bulgular

Identification of Adenovirus, Influenza Virus,
ParainfluenzaVirus, and Respiratory Syncytial
Virus by Two Kinds of Multiplex Polymerase
Chain Reaction (PCR) and a Shell Vial Culture in
Pediatric Patients with Viral Pneumonia
Jong-Han Lee, Jin-Kyong Chun, Dong Soo Kim,Yongjung Park, Jong Rak Choi and
Hyon-Suk Kim
Seoul, Korea.
Yonsei Med J 51(5):761-767, 2010
VİRAL PNÖMONİLİ ÇOCUKLARDA
ADENOVİRÜS, İNFLUENZA VİRÜS,
PARAİNFLUENZA VİRÜS VE
RESPİRATUVAR SİNSİTYAL VİRÜSÜN İKİ
FARKLI MULTİPLEKS PCR KİTİ VE
SHELL VİAL KÜLTÜRÜYLE
TANIMLANMASI
Araş.Gör.Dr.Oya AKKAYA
Prof.Dr.Bülent BAYSAL
GİRİŞ

Akut viral kökenli solunum yolu hastalıkları çocuklarda
morbiditeye yol açan en sık nedenlerdir

Üst solunum yolunda sınırlanmalarına rağmen yine de alt
solunum sistemi komplikasyonlarına yol açar

Bu nedenle viral infeksiyonların erken ve hızlı tanısı, virüsün
yayılımının engellenmesi için önemlidir
GİRİŞ




Respiratuvar virüslerin PCR ile tespit edildiği birkaç çalışma
vardır
Bu çalışmalara göre toplumsal kaynaklı ve nasokomiyal
solunum sistemi infeksiyonlarından en sık IFV, HPIV, AdV
ve RSV izole edilmiştir
IFV, enterovirüs ve AdV antiviral tedaviden faydalanabilecek
virüslerdir
Bu çalışmanın amacı, çocuklardaki şiddetli viral pnömoni
sebeplerinin 2 farklı PCR kiti kullanılarak tespit edilmesidir
GEREÇ VE YÖNTEM




ÖRNEK TOPLAMA:
2009 yılında Seul’de, 6 aylık bir periyodda, viral pnömoni
semptomları olan 220 çocuk hasta pediyatri servisine yatırıldı
Fizik muayene bulguları, akciğer röntgeni, kan testleri,
sedimentasyon hızı ve CRP ile bakteriyel pnömoni ekarte
edilip viral pnömoni tanısı kondu
Bu hastalardan nasofarengeal sürüntü örneği alındı
Bu örnekler çalışılıncaya kadar -75˚C’de saklandı
NÜKLEİK ASİT EKSTRAKSİYONU

QIAamp viral RNA Mini Kit ( QIAGEN,Hilden,
Germany ) ticari kiti kullanılarak 220 nükleik asit
ekstraksiyonu yapıldı ve -70˚C’de donduruldu
Multipleks PCR
Seeplex RV detection kiti








A setinde;
AdV
HMPV
HCoV 229E/NL63
HPIV 1-2-3
B setinde;
IFV A-B
RSV A-B
RhV
HCoV OC43/HKU1
Labopass RV detection kiti








AdV
HboV (bocavirüs)
HCoV
EnV
HPIV 1-2-3
RhV
RSV A-B
IFV A-B
Seeplex RV detection kiti protokolü
3 µL cDNA
 3 μL of 8-methoxypsoralen (MOP) solution
 4 μL of 5×RV Primer
 10 μL of 2×master mix.
Toplam 20 µL final solusyonu elde edilir

Seeplex RV detection kiti protokolü





94C’de 30 saniye
60C’de 1.5 dakika 35 siklus
72C’de 1.5 dakika
Çoğaltılan ürünler etidyum bromürle boyanıp %2 agarose
jelde yürütüldü
Her virüsün markırı ve internal kontroller de yürütüldü
Labopass RV Detection kiti protokolü

2 farklı PCR kit protokolü kullanıldı:

95C’de 3 dakika
95C’de 1dakika 35 siklus
72C’de 1 dakika
72C’de 5 dakika bekleme ve uzama evresi









42C’de 60 dakika
95C’de 3dakika
95C’de 1 dakika 35 siklus
55C’de 1dakika
72C’de 1 dakika
72C’de 5dakika final bekleme
Bu protokol de ; HCoV, EnV, HPIV 1-2-3, RhV, RSV A-B
içindir.
Çoğaltılan ürünler etidyum bromürle boyanıp %2 agarose jelde
yürütüldü
VİRÜS KÜLTÜRÜ

Multipleks PCR kitleriyle pozitif sonuç veren ve AdV, IFV,
HPIV ve RSV taşıyan örneklere R-Mix Ready Cells (
Diagnostic Hybrids,USA ) ticari kitinin prosedürlerine uygun
olarak shell vial kültürü yapıldı
DİZİ ANALİZİ

Kültür negatif, PCR pozitif olan 10 örnek için dizi analizi
yapıldı

Otomatize sekanslama analizörü olan Applied Biosystems,
USA ile çalışıldı

Sonuçlar Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)
verileri kullanılarak verildi
BULGULAR
BULGULAR
Virüsler
Seeplex RV-12
Labopass RV
AdV
14
14
HCoV 229E
5
1
HCoV OC 43
4
2
IF-A
8
2
IF-B
9
1
HMPV
22
PIV- 1
0
2
PIV- 2
0
0
PIV- 3
4
1
RhV
18
6
RSV- A
39
60
RSV-B
33
BULGULAR
RV-12 kitinde 220 örnekte 116 pozitif bulundu(%52.7)
Labopass RV kitinde ise 220 örnekte 102 pozitif bulundu
(%46.4)
Seeplex
RV-12 kitinde koinfeksiyon oranı 15/220 (%6.8)
Labopass RV kitinde ise 13/220 (%5.9) bulundu
Seeplex
BULGULAR



