1 TARİFNAME MİKROORGANİZMA TANIMLAMAK İÇİN BİR SİSTEM
advertisement
1 TARİFNAME MİKROORGANİZMA TANIMLAMAK İÇİN BİR SİSTEM VE YÖNTEM 5 TEKNİK ALAN Mevcut buluş, mikroorganizmaların (protista, fungus, bakteri, virüs vs.) strain/ tür/ cins/familya vs. seviyesinde tanımlanabilmesi ve taksonomik olarak sınıflandırılabilmesi/gerçekleştirilebilmesi için bir sistem ve yöntem ile ilgilidir. 10 ÖNCEKİ TEKNİK Mikroorganizmaların identifikasyonunda fenotipik ve genotipik yöntemlerin kullanımı oldukça yaygındır. 15 Fenotipik yöntemler morfojik, fizyolojik ve biyokimyasal karakteristiklere dayanmaktadır. Fenotipik yöntemlere dayalı teknikler, rutin tanımlama için kullanılan geleneksel testler, mikroskobik muayene, farklı karbon kaynaklarının asimilasyonu, farklı azot kaynaklarında gelişebilme, vitamin gereksinimleri, farklı 20 sıcaklık ortamlarında ve yüksek konsantrasyonlu şeker veya tuz ortamında gelişebilme, antibiyotiklere direnç ve çeşitli substratları hidroliz edebilme özelliklerine dayanmaktadır. Fenotipik yöntemler yaygın olarak kullanılmasına rağmen uygulamada birçok teknik 25 sorun bulunmaktadır. Örneğin, fenotipik tanımlama yöntemlerinde, tür seviyesinde bir tanımlama yapabilmek için genellikle 60-90 adet gibi çok sayıda testin uygulanması gerekmektedir. Bir diğer sorun, API, BIOLOG, Uni-YeastTec, Abbott Quantum II, VitekATB32, Automicrobic ve benzeri ticari sistemlerin birçoğu ilave analizlere 30 ihtiyaç duymakta, bu analizler yapılmadığı durumlarda ise tanımlamalarda doğruluk seviyeleri çok düşük (50–80%) kalmaktadır. Ayrıca, fenotipik yöntemlerin dayandığı morfolojik özellikler, çevresel koşullara son derece bağlı olduğu için tekrarlanabilirlikleri oldukça düşüktür. Bazı mikroorganizmalar sınırlı morfolojik heterojenite gösterdikleri için fenotipik özeliklere dayalı geleneksel yöntemler, tanımlama ve etkili bir şekilde sınıflandırmada yetersiz kalmaktadır. 2 Fenotipik yöntemler, fizyolojik ve biyokimyasal testlere dayandığı için genotipik testler kadar güvenilir sonuçlar vermemektedir. Bu durum ise belirli bir habitattaki biyoçeşitliliğin eksik veya yanlış tahmin edilmesi ile sonuçlanmaktadır. 5 Fenotipik yöntemlerin yanı sıra mikroorganizmaların tanımlanmasında genotipik yöntemler de sıkça kullanılmaktadır. Mikrobiyal tanımlamada kullanılan genotipik yöntemler, polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayalı olan ve olmayan yöntemler olarak ikiye ayrılmaktadır. PCR’a dayalı olmayan yöntemler arasında DNA hibridizasyon tekniği ve vurgulu elektriksel alan jel elektroforezi (PFGE) yer 10 almaktadır. Genotipik yöntemlerin büyük çoğunluğu polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayalı yöntemlerden oluşmaktadır. Bunlar arasında, PCR ürünlerinin, mitokondriyal ve ribozomal DNA sekans (dizi) analizi, restriksiyon fragment uzunluğu polimorfizm analizi (PCR-RFLP), rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA (PCR-RAPD) ve tekrarlayan palindromik (rep-PCR) dizilerin analizi ile real-time 15 PCR analizi gibi teknikler yer almaktadır. Bunlar arasında mikroorganizma türlerinin tanımlanmasında en yaygın kullanılan yöntem, ribozomal RNA (rRNA) genlerinin ve onların internal transcried spacers (ITS) ve intergenik spacer bölgelerinin (IGS) sekans analizine dayanan yöntemdir. Bu yöntemin doğruluğu yüksek olmasına rağmen dizi analizi çok sayıda izolatın tanımlanabilmesi için pahalı ve ayrıca 20 zaman alıcı bir yöntemdir. DNA’ya dayalı en eski yöntemlerden biri olan PCR-RFLP yönteminde ise, spesifik DNA bölgelerini tanıyarak DNA’yı bu bölgelerden kesen restriksiyon endonükleazlar kullanılır. Elde edilen fragmentlerin, agaroz jel elektroforezi ile 25 ayrımı sağlanır. Ethidium bromür ile boyanan bantlar ultraviyole ışık altında görüntülenir. Ancak bütün genomun bu yolla analizi mümkün değildir ve tanımlama gücü dizi analizine göre daha düşüktür. PCR-RAPD analizi, PCR’a dayalı fingerprint yöntemlerinden biridir. Analiz edilecek 30 türlerin DNA dizisi hakkında bir ön bilgiye ihtiyaç duyulmaksızın rastgele dizayn edilmiş yaklaşık 10 bazlık kısa primerler kullanılarak oluşturulan farklı boyutlardaki fragmentler, elektroforez jelinde farklı hızlarda yürüyerek türe spesifik fingerprintler meydana getirirler. rep-PCR (repetitive element palindromic PCR) ise, genom üzerinde tekrarlayan dizilerin PCR ile amplifikasyonuna dayanan (rep-PCR) 3 fingerprint yöntemidir. PCR sonrası oluşan, farklı boyutlardaki fragmentler, elektroforez jelinde farklı hızlarda yürüyerek türe spesifik fingerprintler meydana getirirler. Ancak her iki yöntemin de tekrarlanabilirliği ve tanımlama gücü düşüktür. Mikrobiyal tanımlamada PCR’a dayalı olmayan genotipik tekniklerin kullanıldığı 5 ticari test kitleri mevcut değildir. PCR’a dayalı test kitleri ise, yalnızca belirli mikroorganizma türlerinin spesifik olarak tespitine yönelik kitlerdir. Örneğin gıda kaynaklı patojen bakterilerden Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella Typhymurium vb. ve bazı fırsatçı patojen maya türleri olan Candida albicans ve Cryptococcus neoformans türlerinin tanımlanmasına yönelik olarak 10 geliştirilmiş real-time PCR tekniğine dayalı kitler mevcuttur. Bu kitler yalnızca hedef mikroorganizma türlerini spesifik tanımlamaya yönelik kitlerdir. Yukarıda açıklanan genotipik yöntemler içerisinde herhangi bir ortamdan elde edilen bir mikroorganizmanın sınıflandırılması ve strain/tür/cins seviyesinde 15 tanımlanmasına yönelik olarak geliştirilmiş bir tanımlama kiti veya sistemi bulunmamaktadır. Açıklanan genotipik yöntemlerden hiçbiri direkt tanımlama yapan yöntemler olmayıp birçoğu PCR sonrası uzun ve zahmetli işlemleri gerektirmektedir. Bu 20 aşamada özellikle ethidium bromür gibi toksik ve kanserojenik kimyasalların kullanımına ihtiyaç duyulmaktadır. Ayrıca söz konusu yöntemlerin mikroorganizma tanısı için standardize edilmiş evrensel bir prosedürü bulunmamakta dolayısıyla sonuçlar laboratuvardan 25 laboratuvara ve analizciden analizciye değişiklik gösterebilmektedir. High Resolution Melting (Yüksek Çözünürlüklü Erime-HRM) ve Melting Temperature (Erime Sıcaklığı - Tm) analiz yöntemi, son yıllarda mutasyon tarama ve metilasyon profil analizinde kullanılmaya başlanmış oldukça yeni bir tekniktir. 