BYM613 Genetik Mühendisliği Rekombinant DNA Teknolojisi - Özet Hacettepe Üniversitesi Biyomü Biyomühendislik Bö Bölümü 20122012-2013 Gü Güz Dö Dönemi Dr. Eda Çelikelik-AKDUR [email protected] Ref: The Scientist, Oct 17, 2012. 1 DNA Tamir Mekanizmaları 1.Direkt onarım ya da hasarın geri döndürülmesi Fotoreaktivasyon O-6-metilguanin onarımı Basit tek zincir kırıklarının ligasyonu 2.Eksizyon (kesip-çıkarma) onarımı Baz eksizyon onarımı (BER) (base excision repair) Nükleotid eksizyon onarımı (NER) (nucleotide excision repair) Mismatch (yanlış eşleşme) eksizyon onarımı (MER) 3. Rekombinasyonal Onarım 4. SOS Onarımı 5. DNA Çift Zincir Kırıklarının Onarımı Serbest Uçların Homolog Olmayan Bağlanması (NHEJ) Homolog Rekombinasyon (HR) Burcu Sarıkaya, BYM613- 2012 sunumundan Bölge Yönlendirilmiş Mutasyon Oligonükleotid Plazmid DNA dizisi *Sentetik *DNA sarmalı, tekli diziler oluşturmak için denature edilir. İstenen mutasyonu içeren bir oligonükleotid sentezlenir. oligonnükleotid hedeflenen bölgeye gelecek şekilde tavlama yapılır. *Plazmid DNA dizisi şablon olarak kullanılarak mutant oligonükleotid uzatılır. * Elde edilen DNA dizileri E.coli içine yerleştirilerek çoğalması sağlanır. Çoğalan heteroduplex yapıların yaklaşık %50sinin mutasyona uğramış, %50sinin ise mutasyoına uğramamış olduğu kabul edilir. Çeşitli yöntemler kullanılarak bu iki yapı birbirinden ayrılır. Gökçe Dicle Demir, BYM613- 2012 sunumundan In vitro site-specific mutagenesis - From Human Molecular Genetics, 1999. (web-books.com) 2 BAKTERİLERİN DOĞAL GEN TRANSFER MEKANİZMALARI 1. Genetik Rekombinasyon 2. Transformasyon 3. Transdü Transdüksiyon 4. Epizomlar ve Konjugasyon 5. Transpozonlar: İç Gen Aktarı Aktarımı 27.11.2012 In Vivo Homolog Rekombinasyon In vivo homolog rekombinasyon özellikle büyük DNA moloküllerinin birleştrilmesinde kullanılmaktadır. Bu method ile DNA parçası taşıyan plazmit (otonom) ile DNA parçası taşımayan plazmit (nonotonom) arasında eş-bütünleşik bir yapı oluşturularak karşılıklı genetik bilgi alış verişi amaçlanmaktadır. Fig Ref. Robert M. Q. Shanks, Nicky C. Caiazza. Saccharomyces cerevisiae-Based Molecular Tool Kit for Manipulation of Genes from GramNegative Bacteria Ebru Doğangün, BYM613- 2012 sunumundan Company Logo 3 Transpozon Çeşitleri Handan Cebeci, BYM6132012 sunumundan Company Logo rDNA için temel basamaklar Doku yada hü hücreden DNA izole edilir; PCR ve/veya Restriksiyon Enzimleri kullanı sifik DNA kullanılarak spe spesifik parç parçaları aları elde edilir. Bu parç yıcı DNA (vektö parçalar, taşı taşıy (vektör) ile birleş birleştirilir (rDNA) rDNA molekü molekülü, çoğaltı altılmak üzere konak hü hücreye aktarı aktarılır. Klonlar izole edilir ve analizlenir. 