nükleik asitlerin saklama koşulları
advertisement
NÜKLEİK ASİTLERİN SAKLAMA KOŞULLARI Dr. Zafer KÜÇÜKODACI GATA HEH Patoloji Servisi 22. ULUSAL PATOLOJİ KONGRESİ 7 Kasım 2012 Manavgat DNA ve RNA’NIN KANTİTASYONU Spektrofotometrik ölçüm Floresans teknik Spektrofotometre Spektrofotometre bir solüsyon tarafından absorbe edilen ışığın miktarını ölçen cihazdır. Spektrofotometre • Hazırlanan çözeltiden belirli spektrumlarda ışık geçirilmesi ve bu ışının ne kadarının çözelti tarafından absorblandığının bulunması esasına dayanır. • Çözeltinin içerdiği madde miktarı ne kadar fazla ise daha fazla ışın, çözelti tarafından soğurulur. • Spektrofotometre, çözeltinin içinden geçebilen çözelti tarafından absorblanmayan- ışığın yoğunluğu tespit ederek çözelti içeriğindeki aranan maddenin miktarı hakkında kantitatif bilgi verir. IŞIK KAYNAĞI DALGABOYU SEÇİCİ ÖRNEK KABI DEDEKTÖR KAYDEDİCİ • Ulraviyole bölgede en çok kullanılan lambalar, hidrojen ve döteryum elektriksel boşalım lambalarıdır. Bu lambalar 180-380 nm arasında ışık yayar. • Dalga boyu seçicileri (monokromatörler), ışık kaynağından gelen polikromatik ışıktan tek bir dalga boyunda monokromatik ışık elde edilmesini gerçekleştiren düzeneklerdir. • Spektrofotometrelerde dedektör, maddenin ışığı absorplayıp absorplamadığını anlamak için ışık kaynağından gelen ışığın şiddetinin ölçülmesi amacıyla kullanılan düzenektir. • Spektrofotometrelerde örneğin konulduğu örnek kapları(küvet),yuvarlak bir tüp veya dört köşe olabilir. Küvetler, soft veya borosilikat camdan, kuartz veya plastikten yapılır. Spektrofotometre • UV spektrofotometre Elektromanyetik ışınlar dalga boylarına göre adlandırılır. Dalga boylarına göre; 200-340 nm : Ultraviyole 340-800 nm : Görünür 800-2000 nm: İnfrared OD 260 OD 280 • Dalga boyu uzunluk birimleri cinsinden ifade edilir. Angstrom Spektrofotometrik ölçümlerde nanometre, mikrometre, veya milimikron 10AO = 1nm = 1milimikron • Absorbansın birimi yoktur. Spektrofotometreden okunan bir sayıdır. Okunan dalgaboyu absorbans ile birlikte A260 = 0.34 DNA konsantrasyonu (g/mL) = OD260 x 100 (dilüsyon faktörü) x 50 g/mL Nükleotid içerisindeki bazlar 260 nm’de maksimum absorbansı sağlar Deoksiribonükleotid Ribonükleotid DNA konsantrasyonu (g/mL) = OD260 x 100 (dilüsyon faktörü) x 50 g/mL 1 A260nm ünite dsDNA = 50 g/mL DNA konsantrasyonu (g/mL) = OD260 x 100 (dilüsyon faktörü) x 50 g/mL Örneğimiz saf mı? Nükleik asit maksimum absorbansı 260 nm dalga boyu OD260/OD280 oranı ? Oran 1.8 - 2.0 DNA saf Oran 1.8 den düşük ise protein varlığı ve/veya diğer UV absorbers Oran 2.0 den büyük ise örnek kloroform veya fenol ile kontamine DNA konsantrasyonu (g/mL) = OD260 x 100 (dilüsyon faktörü) x 50 g/mL DF=100 1:99 (Örnek:dsu) [dsDNA] ≈ A260 x (50 µg/mL) [ssDNA] ≈ A260 x (33 µg/mL) [ssRNA] ≈ A260 x (40 µg/mL) OD260 =0,065 OD280 =0,040 DF=100 1:99 (Örnek:dsu) ? 0,065x 100x 50 • DNA miktarı = = 325 g/mL = 325 ng/L • DNA’nın saflığı ? OD260/280 = 0,065/ 0,040 = 1,625 • NUMUNE • KÖR • STANDART Nano Drop NÜKLEİK ASİTLERİN SAKLAMA KOŞULLARI Phosphate • DNA HO OH P O Base N H O • RNA NH2 H N CH2 O N N Sugar OH H Azotlu heterosiklik bir baz, beş karbonlu bir seker ve bir fosfat grubundan meydana gelir DNA • KARARLI – Çift sarmal yapıda – Şeker fosfat omurga – Hidrojen bağlarıyla birbirine bağlanan baz yapıları – Kümeleşme etkisi (hidrofobik) • FOSİL ÇALIŞMALARI DNA • DNA kararlılığını etkileyen başlıca faktörler – DNA’nın baz içeriği – Tek iplikli DNA oranı – Ortamın ısısı – Ortamın pH değeri – Ortamın tuz içeriği – Fenol-kloroform DNA BAZ İÇERİĞİ •A = T zengin DNA moleküllerine göre, G ≡ C’den zengin DNA molekülleri daha kararlıdır. DNA TEK İPLİKLİ DNA ORANI •Hücrede tek iplik DNA – yıkıma açık • ssDNA bağlayan proteinler •Kümeleşme etkisi daha az DNA pH •Asit ve alkaliye genelde dirençli – güçlü alkaliye dayanıklı – asidik pH’ya hassas •Kuvvetli asitlerde ve yüksek ısıda nükleik asitler kendilerini oluşturan baz, şeker ve fosfat gruplarına hidrolize olur •Seyreltik asitlerde (pH 3-4) beta-glikozid pürin bağlarında hidroliz – apürinik DNA hidroksil iyonlarıyla yıkım •Alkali ortam bazların tautomerik durumunu değiştirir DNA ISI •sıcaklık artışı ile denaturasyon •ssDNA-dsDNA absorbans HELIX-COIL TRANSITION DNA FENOL-KLOROFORM •Fenol ve kloroform organik solventler •Her ikisi de güçlü denaturasyon ajanları – proteinleri denatüre ederler •Fenolden etkilenmez – Kontaminasyon •Kloroform genellikle suya karışmaz DNA • ribonükleazlar • deoksiribonükleazlar – ekzonükleazlar (5' -> 3‘: Ekzonükleaz VII, Bal31 nükleaz 3' -> 5‘: DNA polymerase I, Ekzonükleaz I, Ekzonükleaz VII, Bal31 nükleaz) – endonükleazlar (Non-spesifik: DNaz I, Mikrokokkal nükleaz, Mung bean nükleaz; spesifik: restriksiyon endonükleazlar) Fenol-kloroform-izoamilalkol DNA • Ultraviyole gibi iyonizan radyasyon • Serbest radikaller • Uygunsuz tüpler – Polypropylene plastik: 5ng/mm2 • Uygunsuz solüsyonlar • Agresif pipetleme ve vorteksleme RNA RNA RNaz RNA RNA RNaz •Taze doku-dondurulmuş doku •Neredeyse tüm hücreler ve salgılarda. Neden? •Laboratuvarda bulaş çok olası. Nereden? RNA RNaz •Saç, tüy, tükrük ve ter gibi vücut salgılarında •Bakteri ve küf mantarı içeren toz partiküllerinde •Pipet uçlarında, laboratuvar tüplerinde, cam veya plastik laboratuvar malzemelerinde •Suda, çözeltiler ve solüsyonlarda •Laboratuvar yüzeylerinde •Dokunun kendisinde RNaz İÇERMEYEN ORTAM YALNIZCA RNA İÇİN KULLANILAN MALZEME RNaz RNaz •Kabin •Eldiven, eldiven, eldiven.. •Pipet seti •Rnaz’sız pipet uçları, vs. •Steril, RNaz içermeyen polipropilenli tüpler • Hazır kimyasallar • RNaz içermeyen su • NaOH-EDTA • Çamaşır suyu • DEPC • Otoklav RNaz RNA Çalışma öncesi ve sonrası temizlik •Tezgahlar, cihazlar vb. – hazır kimyasallar – NaOH – çamaşır suyu – deterjan güzelce yayar! RNA • Otoklav yeterli değil • Cam malzemeler 230oC 2-4 saat • Plastik laboratuvar ürünleri önce 0.1 M NaOH, sonra 1 mM EDTA ve RNaz içermeyen su ile durulanmalıdır • Plastik malzemeler DEPC • RNA izolasyonundaki kimyasallar - DEPC RNA • DEPC (dietilpropilkarbonat) – Buffer ve cam malzemelerdeki RNazın inaktivasyonu için kullanılan alkilleyici bir ajandır – %0.05-%0.1 – Karsinojen – Tris, HEPES için uygun değil – Otoklavlanamayacak çözeltiler • Diğer hazır kimyasallar RNA • Pürifiye edilmis RNA, -20°C veya 80°C’de • Solüsyonlar – (1) 1 mM sodyum sitrat, pH: 6.4 – (2) 0.1 mM EDTA (DEPC ile muamele edilmiş) – (3) 10 mM Tris-HCL, 1mM EDTA, pH: 7.0 • Uzun dönem saklama etanolde -20°C’de ve tercihen etanol ve sodyum asetat ile çöktürme işlemi sonrasında -80°C’de Eksizyonu takiben doku hızla en az 10 kat hacminde reaktif içine konulmalı (1 mg doku başına yaklaşık 10 μl reaktif) 150 mg’ a kadar ağırlıktaki dokularda RNA 1.5ml’lik (RNAlater TissueProtect) tüplerde 150-500 mg arası doku parçaları, 5 ml’lik (RNAlater TissueProtect) tüplerde stabilize edilir. RNaz RNazsız ortamda, düşük pH, düşük sıcaklık ve yoğun alkol içinde RNA’nın saklanması önerilir
