DOKSORUBĠSĠNĠN OLUġTURDUĞU KARDĠYOTOKSĠSĠTEDE
advertisement
T.C. ÇUKUROVA ÜNĠVERSĠTESĠ TIP FAKÜLTESĠ HĠSTOLOJĠ-EMBRĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI DOKSORUBĠSĠNĠN OLUġTURDUĞU KARDĠYOTOKSĠSĠTEDE MELATONĠNĠN ETKĠSĠ UZMANLIK TEZĠ TEZ DANIġMANI Prof. Dr. Ufuk Özgü METE Dr. Ebru BALLI Adana-2003 TEġEKKÜR Uzmanlık tezimin hazırlanmasında emeği geçen değerli hocalarım Anabilim Dalı Başkanımız Sayın Prof. Dr. Mehmet KAYA’ya, tez konumun seçimi, yürütülmesi ve değerlendirilmesinde yardımlarını esirgemeyen danışman hocam Sayın Prof. Dr. Ufuk Özgü METE’ye en derin saygı ve şükranlarımı sunarım. Ayrıca tez çalışmalarım sırasında manevi desteklerini gördüğüm Anabilim Dalımızda görev yapan diğer hocalarıma ve teknik desteklerini gördüğüm teknisyen arkadaşlarıma, biyokimyasal çalışma aşamasındaki desteklerinden ötürü Biyokimya Anabilim Dalı öğretim üyelerinden Doç. Dr. Abdullah Tuli’ye ve Arş. Gör. Ebru Dündar’a, tez çalışmalarım boyunca yakın desteklerini gördüğüm Farmakoloji Anabilim Dalına ve Arş. Gör. Sinem Büyüknacar’a teşekkür ederim. Ayrıca bu günlere gelmemde çok büyük emekleri olan sevgili anne ve babama, manevi desteklerinden ötürü de eşime teşekkür ederim. ArĢ. Gör. Dr. Ebru BALLI Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından TF 2002 LTP 65 No’lu proje olarak desteklenmiştir. ĠÇĠNDEKĠLER Sayfa No TEġEKKÜR..........................................................................................................................I ĠÇĠNDEKĠLER.....................................................................................................................II TABLO DĠZĠNĠ....................................................................................................................IV RESĠM DĠZĠNĠ.....................................................................................................................V ÖZET.....................................................................................................................................VI ABSTRACT..........................................................................................................................VII 1. GĠRĠġ VE AMAÇ.............................................................................................................1 2. GENEL BĠLGĠLER..........................................................................................................3 2.1. Doksorubisin.......................................................................................................3 2.1.1. Etki Mekanizması................................................................................3 2.1.2. Direnç GeliĢimi....................................................................................4 2.1.3. Tedavideki Yeri...................................................................................4 2.1.4. Farmakokinetik Özellikleri................................................................4 2.1.5. Yan Etkileri.........................................................................................5 2.2. Melatonin............................................................................................................5 2.2.1. Melatonin Sentez ve Salınımı.............................................................5 2.2.2. Melatonin Metabolizması...................................................................6 2.2.3. Melatonin Reseptörleri.......................................................................7 2.2.4. Melatoninin Serbest Radikal Giderici Etkisi...................................7 2.2.5. Melatoninin Klinik Etkileri...............................................................8 2.2.6. Melatoninin Yan Etkileri...................................................................8 3. GEREÇ VE YÖNTEM..................................................................................................10 3.1. Kullanılan Deney Hayvanı ve Hayvan Bakımı.............................................10 3.2. Deneyin YapılıĢı...............................................................................................10 3.3. Kalbin Eksizyonu............................................................................................10 3.4. Enzim Analiz Yöntemi....................................................................................11 3.4.1. Süperoksit Dismutaz Analizi...........................................................11 3.4.2. Glutatyon Peroksidaz Analizi..........................................................11 3.4.3. Malondialdehit Analizi.....................................................................11 3.5. IĢık Mikroskobik Doku Hazırlama Yöntemi................................................11 3.5.1. Doku Takip ĠĢlemi............................................................................12 3.6. Elektron Mikroskobik Doku Hazırlama Yöntemi...........................................12 3.7. Ġstatistiksel Analiz...............................................................................................14 4. BULGULAR.......................................................................................................................15 4.1. Enzim Analizleri..................................................................................................15 4.2. IĢık Mikroskobik Bulgular.................................................................................16 4.2.1. IĢık Mikroskobik Resimler..................................................................17 4.3. Elektron Mikroskobik Bulgular........................................................................21 4.3.1. Elektron Mikroskobik Resimler.........................................................25 5. TARTIġMA.......................................................................................................................45 6. SONUÇ VE ÖNERĠLER..................................................................................................53 7. KAYNAKLAR...................................................................................................................55 8. ÖZGEÇMĠġ.......................................................................................................................61 TABLO DĠZĠNĠ Sayfa No Tablo 1. Elektron mikroskobik doku takip yöntemi..........................................................13 Tablo 2. Kontrol ve deney gruplarına ait enzim analiz sonuçları.....................................15 ġEKĠL DĠZĠNĠ Sayfa No IĢık Mikroskobik ġekiller ġekil 1. I. Gruba ait kalp kası hücreleri.............................................................................17 ġekil 2. II. Gruba