30 Mikrobiyal tanı amacıyla yalnızca sınırlı sayıda tür üzerinde denemeler yapılmıştır. Bu çalışmalarda yalnızca tek bir DNA bölgesi analiz edilmiştir. Bununla birlikte mikroorganizma tanısında kullanılabilecek HRM ve Tm analizine dayalı kite dönüştürülmüş herhangi bir ürün/kit/sistem mevcut değildir. 4 Sonuç olarak, yukarıda bahsedilen tüm sorunlar, ilgili teknik alanda bir yenilik yapmayı zorunlu hale getirmiştir. 5 BULUŞUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut buluş yukarıda bahsedilen dezavantajları ortadan kaldırmak ve ilgili teknik alana yeni avantajlar getirmek üzere, bir sistem, yöntem ve bu sistemde kullanılmak için bir plate/strip gibi bir çoklu tüp ortamı ve yazılım ile ilgilidir. 10 Buluşun ana amacı, herhangi bir ortamdan izole edilen, bilinmeyen bir mikroorganizmanın sınıflandırılması ve strain/tür/cins/familya…vs. seviyesinde tanımlanmasına yönelik olarak doğru, hızlı, etkin, tekrarlanabilir sonuçlar veren bir mikroorganizma tanımlama sistemi ve yöntemi ortaya koymaktır. 15 Buluşun bir diğer amacı, bilinmeyen bir mikroorganizmayı tek basamaklı bir işlemle ilave işlem ve analizlere gerek olmaksızın strain/tür/cins/familya…vs. seviyesinde tanımlamaktır. 20 Buluşun bir diğer amacı ise, analizci ve çevreye herhangi bir toksik etkisi bulunmayan bir mikroorganizma tanımlama sistemi geliştirmektir. Buluşun bir diğer amacı, tanımlama aralığı (spektrumu) oldukça geniş bir mikroorganizma tanımlama sistemi geliştirmektir. 25 Buluşun bir diğer amacı ise, standardize edildiği zaman analizci, cihaz veya laboratuvar vb. değişimlerden sonuçlarının etkilenmediği bir yöntemi ortaya koymaktır 30 Buluşun bir diğer amacı ise, fenotipik yöntemler gibi çevresel koşullardan etkilenmeyen bir genotipik mikroorganizma tanımlama sistemi ve yöntemi ortaya koymaktır. 5 Buluşun diğer bir amacı tanımlama gücü ve hassasiyeti arttırılmış bir mikroorganizma tanımlama sistemi ve yöntemi ortaya koymaktır. Yukarıda bahsedilen ve aşağıdaki detaylı anlatımdan ortaya çıkacak tüm amaçları 5 gerçekleştirmek üzere mevcut buluş, mikroorganizmaların tanımlanması için; farklı tür/cins mikroorganizmalar arasında değişkenliği (heterojenitesi) yüksek DNA bölgelerinin amplifikasyon ürünlerine ait HRM eğrileri ve Tm değerlerini gerçek zamanlı (4) PCR cihazı veya termal cycler ile kombine florometrik/spektroskopik ölçüm yapan bir cihazdan giriş olarak alan bir işlemci birimini içeren bir sistemdir. 10 Buna göre yeniliği, mikroorganizmaların farklı tür/cins/familya…vs. arasında farklılık gösteren birden çok DNA bölgesini eş zamanlı analiz etmesidir. Buna göre yeniliği, işlemci biriminin; gerçek zamanlı PCR cihazı veya termal cycler 15 ile kombine florometrik/spektroskopik ölçüm cihazının, referans mikroorganizmanın DNA’sını içeren en az bir referans tüpünden aldığı ölçüm verileri ile eş zamanlı olarak diğer mikroorganizmalara ait DNA’ları içeren tüplerden aldığı ölçüm verilerini giriş olarak alacak şekilde konfigüre edilmiş olması, 20 bu yapılanma içerisinde referans mikroorganizma da dahil olmak üzere çoklu sayıdaki bilinen mikroorganizmalara ait strain/tür/cins/familya…vs bilgileri ve HRM eğrileri ve Tm değerlerinden en az birini içeren kayıtlı verileri barındıran bir bilinen mikroorganizmalar veri tabanını içermesi, 25 işlemci biriminin, referans mikroorganizmaya ait ölçüm verileri ile referans mikroorganizmaya ait kayıtlı verileri karşılaştıracak ve aradaki sapma verilerini dikkate alarak bilinmeyen mikroorganizmalara ait verileri ön işlemden geçirerek düzeltilecek şekilde konfigüre edilmiş olması, 30 işlemci biriminin, her bir bilinmeyen mikroorganizmaya ilişkin düzeltilmiş ölçüm verileri ile kayıtlı verileri karşılaştıracak şekilde ve ölçüm verileri ile kayıtlı verilerin eşleşmesi durumunda, kayıtlı verilerin sahibi olan bilinen mikroorganizmalara ait strain/tür/cins/familya…vs bilgilerinden en az birini eşleştikleri bilinmeyen mikroorganizmalara atayacak şekilde konfigüre edilmiş olmasıdır. Böylece bir 6 operatörün yorumlarına/tecrübesine ihtiyaç duyulmadan, farklı cinslerin/türlerin farklı ışıma vermesi bilgisine dayanarak mikroorganizmaların hassas bir şekilde tanımlanması sağlanmaktadır. Ayrıca, çoklu sayıdaki mikroorganizmalara ait ölçüm verileri, eş zamanlı olarak veri tabanı taranarak tanımlamaları yapılmaktadır. 5 Tanımlamanın esası, ayrım gücü oldukça yüksek tek nükleotidlik polimorfizmleri dahi ayırt edebilen HRM ve Tm analizine dayanmaktadır. Buna göre tanımlamanın esası, bilinmeyen bir mikroorganizmanın çok sayıda farklı DNA bölgelerinin (en az 2) eş zamanlı olarak farklı tüplerde amplifikasyonunun ardından, amplifikasyon 10 ürünlerinin HRM ve Tm analizlerinden elde edilen ölçüm sonuçlarının, veri tabanında bilinen mikroorganizmaların kayıtlı HRM ve Tm verileri karşılaştırarak eşleşme esasına göre tanımlama yapılmasına dayanmaktadır. Ölçüm sonuçlarını değişen ölçüm/çevre koşullarına karşı uyumlaştırmak amacıyla, referans mikroorganizmanın aynı hedef DNA bölgeleri eş zamanlı olarak analiz edilmekte ve 15 referans mikroorganizmanın ölçüm sonuçları ile referans mikroorganizmaya ait kayıtlı veriler karşılaştırılarak sapma verileri elde edilmektedir. Bu sapma değerlerine göre bilinmeyen mikroorganizmaya ait ölçüm verileri bir ön işlemden geçirilerek düzeltildikten sonra veri tabanındaki bilinen mikroorganizmalara ait kayıtlı verilerle karşılaştırılmaktadır. 