SEKANS TEKNİKLERİ GENOMİK-PROTEOMİK Ders Sorumlusu

SEKANS TEKNİKLERİ
GENOMİK-PROTEOMİK
Ders Sorumlusu: Doç.Dr. Hatice MERGEN
Hazırlayan: Levent ZORBEK
Ankara,2006
DNA Dizi Analizi için geliştirilen birbirinden farklı iki
yöntem bulunmaktadır. Bu iki yöntem;
1- Maxam ve Gilbert’in kimyasal kırılma yöntemi (Maxam et
al.,1977).
2- Sanger-Coulson’un zincir sonlanma yöntemi. (Sanger et
al.,1977).
a-) Manuel (Radyoaktif İşaretleme) Dizi Analizi
b-) Otomatik (Fluoresan İşaretleme) Dizi Analizi
Sanger-Coulson Zincir Sonlanma Yöntemi
DNA dizi analizinde en sık kullanılan yöntem Fred SANGER
ve arkadaşlarının geliştirdiği yöntem olan zincir sonlanma
yöntemidir (Sanger et al., 1977). Bu yöntem enzimatik DNA
sentezine dayanır ve günümüzün en yaygın kullanılan DNA
dizi analizi tekniğidir. Bu yöntemde dizisi saptanacak olan
DNA ipliği yeni sentezlenecek iplik için kalıp olarak
kullanılır. DNA sentezini sağlamak için Klenov, Taq DNA
polimeraz, ters transkriptaz ya da sekuenaz enzimlerinden
birisi kullanılabilir.
Yöntemin temeli DNA polimerazın dNTP’ lerin
(deoksiribonükleozit trifosfat) yanısıra deoksiribozun
3’ pozisyonunda OH grubu taşımayan ddNTP’ leri de
(dideoksiribonükleozit trifosfat) substrat olarak
kullanabilmesine dayanır. Sentezlenen DNA’ ya bir
ddNTP’ nin katılması 3’ pozisyonunda OH grubu
olmadığı için sentezi durdurur.
dATP
ddATP
Dizi analizi yapılırken dört ayrı reaksiyon karışımı
hazırlanır. Her bir karışım kalıp DNA zinciri, bir primer,
dNTP’ lerin dördü ve az miktarda ddNTP’ lerden birini
içerir. Özgül zincir sonlanması için her bir reaksiyonda
farklı bir ddNTP bulunur. Reaksiyonların her birinde çok az
miktarda modifiye nükleotit kullanıldığı için yeni zincir
sentezi rastgele sonlanarak bir dizi DNA fragmenti
meydana gelir (Klug et al., 2000).
Reaksiyonlar sonucu elde edilen DNA parçalarına
elektroforez uygulanarak jel üzerinde yan yana yürütülür.
Uygulanan elektriksel alanın etkisi ile DNA parçacıkları en
kısası en önde olmak üzere jel üzerinde bir merdiven
görüntüsü oluşturur. İşaretleme yöntemine göre jel üzerinde,
tespit edilen parçacıklar reaksiyon karışımına konulan
ddNTP’ nin tipine göre okunur (Klug et al., 2000).
Sanger-Coulson Zincir Sonlanma Yönteminde Kullanılan Kimyasallar
Primerler
Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde istenilen DNA
kalıbının çoğaltılması ve dizi analizinin yapılabilmesi için özgül
oligonükleotitlere yani primerlere ihtiyaç vardır. Primer çiftleri
kullanılacak kalıp DNA’nın genomik DNA’dan eldesinde,
çoğaltılmasında kullanılır. Ayrıca primerler yöntemin son
aşaması olan sonlanma reaksiyonunda polimeraz enzimi için
uygun 3’ ucu sağlar. Her iki reaksiyondaki primer çifti aynı
olabileceği gibi farklı primerler de kullanılabilir.
Gen bölgesinin elde edilmesinde kullanılan primer çifti dizi
analizi yapılacak bölgenin daha dışından seçilip dizi analizi
reaksiyonunda kullanılan primer ise bu primerlerin arasında
ve dizinin analizi yapılacak bölgesine daha yakın olmalıdır.
Sekanslama reaksiyonunda tek bir primer kullanılır ve
böylece reaksiyon yönü tayin edilmiş olur (Sambrook et al.,
1989).
