Uploaded by User5990

Lab Hafta 14 elektroforezzz

advertisement
GÜVENLİ VE ETKİN
LABORATUVAR UYGULAMALARI
111-546
ELEKTROFOREZ
Doç. Dr. Hilâl Özdağ
Elektroforez
• Yüklü moleküllerin bir elektrik alanı içinde yürütülerek
ayrıştırılması tekniğine elektroforez denir.
• DNA, RNA ve Protein molekülleri ile yapılan çalışmaların
öncelikle basamakları arasında yer alır.
Temel Kurallar
• Jel tankında işlem yapmadan
kapattığınızdan emin olun.
• Yükleme ve yürütme yapmadan
polimerleştiğinden emin olun.
önce
önce
güç
kaynağını
jelinizin
iyice
• Neyi hangi sırayla yüklediğinizi hemen kaydedin: Bunun için
yüklediğiniz örneklerin tüplerini tüplüğün üzerinde yükleme
sırasıyla deney bitip siz bunların sırasını kaydedinceye dek
muhafaza edin.
• EtBr veya toz akrilamid kalıntılarına karşı muhakkak eldiven
giyin.
Temel Kurallar
•
Jelinizi erittikten sonra EtBr ekleyin. EtBr eklenmiş jel solüsyonunu
eritip kaynatmayın.
•
Kullanılmış jelinizi jel tankının içinde bırakmayın.
•
Kullanılmış jelleri jel atık çöpüne atın.
•
Jel tankının içindeki tampon çözelti defalarca kullanılabilir. Ancak bu
tamponun kullanım sıklığına bağlı olarak birkaç günde bir boşaltılıp
karıştırılması ve buharlaşan kısmı kadarının taze tamponla doldurulması
gerekir.
•
Jel tankının en az haftada bir boşaltılıp yıkanması ve distile sudan
geçirilmesi tankın platin tellerinin uzun ömürlü olması açısından gereklidir.
Zira yıkanmadığı takdirde zaman içinde tamponun için tuz platin teller
üzerinde birikecektir.
Temel Kurallar
• Jelinizi yürütmeye başlamadan önce kutupların doğru
bağlandığından emin olun.
• En doğrusu jeli yürütmeye başladıktan sonra 0.5-1
dak bekleyip yürümenin doğru yönde olduğundan,
akımın geçtiğinden emin olmaktır.
Örnek hazırlama
• Örnekler yükleme solüsyonu ile jele yüklenirler.
• Yükleme solüsyonunun içinde örneğin kuyulara oturmasını sağlayan
ağır bir molekül (sukroz, ficoll, gliserol) ile yürümeyi takip etmeyi
mümkün kılan indikatör bir boya (BFB, XC) bulunur.
• Yükleme solüsyonu
saklanmalıdır.
uzun
dönem
için
-20oC’de
bölünerek
• Kullanımdaki yükleme solüsyonu oda ısısında kararlılığını uzun süre
muhafaza edecektir.
Standartlar/Belirteçler
• Moleküler ağırlık belirteçleri muhakkak jele dahil edilmelidir.
• Bunların jele yüklenmesi hem jelin ve elektroforezin kalitesini
standardize edecek hem de örneklerin yorumlanmasını mümkün
kılacaktır.
• Yüklenecek belirteç
seçilmelidir.
analiz
edilecek
örneklere
uygun
olarak
• Moleküler ağırlık belirtecinin yürüme profili belirtecin kullanım
kılavuzundan alınarak lab defterine, jel dokümantasyon sisteminin
yanına konmalı, gerektiğinde kolayca kontrol edilebilmelidir.
• Gerektiğinde ve mümkün
kontroller yüklenmelidir.
olduğunda
jele
pozitif
ve
negatif
Elektroforez Tipleri
• Agaroz jeller genellikle yatay iken akrilamid jeller dikey olarak
yürütülür.
• Jeller farklı ebatta olabilir. Dizileme jelleri büyük olmak