20 Buluşun bir yapılanması, bilinen mikroorganizmalar veri tabanının, bilinen mikroorganizmaların farklı DNA bölgelerine ait HRM ve Tm eğrilerinden en az birini içeren kayıtlı verileri içermesi, işlemci biriminin, bilinmeyen (birinci) bir mikroorganizmanın farklı tüplerdeki farklı DNA bölgelerinin HRM eğrileri ve Tm değerlerine ait ölçüm verilerini giriş olarak 25 alacak şekilde konfigüre edilmiş olması, işlemci biriminin, alınan ölçüm verilerini kayıtlı veriler ile karşılaştıracak şekilde ve önceden hesaplanan yakınlıkta bir eşleşme olması durumunda kayıtlı verilerin sahibi olan bilinen mikroorganizmaya ait kimlik bilgilerinden en az birini (strain/tür/cins/familya…vs) bilinmeyen (birinci) mikroorganizmaya atayacak şekilde 30 konfigüre edilmiş olmasıdır. Böylece farklı dizilim ve uzunluktaki DNA bölgelerinin HRM verileri ve Tm değerlerinin de farklı olacağı bilgisinden yararlanılarak aynı mikroorganizmaya ait çok sayıda farklı DNA bölgesi analiz edilerek eşleştirmenin daha hassas yapılması sağlanmaktadır. Eş zamanlı olarak farklı DNA bölgelerinin çoklu HRM ve Tm analizi yapılabilmektedir. HRM ve Tm sonuçları sistemin yazılımı 7 içindeki veri tabanından taranarak ilave bir işleme ihtiyaç duyulmaksızın strain /tür/cins/familya.. vs seviyesinde tanımlama kısa bir süre içerisinde yapılabilmektedir. 5 Buluşun bir diğer yapılanması, işlemci biriminin, ölçüm verileri ile kayıtlı verileri Öklid algoritması ile karşılaştıracak şekilde konfigüre edilmiş olmasıdır. Buluşun bir diğer yapılanması, işlemci biriminin referans mikroorganizmaya ait kayıtlı veriler ile referans mikroorganizmaya ait ölçüm verilerini karşılaştırarak 10 sapma verilerini oluşturacak şekilde konfigüre edilmiş olmasıdır. Böylece bilinen mikroorganizmalar veri tabanı, HRM ve Tm değerlerinin sapma değerlerine göre güncellenmiş ölçümleri içeren dinamik bir kütüphaneye dönüştürülebilmektedir. Buluşun 15 bir diğer yapılanması, bahsedilen işlemci biriminin karşılaştırma işleminden önce ölçüm verilerini interpolasyon işleminden geçirecek şekilde konfigüre edilmesidir. Böylece ara ölçüm değerleri tahmini olarak elde edilmiş olmaktadır. Buluş ayrıca, ölçüm cihazı ile uyumlu ölçülerde ve ışık geçirgenliği olan yüksek 20 sıcaklığa dayanıklı malzemeden yapılmış, bir plate/strip ve çoklu tüp gibi bir analiz ortamı içermekte olup özelliği; herbir tüp içerisinde liyofilize edilmiş olarak konumlanan primer setlerini (ileri ve geri primer) içermesidir. Böylece HRM ve Tm analizi için kullanıma hazır bir plate/strip/çoklu tüp ortamı sağlanmaktadır. Buluşun bir yapılanması, bir plate/strip gibi çoklu tüp ortamındaki en az iki tüpün 25 farklı DNA bölgelerini ayrıştıran farklı primer setleri içermesidir. Böylece mikrobiyal izolata ait farklı DNA bölgelerinin, tek bir plate/strip/çoklu tüp ortamı üzerinde eş zamanlı olarak HRM ve Tm analizini yapılabilmektedir. Buluşun bir diğer yapılanması, gerçek zamanlı PCR cihazları veya termal cycler ile 30 kombine florometrik/spektroskopik ölçüm yapabilen cihazlar ile uyumlu olmasıdır. Buluşun bir diğer yapılanması, tüm primerlerin biribirine çok yakın bir annealing derecesinde reaksiyon verebilmesidir. 8 Buluşun bir diğer yapılanması, plate’in bir satırda 12 adet ve bir sütunda 8 adet olmak üzere 8x12 adet tüp içermesidir. Buluşun diğer bir yapılanması, plate’in herbir satırındaki primerlerin farklı bir DNA 5 bölgesine etki etmesi, aynı satırdaki tüm primerlerin ise, aynı hedef DNA bölgesine etki eden primerler olmasıdır. Buluş ayrıca, mikroorganizmaların tanımlanması için bir gerçek zamanlı PCR cihazı veya termal cycler ile kombine edilmiş florometrik/spektroskopik ölçüm cihazında 10 analiz edilmek üzere çoklu sayıdaki tüplere çoklu sayıdaki mikroorganizma DNA’larının yerleştirildiği bir yöntemdir. Buna göre yeniliği, bilinmeyen mikroorganizmaların en az 2 farklı DNA bölgesinin HRM ve Tm analizini gerçekleştirmek için kullanıma hazır bir plate/strip/çoklu tüp ortamı gibi bir analiz ortamı, bilinen mikroorganizmalara ait HRM eğrileri ve Tm değerlerinden oluşan 15 veri tabanı ve bilinmeyen mikroorganizmaya ait HRM eğrileri ve Tm değerlerine ait ölçüm verilerini giriş olarak alan ve veri tabanındaki bilinen mikroorganizmalara ait verilerle karşılaştırarak tanımlama yapan bir işlemci birimini içeren bir sistem olmasıdır. Ayrıca bilinmeyen mikrobiyal izolatlara ait çok sayıda farklı DNA bölgesinin 20 (en az iki), amplifikasyon ürünlerinin HRM ve Tm analizini tek bir plate/strip/çoklu tüp gibi bir analiz ortamında eş zamanlı olarak yapmasıdır. - en az bir referans mikroorganizma ve en az bir bilinmeyen mikroorganizmanın, gerçek zamanlı PCR cihazı veya termal cycler ile kombine florometrik/spektroskopik ölçüm cihazı ile analiz edilerek HRM ve Tm değerlerinden 25 en az birini içeren ölçüm verilerinin elde edilmesi, - işlemci birimi tarafından; içerisinde referans mikroorganizma da dahil olmak üzere çoklu sayıdaki bilinen mikroorganizmalara ait strain/tür/cinsfamilya ..vs. bilgileri ve HRM ve Tm verilerinden en az birini içeren kayıtlı