kloroplast transformasyonu

KLOROPLAST TRANSFORMASYONU
ÖZGE ÇELİK
HALİÇ ÜNİVERSİTESİ
MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİK BÖLÜMÜ
PLASTİDLER
Çift zarlı ve kendi genomlarını (plastom) taşıyan hücre
organelleridir. Hücre DNA’sının %10-20’si kloroplastlarda
bulunur.
Karbohidratlar, pigmentler, amino asit ve yağ asitleri gibi
önemli bileşiklerin sentezinde görevlidirler.
1
PLASTOM
• Sirküler
• Çift iplikli DNA molekülü
• 120-160 kb boyutunda
•Yaklaşık 130 gen
•Yüksek oranda korunmuştur.
• Büyük ve küçük kopya bölgeleri (LSC ve SSC)
• 2 adet tekrar dizisi (IRA ve IRB) içerir
Bitki mezofil hücresi, 10.000-50.000 adet plastid DNA kopyası
taşır (Bendich, 1987).
Yüksek organizasyonlu bitkilerde plastidler
mühendislik uygulamaları için önemli hedeflerdir.
genetik
2
Plastomun transformasyonu, nuklear transformasyona göre bazı
avantajlara sahiptir.
1) Transgenlerin polenlerle çevreye yayılımı önlenmiştir (Maliga,
1993; Daniell et al., 1998).
2) Plastid kromozomlarının çok sayıda kopyası bulunur; yüksek
oranda protein sentezi ve birikimi mümkündür (Mc Bride at al.,
1995; Staub et al., 2000).
3) Gen transferi homolog rekombinasyon ile olmaktadır. Pozisyon
etkisi veya çoklu integrasyon olaylarından kaçınılır (Fejes et al.,
1990; Suab et al., 1990; Eibl et al., 1999).
Plastom Transformasyonunun Avantajları
4) Plastom, prokaryotik gen organizasyonu gösterir; böylece
birçok gen 1 operonda transkribe olabilir ( Staub and Maliga,
1995).
5) Gen sessizleşmesi olmaz ve gen ekspresyonu stabildir
(Sidorov et al., 1999).
3
Seçici markır ve homolog yan bölgeleri içeren vektör oluşturulması
Partikül bombardımanı ile veya PEG muamelesiyle hücreye
aktarılması
Transforme DNA’nın plastom içine homolog rekombinasyon ile girişi
Yabani tip genomlaın eliminasyonu
Plastid Transformasyonunda Kulanılan Metodlar
BİOLİSTİK
PEG METODU
4
MARKIR GENLER
• Spektinomisin Direnci (Suab et al., 1990)
• Kanamisin Direnci ( Carrer et al., 1993)
• Ispanaktaki betain aldehit dehidrogenaz geni (BADH) (Daniell
et al., 2000).
aadA geni spektinomisin ve streptomisine direnç gösterir.
Tütün için iyi bir plastom seçilim markırıdır ancak arpa ve A.
thaliana için uygun değildir (Kofer et al., 1998).
En iyi seçilim, seçici ortam kültür koşulları ile birlikte
kullanılmalıdır. Diğer seçici markırlardan nptII dışında
BADH’da kullanılabilir.
5
REPORTER GENLER
• Kloramfenikol asetil transferaz (CAT) (Daniell et al., 1990)
• β- glukoronidaz (uid A, GUS) (Ye et al., 1990)
• Green –floresan protein (GFP) (Sidorov et al., 1999)
kullanılmaktadır.
BİOLİSTİK METODU
1 ml buz soğukluğunda %100 etanol 50 mg tungsten tozuna eklenir
(partikül boyutu 1.1 µm)
Max hızda 2 dakika vortekslenir (x3)
8000 rpm’de 2 sn santrifüjlenir
Etanol uzaklaştırılır ve partiküller 1 ml buz
soğukluğunda steril dH2O ile yıkanır (x3)
Partiküller 1 ml suda süspanse edilir
50 µl tungsten partikül süspansiyonu+15 µg plazmid
DNA+50 µl 2.5 M CaCl2+20 µl 0.1M spermidin
Partiküller 1 ml suda süspanse edilir
30 dakika 4oC’de vortekslenir
6
200 µl %100 etanol eklenir ve 2 sn 8000 rpm’de santrifüj
edilir.