ait kalp kası hücreleri...........................................................................17 ġekil 3. III. Gruba ait kalp kası hücreleri.........................................................................18 ġekil 4. IV. Gruba ait kalp kası hücreleri.........................................................................18 ġekil 5. IV. Gruba ait kalp kası hücreleri.........................................................................19 ġekil 6. V. Gruba ait kalp kası hücreleri...........................................................................19 ġekil 7. V. Gruba ait kalp kası hücreleri...........................................................................20 Elektron Mikroskobik Resimler ġekil 8. I. Gruba ait kalp kası hücreleri.............................................................................25 ġekil 9. I. Gruba ait kalp kası hücreleri.............................................................................26 ġekil 10. I. Gruba ait kalp kası hücreleri...........................................................................27 ġekil 11. II. Gruba ait kalp kası hücreleri.........................................................................28 ġekil 12. II. Gruba ait kalp kası hücreleri.........................................................................29 ġekil 13. II.gruba ait kalp kası hücreleri...........................................................................30 ġekil 14. III. Gruba ait kalp kası hücreleri.......................................................................31 ġekil 15. III. Gruba ait kalp kası hücreleri.......................................................................32 ġekil 16. III. Gruba ait kalp kası hücreleri.......................................................................33 ġekil 17. IV. Gruba ait kalp kası hücreleri.......................................................................34 ġekil 18. IV. Gruba ait kalp kası hücreleri.......................................................................35 ġekil 19. IV. Gruba ait kalp kası hücreleri.......................................................................36 ġekil 20. IV. Gruba ait kalp kası hücreleri.......................................................................37 ġekil 21. IV. Gruba ait kalp kası hücreleri.......................................................................38 ġekil 22. IV. Gruba ait kalp kası hücreleri.......................................................................39 ġekil 23. IV. Gruba ait kalp kası hücreleri.......................................................................40 ġekil 24. V. Gruba ait kalp kası hücreleri.........................................................................41 ġekil 25. V. Gruba ait kalp kası hücreleri.........................................................................42 ġekil 26. V. Gruba ait kalp kası hücreleri.........................................................................43 ġekil 27. V. Gruba ait kalp kası hücreleri.........................................................................44 ÖZET Doksorubisinin OluĢturduğu Kardiyotoksisitede Melatoninin Etkisi Doksorubisinin en önemli yan etkisi olan kardiyotoksisite üzerine melatoninin koruyucu etkisini araştırmak amacıyla yapılan bu çalışmada 40 adet Wistar tipi albino erkek sıçan kullanıldı. Sıçanlar 5 gruba ayrıldı. I. gruba 4 gün süre ile serum fizyolojik, II. gruba 15 gün süre ile %2,5’luk etanol, III. gruba 15 gün boyunca 6 mg/kg/gün dozunda melatonin (Sigma), IV. gruba 4 gün boyunca 3 mg/kg/gün dozunda doksorubisin (Adriblastina-Carlo Erba) ve V. gruba doksorubisin + melatonin kombinasyon tedavisi intraperitoneal olarak uygulandı. Deney sonunda alınan doku örnekleri biyokimyasal analizler, ışık ve elektron mikroskobik incelemeler için uygun yöntemlerle hazırlandı. Biyokimyasal inceleme için alınan doku örneklerinde malondialdehit, süperoksit dismutaz ve glutatyon peroksidaz değerleri ölçüldü. Doksorubisin grubunda bir lipid peroksidasyon ürünü olan malondialdehit değerleri anlamlı bir şekilde yüksek iken doksorubisin ile melatoninin kombine uygulandığı grupta malondialdehit değerlerinin düştüğü saptandı. Ayrıca süperoksit dismutaz değerlerinin melatonin grubu ile doksorubisin + melatonin kombinasyon tedavisi uygulanan grupta arttığı ve glutatyon peroksidaz değerlerinin ise doksorubisin grubu ile doksorubisin + melatonin kombinasyon tedavisi uygulanan deney grubunda azaldığı saptandı. Histolojik inceleme sonucunda doksorubisin grubunda belirgin miyofibril harabiyeti, sarkomer düzenlenmesinde bozulma, mitokondriyal dejenerasyon ve dev mitokondriyon formasyonu, sarkolemma bütünlüğünde bozulma ve lipid birikimi gözlendi. Ayrıca bazı hücrelerde sarkoplazma içerisinde filamentöz yapıların biriktiği, hücreler arası bölgelerde kan damarlarında yapısal değişikliklerin olduğu ve kollajen liflerin artarak kalın demetler oluşturdukları izlendi. Doksorubisin tedavisine melatonin eklendiğinde tüm yapısal değişikliklerin azalarak gerilediği gözlendi. Kemoterapötik bir ilaç olarak kullanılan doksorubisinin kardiyotoksik yan etkisinin antioksidan sistemin baskılanması ve lipid peroksidasyonuna bağlı olarak geliştiği ve doksorubisin tedavisine melatonin eklenerek doksorubisinin kardiyotoksik etkisinin büyük oranda önlenebileceği sonucuna varıldı. Anahtar Sözcükler: Doksorubisin, Kalp kası, Melatonin, Ultrastrüktür ABSTRACT Effect of Melatonin on The Cardiotoxicity of Doxorubicin This study was designed to investigate the preventive effect of melatonin on doxorubicin’s most important side effect, cardiotoxicity. Fourty male albino Wistar rats were utilized and the rats were divided into five groups. Group I, serum physiologic solution for 4 days; group II, 2.5 % ethanol for 15 days; group III, melatonin 6 mg/kg/day for 15 days; group IV, doxorubicin 3 mg/kg/day for 4 days and group V doxorubicin and melatonin combination were administered intraperitoneally. At the end of the experiment, tissue samples obtained from the rats were prepared for biochemical analysis, light and electron microscopic examination. The levels of malondialdehyde, superoxide dismutase and glutathion peroxidase were measured in tissue samples for biochemical analysis. Malondialdehyde, a product of lipid peroxidation, was found to be significantly higher in the doxorubicin group. However, in the doxorubicin and melatonin combination group the levels of malondialdehyde were decreased. While superoxide dismutase levels were increased in both melatonin and melatonin-doxorubicin combination groups, levels of glutathion peroxidase were decreased in doxorubicin and doxorubicin-melatonin combination groups. The histologic examination revealed destruction of myofibrils, disorganization of sarcomeres, mitochondrial degeneration and formation of giant mitochondria, disruption of integrity of sarcolemma and lipid accumulation in doxorubicin group. Also, accumulation of filamentous structures in the sarcoplasma in the some of the cells, structural changes in capillaries and increasement of collagen fibers forming bundles were observed. When the melatonin added to doxorubicin treatment all structural changes were reduced gradually. Cardiotoxic side effect of doxorubicin used as a chemotherapeutic agent probably developed as a result of supression of antioxidant system and lipid peroxidation. And it was concluded that the addition of melatonin at the treatment of doxorubicin could prevent the cardiotoxicity of doxorubicin. Key Words: Doxorubicin, Cardiac muscle, Melatonin, Ultrastructure. 