zorundadır ancak tarama ve transfer için kullanılan jeller mini
veya midi boyutta tercih edilir.
• Kapiller elektroforezde ince kapillerler için DNA, RNA,
proteinleri otomatik olarak yüksek verimde ayrıştırılırlar. Ayrışma
kromatografide olduğu gibi tespit ve analizle beraber gerçekleşir.
Jel Tipleri
• Agaroz ve akrilamid her ikisi de porlu yapıdadır. Yüzdeleri ne
kadar yüksekse por çapı o kadar küçülür. Gerekli ayarlamalar
yapıldığında her ikisinde de DNA, RNA ve Protein incelenebilir.
• Düşük konsantrasyondaki akrilamid jelleri manipüle etmek zordur.
Düşük konsantrasyondaki agaroz jellerin manipülasyonu daha
kolaydır.
• Jel konsantrasyonunun
olması gerekir.
ilgilenilen
fragmentin
boyutuna
uygun
• Önceden dökülmüş hazır akrilamid jeller birçok firma tarafından
üretilmektedir. Bu jeller buzdolabında aylarca bozulmadan
kalabilir.
Yürütme Tamponları
• Yürütme tamponları konsantre olarak (5X veya 10X) hazırlanır.
0.5X veya 1X konsantrasyonda kullanılır.
• Her tamponun belirli bir amperde belirli bir voltajı vardır.
Kullandığınız tamponun özelliklerini farkedin, öğrenin ki problem
oluştuğunda teşhis edin.
Güç Kaynağı
• Güç kaynağının çıkışı sabit voltaj (mV), sabit akım (amps) veya
sabit güç (W) şeklinde olabilir. Birçok güç kaynağı modelinde bu
modlar arasında otomatik değişimler mümkündür.
• Her güç kaynağı sizin için uygun olmayabilir. Deneyiniz için gerekli
olan amper veya voltu öğrenin ve buna uygun güç kaynağını seçin.
• Dizileme jelleri yüksek wattlı, elektroforetik transferler yüksek
akımlı ve agaroz veya akrilamid jel elektroforezleri geniş voltaj
aralıklı güç kaynaklarına ihtiyaç duyar.
• DNA, RNA ve protein jellerinde örnekler eksiden artıya yürürler.
Eksi (katod) siyaha, artı (anod) kırmızıya bağlanmalıdır.
Güç Kaynağı
• Güç kaynağının zaman ayarı varsa mutlaka kullanın yoksa jelinizi
yürütmeye başladıktan sonra kronometrenizi ayarlayın. Özellikle
küçük fragmentleri unutup fazla yürütüp jelden kaybetmeniz
mümkündür.
• Güç kaynağını kapatmadan jel tankına müdahale etmeyin!
Fiksasyon
• Boyanacak jellerin boyamadan önce fikse edilmesi gerekmekdir.
• Fiksasyon
jellerin
şişmesini
denatürasyonunda da etkindir.
engellediği
gibi
örneklerin
Kurutma
• Jeller jel kurutucuda ısı ve vakum altında kurutulur.
• Otoradyografide daha keskin bant verir.
• Jellerin uzun yıllar saklanmasına imkan verir (Gümüş Boyama)
Kurutma
• Jeller jel kurutucuda ısı ve vakum altında kurutulur.
• Otoradyografide daha keskin bant verir.
• Jellerin uzun yıllar saklanmasına imkan verir (Gümüş Boyama)
Boyama
• Agaroz jel içine EtBr eklenerek DNA ve RNA jellerinin boyanması
sağlanır.
• DNA yürütülen poliakrilamid jelleri yürütme sonrasında jelin
ebadına göre EtBR veya gümüş nitrat ile boyanır.
• Protein jelleri de elektroforez sonrası gümüş nitrat veya coomasie
mavisi ile boyanır.
Belgeleme
• Poloroid fotoğraf