Etanol uzaklaştırılır
Partiküller 200 µl buz soğukluğunda %100 etanolle yıkanır
(x3)
Partiküller 200 µl buz soğukluğunda %100 etanolle yıkanır
Partiküller 8000 rpm’de 2 sn santrifüjlenir
Partiküller200 µl taze etanolle süspanse edilir.
Partiküller 30 µl % 100 etanolle süspanse edilir
ve kullanıma kadar buzda bekletilir.
Nicotiana tabacum cv. Petit Havana için biolistik metodu
kullanılarak kloroplast transformasyonu yapılmıştır.
Uygulanan Koşullar:
Tank regülatöründeki helium basıncı: 1300-1400 psi
Hareketli disk: Üstten 2. Seviye
Petri taşıyıcı disk: Alttan 2. Seviye
Vuruş anındaki vakum: 24-28 in.Hg
7
(Bock, 1998)
İşlem sonrasında yapraklar 1-2 gün 25oC’de normal besiyerde
bekletilir.
Daha sonra küçük parçalara ayrılan yapraklar seçici ortama
ekilirler (500 µg/ml spektinomisin).
Dirençli kallus ve sürgünler 4-6 hafta sonra görülür.
8
Ancak tüm rejenere
olmayabilirler.
olanlar
kloroplast
transformantı
16S rRNA geninde spesifik nokta mutasyonu oluşumuyla
spektinomisine dirençli hale gelebilirler.
Mutasyon sonucu aadA geni birçok aminoglikozid antibiyotiğe
direnç gösterir. Böylece spontan spektinomisin dirençli bitkiler
streptomisine karşı hassastırlar. Bu nedenle gerçek kloroplast
transformantları her iki ilacın bulunduğu ortamlarda
seçilmelidirler.
9
Yapılmış Olan Çalışmalara Örnekler
Daucus carota L. tuza hassa bir bitkidir.
Tuz
stresine
metabolik
adaptasyonlardan
osmoprotektanların birikimidir.
biri
de
Glisin betain, çevre ile osmotik dengenin sağlanması ve
komplex proteinlerin kuaterner yapılarını stabilize ederek
hücreleri tuz stresinden korur.
Transgenik havuçta BADH enzim aktivitesi 100 mM NaCl
varlığında 8 kat artmıştır (Daniell et al., 2005)
(Daniell et al., 2005)
10
Pamuk, ticari öneme sahip bir bitkidir.
Bt toksinine dayanıklı nüklear transforme bitkiler tamamen
korumalı değildirler.
Kumar ve ark.(2005), pamuk plastid genomuna transformasyonu
başarmışlardır.
(Daniell et al., 2005)
11
Soya (Glycine max. L.Merrill), önemli bir protein kaynağıdır.
Yapılan ilk uygulama Zhang ve ark.’ları tarafından (2001)
fotosentetik potansiyeli arttırmak için yapılmıştır.
(Daniell et al., 2005)
12
Polietilen Glikol ile Plastid Transformasyonu
Çıplak DNA,
divalent katyonlar (genellikle kalsiyum)
varlığında PEG uygulamasıyla hücreye direkt olarak
aktarılabilir.
PEG ve divalent katyonlar, bitki protoplastının hücre zarını
destabilize ederler. Böylece yabancı DNA plastoma integre
olur.
Etkili bir PEG Metodu için;
• Protoplast kültürü kurulmalı
• Türler, protoplastlardan rejenere olmalı
• Hedef doku ve organlar yüksek etkinlikte rejenere olabilmeli
• Kullanılan vektör yaklaşık 1 kb boyutunda olmalı
• Seçici marker ve düzenleyici elementler olmalı (Saub and
Maliga, 1995).