1. GĠRĠġ VE AMAÇ Çağımızın en önemli ve öldürücü hastalığı olan kanserin tedavisi de oldukça zordur. Kullanılan ilaçların toksik etkisi antineoplastik tedaviyi etkileyen önemli bir faktördür. Belirli toksik etkiler antineoplastik ilaçların tedavide daha yüksek dozda ve daha sık bir şekilde kullanılmasını ve böylece daha güçlü bir terapötik etkinlik elde edilmesini engeller. Bunlara doz kısıtlayan toksik etkiler adı verilir. Antineoplastik ilaçların doz kısıtlayıcı toksik etkilerini önleyerek onları daha etkin olan yüksek dozda vermeyi (yüksek doz kemoterapisi) sağlayan çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Yüksek doz kemoterapisine olanak veren tedavi yaklaşımlarından birisi ilaçla birlikte onun antineoplastik etkinliğini azaltmadan toksisitesini azaltan bir ilacın verilmesidir. Bunun bir örneği yüksek doz metotreksatla birlikte onun antidotu olan folinik asidin verilmesidir1. Bazı klinik çalışmalarda uygulanan doksorubisin-melatonin kombinasyon tedavisi de bu tedavi yöntemine bir örnek oluşturabilir2. Mikrobiyal ürünler üzerinde yapılan araştırmalar kanser kemoterapisinde faydalı olduğu klinik olarak ispat edilmiş çok sayıda maddenin keşfine yol açmıştır. Antrasiklinler bunlardan birisidir3. Doksorubisin kemoterapötik tedavide sık kullanılan, geniş spektrumlu bir antrasiklin antibiyotik olmakla birlikte birçok organ ve dokuda toksik etkiler oluşturması, özellikle de nadir ve öldürücü kardiyak toksisite potansiyelinden dolayı kullanımı kısıtlıdır4,5,6,7. Doksorubisinin ince barsak, akciğer, beyin ve böbrek üzerine önemli toksik etkileri olup5 kalpte doza bağımlı olarak gelişen irreversibl dilate kardiyomiyopati ile şiddetli konjestif kalp yetmezliğine neden olur8,9. Yapılan çalışmalarda akut kardiyotoksisite semptomları ventrikül fonksiyonunda bozulma ve elektrokardiyogramda oluşan değişiklikler olarak bildirilmiştir. Bununla birlikte kronik toksisite de ise kardiyomiyopati ve konjestif kalp yetmezliği görülür6. Doksorubisin hücre içinde reaktif oksijen radikallerinin oluşumuna yol açar4,5,7,10,11,12,13,14. Oluşan bu serbest radikaller lipid peroksidasyonuna sebep olur ve bu da membran yapısında ve fonksiyonunda irreversibl hasara yol açar5,7,12,13,14. Membran lipidleri ve diğer hücresel komponentlerde oluşan oksidatif hasarın doksorubisin ve diğer antrasiklik antibiyotiklerin toksisitesinde majör faktör olduğuna inanılmaktadır. Bundan dolayı doğal ve sentetik antioksidantların kullanımının doksorubisin ve diğer sitotoksik ilaçların oluşturduğu oksidatif strese karşı koruyucu olabileceği birçok araştırmacı tarafından doğrulanmıştır5,10,14,15,16. Son zamanlarda, endojen antioksidantların salgılanmasını regüle eden ajanlara ve antioksidant gibi fonksiyon gören bileşiklere çok fazla ilgi oluşmuş, pineal gland ve diğer bazı dokular tarafından üretilen bir hormon olan melatonin biyolojik antioksidantlar sınıfına dahil edilmiştir5. Melatoninin (N-acetyl-5-methoxytryptamine) klinik uygulamaları, biyolojik ve fizyolojik fonksiyonları birçok çalışmada açıklanmış olup son yıllarda antioksidant özelliği üzerinde çok çalışılmıştır14. Melatonin özellikle oksijen kökenli serbest radikallere karşı antioksidant aktivite sergiler. Örnek olarak hidroksil (OH) radikallerini hızla ortadan kaldırır5,14. İlaçlar tarafından oluşturulan serbest radikallerin yan etkilerinin azaltılmasından başka, melatonin hem antineoplastik potansiyele sahiptir hem de immun sistemi stimüle eder14. Melatoninin sıçanlarda doksorubisin tarafından meydana getirilen kardiyotoksisiteden başka nefrotoksisite ve nöral toksisitede de antioksidatif etkisinin olduğu gösterilmiştir7. Doksorubisinin kardiyotoksik etkisi üzerine melatoninin koruyucu foksiyonunun varlığı konusunda çalışmalar bulunmakla birlikte, bunlar genel olarak biyokimyasal ve hemodinamik değişiklikler üzerinde yoğunlaşmıştır5,7,12,17. Yeterli sayıda ultrastrüktürel çalışma bulunmamakta olup sunulan çalışmada doksorubisinin oluşturduğu kardiyomiyopatiye karşı melatoninin koruyucu fonksiyonunun biyokimyasal değişikliklerle birlikte kapsamlı bir şekilde ışık ve elektron mikroskobik düzeyde araştırılması planlanmıştır. 2. GENEL BĠLGĠLER 2.1. DOKSORUBĠSĠN Antrasiklin antibiyotikler, bir mantar türü olan Streptomyces peucetius var caesius kültürlerinden izole edilen en yararlı antimitotik ve sitotoksik antikanser ilaçlar arasında yer almaktadırlar. Doksorubisin, antrasiklin antibiyotikler sınıfından bir kemoterapötik ilaç olup kanserlerin çok farklı tiplerine karşı güçlü aktiviteye ve geniş spektruma sahiptir3. Doksorubisin genellikle ticari ismi olan adriyamisin olarak da tanınır18. 2.1.1. Etki Mekanizması Antrasiklinlerin hücre tipine göre değişen üç önemli etkileri vardır. Bu etkileri hücre bölünmesinin özellikle S ve G2 fazlarında en belirgindir18. Bu etkiler: 1-DNA yapısına katılmaları: Bu ilaçlar seçicilik göstermeksizin DNA’da birbirine yakın baz çiftlerinin arasına girerek, şeker-fosfat yapısına yüksek afiniteyle bağlanırlar ve sonuç olarak DNA ile RNA’nın sentezini inhibe ederler. İlacın DNA yapısına katılması ile birlikte, topoizomeraz II enziminin katalizlediği DNA zincirinin kesilmesi ve farklı noktalardan tekrar birleştirilmesi işlemi engellenir ve sonuçta DNA zincirinde tamir edilmesi mümkün olmayan kırılmalar meydana gelir3,18. 2-Hücre zarlarına bağlanmaları: Bu özellikleri, fosfatidilinositol aktivasyonuna kenetli iyon transportu mekanizmalarını bozar3,18. 