verileri barındıran bir bilinen mikroorganizmalar veri tabanına erişilmesi, 30 - işlemci birimi tarafından; referans mikroorganizmaya ait ölçüm verileri ile referans mikroorganizmaya ait kayıtlı verilerin karşılaştırılması ve aradaki sapma verilerini dikkate alınarak bilinmeyen mikroorganizmalara ait ölçüm verilerinin bir ön işlemle düzeltilmesi 9 - işlemci birimi tarafından; her bir bilinmeyen mikroorganizmaya ilişkin düzeltilmiş ölçüm verileri ile kayıtlı verilerin karşılaştırılması ve ölçüm verileri ile kayıtlı verilerin önceden hesaplanan yakınlıkta eşleşmesi durumunda kayıtlı verilerin sahibi olan bilinen mikroorganizmalara ait strain/tür/cins/familya …vs 5 bilgilerinden en az birini eşleştikleri bilinmeyen mikroorganizmalara atanmasıdır. Buluşun diğer bir yapılanması, içinde DNA olmadığı bilinen bir kontrol tüpünden önceden hesaplanan değerlerde bir ölçüm verisi alındığında kullanıcının uyarılmasıdır. Böylece ölçümlerin dolayısıyla eşleştirmelerin hatalı yapılması 10 önlenmektedir. ŞEKİLİN KISA AÇIKLAMASI Şekil 1’de plate örneği üzerinden buluş konusu sistemin temsili bir görünümü 15 verilmiştir. Şekil 2a’da platenin üstten temsili bir görünümü verilmiştir. Şekil 3’de platenin sağ yanından bakıldığındaki temsili bir görünümü verilmiştir. 20 Şekil 2c’de platenin üst yanından bakıldığındaki temsili bir görünümü. ŞEKİLDE VERİLEN REFERANS NUMARALARI 25 1 İşlemci birimi 2 Hafıza birimi 21 Birinci veri tabanı 22 İkinci veri tabanı 23 Bilinen mikroorganizmalar veri tabanı 30 3 Plate 31 Tüp 311 Kontrol tüpü 312 Referans tüpü 32 Kontrol Sütunu 10 33 Referans sütunu 34 Birinci sütun 35 İkinci sütun 36 Birinci DNA bölgesi satırı 37 İkinci DNA bölgesi satırı 5 4 Gerçek zamanlı PCR cihazı 5 Primer seti 51 Birinci primer seti 52 İkinci primer seti 10 BULUŞUN DETAYLI AÇIKLAMASI Bu detaylı açıklamada buluş konusu sistem ve yöntem sadece konunun daha iyi anlaşılmasına 15 yönelik hiçbir sınırlayıcı etki oluşturmayacak örneklerle açıklanmaktadır. Mevcut buluştaki mikroorganizma tanımlama sisteminin esası, HRM eğrileri ve Tm değerlerinin analizine dayanmaktadır. 20 Ölçümün esası; sıcaklık artışı ile birlikte çift zincirli DNA’nın ayrışma karakteristiklerini analiz eden erime eğrisi (Melting curve analysis) analizine dayanmaktadır. HRM analiziyle bu erime eğrisinin sıcaklığa bağlı olarak floresan şiddetindeki değişim grafiği oluşturulmaktadır. Ayrıca çift zincirli DNA’nın tek zincirli hale geçtiği sıcaklık derecesi olarak bilinen erime noktası (Melting temperature25 Tm) analizine dayanmaktadır. Buluş konusu sistem mikroorganizmalar arasında değişkenlik gösteren birden çok hedef DNA bölgesinin, PCR gibi bir amplifikasyon işlemiyle çoğaltıldıktan sonra eş zamanlı olarak HRM ve Tm analizini yapmaktadır. 30 Buluş, en genel anlamda, tanımlanacak mikroorganizma türlerinin her bir DNA bölgesi için elde edilen ortalama HRM eğrileri ve Tm değerlerini veri tabanında kayıtlı türlerin yapmaktadır. verileri ile karşılaştırıp benzerlik oranına göre tanımlama 11 Mikroorganizma tanımlama sitemi, toprak, su, gıda, yem vs. gibi çeşitli çevresel ve biyolojik materyallerden izole edilerek saflaştırılan bilinmeyen mikroorganizmaların familya/cins/tür/strain…vs seviyesinde tanımlanmasında kullanılır. Mikroorganizma 5 tanımlama siteminde analiz edilen DNA’lar, bilinmeyen mikroorganizmalardan uygun bir yöntem ile ekstrakte edilmiş yüksek saflıktaki DNA’lardır. Ölçüm cihazı, gerçek zamanlı PCR cihazı (4) veya bir termal cycler ile kombine edilebilen bir florometrik/spektroskopik deteksiyon sistemi olup bir tüp (31) 10 içerisindeki mikroorganizmalara döngüsel ısıl işlem uygulayarak çoğaltan, daha sonra ani ısıtma ve kademeli soğutma işlemlerinden geçirerek ışıma şiddetinde meydana gelen değişimi ölçüm verisine dönüştüren bir cihazdır. Termal döngü reaksiyonları ve florometrik ölçümler cihaza uygun boyut ve geçirgenlikteki (ısı ve ışık) tüplerde (31) gerçekleştirilmektedir. 15 Her bir tüp (31) içerisinde, test edilmek istenen mikroorganizmaya ait DNA ile birlikte mikroorganizmanın ilgili DNA bölgesinin ısıl döngülere tabi tutulduğunda amplifikasyonunu sağlayan bir ileri ve bir de geri primer (primer seti (5)) ve çift zincirli DNA’nın ayrışması ile ışıma şiddeti değişen bir renklendirici yer almaktadır. 20 PCR’da uygulananı ısıl döngüler sonucunda hedef DNA bölgesi çoğaltılmakta ve elde edilen PCR ürünlerinin erime eğrisi analizi sırasında, çift zincirli DNA’ya satüre olmuş floresan dönüştürülmektedir. boyanın floresan şiddetindeki azalma ölçüm verisine Bu yapılanmada ölçüm cihazı, tüpler (31) içerisindeki floresans veya muadil bir renklendiriciyi uyarmak için (excitation) çeşitli dalga 25 boylarında ışık uygulayabilmekte ve daha sonra oluşan ışımayı (emission) ölçebilmektedir. Buluş konusu sistem, ölçüm cihazı ile haberleşebilen bir işlemci birimini (1) ve işlemci birimi (1) ile ilişkili bir hafıza birimini (2) içermektedir. İşlemci birimi (1) herhangi bir genel ya da özel amaçlı bir işlemci olabilmektedir. Hafıza birimi (2) ise 30 RAM, ROM, manyetik ya da optik özellikli bir sabit disk ya da bilgisayar tarafından okunabilir herhangi bir veri saklama cihazı kombinasyonunu içerebilmektedir. Daha detaylı olarak ölçüm cihazından alınan ölçüm verileri, yüksek çözünürlükte erime eğrisi (HRM eğrisi) ve erime derecesini (Tm) içermektedir. HRM eğrisi, analiz 12 edilen her bir mikroorganizma türünün farklı DNA fragmentlerine ait yüksek çözünürlüklü erime eğrilerini (HRM analizi), Tm değerleri ise, bir tüpteki (31) DNA fragmentlerinin %50’sinin tek zincirli