Kalıp DNA
Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde hem çift, hem
de tek zincirli DNA kullanılabilir. Yöntemin birinci
aşamasında polimeraz zincir reaksiyonu (Polymerase Chain
Reaction, PCR) tekniği ile elde edilen ve çoğaltılan DNA
parçası kalıp DNA olarak adlandırılır. PCR ürünü kalıp DNA,
önce reaksiyon artıklarından arındırılmalıdır. Bu çok özen
gösterilmesi gereken bir aşamadır. Eğer kalıp DNA yeterince
temizlenemezse bir sonraki sonlanma reaksiyonuna
aktarılacak olan kimyasallar ile primer artıkları reaksiyonun
hassasiyetini bozacaktır (Sambrook et al., 1989).
Enzimler
Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde bir çok tipde
DNA polimeraz enzimi kullanılabilmektedir. Bu enzimlerin
ortak özellikleri özgül ve hassas olmalarıdır.
E.coli Klenow Fragmenti DNA Polimeraz I
İlk geliştirilen yöntemde kullanılan bu enzimin iki büyük
dezavantajı vardır. Birincisi enzimin kontrolsüz olarak
çoğaltma reaksiyonlarını yarıda kesmesidir. Özellikle uzun
okumalarda bu problem iyice belirginleşmektedir. İkincisi
enzimin homopolimerik bölgeler ile ikincil yapısı kuvvetli olan
bölgelerde istenilen verimde çalışmamasıdır (Sambrook et al.,
1989).
Reverse Transcriptase
Reverse transcriptase enziminin her ne kadar çok yaygın
bir kullanım alanı olmasa da özellikle homopolimerik
bölgelerde etkin çözüm verir. Enzim özellikle bu tip
bölgelerde Klenow fragmentinden daha etkin ve kullanışlıdır
(Sambrook et al., 1989).
Sequenase Enzimleri
Sequenase enzimleri T7 bakteriofajın’dan elde edilirler.
Enzimin 3’-5’ ekzonükleaz aktivitesi inhibe edilmiştir. İnhibe
edilen bu özelliği sayesinde enzim tek yönlü ve hızlı çalışır.
Kalıp DNA’ nın uzun olduğu deneylerde yüksek özgül
aktivitesi ve dayanıklılığı ile tercih edilir (Sambrook et al.,
1989).
Taq DNA Polimeraz
Özellikle tek zincirli DNA dizisinin saptanmasında tercih
edilir. Sıcağa dayanıklı olduğu için yaygın kullanılan enzim
türüdür. Özellikle 95 0C’ da aktif olması nedeni ile
homopolimerik bölgelerde bile çok etkindir (Sambrook et
al., 1989).
Manuel DNA Dizi Analizi
Sekans reaksiyonu kullanılarak zincir sonlandırma metodu
uygulanır (Sanger et al., 1977). Örnekler %6’lık denatüre
edici poliakrilamid jelde ayrıştırılarak, otoradyografi ile
görüntülenir. Çalışılan gen amplifiye edildikten sonra
enzimatik ön muamele yapılır. Bu amaçla hidrolitik enzimler
(alkalin fosfataz ve ekzonükleaz I ) kullanılır. Ekzonükleaz I
ortamdaki tek zincirli DNA iplikciklerini, alkalin fosfataz ise
dNTP’leri uzaklaştırarak, dizi reaksiyonu için kullanılacak
amplifikasyon ürününün temizlenmesini sağlar. İşlem
tamamlandıktan sonra enzimleri inaktive etmek için, örnek
karışımı 80 0C’da 15' bekletilir.
Primer tutunma reaksiyonu
Temizlenmiş amplifikasyon ürünü üzerine primer ilave
edilir. Karışım 100 0C’ da inkübe edildikten sonra, önce
buzlu su içinde, sonra buzda bekletilir. Örneğin bu şekilde
kademeli olarak soğutulması, kalıp katlanmasını ve
primerlerin kendi aralarında eşleşmesini önler.