4 Plasmid saflaştırılması Tek kloni LB + Antibiyotik 37°C’da inkübasyon Alkalin parçalama ve kaynatma Stratejileri (yaklaşımları) CsCl ile Saflaştırma Affinite Teknikleri Ticari kitler 9 Araz Norouz Dizaji, BYM613- 2012 sunumundan ° 94 C ° 37-65 C Temel 3 aşama 30-35 döngü (cycle) tekrarlanır: ° 70-75 C 1.Denatürasyon (90-95°C): Dubleks DNA‟nın (çift iplikçikli DNA) yüksek sıcaklıkta tek iplikçiklere ayrılması 2.Hibridizasyon (Annealing) (50-70 °C) : Primerlerin uygun sıcaklıkta hedef DNA‟ya bağlanması. 3.Amplifikasyon (Extension) (70-75 °C) : DNA polimeraz ile primerin 3’OH grubuna nükleotitlerin eklenerek DNA’nın uzatılması. 5 Primer tasarımı için kullanılan belli başlı yazılımlar : Primer3 PrimerZ PerlPrimer Vector NTI Advantage 10 DNASIS SmartNote Pride Primer BLAST Primer tasarımında parametreler: Boyutu Erime sıcaklığı Pürin:Pirimidin içeriği Primer-primer etkileşimi Dimer oluşumu 5’ ucu RE tanıma bölgesi 27.11.2012 ule Ünal, BYM613- 2012 sunumundan PCR Tipleri HEDEF UYGULAMA AVANTAJ DEZAVANTAJ Klasik DNA DNA dizisinin amplifikasyonu ve araş araştırılması lması • • • Amplifikasyon sonrası sonrası analiz gerektirir.Daha fazla zaman ,araç ,araç/gereç /gereç harcanı harcanır. • İnsan hatası hatası ve kroskontaminasyon riski taşı r. taşır. • Elde edilen ürünün prob hibridizasyonu veya dizileme ile doğ doğrulanması rulanması tercih edilir. Real Time DNA Hedef nü nükleik asit dizisinin kopya sayı sayısının tespiti ile quantifikasyon • Hızlı zlı • Bağı Bağıll veya kesin hedef dizi quantifikasyonu • Genellikle amplifikasyon sonrası sonrası analize gerek duyulmaz. • Prob ve melting curve (erime eğrisi) kullanı kullanıldığı ldığı için daha kesin sonuç sonuç. • Daha az kroskontaminasyon riski • Daha pahalı pahalı ekipman ve sarf malzeme gerektirir. • Primer ve prob seç seçimi sı sınırlı rlıdır. • Doğ Doğrulama analizlerine (dizileme gibi) izin vermez. Multiplex DNA İki veya daha fazla sayı sayıdaki farklı farklı DNA dizisinin aynı aynı anda amplifikasyonu • • • En kolay uygulanan PCR tipi. Düşük maliyetli ve az ekipman gereksinimi Çoklu hedef dizisinin tek bir reaksiyonda amplifikasyonu ile zaman ve araç araç/gereç /gereç tasarrufu. • Primer seç seçim olanakları olanakları sınırlı rlıdır Önemli ölçüde çüde optimizasyon gerektirir. Çoğunlukla hassasiyeti ve özgü zgünlü nlüğü düşüktü ktür. Nested DNA External ve internal primer takı takımları mları kullanı kullanılarak • Daha hassas • Nonspesifik amplifikasyonun azaltı azaltılması lması • İlk amplifikasyon sonrası sonrası ürünün taşı nmasıı nedeniyle yanlış taşınmas yanlış pozitif sonuç sonuç ihtimali var. (RT)(RT)-PCR ReversReversTranskripsion mRNA, rRNA, Viral RNA RNA ‘nın amplifikasyonu ve araş araştırılması lması • • • Tüm RNA çeşitlerinin amplifikasyonu Göksu Gür, BYM613- 2012 sunumundan RNA’ RNA’nın çabuk bozunması bozunması Ek RT aş aşaması aması daha fazla zaman ve para gerektirir ,kontaminasyon riski taşı r. taşır. 