3-Lipid peroksidasyonu ve oksijen radikallerinin oluşumu: Doksorubisinin sitotoksik aktivitesi kinon yapısı ile de ilişkilidir. Hücre çekirdek membranında bulunan NADPH-sitokrom P-450 redüktaz enzimi, antrasiklinlerin semikinon serbest radikallere indirgenmesini sağlar. Bu radikaller oksijen molekülünde indirgenmeye neden olarak, DNA zincirini parçalayan süperoksit iyonları ile hidrojen peroksitin oluşmasını sağlarlar ve dolayısıyla DNA zincirinde kırılmalar meydana gelir. Ayrıca bu radikaller hücre membranında lipid peroksidasyonuna yol açarlar3,5,18. Süperoksit dismutaz veya glutatyon peroksidaz enzimlerinin yüksek oranlarda bulunduğu hücreler bu üç etkiye dirençlidir. Tümör hücrelerinde ve kalp hücrelerinde ise süperoksit dismutaz enzimi düşük miktarlarda bulunmaktadır. Aynı zamanda kalp dokusunda katalaz enziminin de bulunmaması sonucu hidrojen peroksit parçalanamamaktadır ve böylece de antrasiklinlerin kardiyotoksik etkileri ortaya çıkmaktadır18. 2.1.2. Direnç GeliĢimi Doksorubisinin hücre dışına taşınmasında rol oynayan ve hücre zarında yerleşim gösteren bir glikoprotein olan P-transport proteininin aktivitesindeki artışın ilaca karşı direnç gelişimini sağladığı düşünülmektedir. Aynı zamanda yüksek miktarda glutatyon peroksidaz enzimi içeren hücreler de ilaca karşı dirençlidirler. Sitokrom P-450 miktarında azalma, topoizomeraz II enziminin miktarında artma ve DNA onarımı da dirençte rol oynayan diğer faktörlerdir18. 2.1.3. Tedavideki Yeri Doksorubisin en önemli ve en sık kullanılan kemoterapötik ilaçlardan birisidir3,18. Oldukça geniş spektrumlu ve güçlü etkili olmasının sağladığı üstünlüğe karşın toksisitesinin fazlalığı bir sakınca oluşturur1. Doksorubisin sıklıkla kombinasyon tedavisi şeklinde pek çok solid ve hematolojik tümörlerin tedavisinde kullanılmaktadır1,3,18. Kombinasyon tedavisindeki ilaçlar sıklıkla birbirlerinin etkilerini arttırırlar. Tek ajanla yapılan tedaviye göre daha uzun süreli remisyon elde edilir. Bu yaklaşım ile doksorubisinin yüksek dozlarda kullanılmasına bağlanan bazı toksik etkileri azaltılabilir3. 2.1.4. Farmakokinetik Özellikleri a-Emilim ve dağılım: Doksorubisin gastrointestinal sistemde absorbe olmadığı ve inaktivasyona uğradığı için intravenöz olarak uygulanır1,3,18. İlacın çevre dokulara sızarak doku nekrozuna neden olması ciddi problemlere yol açabilmektedir1,18. Doksorubisin plazma proteinlerine bağlanır ve dokulara dağılır. Ancak serebrospinal sıvıya geçmez1,18. Dokulara fazla oranda bağlanıp bu bölgelerden yavaş bir şekilde salıverilir. Bu nedenle karaciğerde hızlı bir şekilde metabolize edilmesine rağmen vücutta kalışı ve etkisi uzun sürer1,18. Enjeksiyondan sonraki ilk 30 dakikada kan konsantrasyonu %50 oranında azalır. Ancak yine de yaklaşık 20 saat kan konsantrasyonu önemli seviyelerde devam eder3. b-Eliminasyon: Doksorubisin karaciğerde redüksiyon ve hidroliz ile hızlı bir şekilde metabolize edilir3. İlacın büyük bir kısmı safra içinde itrah edilir1,3,18. Karaciğer fonksiyonları bozuk olan hastalarda doz ayarlaması yapılmalıdır. İlacın bir kısmı da böbreklerden atılmasına rağmen böbrek yetmezliği olan hastalarda doz ayarlamasına gerek yoktur1,3,18. 2.1.5. Yan Etkileri Diğer sitotoksik ilaçların olduğu gibi antrasiklinlerin de en sık yan etkilerinden birisi kemik iliği depresyonu olup kısa sürede iyleşmektedir. Bundan başka akut ve öldürücü gastrointestinal toksisiteye de sebep olabilmektedir. Alopesi, ağızda ülserasyon, bulantı, kusma ve diyare gibi yan etkileri de mevcut olmakla birlikte serbest radikallere bağlı olarak ortaya çıkan kalıcı ve doza bağımlı kardiyotoksisite en ciddi yan etkisidir1,3,5,18. Birisi akut, diğeri ise geç ve yavaş gelişen kronik olmak üzere iki tür kardiyotoksik etkisi vardır. Akut toksisite EKG bozuklukları ile kendini göstermekle birlikte kronik toksisite doza bağımlı kardiyomiyopati ile sonuçlanır ve tedavinin kesilmesinden 1-6 ay sonra ortaya çıkabilir. Kardiyomiyopati, ventriküllerin kasılma gücünün ve ejeksiyon fraksiyonunun giderek ilerleyen bir şekilde irreversibl olarak azalmasına neden olur. Sonuçta konjestif kalp yetmezliği gelişir1. Doksorubisinin uygulanan kümülatif dozu 550 mg/m2 yi geçtiği takdirde akut konjestif kalp yetmezliği riski artar. Doksorubisin ve diğer antrasiklinlerin oluşturduğu kardiyomiyopatiyi önlemek için çeşitli ilaçlar (asetil sistein, dijital, E vitamini ve oksitetrasiklin gibi) denenmiş fakat yeterli başarı sağlanamamıştır1. Bazı risk faktörlerinin mevcudiyeti durumunda (daha önce uygulanan göğüs irradiyasyonu, 65 yaşın üzerinde olma, önceden var olan kalp hastalığı gibi) doksorubisinin kardiyotoksik etkisi artmaktadır1,18. Doksorubisinin tüm bu etkilerinden başka teratojenik, mutajenik ve karsinojenik etkileri de vardır1. 2.2. MELATONĠN Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine) pineal gland ve diğer bazı dokular tarafından üretilen bir hormon olup, pek çok fonksiyonu mevcuttur3. Diğer pineal indollerine kıyasla hakkında çok daha fazla bilgi sahibi olduğumuz melatoninin temel fizyolojik fonksiyonları; uyku, davranış ve sirkadiyen ritimlerin düzenlenmesi ile immün sistem ve reprodüksiyon ile ilişkili etkileridir19,20,21,22. Yine, nörotropik (sinir dokusuna karşı eğilimi olan) bir özelliğe sahip olduğu ve bu nedenle de bellek fonksiyonu ile ilişkili olduğu iddia edilmektedir23. 2.2.1. Melatonin Sentez ve Salınımı Vücutta, endojen melatoninin çoğu pineal glandda sentezlenmektedir. Son yıllarda, diffüz nöroendokrin sisteme ait endokrin hücrelerde de az miktarda melatonin sentezlendiği ve aynı şekilde, hematopoietik sisteme ait kemik iliği hücrelerinin de önemli bir melatonin sentez yeri olduğu bildirilmiştir19. Göze gelen fotik stimülasyon sonucu retinohipotalamik traktuslar ile hipotalamusdaki suprakiazmatik nukleus aktive olmaktadır. Daha sonra pineal glanddaki pinealosit hücreleri ile sinaptik bağlantılar meydana gelmektedir. Bu sinaptik iletimde rol oynayan transmitter norepinefrindir. Pinealositler arasına norepinefrin salınımı ile onların sekretuar fonksiyonları başlatılmaktadır. Norepinefrin bu etkisini pinealosit membranları üzerinde yer alan reseptörleri stimüle etmek suretiyle göstermektedir19. Melatonin, pinealosit sitoplazması içerisinde triptofandan bir seri enzimatik reaksiyon vasıtasıyla sentezlenmektedir19. Melatonin sentez ve salınımı ışık miktarı ile yakın bir ilişki göstermektedir. Gece maksimum düzeyde ve gündüz ise minumum düzeydeki seyri ile karakterize sirkadiyen salınım ritmi göstermektedir19,21. Sentez ve salınım karanlıkta meydana gelir ve güneş ışığı tarafından baskılanır3,19. Melatonin sentezinde görev alan enzimlerin salınımı gündüz ışıkta azalmasına karşın, gece karanlıkta 100 kata ulaşan bir artma göstermektedir. Sistemik kan dolaşımı, pineal gland, serebrospinal sıvı, idrar ve hücre içindeki melatonin konsantrasyonu geceleyin gündüz ölçülen melatonin düzeyinin 10 katına kadar ulaşabilen bir artış göstermektedir. Melatonin salgılanması akşam başlamakta, gece yarısı maksimum düzeyine ulaştıktan sonra sabah azalma göstermektedir. Sistemik kan dolaşımındaki günlük sirkadiyen melatonin ritmi tamamen pineal glanddan salgılanan melatonin ile ilişkilidir19. Pinealositlerde üretilen melatonin, çok hızlı bir şekilde bu hücrelerin komşuluğunda yer alan kapillerlere bırakılmak suretiyle sistemik kan dolaşımına karışmaktadır. Lipofilik özelliği nedeniyle, vücuttaki tüm doku ve sıvılara kolayca dağılmaktadır. Pineal glandda kan-beyin bariyeri olmadığı için, salgılanan melatonin direkt olarak sistemik kan dolaşımı ve serebrospinal sıvı içine karışmaktadır19. 