuşlardır. Xia HP. J Cancer Mol 2008; 4:79-89 PIWIL 2; KANSER KÖK HÜCRE/ EŞEY HÜCRE PROTEİNİ • PIWIL 2, Argonaute Proteinlerini kodlayan geniş bir gen ailesinin germline kök hücrelerinin gelişimi ve onarımından sorumlu bir üyesidir. • 8p 21.3 bölgesinde lokalizedir. • 973 amino asit; 109.849 Da ağırlığındadır. • Eşey hücrelerin bütünlüğü için gerekli olan transpozonları baskılayıp mobilizasyonlarını engelleyerek spermatogenez sırasında önemli bir rol oynar. • Spermatozoaların mayotik farklılaşmasında ve spermatogonial hücrelerin kendilerini yenilemelerinde büyük rolü vardır. • Piwi gen ailesinin üyesi olan PIWIL2’nin, ilk olarak testis dokusunda eksprese olduğu tespit edilmiştir. • Piwi, germline kök hücre bölünmesinde otonomik organizatör olarak çalışmaktadır. PIWIL 2; KANSER KÖK HÜCRE/ EŞEY HÜCRE PROTEİNİ • Piwi genleri, Arapidopsis bitkisinden insana kadar değişen aralıkta farklı organizmalarda kök hücrelerin kendilerini yenilemesinde, gametogenezde ve RNA interferansında rol oynadığı bilinmektedir. • Piwil2 kanser kök hücrelerinde sinyal ileti yolaklarında proliferasyon ve apopitozisi düzenleyen anahtar görevindedir. • Onkogenezde etkili olan Piwil2’nin birçok genle etkileşimde olduğu ve birlikte eksprese olduğu bilinmektedir. Bunların arasında onkogenik mekanizmalarda etkili olduğu en çok düşünülen genler Piwil1 ve DDX4 ‘tür. Piwil2’nin somatik hücrelerde sessiz durumda iken, kanser kök hücrelerinde neden ve nasıl aktiflendiği konusu tam olarak açıklık kazanmamıştır. Piwil1 ve Piwil2’nin spesifik olarak premeiotik eşey hücreleri tarafından eksprese edildiği çeşitli araştırma grupları tarafından daha önce gösterilmiştir. Fakat bunların atipik olarak farklı tümör türlerinde de eksprese edildiği belirlenmiştir. ??? Piwil2 Proliferation Apoptosis PIWIL 2; KANSER KÖK HÜCRE/ EŞEY HÜCRE PROTEİNİ • Olası mekanizmalardan biri Piwil2 ilişkili gen regülasyonunun küçük RNA ve metilasyon vasıtasıyla olabileceğidir • Bu olasılık doğrultusunda piwi-etkileşimli RNA’lar (piRNAs) olarak adlandırılan küçük RNA türlerinin bir alt grubu, memeli testislerinde tanımlandırılmıştır. • Bu küçük RNA’lar eşey hücrelerin genomundaki transpozon fonksiyonunu baskılamak için PIWI proteinleri ile (Piwil1 ve Piwil2) etkileşime girmektedirler. • Bu da piRNA’ların, kanser hücrelerinde gen regülasyonunun anahtar bileşeni olarak bilinen DNA metilasyonunun spesifik belirleyicileri olduğunu göstermektedir. Piwi gen ailesi Piwi protein & piRNA Piwi Proteinlerinin Fonksiyonlar Gen Baskılama; Translasyonel Kontrol; Epigenetik Regulasyon Piwil 2 Fonksiyonel Bölgeleri 1-Piwi Piwi gen ailesi; korunmuş PAZ ve Piwil bölgesi olarak tanımlanır ve - kök hücrede kendini yenileme -RNA baskılama -çeşitli organizmalarda translasyonel regülasyonda rol oynar. 2- PAZ - Paz bölgesi siRNA dubleksine bağlanır ve efektör kompleks içindeki öncü RNA’ya takılmayı kolaylaştırır. 