DNA polimeraz Delta

DNA’NIN REPLİKASYONU
Prof.Dr. Davut ALPTEKİN
 Watson-Crick modeline göre
Hücre siklusunun S evresinde
DNA kendi kendisinin
kopyasını çıkarır yani dublike
olur. Oluşan yeni hücrelere eşit
dağıldığı için her hücrede aynı
miktarda değişmeden kalır.
 Kopyasını çıkarmak için DNA
iplikleri açılır ve iplikler kalıp
olarak kullanılır. Her iplik
birbirinin tamamlayıcısı olduğu
için oluşan iki iplik birbirinin
aynısıdır.
 DNA’nın çoğalması
Semikonservatif yolla olur.
Hücre döngüsünün S evresinde
iki iplik açılır. Eski ipliğin
karşısına yeni iplik sentez
edilir.
 1958 yılında Meselson ve Sthal
kültür ortamında N14 ve N15
kullanarak E. coli ile yaptığı
denemelerde DNA
replikasyonunun
semikonservatif yolla olduğunu
göstermişlerdir.
Replikasyonun Orijini ve Yönü
 Replikasyon DNA üzerindeki orijin noktalarından
başlar. Prokaryotların DNA’sında tek bir orijin
nokTası vardır.
Replikasyonun Orijini ve Yönü
 Ancak ökaryot DNA’sı çok uzun olduğu için
çok fazla orijin noktası bulunur. (İnsanda
haploit genomun yani 23 kromozomun
büyüklüğü yaklaşık 3 milyar baz çiftidir).
 DNA ipliklerinin açılması orijin noktasından iki
tarafa doğru olur. Orijin noktasından itibaren
replike olan DNA parçasına Replikon denir.
 Bakterilerde tek orijin noktası bulunduğu için
tek replikon vardır. Ökaryotlarda ise çok fazla
replikon vardır.
 E. coli DNA’sının orijin noktası William
Wellington Cairns tarafından saptanmış ve Ori C
olarak adlandırılmıştır. 245 baz çiftinden oluşur,
9-13 bazdan oluşan tekrarlar içerir.
 Ökaryotlara örnek olarak mayalarda orijin
bölgeleri çalışılmış, mayaların orijin bölgelerine
ARS (Autonomous Replicating Sequences) ismi
verilmiştir. Bu bölge 100 bazlık bir bölge olup
tüm mayalarda ortak olan 11 bazlık çekirdek
dizisi içerir.
 Replikasyon başladığında orijin noktasında
bazlar arasında H+ bağları kırılır ve iki yöne
doğru açılma olur. İki replikasyon çatalı oluşur.
Replikasyon çatalının açılmasını
replikasyon kompleksinin bir parçası olan
Helikaz enzimi sağlar. Helikaz DNA’ya ve
ATP’ye bağlıdır. ATP’den aldığı enerji ile
bazlar arasındaki H+ bağlarını kırar ve
DNA ipliklerinin açılmasını sağlar.
İplik açılırken açılan her kola SSBP (Single
Stranded Binding Protein) bağlanarak
ipliğin stabil kalmasını sağlar.
İpliklerin açık kalması, her ipliğin karşısına
yeni bazlar bağlanarak komplementeri
yapılacağı için oldukça önemlidir.
İplik Helikaz enzimi tarafından açıldıkça
DNA’nın henüz açılmayan kısımlarında
kıvrımın sıklığı artar. Üst üste gelen kıvrımlar
DNA Topoizomeraz enzimleri tarafından
rahatlatılır.
Bir topoizomeraz olan Giraz DNA’nın tek veya
çift ipliğini keser, kıvrımı düzleştirerek
rahatlatır. Sentez edilen DNA’da da kıvrımlar
artarsa orayı da keserek kıvrımı rahatlatıp
yeniden birleştirir.
İplik açıldıktan sonra DNA polimeraz enzimleri
devreye girip replikasyonu başlatır.
DNA Polimeraz I
 1957 yılında Cornberg tarafından
keşfedilmiştir. Var olan nükleotide yeni bir
nükleotit ekler. Yeni bir zincir oluşumunu
başlatamaz.
 5. karbonuna bağlı (5’) ve üç fosfatlı
dNTP’lerden 2 fosfat grubu ayrılır. Geride
kalan fosfat uzayan zincirdeki deoksi ribozun
3’ OH grubuna bağlanır. İpliğin uzaması 5’→3’
yönünde olur.
 Her bağlama sonunda deoksi ribozun 3’OH
grubu açıkta kalır, yeni nükleotidin 5’
ucundaki fosfat diğer nükleotidin 3’ ucundaki
OH grubuna bağlanır ve iplik gittikçe uzar.
DNA Polimeraz II, III
1969 yılında radyasyona maruz kalan
E.coli’de mutant bir suş bulmuşlar ve bu
suşda DNA Polimeraz II ve III’ün olduğunu
saptamışlar.