2.2.2. Melatonin Metabolizması Pineal glanddan sistemik kan dolaşımına verilen melatoninin 2/3’ü albumine bağlı ve geri kalan 1/3’ü ise serbest olarak taşınmakta olup, primer olarak karaciğerde ve sekonder olarak da böbrekte metabolize olmaktadır19. Melatonin karaciğerde öncelikle hidroksilasyon ve konjugasyon ile metabolize edilir3. Karaciğerde melatonin mikrozomal enzimler tarafından 6hidroksimelatonine dönüştürülerek deaktivasyon-detoksikasyona uğratılmakta ve idrarla atılmaktadır19. Sirozlu hastalarda eliminasyon yarılanma ömrü iki kat artar ve temizlenme beş kat azalır3. Dışardan 2.5-100 mg dozunda verilen melatoninin oral biyoyararlanımının %40-70 olduğu tahmin edilmektedir. 80 mg’lık oral doz ile en yüksek plazma konsantrasyon zamanı 60150 dakikadır. Eliminasyon yarılanma ömrü 20-70 dakikadır3. 2.2.3. Melatonin Reseptörleri Melatonin hormonu hedef dokulardaki etkisini, bu dokularda yer alan spesifik reseptörler aracılığı ile göstermektedir. Hedef doku nöral bir yapı (beyin, retina, hipofiz vb.) ya da ekstranöral bir yapı (tiroid, timus, dalak, endometriyum, plasenta, gastrointestinal sistem, eritrosit, lökosit, neoplastik doku vb.) olabilir. Sözü edilen reseptörlerin de melatonine benzer bir şekilde sirkadiyen bir ritm ile fonksiyon gösterdiği saptanmıştır. Yine, hücre membranındaki melatonin reseptörlerine ilaveten nukleusda da benzer reseptörlerin yer aldığı ve DNA üzerinde bir etki oluşturduğu ileri sürülmüştür19. 2.2.4. Melatoninin Serbest Radikal Giderici Etkisi Aeorobik solunum esnasında kullanılan oksijenin %1’i serbest radikal adı verilen ve ileri derecede reaktif olan hidroksil radikali (OH), hidrojen peroksit radikali (H2O2), süperoksit anyon radikali (O2-) yada tek değerlikli oksijen radikali (O2) adı verilen toksik maddelere dönüşmektedir. Bu radikallerden hidroksil radikali, hücre zarında bulunan membran fosfolipidleri ile lipid peroksidasyonu adı verilen bir reaksiyona girmek suretiyle, malondialdehit (MDA) adı verilen bir ürünün oluşmasına neden olmaktadır. Oksidatif stres adıyla da bilinen bu reaksiyon sonucu, hücre membranının stabilitesi bozulmakta ve hücre içinde fazla miktarda kalsiyum birikmesi neticesi hücre ölümü oluşmaktadır24,25. Öte yandan, vücutta serbest radikallerin neden olduğu değişik toksik durumların düzeltilmesi için enzimatik (sitokrom oksidaz, katalaz, glutatyon peroksidaz vb.) ya da non-enzimatik (vitamin E, vitamin C, vitamin A vb.) antioksidantlar görev yapmaktadır26,27,28,29. Melatonin, organizma için en zararlı radikal olan hidroksil radikalini ortadan kaldıran ve böylece de lipid peroksidasyonu reaksiyonunu engelleyen güçlü bir antioksidantdır29. Vücuda her yoldan uygulanabilen, hızla absorbe olabilen ve ileri derecede lipofilik özelliği nedeniyle tüm dokulara kolayca diffüze olabilen bir maddedir. Serbest radikal giderici etki için herhangi bir membran reseptörü bağlantısına ihtiyaç göstermediği iddia edilmektedir. Bu nedenle, melatonin diğer serbest radikal giderici antioksidantlardan çok daha güçlü bir madde olup, antioksidant özelliği glutatyondan 5 kez ve mannitolden ise 15 kez daha etkindir19. Melatonin hem hücre membranı ve hem de hücrenin nukleusunda serbest radikallere karşı sürekli bir şekilde savaş halindedir. Melatoninin oksidatif strese maruz bırakılan eritrositlerin içine girmek suretiyle hücreyi koruduğu saptanmıştır19. Yine nitrik oksit ve kainatın neden olduğu lipid peroksidasyonu da melatonin verilerek suprese edilmektedir30,31. İskemi-perfüzyon durumlarında da serbest radikal ve lipid peroksidasyonu oluşumunun melatonin verilerek önemli ölçüde azaltıldığı saptanmıştır32. 2.2.5. Melatoninin Klinik Etkileri Melatoninin doku rejenerasyonu üzerine olan olumlu etkilerinin değerlendirilmesi amacıyla değişik doku türleri kullanılmıştır33. Melatonin, doku rejenerasyonu ve hücresel mitotik aktivite üzerine hızlandırıcı bir etki göstermektedir. Diğer yandan, pinealektomi uygulanan hayvanlarda doku kollajen içeriğinde artış olmakta, melatonin verildiğinde ise kollajen yapımı suprese olmaktadır34. Melatoninin beyin fonksiyonları üzerinde depresif bir etki gösterdiği saptanmış olup analjezik bir etkisinin bulunduğu da ileri sürülmektedir35. Gama amino bütirik asit (GABA) üzerine etki etmek suretiyle homeostatik sistem kontrolünde rol almaktadır. Melatonin, hem hidroksil hem de peroksil radikallerini giderici antioksidant özelliğine bağlı analjezik, antikonvülzif ve depresif etkileri ile nöroprotektif bir ajandır36,37. Yapılan deneysel çalışmalarda, melatoninin osteoblastik aktiviteyi stimüle ettiği saptanmıştır38. Klinik olarak, postmenopozal dönemdeki kadınlarda osteoporoz gelişmesinin nedeni serum melatonin düzeyindeki düşüş olabilir. Yaşlılarda,radyolojik olarak saptanan pineal kalsifikasyon nedeniyle serum melatonin düzeyinde bir düşüşün ortaya çıkması sonucu osteoblastik aktivitenin azalması muhtemeldir19. İmmünitede rol oynayan değişik komponentlerin köken aldığı kemik iliğindeki hematopoietik hücreler sürekli bir şekilde çoğalarak farklılaşmaktadır. Değişik oksidatif stres durumlarında, kemik iliği ve dolayısıyla da immün sistem zarar görmektedir27. Kemik iliği hücrelerinde fazla miktarda melatonin bulunduğu ve immün hücrelerin zarar görmesini önleyici bir koruyuculuk görevi ve immün güçlendirici etkiye sahip olduğu saptanmıştır22,27. Kanserli hastalara melatonin vermek suretiyle, hastanın immünitesinin güçlendirilmesi sonucu kanserin ilerlemesinin durdurulabileceği konusundaki çalışmalar halen devam etmektedir3. Melatoninin anti-toksik19, antiepileptik39, hipotermik40 ve uyku ritmini düzenleyici etkileri de3,20 bulunmaktadır. Bundan başka melatoninin depresyon ve HIV enfeksiyonunun tedavisi, yaşlanmanın önlenmesi, gebelikten koruma gibi fonksiyonlarını araştıran çalışmalar da bulunmaktadır3. 2.2.6. Melatoninin Yan Etkileri Yapılan çalışmalarda, melatoninin çok yüksek dozlarda (300 mg/kg/gün’ü aşan) ve yıllarla ifade edilen uzun süreli kullanım durumlarında bile oldukça az yan etkisinin olduğu ve genel olarak iyi tolere edildiği saptanmış olup klinikte uykuya yardım ilacı olarak çok sık kullanılmaktadır3-19. Melatonin alındıktan sonraki gün taşikardi ve başağrısı ile bir miktar uyuşukluk bildirilmiştir. Psikoz ve hareket bozukluğu bildirilen sporadik vakalar da vardır3. 