3- Piwil2 Piwil2 (Fare):4913 bp mRNA, 2915 bp ORF, 971 a.a, piwi ailesinin 2 üyesi Piwil2 (İnsan): 3545 bp mRNA, 2921 bp ORF, 973 a.a, piwi ailesinin 8 üyesi Fare piwil2 gapdh colon bone marrow brain cerebellum small intestine fetal brain fetal liver heart kidney spinal cord lung placenta prostate salivary gland skeletal muscle spleen testis stomach thyloid trachea uterous testis liver ovary muscle kidney brain heart lung Fare ve insan testisinde piwil2 ekspresyonu İnsan piwil2 gapdh İnsan Farklı Hücre Hatları Ve Dokularında Pıwıl 2 Ekspresyonu Fare İnsan KÖK HÜCRE PROLİFERASYONU VE DİFERANSİYASYONU SIRASINDA VE EŞEY HÜCRELERDEN EKSPRESE EDİLEN PIWIL2 İLİŞKİLİ GENLER Gene Function Referance Tbca Early meiotic gene in differentiating spermatogonia known to be upregulated by the kit ligand. Rossi et al., 2008 IGF2AS Insulin-like growth factor 2 expressed in testicular seminomas Stier et al., 2006 MAP3K10 (MLK2) Expression of mixed lineage kinase 2 in germ cells of the rat testis. Phelan et al., 1999 TEC High expression of the tec gene product in murine testicular germ cells. Kazama et al., 1996 TBx6 Mouse T-Box gene implicated in paraxial mesoderm formation at gastrulation. Chapman et al., 1996 CDH10 (cadherin10) Plays a role in the regionalization of the chicken embryonic central nervous system and in the embryonic zebrafish. Fushimi et al., 1997; Liu et al., 2006 MEG3 Imprinted gene that is expressed in day-9.5 mouse fetuses. Miki et al., 2004 CSF3 Involved in human mesenchymal stem cell differentiation. Chou et al., 2008 EPHA5 Role in mouse neocortex development. Yun et al., 2003 EPC1 Enhancer of polycomb1, a homeodomain only protein-binding partner, induces skeletal muscle differentiation. Kee et al., 2007 FGF3 Role in embryonic development, for instance of the inner ear. Zelarayan et al., 2007 GH1 Role in breast development. Wagner et al., 2007 HoxA6 Involved in hematopoietic stem cell proliferation and self-renewal Dickson et al., 2009 İnsan Kanser dokularında Piwil2 ekspresyonu A. MDA-MB-231 B. C. D. Ductal invasive breast carcinoma E. Ductal carcinoma in situ F. Normal breast tissue G. teratoma,testis. H. negative control, (only 2nd Ab). I. germ cell tumor. J. teratoma,seißbein K. dysgerminous, ovary. L. teratoma, ovary. M. adenocarcinoma, colon. N. O. T. Gastrointestinal, stromal tumor P. kidney cell carcinoma. Q. MMMT, endometrium. R. stromacarcinoma, endometrium. S. adenocarcinoma, endometrium. Table 1. Expression of Piwil2 protein in breast cancer Score Total 0 +1 +2 +3 Benign 25% (2) 25% (2) 50% (4) 0 8 In situ 19% (3) 56% (9) 19% (3) 6% (1) 16 Invasive 10% (13) 40% (50) 37% (46) 13% (17) 125 B Colon Peripheral blood leukocyte Small intestine Ovary Testis Prostate Thymus Spleen A Testis MDA-MB-231 MCF12A 9.5 kb 7.5 kb 4.4 kb Piwil2 2.4 kb 1.4 kb Fibroadenoma Ductal carcinoma Lobular carcinoma β-actin C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Piwil2 Gapdh D 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Piwil2 Gapdh A B C SC MCF7 C MDA-MB-231 Liver Testis