6 Yeterli miktar DNA elde edildikten sonra, Restriksiyon Enzimleri (RE) ile kesilir. Ref: Dr. M. Erayman ders notları. DNA Ligaz enzimi ile DNA parç parçaları aları birleş birleştirilir (kü kan uç (küt uç uçlu veya yapış yapışkan uçlu olabilir). Fig. Pearson Education Inc., 2009 7 Vektörler Plazmid klonlama vektö vektörleri Lambda ve M13 bakteriyofaj vektö vektörleri Kozmid vektö vektörler Mekik vektö vektörler BAC (Bacterial artifical chromosomes) YAC (Yeast artificial chromosomes) Agaroz, elektroforez tamponu ile %0.3-2.0 konsantrasyon aralığında, yüksek sıcaklıkta çözülerek hazırlanır. Hazırlanan agaroz çözeltisi 50-60 °C soğuduktan sonra boya çözeltisi (etidyum bromid) ilave edilir. Jel katılaştıktan sonra ayrımı yapılacak örnek taraklarla oluşturulmuş kuyucuklara yüklenir ve elektriksel alanda yürütülerek ayrımı yapılır. Örnekler UV ışığı altında görüntülenir. Burcu Güven, BYM613- 2012 sunumundan http://www.biotech.iastate.edu/ppt_presentations/html/Fingerprinting StudentInstruction-gel/05.html 8 Floresan boyalar sayesinde otomatik DNA sekanslama Spektrofotometre ile DNA miktarı belirleme •UV absorbansı kullanılarak DNA miktarı ve saflığı belirlenir. •DNA maksimum absorbansı 260 nm • Proteinler, bazı aminoasitler 280 nm •En iyi sonuçlar için A260 değerleri 0.1-1 arasında olmalı •DNA saflığı A260 / A280 = 1.8 – 2.0 • DNA konsantrasyonu: A = O.D. = ε.b.c • 260 nm’ lik dalga boyu ve1 cm ışık yolu için : 1 O.D. = 50 μg/ mL http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx DNA konsantrayonu = O.D. 260 x 50 μg/ mL x Seyreltme Faktörü İlkay Koçer, BYM613- 2012 sunumundan [4] http://www.nfstc.org/pdi/Subject03/pdi_s03_m05_03.htm [5] QIAGEN, Germany, Philippe Sauer, Markus Müller and Jie Kang, Quantitation of DNA 9 DNA SAKLAMA KOULLARI Farklı saklama sıcaklıkları: Oda sıcaklığı (GenPlateTM, Sample Matrix TM) - 196 ˚C (sıvı azot içinde) Bu iki koşulun ortak mekanizması : DNA camsı duruma geçer, kimyasal ve proteaz bozulmasını engeller. 4 ˚C -20 ˚C -80 ˚C Laboratuvar koşullarında, İyi kalite DNA için önerilen saklama koşulları : Haftaları kapsayan saklama : 4°C, Tris-EDTA Ayları kapsayan saklama : –80°C Tris-EDTA Uzun süreli saklama (yıllar) : –80°C, ethanol Çok uzun süreli saklama : -196 ˚C [3] http://www.ogt.co.uk/resources/literature/403_dna_storage_and_quality KİMYASAL TRANSFORMASYON İlkay Koçer, BYM613- 2012 sunumundan ELEKTROPORASYON sn Kaynak: Competent Cell Guide, Bioline, Third Edition Hande Günan Yücel, BYM613- 2012 sunumundan 10 RNA İZOLASYONU İşlem 4 aşamada gerçekleşmektedir; 1. Hücrelerin parçalanması: Hücre veya doku kültürü lize solüsyonu içersinde parçalanır. Bu işlem hızlı ve etkin bir biçimde soğuk ortamda gerçekleştirilmelidir. 