KimyaKongreleri.org

KM
XVIII. Ulusal Kimya Kongresi, Kars, 2004
İNSAN BÜYÜME HORMONU hGH ÜRETİMİ İÇİN REKOMBİNANT Bacillus
TÜRLERİ GELİŞTİRİLMESİ
Nermi Kalender1, Pınar Çalık2, Güzide Çalık2, Tunçer H. Özdamar2
1
Ankara Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 06100, Tandoğan, Ankara
Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 06531, Ankara
2
Terapatik protein insan büyüme hormonunun (hGH) hücredışı üretimi için genetik
mühendisliği teknikleri ile istenen niteliklere uygun, verim ve seçimliliği yüksek
rekombinant Bacillus türleri geliştirilmesinin amaçlandığı bu çalışmada, öncelikle hücre
içinde üretilen hGH 'nun hücre dışına aktarılabilmesi için, Bacillus hücre dışı
enzimlerinden serin alkali proteaz (SAP) geninin (subC) pre- pro- dizinlerinin hGH gen
dizininin önüne entegre edilmesine ve bunun için PCR tepkimelerine dayanan SOE [1]
yönteminin kullanılmasına karar verilmiştir. Bu çerçevede primerlerin tasarımı yapıldıktan
sonra SAP üretme potansiyeli olan Bacillus licheniformis'ten izole edilen kromozomal
DNA ve E.coli'den izole edilen hGH genini taşıyan pHGH107 plasmidi kalıp olarak
kullanılarak entegre edilecek SAP pre- pro- dizini ve hGH mature peptit dizini ayrı ayrı
PCR tepkimeleriyle çoğaltılmış ve böylece tasarlanan uygun primerlerle birleşecekleri
uçlarına birbirlerine tamamlayıcı dizinler eklenmiştir. Daha sonra bu PCR ürünlerinin aynı
mikroreaktörde yeni bir PCR tepkimesinde biraraya getirilmesiyle birbirleriyle
eşleşebilecek uzantılar taşıyan uçlarından entegrasyonları ve böylece oluşan hibrit genin
ortamda uygun primerlerin varlığıyla çoğaltılması sağlanmıştır. Elde edilen hibrit gen önce
pUC19 E.coli plasmidine klonlanmış ve böylece geliştirilen r-pUC19 E.coli’e transfer
edilerek derişimi artırıldıktan sonra izole edilmiştir. Hibrit gen, iki ucunda bulunan BamHI
ve SalI restriksiyon enzimleriyle kesilerek r-pUC19’dan ayrıldıktan sonra pHV1431 ve
pMK4 Bacillus-E.coli shuttle plasmidlerine sub-klonlama gerçekleştirilmiştir. Daha sonra,
geliştirilen r-pHV1431 ve r-pMK4 plasmidleri E.coli’de derişimleri artırıldıktan sonra
izole edilmiş ve konak Bacillus türleri olarak düşünülen Bacillus subtilis npr- apr-, Bacillus
subtilis spo-159, Bacillus subtilis spo-1516 ve Bacillus licheniformis türlerine doğal
transformasyon ve elektroporasyon yöntemiyle paralel olarak transfer edilmişlerdir.
Böylece geliştirilen farklı Bacillus türleri ile tanımlanmış ortam kullanılarak laboratuvar
ölçekte hücre dışı hGH üretimi gerçekleştirilmiştir.
Kaynak
1.Ho, S.N., Hunt, H.D., Horton, R.M., Pullen, J.K., and Pease, L.R., 1989. Site-directed
mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction, Gene, 77:51-59.
761
KimyaKongreleri.org