13
PEG METODU
200 ml protoplast kültürüne 2% Driselase uygulanır
Protoplast süspansiyonu 1.2×106 protoplasts ml–1 olacak şekilde 3M medium [15 mM
MgCl2, 0.48 M mannitol, 0.1% 2-(N-morpholino)ethanesulfonic asit tamponu,
pH 5.6]’da sulandırılır.
Transformasyon için 250 µl protoplast solüsyonu 350 µl PEG solution (40%
PEG 4000 in 3M medium, pH 6.0) ve 20 µg veya 50 µg DNA içeren 100 µl 0.1 M
Ca(NO3)2 ile karıştırılır.
30 dakika inkübe edilir..
Transformasyon solüsyonu 3M medium ile her 5 dakikada bir 1, 2, 3 and 4 ml ilave
edilir.
Süspansiyon 10 dak 45 g’de santrifüj edilir ve pelet 3 ml rejenerasyon besiyerinde
süspanse edilir.
Süspansiyon 25 °C for 1 gün karanlıkta, takiben 10 gün aydınlıkta (70 µmol s–1 m–2,
ışık/karanlık dozu16/8 h’da inkübe edilirler
Süspansiyon selofan ile kaplanıuş agarlı petrilere yerleştirilir
3 gün sonra, selofanlı kültür 25 µg G418 ml–1 içeren besiyerine 2
haftalığına geçirilir.
2 haftalığına G418 içermeyen besiyerine geçirilirler.
Seçilimin 2. aşamasında yaşayanlar stabil transformant bitkilerdir
(Hohe et al., 2003)
14
VEKTÖRLER
Başta kullanılan transformasyon vektörleri spektinomisin ve
streptomisin direnci sağlayan nokta mutasyonlu plastid 16S rRNA
(rrn16) geni taşıyan vektörlerdir.
Resesif rrn16 markır genleri şimdi kullanılan aadA genine göre 100
kat daha az etkilidir.
aadA geni, adenilasyon ile spektinomisin ve streptomisini inaktive
eden aminoglikozid-3’-adeniltransferaz enzimini şifreler.
Plastid vektörleri, LTR ve RTR olarak gösterilen sağ ve sol
plastid hedefleme bölgelerine homolog hedeflenirler.
Seçilen bölgeye homologdurlar ve 1-2 kb boyutundadırlar.
50 kb DNA (20-30 genlik) girişi için uygundur.
Plastid tekrar vektör (pPRV) serileri, trnV-rps12 bölgesine girişi
hedeflerler.
15
pRB94 ve pRB95 vektörleri, trnfM-trnG bölgelerine hedeflenirler.
Plastid genomundaki tekbölgesidir.
trnV-rps12 bölgeye sokulan genin 2 kopyası bulnur çünkü, giriş
bölgesi tütün plastid genomunda inverted tekrar bölgesindedir.
Plastid transgenleri, 5’-PL (promotör ve lider) ve 3’-T kaset (Tterminatör)de eksprese olurlar.
PL kasedi, promotör ve translasyon kontrol dizisi içerir.
Translasyon kontrol dizisi, mRNA 5’-transle olmayan bölge (UTR)
veya 5’-translasyon kontrol bölgesi (TCR) olabilir.
mRNA 5’-UTR, mRNA stabilitesi için gereklidir ve dizisi
mRNA’nın ribozomlara yerleşmesini kolaylaştırır.
16
T-kasedi, mRNA 3’-UTR’yi şifreler. T-3’-UTR, translasyonun
etkisiz terminatörü olarak görev yapar ve mRNA stabilitesi için
gereklidir.
PL ve T kasetleri ve kodlama bölgelerinde aynı RE kesim
bölgelerinin olması gen düzenlenmesini kolaylaştırır.
Fazla miktarda protein birikimi için dikkat edilmesi
gerekenler:
1) İyi promotör seçimi
2) mRNA, 3’-UTR ile stabilize olmalıdır (Maliga, 2003).