3. GEREÇ ve YÖNTEM 3.1. Kullanılan Deney Hayvanı ve Hayvan Bakımı Deneyde, ortalama ağırlıkları 170-220 gr olan Wistar tipi albino, ergin, erkek sıçanlar kullanıldı. Sıcaklık 22±2 °C’de sabit tutuldu. Havalandırma pencere tipi aspiratörle sağlandı. Odanın pencereleri siyah boyanmış olup, aydınlık karanlık döngüsü otomatik denetleyici bir aygıt ile 12 saat aydınlık 12 saat karanlık olacak şekilde ayarlandı (06.00-18.00 aydınlık, 18.0006.00 karanlık). Sıçanlar paslanmaz tel kapakları olan plastik kafesler içerisinde tutuldu. Kafeslerin içine altlık olarak talaş serildi ve talaşlar haftada bir değiştirildi. Hayvanlar hazır pellet yem ile beslenirken, su gereksinimlerinde çeşme suyu kullanıldı. Tüm hayvanların su ve besin alımları serbest olarak sağlandı. 3.2. Deneyin YapılıĢı Deney kapsamına 40 adet erkek sıçan alınarak her grupta 8 sıçan olmak üzere, 5 gruba ayrıldı. I. Grup; Kontrol grubu I olarak değerlendirildi ve 4 gün boyunca intraperitoneal olarak serum fizyolojik uygulandı. II. Grup; Kontrol grubu II olarak değerlendirildi ve 15 gün boyunca intraperitoneal olarak %2.5’luk etanol uygulandı. III. gruba %2.5’luk etanol içinde çözülen melatonin (Sigma) 6 mg/kg/gün dozunda 15 gün boyunca, IV. gruba serum fizyolojik içinde çözülen doksorubisin (Adriblastina-Carlo Erba) 3 mg/kg/gün dozunda 4 gün boyunca intraperitoneal olarak uygulandı. V. Gruba ise uygun çözücüler içerisinde çözülen melatonin + doksorubisin kombinasyon tedavisi uygulandı. Melatonin (6 mg/kg/gün) tedavisine doksorubisin (3 mg/kg/gün) tedavisinden 1 gün önce başlandı ve iki uygulama arasında 3 saatlik zaman farkı vardı. Melatonin sabah saat 09.00’da, doksorubisin saat 12.00’de uygulandı. Kombinasyon tedavisi 4 gün tekrarlandı ve daha sonra gruba 15 günü tamamlayacak şekilde melatonin verilmeye devam edildi. Tüm tedavinin sonunda anestezi altında tüm deneklerin kalbi eksize edildi. 3.3. Kalbin Eksizyonu Sıçanlara 10 mg/kg Ksilazin (Rompun %2’lik, Bayer) ve 80 mg/kg ketamin (Ketalar, Parke-Davis) intraperitoneal (i.p.) olarak verildi. Uyutulan sıçanlara torakotomi yapılarak perfüzyon için pembe uçlu intraket (16 F Gauge kateter) ile sol ventrikülden aortaya girildi ve sağ atrium kesildi. Perfüzyon sırasında, öncelikle dolaşımdaki kanı boşaltmak amacıyla %0.9’luk NaCI eriyiği ile 5 dakika yıkandı. Sağ atriumdan berrak serum fizyolojik gelince, perfüzyon solüsyonu olarak kullandığımız Karnovsky solüsyonu41 ile 15 dakika boyunca perfüzyon yapıldı. Perfüzyon işlemi bittikten sonra kalp eksize edilerek doku örnekleri alındı. Dokular elektron mikroskobik inceleme için %5’lik gluteraldehit, ışık mikroskobik inceleme için ise %10’luk formalin solüsyonu içerisine konularak takibe alındı. Ayrıca dokuda enzim analizi için her deneğin karaciğerinden bir parça alınarak serum fizyolojik içeren şişeler içerisine konuldu. 3.4. Enzim Analiz Yöntemi İçerisinde serum fizyolojik bulunan şişeler içerisine konulan karaciğer dokusu örnekleri buz içerisinde muhafaza edildi. Daha sonra serum fizyolojik içerisinden çıkarılan dokular tartıldı ve ağırlıklarına uygun oranlarda hazırlanan fosfat tamponu ile homojenize edilerek (homojenizat) santrifüj tüpü içerisine konuldu ve buz içerisinde muhafaza edildi. Daha sonra fosfat tamponu ile 1/10 oranında seyreltilen homojenizatlarda süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPx) ve malondialdehit (MDA) tayinleri yapıldı. 3.4.1. Süperoksit Dismutaz Analizi Homojenizatlarda, ksantin ve ksantin oksidaz kullanılarak oluşturulan süperoksit radikallerinin p-iyodonitrotetrazoliyum viyolet (INT) ile meydana getirdiği kırmızı renkli formazan boyasının optik dansitesinin okunması esasına dayanan randox kit yöntemi kullanılarak süperoksit dismutaz tayini yapıldı. Daha sonra ölçülen değerlerin hesaplamaları yapıldı. 3.4.2. Glutatyon Peroksidaz Analizi Hidrojen peroksit tarafından redükte glutatyonun (GSH) okside glutatyona (GSSG) yükseltgenme reaksiyonunu katalize eden glutatyon peroksidaz, bu reaksiyon sonucunda oluşan NADP’nin absorbansının (optik dansite) okunmasıyla tespit edildi. Daha sonra okunan değerlerin hesaplaması yapıldı. 3.4.3. Malondialdehit Analizi Homojenatın, aeorobik koşullarda, pH:3.4 de tiobarbitürik asit ile 95 C0 de inkübasyonu sonucu oluşan pembe renkli kompleksin optik dansitesinin ölçümüyle malondialdehit miktarı saptandı ve hesaplamaları yapıldı. 3.5. IĢık Mikroskobik Doku Hazırlama Yöntemi42 %10’luk formalin solüsyonu42 içerisine alınan kalp dokuları 72 saat süreyle tespit edildi. Daha sonra dokular formalinin dokudan uzaklaştırılması amacıyla yıkandı ve rutin olarak uygulanan doku takibi yöntemi ile takip edildi. 3.5.1. Doku Takip ĠĢlemi 1.Etil Alkol (%80) 30 dakika 2.Etil Alkol (%95) 2 saat 3.Etil Alkol (%95) 1 saat 4.Etil Alkol (%100) 1 saat 5.Etil Alkol (%100) 1 saat 6.Etil Alkol (%100) 1 saat 7.Ksilol 1 saat 8.Ksilol 1 saat 9.Ksilol 2 saat 10.Parafin 2 saat 11.Parafin 2 saat 12.Parafin 2 saat 13.Bloklama Blok haline getirilen dokulardan mikrotom ile 4 µ kalınlığındaki kesitler lam üzerine alındı, hematoksilen eozin ile boyanarak Nikon marka ışık mikroskobunda incelendi ve Nikon Coolpix 995 digital kamerada resimleri çekildi. 3.6. Elektron Mikroskobik Doku Hazırlama Yöntemi43 Millonig fosfat tamponu44 ile hazırlanmış %5’lik gluteraldehit tespit solüsyonu içerisine alınan dokular, 1 saat sonra dişçi mumu ile kaplanmış petri kutuları içerisinde bistüri yardımı ile 1 mm3 büyüklüğünde parçalara ayrılarak toplam 4 saat süre ile tespit edildiler. Milloning fosfat tamponu ile çalkalanan bu dokular 1 gece bu tampon solüsyonu içinde bekletildiler. 