hale geçebilmesi için gerekli olan sıcaklık derecesi değerlerini içermektedir. HRM eğrisi ve Tm değeri hedef DNA 5 fragmentinin baz dizilimi ve uzunluğuna bağlı olarak değişmekte dolaysıyla mikroorganizmaların cins tür ve hatta strainlerine göre farklılık göstermektedir. Hedef DNA bölgeleri, filogenetik ve moleküler sistematik çalışmalarda yaygın olarak kullanılan, nükleotid dizilerine hemen hemen tüm türler için gen bankasından 10 erişilebilen, ribozomal RNA genleri veya bunlar arasında bulunan ITS ve ISR bölgeleri veya heterojenitesi yüksek başka bir DNA bölgesi olabilmektedir. Hafıza biriminin (2) bilinen mikroorganizmalara ait veri tabanı, çoklu sayıdaki bilinen mikroorganizmalara 15 ait verileri içermektedir. Daha detaylı olarak, bilinen mikroorganizmaların familya, cins, tür ve strain bilgilerini kapsayan kimlik bilgilerini ve HRM eğrileri ve Tm değerlerini kapsayan kayıtlı verileri içermektedir. HRM eğrileri ve Tm değerleri önceden bilinen veya önceden test edilmiş veriler olabilmektedir. Veri tabanına kayıtlı herbir mikroorganizmanın birden çok farklı DNA bölgeleri için (en az iki farklı bölge) HRM eğrileri ve Tm değerleri sağlanmaktadır. 20 Örneğin; bir bilinen mikroorganizmaya ait cins ve tür bilgileri ile ilişkilendirilmiş bir birinci DNA bölgesi için kayıtlı veriler, bir ikinci DNA bölgesi için kayıtlı veriler, bir üçüncü DNA bölgesi için kayıtlı veriler vb. veri tabanında yer almaktadır. Örnek bir yapılanmada bilinen mikroorganizmalar veri tabanı (23) harici olarak sağlanabilmektedir. 25 Mikroorganizma tanımlama sistemine ait bilinen mikroorganizmalar veri tabanı (23) oluşturulurken her bir türe ait en az 2 suş (strain) kullanılmaktadır. Bilinen mikroorganizmalar veri tabanı (23), her bir türe ait en az iki farklı DNA bölgesi için elde edilen HRM eğrilerini ve Tm değerlerini içermektedir. 30 Mikroorganizmalara ait DNA’ların PCR reaksiyonları ve sonrasında HRM ve Tm analizlerinin gerçekleştirildiği fiziksel ortamlar ölçüm cihazı ile uyumlu çoklu tüp, plate (3) veya strip olabilir. Buluş konusu analizi sistemi aşağıda plate (3) örneği üzerinden açıklanmıştır. 13 Bir plate (3) veya strip/çoklu tüp ortamı, içerisinde tanımlanmak istenen ve bilinmeyen mikroorganizmaların DNA’larının, hedef bölgelerinin ölçüm cihazı tarafından analiz edilmesi üzere sağlanmaktadır. Bahsedilen plate (3) ve strip, 5 çoklu sayıdaki tüplerinin (strip ise 8 veya 12 adet tüp (31)) birbirleriyle bitişik olduğu reaksiyon ortamlarıdır. Bahsedilen tüpler (31) birer uçları açık ve içlerinde sıvı tutabilecek formdadır. Bahsedilen plate (3) matris formuna dizilmiş tüpleri (31) içermektedir. Bahsedilen plate (3) bir sütununda 8 adet tüp (31) ve bir satırında 12 adet tüp (31) içermektedir. Bahsedilen platein bir sütunu kontrol sütunu (32) olarak 10 tanımlanmaktadır. Bu sütundaki tüplere (31) DNA yerleştirilmemekte, dolayısıyla bu sütundaki tüplerde (31) algılanacak ışımalar ölçüm ortamındaki kontaminasyon veya çeşitli hataları belirlemede fayda sağlamaktadır. Plate (3), bir referans sütunu (33) olarak tanımlanan bir sütunu da içermektedir. Bahsedilen referans sütunu (33), referans olarak kullanılmak üzere HRM ve/veya Tm değerleri ile birlikte kimlik 15 bilgileri de bilinen bir mikroorganizmaya ait DNA’yı yerleştirmek üzere sağlanmaktadır. Bir birinci sütun (34) olarak tanımlanan bir sütun da bir birinci mikroorganizma, bir ikinci sütun (35) olarak tanımlanan bir sütun da bir ikinci mikroorganizmanın DNA’larının yerleştirilmesi için sağlanmaktadır. Çoklu sayıda mikroorganizmaların DNA’ları diğer sütunlara yerleştirilebilmektedir. İçerisine 20 mikroorganizmalara ait DNA’lar yerleştirilecek tüplerin (31) herbir satırı farklı DNA bölgelerini amplifiye edebilen farklı ileri ve geri primerler (primer seti (5)) içermektedir. Bahsedilen primerler liyofilize edilmiş olarak tüplerde (31) konumlanmaktadır. Bir birinci satır (36) birinci DNA bölgesini amplifikasyonunu sağlamak üzere bir birinci primer seti (51) içerirken, bir ikinci satır (37) (ikinci dna 25 bölgesi satırı) ikinci DNA bölgesini amplifikasyonunu sağlamak üzere bir ikinci primer seti (52) içermektedir. Daha detaylı olarak mikroorganizma tanımlamasında kullanılacak plate (3), 8x12 kuyucuklu 30 ve gerçek zamanlı PCR cihazı (4) veya başka bir florometrik/spektroskopik ölçüm sistemi ile uyumlu bir malzeme ve ölçülerde yapılmış olup, tüpler (31) (kuyucuklar) içerisinde PCR reaksiyonu ve sonrasında HRM ve Tm analizi gerçekleşmektedir. Plate’in (3) konfigürasyonunda, herbir satırdaki farklı bir DNA bölgesinin eş zamanlı olarak analizinin yapılmasına imkan tanımaktadır. Dolaysıyla, plate’in (3) her bir satırı, 8 farklı DNA bölgesinin 14 amplifikasyonunu sağlayacak 8 farklı primer seti (5) içermektedir. Primer setleri hedef DNA bölgesini amplifiye edecek ileri ve geri primerden oluşur ve her biri plate (3) içerisinde uygun konstrasyonunda ve liyofilize olarak bulunmaktadır. 5 Plate (3) üzerindeki birinci sütunda (34) yer alan tüplerden (31) biri birinci tüp (313) olarak tanımlanmakta, ikinci sütunda (35) yer alan tüplerden (31) biri ikinci tüp (314) olarak tanımlanmakta, referans sütununda (33) yer alan tüplerden (31) biri referans tüpü (312) olarak, kontrol sütununda (32) yer alan tüplerden (31) biri de kontrol tüpü (311) olarak tanımlanmaktadır. 