İşaretleme reaksiyonu
İşaretleme reaksiyonu için dört farklı tüp hazırlanır. Her bir
tüp dört çeşit dNTP’nin yanısıra bir ddNTP içerir. Bu
aşamada kullanılan DNA polimeraz T7 bakteriofaj DNA
polimerazının modifiye formudur. Bu enzim 3‘5'
ekzonükleaz aktivitesi içermez. Enzimin polimerizasyon
hızı çok yüksek olup, DNA zincirine ddNTP takabilme
özelliğine de sahiptir. Reaksiyon karışımı 5' oda
sıcaklığında bekletilir. İşaretleme aşamasında kullanılan
işaretleme çözeltisi üç farklı dNTP içerir. Dördüncü tip
dNTP, karışıma ilave edilen radyoaktif işaretli dNTP’dir.
Sonlandırma reaksiyonu
Zincir sonlanması 3'OH grubu bulunmayan nükleotit
analoglarının (ddNTP) zincire takılması ile sağlanır. Dört
farklı sonlandırma çözeltisinin her biri 80µl eşit dNTP (A; C;
G; T) ve 8µl tek bir bazın ddNTP’ sini içerir. Sonlandırma için
hazırlanan tüplerin her birine sonlandırma çözeltisi reaksiyon
karışımından ilave edilir. Tüplere formamid içeren durdurma
çözeltisi eklenerek reaksiyon durdurulur. Bu örnekler jele
yüklemeden önce denatüre edilir.
Reaksiyon Ürünlerinin Elektroforezi
Örneklerin görüntülenmesi için ürünler denatüre edici
poliakrilamid jel elektroforezine tabi tutulurlar. Jel
hazırlandıktan ve polimerizasyon işlemi tamamlandıktan
sonra ortamda kalan üre temizlenir. Elektroforez tamponu
olarak 1X TBE kullanılır. Sisteme 70 watt, 1800 volt ve 50mA
elektrik akımı verilerek 15-30’ ön elektroforez uygulanır. Bu
uygulama tamlandıktan sonra yapılan DNA Dizi Analizi
reaksiyonları jele yüklenerek 2.5-3 saat yürütme yapılır.
Reaksiyon Ürünlerinin Otoradyografisi
Elektroforez bitiminde jel, asetik asit – metanol karışımında
bekletilir, Whatmann 1MM kromatografi kağıdı üzerine
alınarak jel kurutucuda kurutulur. Kuruma sonrası X-ışınına
duyarlı filmle kaplanır. 1-2 gün boyu oda sıcaklığında
karanlık odada tutularak otoradyografisi alınır.
Otomatik DNA Dizi Analizi
Otomatik dizi analizi için çoğaltılan PCR ürünleri çeşitli
yöntemler kullanılarak temizlenir. En sık kullanılan
temizleme yöntemi ticari kitlerin kullanıldığı silika
temelli yöntemlerdir.
İşaretleme Reaksiyonu
Otomatik Dizi Analizi ticari olarak üretilen kitler kullanılır. En
sık olarak ABI Prism Big DyeTM Terminatör Reaksiyon Kiti
kullanılır. Bu PCR kitinin özelliği tüm PCR kimyasalları ile
beraber, floresan boyalı ddNTP’ler ile Taq DNA Polimeraz
enzimini de tek bir karışım halinde bulundurmasıdır. “Big
Dye Ready Reaction Mix” olarak adlandırılan bu karışıma
sadece primer ve temizlenmiş kalıp DNA eklenir ve PCR
başlatılır.
• BigDye Terminatör
DNA Polymerase,
dNTP’s and
DyeDeoxyterminator
s
A
C
G
T
A
AC
AC C
ACC G
ACCG T
ACCGT A
ACCGTA T
Bağlanma
Uzama
Ürünler
Fluorescent Dyes Used in 44-Color
-Color
Detection
FAM (Blue)
TAMRA (Yellow)
JOE (Green)
ROX (Red)
Amplifikasyon Koşulları
1 amplifikasyon tüpü (20 µl) için reaksiyon karışımı
Kalıp DNA
Big Dye Ready Reaction Mix
Primer (3.2pmol / µl)
Distile su
8.0 µl
8.0 µl
1.0 µl
3.0 µl
PCR Programı
96 0C ‘
10’’
50 0C‘
5’’
60 0C‘
4’’
40C’
10’
24 döngü;
1 döngü;
Örneklerin Hazırlanması
Örnek hazırlama sırasında amplifikasyon ürünü izopropanol
çöktürmesi ile PCR artıklarından temizlenir. Bu aşama
özellikle reaksiyona girmemiş floresan boyalı ddNTP’ lerin
uzaklaştırılması açısından da çok önemlidir. İşlem uygun
şekilde yapılamazsa kontaminant boyalar lazer tarafından
okunacak ve analizin hassasiyetini bozacaktır.