2. gün dokular %1’lik Osmium tetroksit (OsO4) solüsyonu ile ikinci kez tespit edildi ve tespit sonrasında dokular Millonig fosfat tamponu ile 10’ar dakika iki kez yıkandı ve ikinci tespitten sonra derecesi giderek artan alkol serilerinden geçirilerek dehidratasyon işlemi yapıldı (Tablo 1). Son %100’lük alkol değişimine kadar solüsyonlar +4°C’de saklandı. Sonraki işlemler oda ısısında gerçekleştirildi. Tablo 1. Elektron mikroskobik doku takip yöntemi Süre (dakika) Sıcaklık (°C) %50 Etil Alkol 15 +4 %70 Etil Alkol 15 +4 %86 Etil Alkol 15 +4 %96 Etil Alkol 15 +4 %100 Etil Alkol 10 +4 %100 Etil Alkol 10 +4 %100 Etil Alkol 10 Oda ısısında Propilen Oksit 15 Oda ısısında Propilen Oksit 15 Oda ısısında Dehidratasyon işleminden sonra doku parçaları; Bir kısım propilen oksit + bir kısım gömme materyali 30 dakika Bir kısım propilen oksit + bir kısım gömme materyali 30 dakika olacak şekilde immerse edildi. Bu işlemden sonra doku parçaları yeni hazırlanmış gömme materyali içerisinde bir gece döndürücüde karıştırıldı. Gömme Materyali: Araldite CY 212 20 ml Sertleştirici HY 964 20 ml Hızlandırıcı DY 064 0.6 ml Plastikleştirici (Dibutul fitalat) 1.0 ml Gömme materyali olarak kullanılan maddeler belirtilen ölçülerde cam kaba aktarılarak 10-15 dakika karıştırıcıda döndürüldü ve hava kabarcıkları giderildikten sonra kullanıldı. Ertesi sabah doku parçaları, yeni hazırlanmış gömme materyali kullanılarak 00 polietilen beem kapsüllere gömüldü ve 60°C’deki etüvde 48 saat süreyle polimerize edildi. Elde edilen bloklardan Reichart Ultracut S ultramikrotom ile cam bıçak kullanılarak alınan yarı ince kesitler toluidin mavisi ile boyandı ve ışık mikroskobunda incelendi. Işık mikroskobik inceleme sonucu belirlenen bloklardan alınan 500 A0 kalınlığındaki ince kesitler 300-500 gözenekli bakır gridlerde toplandı, %70’lik etil alkolde doymuş uranil asetat ve Reynolds’un kurşun sitrat (Lead sitrat) solüsyonları ile boyandı ve Zeiss E.M. 10 B elektron mikroskobu ile incelendi. Resimler ince Forte kartlara basıldı. 3.7. Ġstatistiksel Analiz Gruplar arası karşılaştırma tek yönlü varyans analizi (one way ANOVA) ile istatistiksel olarak değerlendirildi. Karşılaştırma Student-Newman-Keuls testine göre yapıldı. 0.05’ten küçük p değerleri anlamlı olarak kabul edildi (p<0.05). Değerler aritmetik ortalama (X) ± standart hata (SE) şeklinde ifade edildi. 4. BULGULAR 4.1. Enzim Analizleri Tablo 2. Kontrol ve deney gruplarına ait enzim analiz sonuçları Malondialdehit ( nmol / ml ) X ± SE I . Grup ( kontrol I ) n=6 II . Grup ( kontrol II ) n=6 III . Grup ( melatonin ) n=6 IV . Grup ( Doksorubisin ) n=6 V . Grup ( Doksorubisin + melatonin ) n = 6 Süperoksit dismutaz Glutatyon peroksidaz ( ü / gprotein ) ( ü / gprotein ) X ± SE X ± SE 5.51 ± 0.43 360.00 ± 22.46 222.83 ± 43.66 3.57 ± 0.81 280.83 ± 35.87 176.00 ± 15.47 4.67 ± 0.43 2937.17 ± 382.12 c 219.50 ± 32.07 14.22 ± 4.25 a 369.28 ± 120.03 52.03 ± 11.50 a 5.85 ± 1.10 b 2486.15 ± 564.70 d 72.23 ± 12.06 e I.Grup: İntraperitoneal olarak serum fizyolojik uygulanan deney grubu (Kontrol I) II.Grup: İntraperitoneal olarak %2.5 etanol uygulanan deney grubu (Kontrol II) III.Grup: İntraperitoneal olarak 6 mg/kg/gün melatonin uygulanan deney grubu IV.Grup: İntraperitoneal olarak 3 mg/kg/gün doksorubisin uygulanan deney grubu V.Grup: İntraperitoneal olarak 6 mg/kg/gün melatonin ile birlikte 3 mg/kg/gün doksorubisin uygulanan deney grubu a; kontrol I’e göre anlamlılığı ifade etmektedir, b; doksorubisin grubuna göre anlamlılığı ifade etmektedir, c; kontrol II’ye göre anlamlılığı ifade etmektedir, d; doksorubisin grubu, kontrol I ve kontrol II’ye göre anlamlılığı ifade etmektedir, e; melatonin grubu, kontrol I ve kontrol II’ye göre anlamlılığı ifade etmektedir (a,b,c,d ve e: p<0.05 anlamlı olarak kabul edilmiştir). Doksorubisinin çözücüsü olarak kullanılan serum fizyolojiğin uygulandığı kontrol grubu (kontrol I), melatoninin çözücüsü olarak kullanılan %2.5 etanolun uygulandığı kontrol grubu (kontrol II) ve melatonin uygulanan deney grubuna ait doku örneklerinde saptanan malondialdehit değerleri arasında anlamlı bir fark bulunmadı. Doksorubisin uygulanan deney grubunda saptanan malondialdehit değerleri, kontrol grupları (kontrol I ve II), melatonin grubu veya doksorubisin ve melatoninin kombine uygulandığı grup değerleri ile karşılaştırıldığında anlamlı bir artma gözlendi (p<0.05). Doksorubisin ve melatoninin kombine uygulandığı deney grubunda saptanan malondialdehit değerleri, doksorubisin uygulanan deney grubunda saptanan malondialdehit değerleri ile karşılaştırıldığında anlamlı bir azalma gözlendi (p<0.05). Ayrıca doksorubisin ve melatoninin kombine uygulandığı deney grubunda saptanan malondialdehit değerleri ile kontrol grupları (kontrol I ve II) ve melatonin grubunda saptanan malondialdehit değerleri arasında anlamlı bir fark görülmedi (Tablo 2). Sonuç olarak melatoninin doksorubisin etkisi ile oluşan lipid peroksidasyonundaki artışı düzelttiği gözlendi. Kontrol grupları (kontrol I ve II) ile doksorubisin uygulanan deney grubuna ait doku örneklerinde saptanan süperoksit dismutaz değerleri arasında anlamlı bir fark bulunmadı. Ancak melatonin uygulanan deney grubu ve kombine olarak melatonin ile doksorubisinin uygulandığı deney grubunda saptanan süperoksit dismutaz değerleri, kontrol grupları (kontrol I ve II) ve doksorubisin grubunda saptanan süperoksit dismutaz değerleri ile karşılaştırıldığında anlamlı bir artma gözlendi (p<0.05) (Tablo 2). Kontrol grupları (kontrol I ve II) ile melatonin uygulanan deney grubuna ait doku örneklerinde saptanan glutatyon peroksidaz değerleri arasında anlamlı bir fark bulunmadı. Ancak doksorubisin uygulanan deney grubu ve kombine olarak doksorubisin ile melatonin uygulanan deney grubunda saptanan glutatyon peroksidaz değerlerinde, kontrol grupları (kontrol I ve II) ve melatonin uygulanan deney grubunda saptanan değerlere göre anlamlı bir azalma gözlendi (p<0.05). Tek başına doksorubisin uygulanan deney grubu ile doksorubisin ve melatoninin kombine olarak uygulandığı deney grubunda saptanan glutatyon peroksidaz değerleri arasında anlamlı bir fark görülmedi (Tablo 2). Sonuç olarak melatoninin, doksorubisin etkisi ile oluşan glutatyon peroksidaz seviyelerindeki azalmayı düzeltmediği gözlendi. 4.2. IĢık Mikroskobik Bulgular Serum fizyolojik uygulanan kontrol grubu, %2.5 etanol uygulanan kontrol grubu ve 6 mg/kg/gün melatonin uygulanan deney grubuna ait Hematoksilen-Eozin ile boyanmış kesitlerin incelenmesi sonucu kalp kası hücrelerinin ve merkezi yerleşimli hücre çekirdeklerinin normal yapıda oldukları, miyofibrillerin düzenli bir dizilim gösterdikleri izlenmekteydi (Şekil 1,2,3). 3 mg/kg/gün doksorubisin uygulanan deney grubunda kalp kası hücrelerinde dejeneratif değişikliklerin oluştuğu, miyofibrillerin düzenli diziliminin bozulduğu ve yer yer parçalandıkları dikkati çekmekteydi (Şekil 4,5). Doksorubisin ile birlikte melatoninin verildiği deney grubunda ise kalp kası hücrelerinde doksorubisin grubunda gözlenen dejeneratif değişikliklerin azaldığı, miyofibrillerin doksorubisin grubuna kıyasla düzenli bir dizilim gösterdikleri izlenmekteydi (Şekil 6,7). 