2. Ribonüklezların inaktivasyonu: Bunun için genelde çok güçlü bir denatürant olan Guanidyum tiyosiyanat kullanılır. 3. RNA ekstrasyonu: Bu işlem RNA’ya düşük pH’da ekstraksiyon çözeltisi (fenol:kloroform çözeltisi) eklenip santrifüjlenmesiyle gerçekleşir. Santrifüj sonrası üst sıvı faz RNA içerir. DNA ve proteinler ise organik fazda ve ara fazda kalır. 4. RNA’nın çöktürülmesi: RNA etanol:LiCl çözeltisi kullanılarak çöktürülür ve santrifüj edilerek ayrılır. [2]http://www.istanbul.edu.tr/fen/notlar/1260103777.doc Merve Özkutlu, BYM613- 2012 sunumundan Teknik 1975 yılında İngiliz biyolog Sir Edwin Southern tarafından bulunmuştur. Hedeflenen bir genin ya da aranılan DNA dizisinin, DNA molekülündeki varlığının belirlenmesini sağlar. Moleküler biyoloji ve rekombinant DNA teknolojisi için önemli bir adımdır. Gökçe Dilli, BYM613- 2012 sunumundan Brown, T.A., Southern Blotting and Related DNA Detection Techniques, 2001 22 11 Nükleik Asit Blotlaması Birbirinin tamamlayıcısı olan nükleik asit molekülleri arasındaki hibridizasyona dayanır. Northern Blot: •James Alwine, David Kemp, George Stark 1977 •RNA’nın filtreye bağlandığı blotlama tekniği Western Blot: proteinler Eastern Blot: post-translasyonal modifikasyonlar Southern Blot: DNA Bakiye Göker, BYM613- 2012 sunumundan Ref: Klug, S.W., Cummings M. R., Spencer C. A., 2006, Consepts of Genetics, Pearson Education Publishing http://www.transcriptome.ens.fr/sgdb/presentation/principle.php Nurşen Ziğal, BYM613- 2012 sunumundan 12 FACS ile Hücre Ayrımı • Floresan işaretli hücrelerin ayrılmasında elektrostatik yükten yararlanılır. Kullanım Alanları • • • • • • • • İmmün fenotipleme DNA analizi Hücre proliferasyonu Hücre ölümü RNA ve protein içerik analizi İlaç alım ölçümü Mikroorganizma tayini Virüs ve viral ürün tayinleri Gökçe Kaynak, BYM613- 2012 sunumundan Güner U., 2012, J FisheriesSciences.com, 6(1): 9-17 . 26 Mikroorganizmaların Moleküler Tanımlanma Yöntemleri Metod Tanımlama kapasitesi Ayırma Gücü Tekrarlanabilirlik Uygulama Kolaylığı Yorumlama Kolaylığı Plazmid analizi PFGE İyi İyi İyi Yüksek İyi Yüksek Yüksek Yüksek Orta İyi PCRRFLP RAPD İyi Orta İyi Yüksek Yüksek Yüksek Yüksek Zayıf Yüksek Yüksek AFLP Yüksek Yüksek İyi Orta Yüksek Sekans analizi Yüksek Yüksek Yüksek Orta Yüksek Buckingham, L., Flaws, M., 2007, Molecular Diagnostics Applications, Medicus Media, 462 s. Fundementals, Methods and Molecular Gamze Nur Kara, BYM613- 2012 sunumundan 13 DNA metilasyonu Gen ifadesinin Kromozomal bütünlüğün Rekombinasyonel olayların kontrolü rollerine sahip bir modifikasyondur. DNA’ ya bağlanabilen proteinlerin bağlanmasını engelleyerek transkripsiyonu önlemesi Zeynep Acar, BYM613- 2012 sunumundan Cindy D. Davis and Eric O. Uthus, DNA Methylation, Cancer Susceptibility, and Nutrient Interactions, Experimental Biology and Medicine 2004, 229:988-995. 14