• Dijital dokümantasyon: Lazer yazıcı veya termal yazıcı. Termal
yazıcı çıktısının rezolüsyonu çok daha yüksektir.
• Otoradyografi veya kemilüminesens sonuçları X-Ray film üzerine
alınabilir.
Belgeleme
• Poloroid fotoğraf
• Dijital dokümantasyon: Lazer yazıcı veya termal yazıcı. Termal
yazıcı çıktısının rezolüsyonu çok daha yüksektir.
• Otoradyografi veya kemilüminesens sonuçları X-Ray film üzerine
alınabilir.
DNA Jelleri
http://a32.lehman.cuny.edu/molbio_course/gelel.GIF
DNA Jelleri
• 6X yükleme solüsyonu: %30 (V/V) gliserol, %0.25 (W/V) BFB,
%0.25 XC distile su içinde hazırlanır.
DNA Jelleri
DNA Jelleri
DNA JELLERİ
Agaroz Jel Elektroforezi
Denatüre edici olmayan (Native)
Denatüre edici (Formaldehitli)
Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)
Denatüre edici olmayan (Native)
Denatüre edici (Üreli)
Kapiller Elektroforez (CE)
Denatüre edici olmayan (Native)
Denatüre edici
ELEKTROFOREZ
Elektroforezde nükleik asitler boy ve konformasyonlarına göre
yürür.
Denatüre edici olmayan (native) ortamda DNA ve RNA daha
ziyade konformasyonlarına bağlı olarak yürür.
Denatüre
edici
ortamda
ise
bu
moleküller
ikincil
oluşturamayacakları için moleküler ağırlıklarına göre yürürler.
yapı
ELEKTROFOREZ
Agaroz Jel Elektroforezi
Denatüre edici olmayan (Native)
Büyük moleküler ağırlıklı DNA yürütülecekse (genomik DNA
gibi) %0.8-1 arası jel hazırlanmalıdır.
PCR örneklerinin kontrolünde (100 bç- birkaç kb arası)
%2’lik jele ihtiyaç vardır.
RFLP benzeri uygulamalarda birbirinden 10-20 bç farklı
fragmentleri ayırmak için NuSieve benzeri agaroz türevleri ile
rezolüsyon arttırılabilir. Metaphor agaroz ile 3-4 bç farkı
ayırmak mümkündür.
ELEKTROFOREZ
Agaroz Jel Elektroforezi
Agaroz jeller TBE (Tris Borik asit EDTA) veya TAE (Tris
Asetik asit EDTA) ile hazırlanır.
DNA düşük voltajda uzun yürütmek gerektiğinde (RE ile
kesilmiş genomik DNA’yı Southern öncesi yürütmek gibi) TAE
tamponu uygundur.
Kısa süreli yüksek voltajda yürütmek için TBE seçilmelidir.
ELEKTROFOREZ
Agaroz Jel Elektroforezi
TBE
5X
veya
10X
konsantrasyonda
hazırlanıp
1X
konsantrasyonda kullanılır. Uzun süre beklediğinde çökelti
oluşturur.
TAE 50X konsantrasyonda hazırlanabilir.
TAE’nin hazırlama maliyeti TBE’ye göre daha düşüktür.
ELEKTROFOREZ
Agaroz Jel Elektroforezi
Denatüre
Özellikle
edici
(Formaldehitli)
Northern
blot
analizi
RNA
analizlerinde
yapılacaksa
jeli
kullanılır.
bu
şekilde
hazırlamak şarttır. Ancak yalnızca RNA’nın varlığına/yokluğuna ve
bütünlüğüne bakılacaksa rutin agaroz hazırlanabilir. Her durumda
RNA
analizlerinde
jelin
hazırlanması gerekmektedir.
RNaz’sız
ortama
uygun
şekilde
ELEKTROFOREZ
Poliakrilamid Jel Elektroforezi
Akrilamid ve bisakrilamid molekülleri arasında Amonyum
Persülfat (APS) aracılığıyla TEMED’in katalizörlüğünde çapraz
bağların oluşması ile polimerleşen bir jeldir.
APS her defasında taze hazırlanmalıdır.
ELEKTROFOREZ
Poliakrilamid Jel Elektroforezi