10 Yukarıda detayları anlatılan sistemin örnek bir yapılanması aşağıdaki gibi çalışmaktadır: Kontrol sütununa (32) DNA konulmamakta diğer sütunlardaki tüplere (31) 15 mikroorganizma DNA’ları yerleştirilmektedir. Referans sütununa (33), bir referans mikroorganizmaya ait DNA yerleştirilmektedir. Birinci sütundaki (34) tüplere (31) bir birinci mikroorganizmaya ait DNA yerleştirilmektedir. Bahsedilen birinci mikroorganizma türü, cinsi vs. öğrenilmek istenen bir mikroorganizmadır. İkinci sütundaki (35) tüplere (31) bir ikinci mikroorganizmanın DNA’sı yerleştirilmektedir. 20 Mikroorganizmalara ait DNA’ları içeren tüplere (31) hedef DNA bölgesinin amplifikasyonu ve daha sonra amplifikasyon ürünlerinin HRM ve Tm analizini sağlayan karışımlar eklenmektedir. Tercih edilen yapılanmada floresan bir renklendirici ve PCR master karışımı eklenmektedir. Birinci satırda (36) (birinci DNA bölgesi satırı), herbir sütundaki mikroorganizmaların birinci DNA bölgesi 25 amplifiye edilmekte, ikinci satırda (37) ise, herbir sütundaki mikroorganizmaların ikinci DNA bölgeleri amplifiye edilmektedir. Böylece 8 satırda 8 farklı DNA bölgesi amplifiye edilmektedir. Mikroorganizma tanımlama sisteminin plate’i (3) kullanıma hazır olup her bir kuyucuğa PCR master karışımı ve DNA ilave edilerek uygun hacimler içerisinde reaksiyon 30 gerçekleştirilmektedir. PCR master karışımı; Reaksiyon Buffer, deoksinükleotid trifosfatlar (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), MgCl2, çift zincirli DNA’ya interkalate yapabilen floresans veya muadil özellikte boya, DNA Polymeraz enzimi ve PCR Grade suyu içerebilmektedir. 15 HRM ve Tm analizi için çift zincirli DNA’ya bağlandığında (intercalating) yüksek floresans ışıma yapan renklendiriciler kullanılmaktadır. Boyanın DNA’ya bağlanmış durumdaki floresanslığı bağlanmamış durumdaki floresanslığına göre çok daha (en az 1000 kat) fazla olmalıdır. Mikroorganizma tanımlama sisteminde HRM ve Tm 5 analizi için aynı boya kullanılmaktadır. HRM ve Tm analizi için uygun özellikteki diğer muadil boya veya işaretleyiciler de kullanılabilmektedir. Burada referans mikroorganizma, (pozitif kontrol) tanımlama sisteminde kullanılan tüm primerlerle reaksiyon veren, türü kesin olarak bilinen, ATTC veya diğer kültür 10 kolleksiyonlarından temin edilen suş (strain) anlamına gelmektedir. Gerçek zamanlı PCR cihazı (4) veya bir termal cycler ile kombine edilebilen floresans ölçüm sistemi, tüplere (31) ısıl uygulamanın sonucunda hedef DNA fragmentlerine ait HRM ve Tm eğrilerini elde etmektedir. İşlemci birimi (1) HRM 15 ve/veya Tm eğrilerini içeren ölçüm verilerini giriş olarak almaktadır. İşlemci birimi, (1) ölçüm verilerini interpolasyon işleminden geçirerek bahsedilen birinci veri tabanına (21) kaydetmektedir. Buna göre veri tabanı oluşturulurken 60-99 oC sıcaklık aralığındaki 0.01-0.1 oC arasında artışlı değerler standart olarak kabul edilmektedir. 20 Örnek bir yapılanmada, PCR ürünlerinin artan sıcaklığa karşı floresans şiddetindeki değişime ait ölçüm cihazından elde edilen ölçüm verileri, RDML (Real-time PCR Data Markup Language) uzantılı dosyalara çevrilmektedir. Elde edilen RDML uzantılı dosyalar R dili ile analiz edilerek HRM ve Tm değerleri elde edilmektedir. 25 Örnek bir yapılanmada işlemci birimi (1), bilinmeyen mikroorganizmalara (örneğin birinci mikroorganizma veya ikinci mikroorganizma….) ait ölçüm verilerini bilinen mikroorganizmalar veri tabanındaki (23) bilinen mikroorganizmalara ilişkin kayıtlı verilerle karşılaştırmaktadır. Bilinen mikroorganizmalar veri tabanındaki (23) bilinen 30 mikroorganizmalara ait tüm veriler bilinmeyen mikroorganizmalardan elde edilen verilerle, eşleştiklerinde bilinen mikroorganizmaların kimlik bilgilerinden en az birini (strain/tür/cins/familya…vs) bilinmeyen mikroorganizmaya atamaktadır. Örneğin; bir birinci mikroorganizmanın DNA’sının yerleştirildiği plate’in (3) bir sütundaki tüm satırlarından (8 farklı DNA bölgesine ait veriler) elde edilen ölçüm verileri, bilinen 16 mikroorganizmalar veri tabanındaki (23) bir A mikroorganizmasının verileri ile eşleştiğinde, A mikroorganizmasının kimlik bilgilerinden en az biri (strain/ tür/ cins.. vs) birinci mikroorganizmaya atanmaktadır. 5 Buluş konusu tanımlama sisteminin değişen koşullardan (laboratuar, analizci, cihaz, kimyasal malzeme …vs) sonuçların etkilenmemesi ve standardizasyonun sağlanması için ölçüm sistemi bir referans mikroorganizmaya ait ölçüm verileri ile her ölçümde standardize edilmektedir. 10 Örnek bir yapılanmada işlemci birimi (1), referans mikroorganizmaya ait ölçüm verilerini, referans mikroorganizmanın bilinen mikroorganizmalar veri tabanında (23) yer alan kayıtlı verileri ile karşılaştırmaktadır. İşlemci birimi (1) referans mikroorganizmaya ilişkin ölçüm verileri ile aynı mikroorganizmanın kayıtlı verileri arasındaki sapmayı bir sapma verisi olarak bir ikinci veri tabanına (22) 15 kaydetmektedir. İşlemci birimi (1), sapma verilerini hesaba katarak bilinmeyen mikroorganizmalara ait verileri bu sapma değerlerine göre düzeltmektedir. İşlemci birimi (1) daha sonra, bilinen mikroorganizmalar veri tabanındaki (23) kayıtlı verileri, 20 bilinmeyen karşılaştırmaktadır. mikroorganizmalara, mikroorganizmaların Bilinen eşleştikleri düzeltilmiş mikroorganizmalarla bilinen ölçüm eşleşen mikroorganizmaların verileri ile bilinmeyen kimlik bilgileri atanmaktadır. Sapma verileri, ölçüm verileri ve kayıtlı veriler arasındaki farkı içerebileceği gibi 25 ölçüm verileri ile kayıtlı veriler arasında alınan bir ortalamayı da içerebilmektedir. Burada temel olan ölçüm ortamından alınan veriler ile kayıtlı verileri normalize ederek isabetli bir eşleşmenin yakalanmasını sağlamaktır. Örnek bir yapılanmada yukarıda da bahsedildiği gibi, referans mikroorganizmanın 30 ölçüm verileri