Örneğin Cihaza Yüklenmesi ve Elektroforezin Başlatılması
Örnekler izopropanol ile temizlenip alkol tamamen
uzaklaştırıldıktan sonra işaretleme reaksiyonu ürünleri
formamid veya TSR içinde çözülür. Örnekler denatüre
edildikten sonra buz içinde şoklanarak cihaza yüklenir
ve elektroforez başlatılır. Yürütme işlemi 15 kV gerilim
ve 50 oC sıcaklıkta gerçekleştirilir.
Fluorescent Emission Spectra for ABI Dyes
5-FAM JOE NED
ROX
Normalized Fluorescent
Intensity
100
80
60
40
20
0
520
540
Laser excitation
(488, 514.5 nm)
560
580 600
620
640
WAVELENGTH (nm)
ABI
ABI310
310Filter
FilterSet
SetFF
Matrix File Table from an ABI 310
1.0000
1.0000
These values are used by the GeneScan® Analysis Software to
separate the various dye colors from one another. The letters B, G,
Y, and R represent the dye colors Blue, Green, Yellow, and Red,
respectively.
Sonuçların Değerlendirilmesi
Elektoroforez işlemi tamamlandıktan sonra bilgisayar ana
menüsünden “Sequence Analysis” programı açılır ve
yürütülen örnek burada analiz edilir. Analiz sonrası örnek
isminin bulunduğu alan fare yardımıyla çift tıklandığında
örneğimizin baz dizisi yeni bir ekran üzerinde renkli pikler
halinde görünür. Her bir pik bir DNA fragmentine karşılık
gelir. Piklerin rengi ise söz konusu DNA fragmentinin son
bazı olan ddNTP’ li bazın rengidir. Her bir pik üzerinde o
pikin son bazının ilk harfi renkli olarak yazılıdır. Eğer
istenirse baz dizisi metin olarak da alınabilir ya da her iki
sonuç yazdırıcı vasıtasıyla kağıda aktarılabilir.
Otomatik Dizi Analizi Cihazları
1- Jel Sistemli Cihazlar (ABI Prism 370, 373, 377)
2- Kapiler Sistemli Cihazlar (ABI Prism 310, 3100, 3700)
ABI Prism 377
ABI Prism 377
Labeled DNA fragments
(PCR products)
Capillary or
Gel Lane
Sample Detection
Size
Separation
Ar+
LASER
CCD Panel
(488 nm)
LASER
(488 nm)
Color
Separation
Detection
region
Fluorescence
ABI Prism
spectrograph
ABI 310 PRISM
Kapiller Elektroforez
High Voltage
De
(+)
anode
te c
Capillary
tor
(-)
cathode
STANDARD OPERATION
CAPILLARY FILL
-ELECTROPHORESIS
„ PRE
PRE-ELECTROPHORESIS
„ WATER WASH OF CAPILLARY
„ SAMPLE INJECTION
„ WATER WASH OF CAPILLARY
„ ELECTROPHORESIS
„ DETECTION
„
Electrokinetic Injection
Process
Capillary
Electrode
Q=
πr2cs(µep + µeo)Etλb
λs
Q is the amount of sample injected
r is the radius of the capillary
-
cs is the sample concentration
DN
A-
E is the electric field applied
t is the injection time
-
λb is the buffer conductivity
DNA-
λs is the sample conductivity
µep is the mobility of the sample molecules
Sample
Tube
µeo is the electroosmotic mobility
Rose et al (1988) Anal. Chem. 60: 642-648
ABI Prism 310 Genetic Analyzer
Stepper Motor
capillary