17
Soyada Kullanılmış Olan
pTRA140 ve pB5HYG vektörleri;
GUS reporter geni
Higromisin direnç geni
CaMV 35S promotörü taşırlar (Reedy et al., 2003).
Primer transplastomik hücre hatları, yabani tip ve transforme
bitki genomlarının karışık bir populasyonunu içermektedir.
Böyle hücre, doku veya bitkiler heteroplazmik olarak
adlandırılırlar.
Heteroplazmik durumlar genetik olarak stabil değildir ve 2 tip
genom homojenitesine spontan olarak ayrışır.
Bu hücre dışı genetik materyalin sınıflanması, random hücre
bölünmesine bağlı olarak random organel bölünmesine
dayanır.
18
Transplastomik hücre hatları ve bitki homoplazmiye ihtiyaç
duymaktadır.
Yüksek konsantrasyonda seçici antibiyotik varlığında yeterli
sayıda hücre bölünmesi olduğunda homoplazmi sağlanır.
PCR bazlı testler ile homoplazmi konfirme edilir.
Heteroplazminin 2 tipi ayırt edilir.
1) İnterplastidik heteroplazmi: Yabani tip genom ve mutant
genomları aynı hücrede bulunur.
2) İntraplastidik heteroplazmi: Yabani tip ve mutant plastid
genomu aynı kloroplastta bulunur.
19
Interplastidik heteroplazmi, hızlı bir şekilde kaybolur çünkü,
yabani tip genomlar seçici antibiyotiğe hassastırlar ve bu
nedenle transforme kloroplastlar kadar etkili çoğalamazlar.
Zıt olarak, intraplastidik heteroplazmiyi elimine etmesi çok
zordur çünkü girdiği organelde direnç geninin bir veya birkaç
kopyası direnç sağladığı için, antibiyotik direnç geni dominant
seçici markır gibi davranır
20
Plastid Ekspresyon Teknolojisinin Evrimi
(Maliga, 2003)
1988
Chlamydomonas reinhardtii, 1. stabil plastid transformasyonu, DNA aktarımı: biolistik
Yaklaşım: Homolog hedefleme, Seleksiyon: Fotosentetik yetenek
1990
Nicotiana tobacum (tütün), 1. stabil plastid transformasyonu, DNA aktarımı: biolistik
Yaklaşım: Homolog hedefleme, Seleksiyon: Spektinomisin-streptomisin rezistansı (rrn16)
1991
Chlamydomonas reinhardtii
Seleksiyon: Spektinomisin-streptomisin rezistansı (rrn16)
1993
Nicotiana tobacum (tütün), DNA aktarımı: PEG
Seleksiyon: Spektinomisin-streptomisin rezistansı (aadA)
Seleksiyon:Kanamisin rezistansı (neo)
Protein ekspresyonu:1. en fazla yabancı protein seviyesi; %2.5 GUS (bakteriyel)
1994
Nicotiana tobacum (tütün), Protein ekspresyonu:Nüklear kontrollü plastid gen ekspresyonu
1995
Nicotiana tobacum (tütün), Seleksiyon: düzenleme temelli markır geni
Protein ekspresyonu:Polisistronik ekspresyon ünitesi
Yeni agronomik özellik: Bacillus thuringiensis insektisidiyal protein
Markır gen eliminasyonu:Ko-transformasyon
1996
Chlamydomonas reinhardtii,
Markır gen eliminasyonu:Homolog rekombinasyon ile ilmek açmak ve ko-transformasyon
1998
Arabidopsis thaliana, 1. stabil plastid transformasyonu
1999
Solanum tuberosum (patates), 1.stabil plastid transformasyonu
Oryza sativa (pirinç), 1.stabil plastid transformasyonu
2000
Nicotiana tobacum (tütün), Protein ekspresyonu:İlk insan proteini
Markır gen eliminasyonu: Homolog rekombinasyon ile ilmek açma