ile kayıtlı verileri kıyaslanarak elde edilen sapma verilerine göre bilinmeyen mikroorganizmaların ölçüm verileri ön işlemden geçirilerek düzeltilmiş HRM eğrileri ve Tm değerleri oluşturulabilmektedir. Bilinmeyen mikroorganizmanın en az iki (plate (3) sistemi için 8) farklı DNA bölgesi kullanılarak elde edilen HRM ve Tm verileri ön işlemden geçirilerek kaydedilmektedir. Bu işlem tüm bilinmeyen 17 mikroorganizmalara ait veriler için tekrarlanarak veri tabanında kayıtlı bilinen mikroorganizmaların verileri ile karşılaştırılmaktadır. Bu yöntem sayesinde çevresel etmenlerden ve ölçüm koşullarından kaynaklanan hatalar da minimuma indirilmektedir. HRM ve Tm verilerinin tanımlandığı bilinen mikroorganizmalar veri 5 tabanı (23) yapısı esnek olup güncellemelere açıktır. Örnek bir yapılanmada işlemci birimi (1), aynı sütundaki tüm tüplere (31) yerleştirilen bir mikroorganizma DNA’sının, farklı satırlarda farklı DNA bölgeleri amplifiye edilerek elde edilen amplifikasyon ürünlerinin HRM ve Tm analizine ait 10 ölçüm verilerini, veri tabanında yer alan bilinen mikroorganizmaların ilgili DNA bölgelerine ait kayıtlı verileri ile karşılaştırmaktadır. Bahsedilen karşılaştırma Öklid algoritmasıyla yapılabilmektedir. Böylece bir mikroorganizmanın farklı DNA bölgelerinden alınan ölçüm verileri, kayıtlı verilerle karşılaştırılarak daha hassas bir eşleştirme yapılmasını imkan tanımaktadır. 15 Örnek bir yapılanmada işlemci birimi (1), analiz edilen tüm DNA bölgelerine ait verilerin veri tabanında kayıtlı türlerin verileriyle strain veya tür seviyesinde eşleşmediği durumlarda bilinmeyen mikroorganizmaya yeterince yakın olan bir bilinen mikroorganizmanın cins bilgisini bilinmeyen mikroorganizmaya atamaktadır. 20 Örnek bir yapılanmada karşılaştırma işlemi veri tabanında kayıtlı HRM eğrileri ve Tm değeri ile yapılmaktadır. “Düzeltilmiş HRM eğrisi”, referans mikroorganizmanın herhangi bir DNA bölgesi için elde edilen HRM eğrisine ait sapma değerlerine göre bilinmeyen mikroorganizmanın (analiz edilen mikrobiyal izolatın) aynı DNA bölgesi 25 için elde edilen HRM eğrisinin ön işlemden geçirilerek güncellenmesi ile elde edilen eğridir. “Düzeltilmiş Tm değeri” ise referans mikroorganizmanın herhangi bir DNA bölgesi için elde edilen Tm değerine ait sapma değerlerine göre bilinmeyen mikroorganizmanın (analiz edilen mikrobiyal izolatın) aynı DNA bölgesinin Tm değerinin ön işlemden geçirilerek güncellenmesi ile elde edilen değerdir. 30 Geliştirilen sistem ile birçok genotipik yöntemde olduğu gibi PCR sonrasında kullanılan toksik etkili ethidium bromür gibi kimyasallara ihtiyaç duyulmamaktadır. Bu sayede ethidium bromür ile kontamine olan atıkların neden olduğu çevresel problemler oluşmamaktadır. 18 Buluşun koruma kapsamı ekte verilen istemlerde belirtilmiş olup kesinlikle bu detaylı anlatımda örnekleme amacıyla anlatılanlarla sınırlı tutulamaz. Zira teknikte uzman bir kişinin, buluşun ana temasından ayrılmadan yukarıda anlatılanlar 5 ışığında benzer yapılanmalar ortaya koyabileceği açıktır. 19 İSTEMLER 1. Mikroorganizma tanımlama için bir sistem olup, özelliği HRM ve Tm analizi için kullanıma hazır bir plate (3) veya strip/çoklu tüp gibi bir analiz ortamı, 5 bilinen mikroorganizmalara ait HRM eğrileri ve Tm değerlerini içeren bilinen mikroorganizmalar veri tabanı (23) ve bilinmeyen mikroorganizmanın HRM eğrileri ve Tm değerlerine ait ölçüm verilerini giriş olarak alan ve bir bilinen mikroorganizmalar veri tabanındaki (23) bilinen mikroorganizmalara ait verilerle karşılaştırarak tanımlama yapan bir işlemci birimini (1) içeren bir 10 sistem olup içerisinde; bilinmeyen mikroorganizmalara (mikrobiyal izolatlara) ait birden çok farklı DNA bölgesinin bir analiz ortamı (tek bir plate (3) içerisinde eş zamanlı olarak HRM ve Tm analizini yapmaktadır. 2. Mikroorganizmaların tanımlanması için bir gerçek zamanlı PCR cihazı (4) 15 veya termal cycler ile kombine edilmiş bir florometrik/spektroskopik ölçüm cihazından, alınan bilinmeyen bir mikroorganizmaya ait HRM eğrileri ve Tm değerlerini içeren ölçüm verilerini giriş olarak alan bir işlemci birimini (1) içeren bir sistem olup özelliği; işlemci biriminin (1); ölçüm cihazının, tüplerden (31) aldığı ölçüm verileri ile 20 birlikte eş zamanlı olarak bir referans mikroorganizmayı içeren en az bir referans tüpünden (312) aldığı ölçüm verilerini de giriş olarak alacak şekilde konfigüre edilmiş olması, içerisinde referans mikroorganizma da dahil olmak üzere çoklu sayıdaki 25 bilinen mikroorganizmalara ait strain/tür/cins/familya… vs bilgileri ile HRM eğrileri ve/veya Tm değerlerinden en az birini içeren kayıtlı verileri barındıran bir bilinen mikroorganizmalar veri tabanını (23) içermesi, işlemci biriminin (1), referans mikroorganizmaya ait ölçüm verileri ile 30 referans mikroorganizmaya ait kayıtlı verileri karşılaştıracak ve bilinmeyen mikroorganizmalara ait verileri de bir ön işlemle bu sapma verilerini dikkate alarak bu verilere göre düzeltecek şekilde konfigüre edilmiş olması, 20 işlemci biriminin (1), her bir bilinmeyen mikroorganizmaya ilişkin düzeltilmiş ölçüm verileri ile kayıtlı verileri karşılaştıracak ve ölçüm verileri ile kayıtlı verilerin eşleşmesi durumunda kayıtlı verilerin sahibi olan bilinen mikroorganizmalara ait strain/tür/cins/familya …vs. bilgilerinden en az birini 5 eşleştikleri bilinmeyen mikroorganizmalara atayacak şekilde konfigüre edilmiş olmasıdır. 