Daha sonra bu enzimin normal bireylerde
de olduğu belirlenmiş ve de bu enzimlerin
DNA sentezi esnasında görev yaptığı
saptanmıştır.
DNA Polimeraz I, II, III’ün Özellikleri
 DNA sentezini başlatamazlar.
 Sentez esnasında DNA ipliğinin uzamasını
sağlarlar.
 Büyük proteinler olup moleküler ağırlığı
100.000 Dalton civarındadır.
 Her üç enzimin 3’→5’ ekzonükleaz aktiviteleri
vardır. Geri dönüp eklenen nükleotidlerin
doğru olup olmadığını kontrol eder. Doğru
olmayanlar çıkarılıp yerine doğrusu eklenir.
DNA Polimeraz I, DNA replikasyonunun
5’→3’ yönünde ekzo nükleaz aktivitesi ile
nükleotitlerin aynı yönde dizilmesini
sağlarken aynı zamanda RNA primerlerini
de saptayıp onların kesip çıkarılarak
ayıklanmasını da sağlar.
DNA Polimeraz I daha stabildir. Bu nedenle
hücrede en çok bulunan polimeraz
enzimidir.
Polimeraz I aynı zamanda replikasyon
esnasında RNA primerlerinin ayıklanması
ile oluşan boşlukları da doldurur.
Polimeraz III, Polimerizasyondan sorumlu
ve replikasyon için gerekli bir enzimdir.
3’→5’ ekzonükleaz aktiviteleri ile hatayı
düzeltirler, hatalı DNA oluşumunu
engellerler.
DNA Polimeraz II, UV veya radyasyon ile
DNA’da oluşan hasarları düzeltir.
Prokaryotlarda DNA Sentezi
DNA sarmalı Helikaz ile orijin noktasından
açılır ve sentez başlar. Ancak önce DNA
polimeraz olan Primaz açılan ipliğin karşısına
5-15 nükleotitlik bir primer sentez eder. 5’→3’
yönünde primer sentez edildikten sonra son
nükleotidin 3’-OH ucu serbest kalır.
Serbest kalan bu uca DNA polimeraz I, III
enzimi açılan ipliğin komplementerini 5’→3’
yönünde polimerize eder.
İpliğin biri kesintisiz devam ederken diğer
iplikte sentez kesintili devam eder.
 Kesintili iplik 1000-2000 nükleotitlik DNA
fragmanlarını sentez eder. Bu fragmanlara
Okazaki fragmanları denir (1968 yılında Reiii
Okazaki ve Tsuneko Okazaki bulmuştur).
Okazaki fragmanlarının birleşmesi gerekir.
 Her fragman önce RNA primeri sentez eder,
sonra DNA polimerize olur. Bu nedenle Okazaki
fragmanı kadar RNA primeri vardır.
 Fragmanların birbirine bağlanması için DNA
polimeraz I tarafından önce RNA primeri
çıkarılır. Yerine DNA nükleotitleri eklenir.
 Boşluklar doldurulduktan sonra açıkta kalan 3’OH ucu ile 5’-P ucu Ligaz enzimi ile
katalizleyerek fosfodiester bağı ile birleştirilir.
 DNA polimeraz enzimi aynı zamanda bazların
doğru eşleşip eşleşmediğini de kontrol eder.
 İki iplikte sentez birbiri ile koordineli olarak
yürütülür.
 Bazen komplementer olmayan yanlış baz
eklenebilir. Bu durumda yeni oluşan iplikteki
yanlış baz DNA polimeraz I ve III’ün 3’→5’
ekzonükleaz aktivitesi ile kesip çıkarılır. Yerine
doğru nükleotit eklenir.
Ökaryotlarda DNA Sentezi
 Ökaryotlarda DNA sentezi bakterilerdekine
benzer. Ancak çok fazla orijin noktası vardır.
Ayrıca ökaryot DNA’sı proteinlerle kompleks
halindedir, sentez esnasında bunlarında açılması
gerekir.
 Ökaryot DNA’sı interfaz evresinde kromatin
yapısını oluşturmak için histon proteinleri ile
kompleks oluşturur.
 DNA+Histon kompleksi o canlının her
hücresinde aynıdır.
DNA sentezinden hemen önce histonlar
yapıdan ayrılır. Replikasyon çatalından
itibaren yeni sentezlenen DNA ile yeniden
birleşir.
Hücre bölünmesinde DNA sentezinden önce
hücre hacmini iki katına çıkardığı için histon
proteinleri de hücrede S evresinde iki katına
kadar sentez edilir ve yeni oluşan ipliklere
bağlanır.
Ökaryotlarda da DNA sentezini DNA
Polimeraz yapar. Ancak 6 çeşit DNA
polimeraz vardır.
