elektroporasyon

ELEKTROPORASYON
Özlem Diken
İ.Ü. Moleküler Biyoloji ve Genetik
Bölümü
Elektroporasyon, hücrelere veya
dokulara kısa zamanlı cok kuvvetli
elektrik akımı uygulayarak, hücre
zarında nanometre boyutunda
gecici porlar olusturulması islemidir.
Bu gecisken durumda zar, hücrelere
DNA, enzim, antibodi ve diger
makromolekül gecisine izin verir.
Elektroporasyonun mekanizmasi
Iki cesit dalga formu tanımlanır:
1)Üssü kuvvetle azalan akım:
Burada akım cok hızlı artar ve daha sonra asamalı olarak azalır.
2)RF bükümlü dalga akımı:
Burada istenilen akıma cok hızlı ulasılır, akım bu seviyede kalır ve sonra
hemen azalır.
Dalga formlarını olusturmak icin genellikle ticari elektroporatörler
kullanılır. Bu cesit cihazlarda iki cesit parametre önemlidir:
a)Elektrik alan kuvveti(kV/cm)
b)Zaman sabiti
DİĞER DEĞİSKENLER
• HÜCRELER: Hücre tipi, büyüme oranı, populasyonun büyüme fazı
elektroporasyon deneylerindeki önemli degiskenlerdir.
• DNA: DNA’nin formu elektroporasyonla DNA aktarımını
etkileyebilmektedir.
• SICAKLIK: Memeli hücreleriyle yapılan deneylerde, akım verilmeden
önce ve sonra 10 dk, hücreleri buz üzerinde DNA ile muamele etmek
gerekir.
Moleküler biyolojide
bircok
teknik , yabancı bir geni
veya bir protein
materyalini ana hücreye
aktarmayı gerektirir.
Fakat plazma membranının, fosfolipid tabakası hidrofobik dıs yüzey ve hidrofilik
ic yuzeye sahip oldugundan DNA ve protein dahil hicbir polar molekül zardan
gecemez.
Alıcı hücreler ve bu hücrelere
sokulacak
moleküller solusyonda süspansiyon
halindedir
Tipik olarak elektroporasyon icin bir akımda bir mikrosaniye bir mili saniye
arasında 10.000-100.000 V/cm gereklidir.
Elektroporasyonun avantajlari
• Hızlı bir yöntemdir.
• Genis kullanım alanı : Elektroporasyon neredeyse tüm hücre ve tür
tiplerinde etkilidir.
• Verimlilik: Hücrelerin cogu hedef DNA molekülünü icine alır.
• Kücük ölçek: Gerekli olan DNA miktarı diger metodlardan daha
düsüktür.
• Alıcı hücre icin toksik etki göstermez.
Elektroporasyonun dezavantajları
• Hücre zararı: Eger akımlar yanlıs uzunlukta ve siddette ise bazı porlar
cok büyüyebilir ya da zar desarjindan sonra açık kalabilir ve hücre
zararına yol acabilir.
• Belirgin olmayan iletim: Elektropermabilite süresince hücreye giren ve
cıkan maddenin iletimi dengeli degildir. Bu da iyon dengesizligine yol
acabilir ve hücre fonksiyonunda bozukluklara ve hücre ölümüne yol
acabilir.
Biyomisin
enjeksiyonu
Ilac tümör
hücrelerini
sarar
Hücrede por
olusması
Ilac hucreye gırer
Tümöre akım verilmesi
Hücreler kapanır
ve ölür
Electroporation
Cell Membrane
Before Pulse
DC
Cell Membrane
During Pulse
Cell Membrane
After Pulse
(Cell returns to original state)
Transformasyon
Kallus formasyonu
oksin
sitokinin
Elekroporasyon tekniği kullanılarak
yapılan
bazı çalısmalar :
Elektroporasyonla gen terapisi
•Ilac aktarımına benzer olarak, elektroporasyon teknikleri önemli genleri
ihtiva eden vektörlerin deriye ve hedef dokuya aktarımına izin verir.
•Vücudun hücrelerine aktarıldıktan sonra bu gen tarafından üretilen protein
kusurlu bir proteinin yerine gecebilir ve böylece genetik bir bozuklugu tedavi
edebilir.
In vivo Elektroporasyon kullanılarak embriyonik
fare beynine etkili gen transferi
(Developmental biology 2001)
Fare beyninde anlatim yapan reporter genler
EYFP(yesil)
DsRed(kirmizi)
Tavsan karotid arterine elektroporasyonla LacZ markeriyle birlikte
Plazmid transferi
Xenopus tectal neurons transfected with GFP
Radyal hücre göcünün döl yatagında EGFP anlatımı yapan
plazmidlerin elektroporasyonuyla gözlenmesi
Mısır embriyonik dokularının elektroporasyonla
transformasyonu (Plant Cell)
DNA elektroporasyonla olgunlasmamıs mısır zigotik embriyolarına ve
Tip 1 kallus kültürüne aktarılmıstır.
Olgunlasmamıs zigotik embriyo ve embriyonik tip 1 kallusları kimerik
bir geni kodlayan neomycin fosfotransferazla elektropore edilmistir.
Transgenic mısır bitkileri bu kültürlerden elde edilmis ve aktarılan genin
kalıtımı bircok nesil boyunca calısılmıstır.
excised embryos
| "wound" with macerozyme 1-3 min.
v
| transfer to cuvette (100-150 embryos)
v
| +10-20 ng DNA
v
| 1hr. room temp.
v
| ice 10 min.
v
| electric pulse: 375 V/cm
v
| ice. 10 min.
v
| transfer to selective media
v
Elekroporasyonu takip eden tip 1 kallus formasyonu
Tip 1 kallus elektroporasyonu