SC C Piwil2 Gapdh SC C E % Piwil2 + Cells D 100 86 50 12 0 SC C Piwil2+ Piwil2 : Stat3/Bcl-X yolağındaki moleküllleri aktive eder Piwil2 : eksprese eden hücreler farede tümör oluşumuna yol açar. EÜ. GENOM VE KÖK HÜCRE MERKEZİNDE KÖK HÜCRE VE PIWIL2 İLE İLGİLİ YÜRÜTÜLEN ÇALIŞMALAR İNSAN MEME EPİTEL HÜCRELERİNİN, MEME KANSERİ KÖK HÜCRELERİNE TRANSİSYONUNDA PİWİL2 ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI” Amaç: Kök hücre proteini Piwil 2’nin meme kanseri kök hücreleri üzerindeki rolünün araştırılarak erken teşhis için Piwil2 ilişkili ve kök hücre temelli yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi. Materyal &Metod: Meme epitel hücrelerinin kanser kök hücrelerine transformasyonunda kanseröz ve non-kanseröz meme epitel hücre kültürü kullanıldı. Bu amaçla; ve (kanseröz meme epitelyal hücre hatları) ve (normal meme epitelyal hücre hatları) İNSAN MEME EPİTEL HÜCRELERİNİN, MEME KANSERİ KÖK HÜCRELERİNE TRANSİSYONUNDA PİWİL2 ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI” Metod: 1- Stabil hücre kültürleri oluşturma MCF7 ve MDA-MB-231 MCF12A ve MCF10 2-Transfeksiyon Piwil2 kodlayan geni taşıyan plazmidle vasıtasıyla hücrelerin transfekte edilmesi İNSAN MEME EPİTEL HÜCRELERİNİN, MEME KANSERİ KÖK HÜCRELERİNE TRANSİSYONUNDA PİWİL2 ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI” 3- RNA İzolasyonu ve RT-PCR Analizi Kontrol hücrelerden ve transfekte edilen hücrelerden RNA izolasyonu ve gibi kök hücre spesifik markerlara RT-PCR ile bakılması 4- İmmunositokimya Transfekte edilen hücrelerde Piwil2, Oct4 ve Nanog için immunboyama (monoclonal anti-Piwil2 antibody, polyclonal anti-Oct4 and anti-Nanog antibodies). 5- Tümorojenik analiz Proliferasyon analizi ve apoptozis analizi-in vitro in vivo tümor oluşumu (SCID Mouse) İNSAN MEME EPİTEL HÜCRELERİNİN, MEME KANSERİ KÖK HÜCRELERİNE TRANSİSYONUNDA PİWİL2 ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI” RT-PCR MCF7 hücre kültürü Kültür ve Transfeksiyon Bulgular HÜCRE ADI PWİLL/GAPDH BCL-XL/GAPDH CyclinD1/GAPDH STAT3/GAPDH MCF12A-wt 0,95 0,92 1,03 0,85 MCF12A-TR-L300 10,95 ↑ 1,2 3,45 ↑ 1,66 ↑ Transfekte ve wild type hücrelerde Piwil2 ekspresyon düzeyleri (over expression) MCF12A-TR-L200 6,85 ↑ (over expression) 0,35 (over expression) 2,66 ↑ 1,78 ↑ (over expression) Transfekte ve wild type hücrelerde Nanog ekspresyon düzeyleri HÜCRE ADI PWİLL/B.ACT BCL-XL/B.ACT CyclinD1/B.ACT STAT3/B.ACT MCF12A-wt 0,86 0,83 0,93 0,85 4,82 ↑ 2,33 ↑ MCF12A-TR-L300 15,31 ↑ 1,406 (over expression) MCF12A-TR-L200 5,65 ↑ (over expression) Transfekte ve wild type hücrelerde Oct4 ekspresyon düzeyleri (over expression) 0,23 2,19 ↑ (over expression) 1,41 ↑ MCF7 tr. piwil MCF12A tr. piwil MDA-MB-231 İNSAN MEME EPİTEL HÜCRELERİNİN, MEME KANSERİ KÖK HÜCRELERİNE TRANSİSYONUNDA PİWİL2 ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI” İmmunositokimya Sonuç Piwil2 ekspresyonu transfekte hücrelerde diğerlerine göre çok daha yüksek bulundu. Bu hücrelerde kök hücre