Hücre Apoptozu
advertisement
HücreApoptozu 1 HücreApoptozu • Apoptoz:ProgramlıHücreÖlümü • Apopto%k hücreler organizmanın bazı dokularında ve hücrelerinde sürekli olarak oluşmaktadırlar ve bu oluşum ömür boyu devam etmektedir. • Böylece ölüm (apoptozis) ve yeniden yapım (mitozis) bu dokularda doku homeostazisini oluşturmak üzere dinamik bir dengehalindesüregelir. 2 HücreApoptozu • Apoptoz:ProgramlıHücreÖlümü • Normalapopto%khücreölümüveyerineyenihücreyapımının (“%ssueremodelling”)gündeyaklaşık1x1011hücreyibulduğu hesaplanmaktadır. • Bu hızda bir hücre ölümü ve yeniden yapımı ye%şkin bir insanınvücutağırlığınınher18-24aydabiryenidenyapımve yıkımıanlamınagelmektedir. 3 HücreApoptozu • Apoptoz:ProgramlıHücreÖlümü • İnce barsaklar: İnce barsaklardaki kriptaların tabanlarında yeni oluşan hücreler, kriptaların uçlarına doğru göç ederler ve 3-4 gün sürenbugöçünsonundaölerek,barsakboşluğunadökülürler. • Deri: Derinin kera%nositleri derinin bazal tabakasında oluştuktan (kök hücre bölünmesi) sonra derinin en üst tabakasına doğru (stratum korneum) göç ederler. Bu göç esnasında derinin her tabakasında çeşitli farklılaşma özellikleri gösterip en sonunda derininorganizmayıdışetkenlerden(enfeksiyonajanları,travma%k zedelenmelervs.)koruyucuölütabakasınıoluşturmaküzereölürler. Deri kera%nositlerinde bu şekilde gerçekleşen apoptozisin özelleşmişbirapoptozisformuolduğudüşünülmektedir. 4 HücreApoptozu • Apoptozsaptanmasındakullanılanyöntemler ü Morfolojikgörüntülemeyöntemleri ü İmmunohistokimyasalyöntemler ü Biyokimyasalyöntemler ü İmmunolojikyöntemler ü Molekülerbiyolojiyöntemleri 5 HücreApoptozu • Morfolojikgörüntülemeyöntemleri • IşıkMikroskobuile – Hematoksilenboyaması – Giemsaboyaması Gözlenebilendeğişikliklerşunlardır: Hücreküçülmesi“cellshrinkage”, Sitoplazmikküçülme“cytoplasmicshrinkage”, Kroma%ninkondanseolması“nuclear condensa%on”venukleuszarınınperiferisinde toplanması, • Nukleusunküçülmesi“pyknosis”veyaparçalara bölünmesi“nuclearfragmenta%on” • • • • 6 HücreApoptozu • Morfolojikgörüntülemeyöntemleri • FloresanMikroskobuile – DAPIboyaması – Propidiumİyodur(PI)boyaması – Hoechstboyaması Gözlenebilendeğişikliklerşunlardır: DNA’yabağlanırlar PIsadeceölühücreleriboyarken, HoechstveDAPIbütünhücreleriboyarveDNA fragmentasyonugözlemlenebilir. • Hücreapoptozuhücremorfolojisinebakılarak anlaşılır. • • • • 7 HücreApoptozu • Morfolojikgörüntülemeyöntemleri • FloresanMikroskobuile – Komettes% • Gözlenebilendeğişikliklerşunlardır: • DNAfragmentasyonuolanhücreleragarozjelde yürütüldüklerindekuyrukluyıldızşekli oluştururlar. • KuyrukkısmınekadarbüyükseDNAooranda fragmenteolmuştur. 8 HücreApoptozu • Morfolojikgörüntülemeyöntemleri • FloresanMikroskobuile – Komettes% 9 HücreApoptozu • Morfolojikgörüntülemeyöntemleri • ElektronMikroskobuile • Gözlenebilendeğişikliklerşunlardır: • Elektronmikroskopuiledeğerlendirme apoptozisdeendeğerliyöntem(“gold standard”)olarakdüşünülmektedir. • Morfolojikdeğişiklik-lerinendoğruolarak gözlendiğibiryöntemdir. • Üsteliksubsellülerdetaylar(örn.mitokondrinin durumu,hücrezarıyadanukleusmembranının bütünlüğününbozulupbozulmadığıgibi)da incelenebilir. 10 HücreApoptozu • Morfolojikgörüntülemeyöntemleri • ElektronMikroskobuile Nukleusfragmentasyonu 11 Soldanormalbirhücregörülmektedir. Sağdakiapopto%khücrede,normal hücreylekıyaslandığındasitoplazmik küçülme,kroma%nkondansasyonuve fragmentasyonuizlenebilmektedir HücreApoptozu • Histokimyasalgörüntülemeyöntemleri • AnneksinVYöntemiile • Gözlenebilendeğişikliklerşunlardır: • Normalhücrelerdehücrezarınınsitoplazmikyüzündefosfa%dilserin(PS) bulunmaktadır. • EğerhücreapoptozisegidersenormaldeiçyüzdeyerleşmişolanPS moleküllerihücrezarınındışyüzünetranslokeolurlar. • DışyüzetranslokeolanPS’ler,floresanbirmadde(örn.FITC)ile işaretlenmişAnneksinVkullanılarakgörünürhalege%rilirler. • Böyleceapopto%khücrelersaptanmışolur. 12 HücreApoptozu • Histokimyasalgörüntülemeyöntemleri • AnneksinVYöntemiile 13 HücreApoptozu • Histokimyasal görüntüleme yöntemleri • TUNELYöntemiile • Gözlenebilendeğişikliklerşunlardır: • DNAfragmantasyonununtanınmasını sağlar. • Parafinbloklar,donmuşkesitler,kültürü yapılmışsolüsyonhalindekiveya “plate”lereekilmiş,yadalamellerüzerinde büyütülmüşhücrelerdeapoptozisinvarlığı bumetodlasaptanabilir. 14 HücreApoptozu • Histokimyasal görüntüleme yöntemleri • Kaspaz3Yöntemiile • Gözlenebilendeğişikliklerşunlardır: • Kaspaz-3yöntemiilesadeceapopto%k hücrelerdeoluşanak%fkaspaz-3’üntespit edilmesiylebelirlenebilir. 15 HücreApoptozu • Biyokimyasal görüntüleme yöntemleri • WesternBlotyöntemiile • Gözlenebilendeğişikliklerşunlardır: • Bumetodyardımıylaapoptoziseözgübazı proteinlerinekspreseolupolmadıklarının (örn.bcl-2)yadakırılıpkırılmadıklarının (örn.kaspaz-3)saptanmasımümkündür. 16 HücreApoptozu 17 HücreApoptozu • İmmünolojikyöntemler • Florometrikölçümile • Gözlenebilendeğişikliklerşunlardır: • Kültürüyapılmışhücrelerdekaspaz ak%vitesinintayinedilmesinde kullanılanbiryöntemdir. 18 HücreApoptozu • Molekülerbiyolojiyöntemleri • DNAmikroarrayile • Gözlenebilendeğişikliklerşunlardır: • Hücredeapoptozileilgiligenifadedeğişimleribelirlenir(örneğin kaspazlar). 19