PCR’ın pozitif verdiği 103 örneğe shell vial kültürü yapıldı ve bunların
95 tanesinde üreme görüldü (Oran %90.3)
3 örnekte ise ikişer virüs üredi
95 örneğin

15’i AdV

6’sı IFV-A

9’u IFV-B

2’si PIV

63’ü RSV çıktı
Pozitif viral kültürün Seeplex RV-12 kitine oranı 99/103=%96
Pozitif viral kültürün Labopass kitine oranı
80/103=%78
BULGULAR

103 örneğin 50’si tutarlı sonuç verdi, her 3 yöntemde
de aynı virüs bulundu

53 örnekte ise sonuçlar tutarsızdı, her 3 testte de
farklı sonuçlar bulundu

Bu 53 sonucun 17 tanesinde sonuç belirsizdi. Her
testle farklı ve birden çok virüs bulundu
Multiplex PCR pozitif, viral kültür negatif



Multiplex PCR pozitif, viral kültür negatif olan 10 örnek için
dizi analizi yapıldı
Sonuçlar PCR ile %91-100 uyumlu çıktı
Sadece 1 örnek PCR’da IFV-A iken, dizi analizinde rinovirüs
çıktı
TARTIŞMA


Pediyatrik hastalarda, viral pnömoni tanısını erken koymak
tedavi için önemlidir
Hem gereksiz antibiyotik kullanımından kaçınılmış olur hem
de IFV, EnV, AdV gibi bazı viral infeksiyonlarda özel
antiviral tedavilerden faydalanılmış olur

Bu çalışma da, kliniklere bu konuda faydalı olmak için 2 multipleks
PCR kiti ve shell vial kültür yöntemi karşılaştırılmış ve hangisinin
klinik olarak daha etkin olduğunu göstermek için yapılmış prospektif
bir çalışmadır.
TARTIŞMA




Respiratuvar virüslerin tanısı için en yaygın kullanılan
yöntemler viral kültür ve sonrasında yapılan immunfloresan
boyama yöntemleridir
ELISA ise hızlıdır ama sensitivitesi daha azdır
Örneğin kalitesi, virüsün tipi, çalışan kişinin teknik hataları
bu yöntemlerde önemlidir
Virüslerin teşhisinde virüs kültürü hala altın standarttır ama
kültür yapımında, solunum yolu örneğinin transportu ve
depolama koşulları önemlidir

üremeyi etkileyen faktörlerdendir
TARTIŞMA



Choi ve ark.2006’da yaptığı bir çalışmada direkt antijen
testini, viral kültürü ve multipleks PCR yöntemini
karşılaştırmış ve AdV,IFV ve RSV için tespit oranını sırasıyla
%28.4, 36.2, 44.8 bulmuştur
Son zamanlarda en yaygın metot ise shell vial kültürü sonrası
immunfloresan boyama olmuştur
Ama bu metot kolay değildir ve rutin laboratuvarlar için
uygun değildir
TARTIŞMA

PCR yöntemleri iyi yöntemlerdir ama yanlış pozitiflik ve
yanlış negatiflik dezavantajları vardır

Kültürden daha hızlı ve daha sensitiftir

Ayrıca HMPV gibi kültürde üretilmeleri zor olan bazı virüsler
için de bu test bir avantajdır
TARTIŞMA






Bu çalışmada 2 multipleks PCR kiti ve viral kültür arasındaki
uyum oranı %49 bulundu ( 50/103)
Viral kültürü yapılabilen sadece 4 virüs vardı: IFV, RSV,
AdV, PIFV
2 multipleks PCR kiti arasında da uyumsuzluk vardı
Seeplex RV kitinin pozitiflik oranı, Labopass PCR kitinden
daha yüksek bulundu
Buna rağmen , Labopass PCR kitinin HMPV tespit etme
oranı Seeplex RV kitinden daha yüksek bulundu
2 PCR kiti arasındaki uyumsuzluk oranı %51 bulundu
(53/103)
TARTIŞMA


Multipleks PCR kitleri arasındaki bu uyumsuzluk, kitlerin
limitasyonlarından kaynaklanabilir
Bu sebeplerden biri, ekstraksiyon aşamasında PCR
inhibitörlerinin temizlenememesi olabilir


Böylece yanlış negatif sonuç çıkmış olabilir
Bir başka sebep te, kullanılan primerin nükleotid varyasyonu
nedeniyle virüsü tespit edememesi olabilir

Böyle bir durum varsa direkt antijen testi ve virüs kültürü PCR’ın
yerine kullanılabilir
TARTIŞMA



Seepleks RV’de koinfeksiyon oranı %7 (15/220) iken
Labopass RV’de %6(13/220) bulundu
Daha önceki çalışmalarda da, şiddetli infeksiyonlarda doublevirüs infeksiyonu görülmüştür (Bu çalışmada infeksiyonun
şiddeti araştırılmamıştır)
Kültür negatif ve PCR pozitif 10 vaka direkt dizi analizi
metoduyla değerlendirilmiş ve bu sonuçlar PCR ile
karşılaştırılmıştır
Sonuç olarak

Solunum yolu virüslerinin PCR ile tesbiti hızlı ve kolaydır

Pozitiflik oranı virüs kültüründen yüksektir

Bu nedenle klinik laboratuvarlarda solunum yolu
infeksiyonlarında ilk seçenek olmalıdır

Virüs kültürü ve dizi analizi ise sadece seçilen vakalarda
yapılmalıdır