•
•
•
•
•
•
DNA polimeraz Alfa (α)
DNA polimeraz Beta (β)
DNA polimeraz Gama (γ)
DNA polimeraz Delta (δ)
DNA polimeraz Epsilon (ε)
DNA polimeraz Zeta (ζ)
DNA Polimeraz alfa, delta ve epsilon’un
bölünen hücrelerde bulunması
replikasyondan sorumlu olduğunu gösterir.
DNA polimeraz-α; DNA replikasyonu için
gerekli en önemli enzimdir. Prokaryotların
DNA polimeraz III enziminin görevi gibi
sentezi başlatır. Daha sonra bu görevi DNA
polimeraz-δ’ya devreder.
DNA polimeraz-δ; ipliğin uzamasını ve
3’→5’ ekzonükleaz aktivitesi sayesinde
hatalı bazın girmesini engeller.
Ayrıca, DNA polimeraz I gibi gecikmeli
sentezin yapıldığı iplikteki RNA
primerlerinin ayıklanmasını ve okazaki
parçalarının birleşmesini de sağlar.
DNA polimeraz epsilon (ε); delta (δ)’ya
benzer. Mayalarda mutasyon ile aktivitesi
bitirilmiş ve maya hücreleri yaşamamıştır.
DNA polimeraz-β ve zeta (ζ); hem bölünen
hem de bölünmeyen hücrelerde bulunur.
DNA tamirinde görev alır.
DNA polimeraz-γ; Mitokondride bulunur ve
mitokondri DNA’sının replikasyonundan
sorumludur.
Ökaryotlardaki DNA polimerazlar da DNA
sentezi için deoksiribonükleozit trifosfatlara,
RNA primerine ve kalıp DNA’ya ihtiyaç
duyar.
Orijin noktası açılıp sentez başladığında iki
replikasyon çatalı vardır ve sentez her iki
yöne doğru olur.
Burda da gecikmeli iplikte okazaki
fragmanları vardır. Ancak bu fragmanlar
prokaryotlardaki parçalardan küçük olup
100-200 nükleotit içerir.
Orijin noktası 50-300 kb arasında değişen
mesafelerde bulunur. Bakterilerde tek
olmasına rağmen insan genomunda 25.000
kadar orijin noktası dolayısı ile replikon
vardır.
 Her replikon 100.000-200.000bç’den oluşur.
 Ökaryot hücrelerinde çok sayıda replikon olduğu
için çok miktarda DNA polimeraza ihtiyaç vardır.
 E.coli’de sentez için DNA polimeraz III’ün 15
kopyası yeterken, hayvansal hücrelerde sadece
DNA polimeraz alfa için 50.000 kopyaya ihtiyaç
vardır.
 Ancak DNA replikasyonu bakterilere göre
ökaryotik hücrelerde daha hızlı yapılmaktadır.
Ör. E.coli’de replikasyon 20-40 dakikada
tamamlanırken, Drosophyla’nın emriyonik
hücrelerinde 3 dakikada tamamlanmaktadır.
Ökaryotlarda Telomerlerin Sentezi
Prokaryotik DNA sirküler yapıda
Ökaryotik DNA lineer yapıdadır. Bu
nedenle DNA replikasyonu da farklıdır.
Sentez 5’→3’ yönünde olduğundan lineer
DNA replikasyonunda her replikasyondan
sonra 5’ ucu boşta kalır ve sentezlenemez.
Bir primer boyu kadar DNA kısalır.
Normal koşullarda, telomerazın somatik
hücrelerde çalışmaması nedeniyle, somatik
hücreler her bir bölünmede 50-200 nükleotit
yitirir.
Üreme hücreleri; yumurta ya da sperm
hücreleri, embriyonik kök hücreler, kemik
iliği hücreleri, tek hücreli ökaryotlar ve
kanser hücrelerinde ise Telomeraz Aktivitesi
görülür.
DNA’nın dolayısı ile Kromozomların uç
kısımlarındaki bu yerlerde Telomeraz
enzimi devreye girer.
Kromozomların uç kısımları Telomer denilen
kısa tekrar dizilerinden oluşur.
Telomer dizileri ilk kez tek hücreli bir canlı
olan Tetrahymena’da saptanmış,
5’-TTGGGG-3’ olduğu, daha sonra
omurgalılarda saptanmış, 5’-TTAGGG-3’
olduğu belirlenmiştir.
Telomerler bir çeşit DNA polimeraz olan
Revers transkriptaz enzimi ile DNA sentezler.
Ancak önce DNA’daki telomer dizisi kalıp
olarak kullanılarak primer RNA sentez edilir.
Tetrahymena; Daha çok tatlı su havuzlarında
yaşayan Ciliata’lardan tek hücreli bir canlı
Sentez edilen RNA primer olarak
kullanıldığı için 3’-OH ucu boş kalır.
Buraya RNA’dan revers transkriptaz ile
yeniden DNA sentezlenip DNA’nın 5’ ucuna
eklenir.
En son primerler ayıklanıp yerine DNA
sentezi yapılır ve replikasyon tamamlanır.