markerları immunboyama ve PCR ile saptandı. Piwil2’nin normal epitel hücrelerinin kanser kök hücrelerine transformasyonunda rolü olduğu kanısına varıldı. İNSAN MEME EPİTEL HÜCRELERİNİN, MEME KANSERİ KÖK HÜCRELERİNE TRANSİSYONUNDA PİWİL2 ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI” NOD/SCID Model’in gelişmesi Nude (atimik): T hücrelerinden yoksun SCID : B ve T hücrelerinden yoksun NOD : NK hücreleri, makrofaj ve kompleman aktivasyonundan yoksun İNSAN MEZENKİMAL KÖK HÜCRELERİNİN KANSER KÖK HÜCRELERİNE DÖNÜŞÜMÜNDE PİWİL2'NİN ROLÜ Amaç: Bu çalışma ile MKH’leri bir kök hücre proteini olan Piwil2 vasıtasıyla yeniden programlanmış mezenkimal kanser kök hücrelerine dönüşmesinde rol oynayan moleküler ve hücresel yolların aydınlatılması amaçlanmıştır. Materyal& Metod: PROSTAT KANSERİ KÖK HÜCRELERİNDE PİWİL2’NİN ROLÜ” • Amaç: Prostat kanserinde Piwil2 rolünün araştırılarak, prostat kanserinde ilgili proteinin erken tanıda kullanılması ve kök hücre temelli tedavi yaklaşımlarının oluşturulması • Materyal&Metod: - LnCap hücre hattı University of Newcastle Jae Ho Lee Rachael Brooker Elda Latif Vaseleios Floros Mosin Wahid Sari Al-Hasan Mehdi Amirrassouli Emma Fairhall Hussain Behbahani Shabnam Thahina He Dawei Ximbo Xu Shuo Huang Christian Mueller Ian Dimmick NIGEB Reza Soleimanpour Maryam Kabir Salmani Maryam Shahali Tehran University of Medical Sciences Said Amanpour Mohamad Vasaei Erciyes University Mustafa Cetin Yusuf Ozkul Servet Ozcan Gokcen Dinc Fahretin Kelestimur IFADO University of Dortmund Jan Hengstler Center of Gynaecology University of Goettingen Thomas Harwighorst NHS Newcastle Robert Pickard Kevin McLeny Department of Pathology University of Goettingen Stephan Schweyer University of Göttingen Institute of Human Genetics: Cornelia Jung Dorothea Schuette Wolfgang Engel Northern Institute of Cancer Research Newcastle Craig Robson Tom Leannard Rakesh Heer Department of Experimental Oncology University of Alberta Fereidoon Bushehri This study was supported by: • University of Erciyes& GENKOK • University of Newcastle • ONE North East • BBSRC • DFG • University of Goettingen Merkez bünyesinde GMP şartlarında Kök Hücre, GMP şartlarında Gen Tedavi, GMP şartlarında Kordon Kanı Bankacılığı, Genom, Proteomiks, Moleküler Mikrobiyoloji, Transgenik-Scid ve Nude Mause Üniteleri, Bitki Biyoteknolojisi, Bitki Doku Kültür Laboratuarları, Görünteleme Merkezi, Biyosensör, Biomateryal ile Bioinformatik ünitelerini içeren toplam 13 alt üniteden oluşmaktadır MOU ANLAŞMASI YAPILAN MERKEZLER University of Palmero, Italy University in Naples, Italy University of Nice, France University of Cologne , Germany Szechenyi Istvan University, Hungary Fontys University of Applied Sciences, The Netherlands State University of Nakhchivan, Azerbaijan University of Tehran, Iran BGI ( Beijing Genome Instuty ), ÇİN University of Goettingen Northern Institute of Cancer ResearchNewcastle Beni dinlediğiniz için teşekkür ederim…..