Heat
Plate
Syringe with
polymer solution
Laser
Injection
cathode
Anode
Pump Autosampler
Outlet Block
tray
buffer
Inlet
buffer
ABI Prism 310 Genetik Analizör Cihazı’na ait elektrot
ve kapiler
Enjeksiyon
Elektrodu
Örnek Tepsisi
Kapiler
ABI Prism 3100
Cihazın İç Yapısı
Long Read BigDye™ Terminator v 3.0, 80 cm Capillary Array 3100
Genetic Analyzer
Model 3100
7_11.ab1
Version 3.4.1
Basecaller-3100POP4_80
2498.13734.1443.567
BC 1.4.b.2
Lane 11
Signal G:304 A:286 T:249 C:197
DT3100POP4{BDv3}v1.mob
Points 1570 to 18468 Pk 1 Loc: 1570
Page 1 of 2
Tue, Sep 18, 2001 11:29 AM
Tue, Sep 11, 2001 8:36 AM
Spacing: 16.00{16.00}
CATTCTTTAGACGCTTCCTG TGCTACCATTCTCGGAAATACTG CAAG AAATCATCG ATG TCCCATG ACGG AAAAGAAGAACCTGG TATTG CCAAAAAGATAAACTCAGTAGATGATATTAT
10
20
40
70
100
110
120
30
50
60
80
90
TTATCAAATGTCAATGCTGGG TCCAAAAAAATGATGAAGAACGATTAGCTGAAATTTTATCCATAAACACAAGAAAAGCACCACCAAAATTCTATGTTCACTATGTTAAT TACAACAAGCGT
130
140
150
160
170
180
190
200
210
220
230
240
TTTAGATGAGTGG ATTACCACTGACAGAATAAACCTGAAGAAGATCCAGTTCCCCAAGAAAGAGGCCAA GACCCCCACTAAGAACGGACTTCCTGGGTCCCGTCCTGGCTCTCCAGAGAGAGAGG
250
260
270
280
290
300
310
320
330
340
350
360
GTGCCGGCCTCGGCGCAGGCCAGCGGG AAGACCTTGCCAATCCCGGTCCAGATCACACTCCGCTTCAACCTGCCCAAGG AGCGGG AGGCCATTCCCGGTGGCGAGCCTGACCAGCCGCTCTCCTCCAGCT
370
380
390
400
410
420
430
440
450
460
470
480
490
TCCTGCCTGCAGCCCAACCACCGCTCAACGAAACGGAAGGTGGAGGTGGTTTCACCAGCAACTCCAGTGCCCAGCGAGACAGCCCCGGCCTCGGTTTTTCCCCAGAATGGAGCCGCCCGTAGGGCAGTGG
500
510
520
530
540
550
560
570
580
590
600
610
620
GCAGCCCAGCCAGGACGGAAGCGAAAATCGAATTGTTTGG GCACTGATGAGGACTCCCAGG ACAGCTCTGATGGAATACCGTCAGCACCACGCATGACTGGCAGCCTGG TGTCTGATCGAAGCCACGA
630
640
650
660
670
680
690
700
710
720
730
740
750
ACGACATCGTCACCCGGATG AAGAACATTGAGTGCATTGAGCTGGGCCGGCACCGCCTCAAGCCGTGGTACTTCTCCCCGTACCCACAGGAACTCA CCACATTGCCTGTCCTCTACC TGTGCGAG
760
770
780
790
800
810
820
830
840
850
860
870
GTTCTGCC TCAAGTACGGCCGTAGTC TCAAGTGTCTTCAGCGTCATTTGACCAGTGTGACCTACGACATCCT CCAGGCAATGAGATTNCCGCAAGGGCCCATCTCTTCTTNGAGAT GATGGAC
880
890
900
910
920
930
940
950
960
970
980
990
ABI Prism 3700
İki Yöntemin Kıyaslanması
Manuel Yöntem
„ Maliyeti düşük
„ Daha fazla işgücü gerekir
„ En fazla 350 bç okunabilir
„ İlk radyoaktif dATP
zincire eklendikten sonra
okuma başlar
„ Daha fazla zaman alır
Otomatik Yöntem
„ Maliyeti yüksek
„ Daha az işgücü gerekir
„ 1000 baz çifti okunabilir
„ Primerden hemen sonra
okunabilir
„
Daha kısa süre alır
„
„
„
„
„
„
„
„
Otomatik sekansın teorik kapasitesi
24 kapiller sekans aletinin kapasitesi 2.7 milyon baz/yıl
Tüm insan genomu sekansında bir tek cihaz
kullanılırsa1000 yıl gerekli
Bu nedenle 96 ve 384 kapiller sekans aletleri
geliştirilmiştir.