Akrilamid ve bisakrilamid tampon çözeltide karıştırılarak
çözüldükten sonra filtreden geçirilerek süzülmelidir.
Akrilamid ve bisakrilamid polimerleşinceye dek nörotoksiktir.
Akrilamid ve bisakrilamid arasındaki oran çapraz bağlarla oluşan
porların çapını dolayısıyla jelin rezolüsyonununu belirler;
19:1/29:1/39:1 gibi
MDE (Mutation Detection Enhancement) Jel
ELEKTROFOREZ
Kapiller Elektroforez
Donmayan
akrilamid
bazlı
özel
polimerler
kullanılır.
Bu
polimerlerin nativ veya denatüre edici özellikte olanları mevcuttur.
PROTEİN JELLERİ
SDS-PAGE
Örneklerin içine 2-mercaptoethanol veya dithiothreitol indirgeyici ajan
olarak konulur. Böylece disülfid bağları indirgenmiş olur ve proteinler “random
coil” konfigürasyonlarını koruyarak moleküler ağırlıklarına göre yürürler.
İndirgeyici ajanların stokları çeker ocak altında açılıp çalışılır.
Yükleme solüsyonu -20oC’de saklanmalıdır.
Örnekler
yüklenmeden
önce
95oC’de
ısıtılır
veya
kaynatılır.
Örnekler
kaynatıldıktan sonra buz üzerinde bekletilmelidir.
Kaynatılan tüplerin kapağı basınçla açılıp etrafa saçılabilir. Bunu önlemek
için plastik kapak kilitleri kullanılmalıdır.
PROTEİN JELLERİ
Standartlar
Standartlar yüksek, düşük ve geniş aralıkta olabilir. Boyasız veya boyalı
versiyonları mevcuttur. Boyalı olanlar daha kullanışlıdır. Aksi belirtilmediği
sürece -20oC’de saklanmalıdır.
Gökkuşağı standartları çok kullanışlı ancak pahalıdır.
Boyaları kovalent bağlı boyalar bantları göçlerinde varyasyon yaratabilir.
Kesin moleküler ağırlık belirlenmesinde kalibre standartlar kullanılmalıdır.
MEMBRANA TRANSFER
Southern blot: Membran üzerindeki DNA DNA ile problanır.
Northern blot: Membran üzerindeki RNA DNA veya RNA ile
problanır.
Western blot: Membran üzerindeki protein antikor ile problanır.
Southwestern blot: Membran üzerindeki DNA protein ile problanır.
Middle eastern blot: PoliU türevli membran mRNA ile problanır.
MEMBRANA TRANSFER
Kapiller Transfer
MEMBRANA TRANSFER
Vakum Transfer
MEMBRANA TRANSFER
Elektroforetik Transfer
MEMBRAN
Membranlar rulo veya değişik ebatta kesilmiş olarak satılır. Tek boy
jel kullanılmadığı sürece rulo olarak satın almakta fayda vardır.
Membranlara çıplak elle asla dokunulmaz.
Membranları almak için temiz bir forseps kullanmak gerekir.
Naylon membran nükleik asit için en uygun olanıdır. Dayanıklıdır.
Soyulup yeniden defalarca problanabilir. Yüksek konsantrasyonda
bloklayıcı
ajanla
muamele
etmek
gerekir
geriplan
boyanmayı
engellemek için.
Nitroselüloz bazı proteinler için en iyi seçimdir. Nükleik asitler
elektroforetik olarak nitroselüloza transfer edilemezler.
Download
Random flashcards
canlılar ve enrji ilişkileri

2 Cards oauth2_google_d3979ca9-59f8-451c-9cf7-08c5056d5753

KIRIHAN GÜMÜŞ DEDEKTÖR

6 Cards oauth2_google_49cd8e53-7096-4be6-ba73-4ff7e4195b4b

TRYF

6 Cards oauth2_google_3b3e6916-5080-45f2-ae61-79434233ea03

Create flashcards