3. İstem 2’ye göre bir sistem olup özelliği; bilinen mikroorganizmalar veri tabanının (23) bilinen mikroorganizmaların farklı DNA bölgelerine ait HRM 10 ve Tm eğrilerinden en az birini içeren kayıtlı verileri de içermesi, işlemci biriminin (1), farklı tüplerde (31) yer alan birinci (bilinmeyen) mikroorganizmanın, farklı DNA bölgelerine ait HRM eğrileri ve Tm değerlerine ait ölçüm verilerini giriş olarak alacak şekilde konfigüre edilmiş 15 olması, işlemci biriminin (1), alınan ölçüm verilerini kayıtlı veriler ile karşılaştıracak şekilde ve önceden hesaplanan yakınlıkta bir eşleşme olması durumunda kayıtlı verilerin sahibi olan bilinen mikroorganizmaya ait kimlik bilgilerinden 20 en az birini (strain/tür/cins/familya …vs) birinci mikroorganizmaya atayacak şekilde konfigüre edilmiş olmasıdır. 4. İstem 2’ye göre bir sistem olup özelliği; işlemci biriminin (1), ölçüm verileri ile kayıtlı verileri Öklid algoritması ile karşılaştıracak şekilde konfigüre 25 edilmiş olmasıdır. 5. İstem 2’ye göre bir sistem olup özelliği; işlemci biriminin (1) referans mikroorganizmaya ait kayıtlı veriler ile referans mikroorganizmaya ait ölçüm verilerini karşılaştırarak sapma verilerini oluşturacak şekilde konfigüre 30 edilmiş olmasıdır. 6. İstem 2’ye göre bir sistem olup özelliği; bahsedilen işlemci biriminin (1) karşılaştırma işleminden önce ölçüm verilerini interpolasyon işleminden geçirecek şekilde konfigüre edilmesidir. 21 7. Reaksiyonların gerçekleştirildiği plate (3) veya strip/çoklu tüp ortamı gibi analiz ortamı, ölçüm cihazı ile uyumlu ölçülerde ve ışık geçirgenliği olan yüksek sıcaklığa dayanıklı malzemeden yapılmış bir ortam olup özelliği; tüp (31) içerisinde liyofilize edilmiş olarak konumlanan primer setlerini 5 içermesidir. 8. İstem 7’ye göre bir plate (3) veya strip/çoklu tüp ortamı olup özelliği; farklı DNA bölgelerini ayrıştıran farklı primerler setlerini içermesidir. 10 9. İstem 7’ye göre bir plate (3) veya strip/çoklu tüp ortamı olup özelliği; gerçek zamanlı (4) PCR cihazları ve florometrik/spektroskopik ölçüm yapan cihazlarla uyumlu formda olmasıdır. 15 10. İstem 7’ye göre bir plate (3) veya strip/çoklu tüp ortamı olup özelliği; kullanılan tüm primerlerin biribirine yakın bir annealing derecesinde reaksiyona girebilmesidir. 20 11. İstem 7’ye göre bir plate (3) veya strip/çoklu tüp ortamı olup özelliği; bir satırda 12 adet ve bir sütunda 8 adet olmak üzere 8x12 adet tüp (31) içermesidir. 12. İstem 7’ye göre bir plate (3) veya strip/çoklu tüp ortamı olup özelliği; herbir 25 satırda primerlerin farklı bir DNA bölgesine etki etmesi, bir satırdaki tüm primerlerin aynı DNA bölgesine etki eden primerler olmasıdır. 13. Mikroorganizmaların tanımlanması için bir gerçek zamanlı PCR cihazı (4) veya termal cycler ile kombine edilmiş bir 30 florometrik/spektroskopik ölçüm cihazında analiz edilmek üzere çoklu sayıdaki tüplere (31) çoklu sayıdaki mikroorganizmanın yerleştirildiği bir yöntem olup özelliği; 22 - en az bir referans mikroorganizma ve en az bir bilinmeyen mikroorganizmanın ölçüm cihazı ile analiz edilerek HRM ve Tm değerlerinden en az birini içeren ölçüm verilerinin elde edilmesi, 5 - işlemci birimi (1) tarafından; içerisinde referans mikroorganizma da dahil olmak üzere çoklu sayıdaki bilinen mikroorganizmalara ait strain/tür/cins/familya… vs. bilgileri ve HRM eğrileri ve Tm değerlerinden en az birini içeren kayıtlı verileri barındıran bir bilinen mikroorganizmalar veri tabanına (23) erişilmesi, 10 - işlemci birimi (1) tarafından; referans mikroorganizmaya ait ölçüm verileri ile referans mikroorganizmaya ait kayıtlı verilerin karşılaştırılması ve aradaki sapma verilerini dikkate alınarak bilinmeyen mikroorganizmaların ölçüm verilerinin bir ön işlemle bu verilere göre düzeltilmesi 15 - işlemci birimi (1) tarafından; her bir bilinmeyen mikroorganizmaya ilişkin düzeltilmiş ölçüm verileri ile kayıtlı verilerin karşılaştırılması ve ölçüm verileri ile kayıtlı verilerin eşleşmesi durumunda kayıtlı verilerin sahibi olan bilinen mikroorganizmalara ait strain/tür/cins/familya… vs. bilgilerinden en az birinin eşleştikleri bilinmeyen mikroorganizmalara 20 atanmasıdır. 14. İstem 13’e göre bir yöntem olup özelliği; 25 işlemci biriminin (1), farklı tüplerde (31) yer alan aynı bilinmeyen mikroorganizmanın farklı DNA bölgelerine ait HRM ve Tm değerlerini içeren ölçüm verilerini bilinen mikroorganizmalar veri tabanındaki (23) ilgili DNA bölgesine ait kayıtlı verileri ile karşılaştırılması, önceden hesaplanan yakınlıkta bir eşleşme olması durumunda kayıtlı verilerin sahibi olan bilinen mikroorganizmaya ait strain/tür/cins/familya… vs. 30 bilgilerinden en az birinin eşleştikleri bilinmeyen mikroorganizmaya atanmasıdır. 15. İstem 13’e göre bir yöntem olup özelliği; ölçüm verileri ile kayıtlı verilerin Öklid algoritması ile karşılaştırılmasıdır. 23 16. İstem 13’e göre bir yöntem olup özelliği; içinde mikroorganizma olmadığı bilinen bir kontrol tüpünden (311) önceden hesaplanan değerlerde bir ölçüm verisi alındığında kullanıcının kontaminasyon olduğu yönünde uyarılmasıdır. 5 10 15 20 25 30 24 ÖZET MİKROORGANİZMA TANIMLAMAK İÇİN BİR SİSTEM VE YÖNTEM 5 Mevcut buluş, mikroorganizmaların strain/tür/cins/familya vs. seviyesinde tanımlanabilmesi ve taksonomik olarak sınıflandırılabilmesi için geliştirilmiş bir sistem ile ilgilidir. Buluş özellikle, herhangi bir ortamdan elde edilen bilinmeyen bir mikroorganizmanın sınıflandırılması ve strain/tür/cins/familya vs. seviyesinde tanımlanmasına yönelik olarak geliştirilmiş HRM ve Tm analizi için kullanıma hazır 10 bir plate (3) veya strip/çoklu tüp gibi analiz ortamı ile bunu destekleyen bilgisayar tabanlı bir sistem ve yöntemdir. Şekil 1