Slab jelÆkapiller sistem= 24 saat/9 yürütme
1-6 milyon baz/1 ay/ 1 sekans aleti
Amersham Megabase 1000 ile 450 000 baz / 1 gün
Büyük genomlar için birçok lab. birarada çalışmakta ve
günde 18 milyon bazın sekansını yapabilmektedir.
İnsan genom projesinde kullanılan sekanslama stratejileri
1- BAC temelli sekanslama
2- tüm genom shutgun stratejisi
BAC temelli sekanslama
İnsan genomu yaklaşık 150-200 kb uzunluğunda
fragmentlere ayrıldı. Bu fragmentler BAC vektörlere
klonlanarak insan genomunun BAC kütüphanesi
oluşturuldu. BAC kütüphanesi yaklaşık 20 000 kadar
BAC klonundan oluşmaktaydı. Daha sonra her bir
BAC klonu insan genomundaki yerinin belirlenmesi
amacıyla haritalandı.
Dizi analizi için her bir BAC klonu yaklaşık 2000 bp’lik
daha kısa fragmentlere parçalandı. Bu subklonların dizi
analizi yapılarak bilgisayarlar kullanılarak birleşme
noktalarından faydalanılarak her bir BAC klonunun
dizisi çıkarıldı. Daha sonra haritalanan BAC klonları
birleştirilerek tüm genomun dizisi çıkarıldı.
Tüm Genom Shutgun Stratejisi
Dr. J. Craig VENTER ve arkadaşları tarafından geliştirilen
bu yöntem haritalamaya gereksinim duymadığından zaman
ve işgücü açısından tassarruf sağlamaktadır. Bu yöntemde
önce genom yaklaşık 2000 ve 10000 bp’lik küçük fragmentlere
ayrılır daha sonra bu fragmentler plazmit vektörlere klonlanarak
çoğaltıldıktan sonra dizisi çıkarılır. Bu diziler bir algoritm
programı ile birleştirilerek genomun dizisi çıkarılır.
Bu teknik basit olarak görünse de insan genomu gibi
büyük genomlara uygulandığında kısa bir süre içinde
milyonlarca fragmentden elde edilen dizilerin kısıtlı bir
sürede birleştirilmesi gerekmektedir. Ayrıca yöntem
çok sayıda yüksek kapasitede çalışabilecek sekansır
ve sekansı çıkarılan dizilerin birleştirilmesi için
bilgisayar sistemlerine gereksinim duymaktadır. Venter
bu amaçla TIGR’yı (The Institute for Genome Research)
kurarak milyonlarca fragmenti biraraya getirmek için
Algoritm programı geliştirdi.
Bu algoritmayı kullanarak Venter ve arkadaşları 1.8
milyon bp’den oluşan Haemophilus influenza genomunun
dizisini çıkardılar. Venter ve arkadaşları bu yöntemi
insan genomuna uygulamaya karar verdiklerinde bir
çok araştırıcı bu yöntemin insan gibi milyonlarca repetatif
DNA içeren büyük genomlarda başarılı olmayacağını öne
sürmekteydi.
Ocak 1998’de yüksek kapasiteli 3700 cihazlarının
ve shutgun sekans algoritmasının geliştirilmesi ile
insan genom projesi hız kazandı. Mayıs 1998’de
Venter, 300 adet 3700 ve çok sayıda yüksek kapasiteli
bilgisayar alarak Celera Genomics şirketini kurdu ve
İnsan genomunun dizisinin 3 yıl içinde tamamlanacağını
duyurdu. Venter ve arkadaşları 9 ay içinde insan
genomunun taslağını çıkarmayı başararak yöntemlerinin
başarılı olduğunu kanıtladılar.
Haziran 2000’de insan genom projesinin tamamlandığı
açıklandı. Ancak açıklanan diziler taslak diziler olup
düzeltilmesi gerekiyordu. İki grup bir arada çalışarak
nisan 2003 yılında diziye son şeklini verdiler
Haziran 2000
„
„
„
„
Genomun %90’ını içeriyor
Hata oranı yaklaşık 1000
bazda 1
150 000 gap bulunuyor
Genomun %28’i bitiş
standardına uygun
Nisan 2003
„
„
„
„
Genomun %99’unu içeriyor
Hata oranı yaklaşık 10000
bazda 1
400 gap bulunuyor
Genomun %99’i bitiş
standardına uygun