2001
Lycopersicon esculentum (domates), Protein ekspresyonu:Meyvada eksprese olan ilk yabancı protein
Nicotiana tobacum (tütün), Protein ekspresyonu:Heterolog RUBISCO ile fotoototrofik bitki
Protein ekspresyonu:Süper ekspresyon kasetleri (>%10), Markır gen eliminasyonu: CRE-lox sistemi
Yeni agronomik özellik: Glifosat (herbisit) toleransı, Yeni agronomik özellik: PPT(herbisit) toleransı
Kloroplast genom mühendisliği ile yapılan ilk agronomik özellikler
(Daniell et al., 2005)
Özellik
Transgen
Promotör
5’/3’ UTRs
Homolog
rekombinasyon
bölgesi
Böcek direnci
Cry1A
Prrn
rbcL/Trps16
trnV/rbs12/7
Herbisit direnci
AroA
Prrn
ggagg/TpsbA
rbcL/accD
Böcek direnci
Cry2Aa2
Prrn
ggagg(doğal)/TpsbA
rbcL/accD
Herbisit direnci
bar
Prrn
rbcl/psbA
rbcL/accD
Böcek direnci
Cry2Aa2
operon
Prrn
Doğal 5’
UTRs/TpsbA
trnI/trnA
Hastalık direnci
MSI-99
Prrn
ggagg/TpsbA
trnI/trnA
Kuraklık toleransı
tps
Prrn
ggagg/TpsbA
trnI/trnA
Fitoremediyasyon
MerA/merB
Prrn
ggagg/TpsbA
trnI/trnA
Tuz toleransı
badh
Prrn-F
ggagg/rps16
trnI/trnA
Sitoplazmik erkek
kısırlığı
phaA
Prrn
PpsbA/psbA
trnI/trnA
21
Plastidlere DNA Aktarımında Kullanılan Bitki Türleri
(Heifets, 2000)
Tür
Arabidopsis
Havuç
Aktarım metodu
Sonuç
Biolistik
Bütünleşmiş homoplazmik
Biolistik
Geçici
Nicotiana plumbaginifolia
Protoplast
Geçici; Bütünleşmiş homoplazmik
Tobacco (NT1 süspansiyon
hücreleri)
Biolistik
Geçici
Kadife çiçeği
Biolistik
Geçici
Patates
Biolistik
Geçici; Bütünleşmiş homoplazmik
Kırmızı biber
Biolistik
Geçici
Pirinç
Biolistik
Bütünleşmiş homoplazmik
Biolistik, protoplast
Bütünleşmiş homoplazmik
Tobacco (Petit Havana, Xanthi)
Tütün Plastidlerinde Stabil Olarak Eksprese Olan Genler
(Heifetz, 2000)
Gen/Protein
Kaynak
aadA
E.coli
aadA:GFP
Kimerik
Aprotinin
Sığır
AroE
Bacillus subtilis
Bsn
Klebsiella pneumoniae
CoxII
Petunia (mitokondri.)
Crtl
Erwinia carotova
Cry1Ac
Bacillus thuringiensis
Cry2Aa2
Bacillus thuringiensis
E5 Selülaz
Thermomonospora fusca
EPSPS
Petunia
GFP
Aequorwa victoria
GUS
E.coli
nptII
Tn5
Poly(GVGVP)
Elastin (sentetik)
PPO
Bitki (nukleus)
RubiscoLSU
Ayçiçeği
Rubisco LSU
Syncechococcus PCC6301
Somatotropin
İnsan
22
Kloroplast genomunda biyofarmasötik proteinleri ve aşı antijenleri
ekspresyonu (Daniell et al., 2005)
Protein
Transgen
Promotör
5’/3’ UTRs
Homolog
rekombinasyon bölgesi
Elastin türevli polimer
EG121
Prrn
T7 gen10/TpsbA
trnI/trnA
İnsan somatotropin
hST
Prrn, PpsbA
T7 gen10,
TpsbA/Trps16
trnV/rbs12/7
Kolera toksini
CtxB
Prrn
ggagg/TpsbA
trnI/trnA
Antimikrobiyal peptid
MSI-99
Prrn
ggagg/TpsbA
trnI/trnA
Interferon α2b
INFa2B
Prrn
Ppsba/TpsbA
trnI/trnA
Monoklonal antikorlar
Guy’s 13;
HSBV-lsc
Prrn
atpA/rbcL
ggagg/TpsbA
atpA/rbcL
trnI/trnA
psbA/5S/23S
Antraks koruyucu
antijen
Pag
Prrn
Ppsba/TpsbA
trnI/trnA
Tetanoz toksini
Tet C
Prrn
T7 gen10,
AtpB/TrbcL
Trnv/rpsa 12/7
Kaynaklar:
Bock, R. Transgenic Plastids in Basic Research and Plant Biotechnlogy. J. Mol.Bio. (2001), 312, 425-438.
Heifetz, P.B. Genetic engineering of the chloroplast. Biochimie (2000), 82, 655-666.
Daniell, H., Kumar, S., Dufourmantel, N. Breakthrough in chloroplast genetic engineering of agronomically important crops. Trends in Biotechnology
(2005). 23, 238-245.
Maliga, P. Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends in Biotechnology (2003), 21, 20-28.
Bendich, AJ.Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome? Bioassays (1987), 6: 279-282.
Carrer, H., Hockenberry, TN., Svab, Z., Maliga, P.Kanamycin resistance as a selective plastid marker. Mol.Gen. Genet. (1993), 241: 49-56.
Daniell, H., Vivekaranda, J., Nelson, BL., Ye, GN., Temari, KK., Sanford, JC. Transient foreign gene expression in chloroplasts of cultured tobacco
cells after biolistic deliver of chloroplast vectors.Proc. Natl.Acad. Sci.(1990), 87:88-92.
Daniell, H., Datta, R., Varma, S., Groy, S., Lee, SB., Containment of herbicide resistance through genetic engineering of the chloroplast genome.
Nature Biotechnol. (1998), 16: 345-348.
Daniell,H., Mathukumar, B., Lee, SB. Marker free transgenic plants: engineering the chloroplast genome without the use of abiotic selection. Curr.
Genet.(2000), 39:109-116.
Eibl, C. In vivo analysis of plastid psbA, rbcL and rpI32 UTR elements by chloroplast transformation:tobacco plastid gene expression is controlled by
modulation of transcript levels and translation efficiency. Plant J.(1999), 19(3): 333-345.
Fejes, E., Engler, D., Maliga, P.Extensive homologous chloroplast DNA recombination in the pt 14 Nicotiana somatic hybrid. Theor. Appl. Genet.
79:28-32.,
Kofer, W., Eibl, C., Steinmüller, K., Koop, Hu. PEG mediated plastid transformation in higher plants. In vitroCell Dev.Biol.(1998), 34: 303-309.
Mc Bride, KE., Suah, Z., Shaaf, DJ., Hogon, PS., Stalker, DM., Maliga, P.Amplification of a chimeric Bacillus gene in chloroplasts leads to an
extraordinary level of an insecticidal protein in tobacco. Biotechnology (1995), 13: 362-365.
Sidorov, VA., Karsten, D., Pang, SZ., Staub, JM., Nehra, NS. Stable chloroplast transformaion in potato: use of a green fluorescent protein as a
plastid marker. Plant J.(1999), 19(2), 209-216.
Staub, JM., Maliga, P. Expression of a chimeric uidA gene indicates that polycistronic mRNAs are efficiently translated in tobacco plastids. Plant
J.(1995), 7:845-848.
Svab, Z. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl.Acad. Sci.(1990), 87: 8526-8530.
Staub, JM., garcio, B., Graves, J.., Huntor, P., Nehra, N., Carroll, JA. High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco
chloroplasts.Nature Biotechnology (2000), 18: 333-338.
Ye, GN., Daniell, H., Sanford, JC. Optimization of delivery of foreign DNA into higher plant chloroplasts. Plant Mol. Biol. (1990), 15: 809-819.
23