4.2.1. IĢık Mikroskobik ġekiller ġekil 1. I. Grup. Merkezi yerleşimli hücre çekirdekleri (ok) ve normal yapıda miyofibrillere sahip kalp kası hücreleri gözlenmektedir. H.E. x40. ġekil 2. II. Grup. Düzenli dizilim gösteren miyofibrillere sahip kalp kası hücreleri izlenmektedir. H.E. x40. ġekil 3. III. Grup. Kalp kası hücrelerinin normal histolojik özellikte miyofibrillere sahip oldukları gözlenmektedir. H.E. x40. ġekil 4. IV. Grup. Kalp kası hücrelerinde miyofibrillerin parçalandığı (ok) izlenmektedir. H.E. x40. ġekil 5. IV. Grup. Kalp kası hücrelerinde miyofibrillerin düzenli diziliminin bozulduğu görülmektedir. H.E. x40. ġekil 6. V. Grup. Kalp kası hücrelerinde miyofibrillerin normal yapılarını korudukları izlenmektedir. H.E. x40. ġekil 7. V. Grup. Merkezi yerleşimli hücre çekirdekleri (ok) ve normal organizasyon gösteren miyofibrillere sahip kalp kası hücreleri gözlenmektedir. H.E. x40. 4.3. Elektron Mikroskobik Bulgular I.Grup Serum fizyolojik uygulanan grupta, kalp kası hücrelerinin ince bir sarkolemma ile sarılı olduğu görülmekteydi. Sarkoplazmada birbirine paralel olarak dizilim gösteren miyofibriller normal sarkomer düzenlenmesine sahiplerdi. Kas liflerinin arasında elektron dens görünümlü diskus interkalarisler yer almaktaydı (Şekil 8). Sarkoplazmada çok sayıda yuvarlak ya da oval şekilli mitokondriyonların bulunduğu ve bu mitokondriyonların membranlarının ve matrikslerinin normal yapıda olduğu izlenmekteydi. Çekirdek ince, uzun yapıda olup düzenli sınırlara ve normal kromatin dağılımına sahipti. Çekirdek elektron dens görünümlü bir ya da iki adet çekirdekçiğe sahipti (Şekil 9). Miyofibrillerin arasında sarkoplazmik retikuluma ait tübül yapıları gözlenmekte ve sarkoplazma içerisinde yer yer lipid damlacıklarına rastlanmaktaydı. Ayrıca miyofibrillerin arasında dağınık bir halde elektron dens yapıda glikojen partikülleri bulunmaktaydı (Şekil 8,9). Kas lifleri ince bir bağ dokusundan oluşan endomisyum ile çevrelenmişti ve burada yerleşim gösteren kan damarları ile bunları döşeyen endotel hücrelerinin normal yapıda oldukları gözlenmekteydi (Şekil 10). II.Grup %2.5’luk etanol uygulanan grupta, kalp kası hücrelerinin normal sarkomer düzenlenmesine sahip oldukları ve özelleşmiş bağlantı komplekslerini içeren elektron dens görünümlü diskus interkalarisler aracılığıyla birbirleri ile bağlanmış oldukları izlenmekteydi (Şekil 11). Sarkoplazma içerisinde merkezi yerleşim gösteren ovoid şekilli hücre çekirdeklerinin normal yapıda oldukları gözlenmekteydi. Çekirdeklerin sınırları düzenli, kromatin dağılımları ise normaldi. Çekirdek içerisinde elektron dens yapıda çekirdekçik yer almaktaydı (Şekil 12). Sarkoplazmanın miyofilamentlerinden birbirine oluşan paralel miyofibriller olarak ile düzenlenmiş, doldurulmuş aktin olduğu ve miyozin gözlenmekteydi. Miyofibrillerin arasında yuvarlak ya da oval şekilli çok sayıda mitokondriyonun yerleşim gösterdiği ve bu mitokondriyonların normal yapıda krista ve membranlara sahip oldukları izlenmekteydi. Ardarda dizilmiş değişik büyüklükteki mitokondriyonların matriks dansitelerinin de normal olduğu görülmekteydi (Şekil 12). Miyofibrillerin arasında sarkoplazmik retikuluma ait tübül yapıları ve dağınık bir şekilde yerleşim gösteren küçük, elektron dens glikojen partikülleri yer almaktaydı. Sarkoplazma içerisinde seyrek olarak lipid damlacıklarına rastlanmaktaydı (Şekil 13). Kalp kası hücreleri normal yapıda ince bir sarkolemmaya sahipti ve bu hücreler küçük kan damarlarını ve retiküler lifleri içeren ince bağ dokusu yapısındaki endomisyum ile sarılıydılar (Şekil 11). III.Grup 6 mg/kg/gün dozunda melatonin uygulanan grupta, geniş bir sarkoplazmaya sahip olan kalp kası hücreleri ince bir sarkolemma ile sarılmıştı (Şekil 14) ve bu hücrelerin arasında retiküler liflerden zengin, küçük kan damarlarını içeren ince bir bağ dokusu bulunmaktaydı (Şekil 15). Sarkoplazma çok sayıda sferikal ya da ovoid şekilli mitokondriyon içermekteydi. Sarkoplazma içerisinde yerleşim gösteren miyofibriller birbirlerinden sıralar halinde dizilen mitokondriyonlar ile ayrılmışlardı. Mitokondriyonların normal yapıda membranlara sahip olduğu ve aralarında yer yer lipid damlacıklarının bulunduğu görülmekteydi (Şekil 15). Kalp kası hücreleri normal sarkomer düzenlenmesine sahiplerdi. Sarkoplazmayı dolduran miyofibrillerin, içerdikleri aktin ve miyozin miyofilamentleri tarafından oluşturulan düzenli açık ve koyu bantlar şeklinde enine çizgilenme gösterdikleri izlenmekteydi. Komşu kalp kası hücreleri arasında elektron dens görünümlü diskus interkalarisler bulunmaktaydı (Şekil 14,15). Sarkoplazma içerisinde merkezi yerleşim gösteren ince, uzun, ovoid şekilli hücre çekirdeği normal kromatin dağılımına, çekirdek zarına ve çekirdekçiğe sahipti (Şekil 16). Bazı mikrograflarda mitokondriyonlar arasında birkaç lipofuksin granülü yer almaktaydı (Şekil 15). Sarkoplazmada miyofibrillerin arasında dağınık halde, elektron dens görünümlü, ince tanecikler halinde glikojen granülleri ve sarkoplazmik retikuluma ait tübüler yapılar yerleşim göstermekteydi (Şekil 14,16). IV.Grup 3 mg/kg/gün dozunda doksorubisin uygulanan grupta, kalp kası hücrelerinin genellikle normal sarkomer düzenlenmesine sahip oldukları gözlenmekteydi. Bu hücrelerde düzenli bir dizilim gösteren aktin ve miyozin filamentleri birbirini izleyen koyu ve açık alanlar şeklindeki A ve I bandlarını oluşturmuşlardı. Komşu kalp kası hücreleri arasında bağlantı kompleksleri içeren elektron dens görünümlü diskus interkalarisler izlenmekteydi (Şekil 17,18). Merkezi yerleşim gösteren hücre çekirdeklerinin genellikle normal yapıda oldukları görülmekteydi. Ovoid şekilli çekirdeklerin sınırları düzgün olup kromatin dağılımları normaldi (Şekil 19). Miyofibriller arasında sarkoplazmik retikuluma ait tübül yapıları ve ince tanecikler şeklinde çok sayıda glikojen partikülleri yer almaktaydı (Şekil 18). Mikrograflarda mitokondriyonlarda yapısal değişikliklerin belirgin olduğu dikkati çekmekteydi (Şekil 20,21). Sayıca artmış olan mitokondriyonlar miyofibriller arasında birbirini izleyen uzun sıralar şeklinde yer almaktaydılar. Bazı bölgelerde ise sarkoplazmayı dolduran geniş topluluklar oluşturmuşlardı. Mitokondriyonlarda matriks dansitesi oldukça artmıştı, yuvarlak ve oval şekilli mitokondriyonlar yanında değişik şekilli çok sayıda mitokondriyonlar da görülmekteydi. Ayrıca mitokondriyonların hacimlerinde belirgin artış olduğu ve miyofibriller arasında çok sayıda dev yapılı mitokondriyonun bulunduğu da dikkati çekmekteydi. Şekil ve hacim değişikliklerinin yanısıra bazı hücrelerde mitokondriyonlarda dejeneratif değişiklikler de gözlenmekteydi. Bu mitokondriyonların matrikslerinin lizise uğradığı, kristalarının parçalandığı ve buna bağlı olarak yer yer krista artıklarını içeren vakuoler bir görünüm kazandıkları izlenmekteydi (Şekil 20,21). Mitokondriyal harabiyetin belirgin olduğu kas hücrelerinde normal sarkomer düzenlenmesinin bozulduğu, Z çizgilerinde koyulaşma olduğu, miyofibrillerin parçalandığı ve bazı bölgelerde ince ve kalın filamentlerin simetrik diziliminin bozulmasıyla birlikte iki Z çizgisi arasındaki bantlaşmanın kaybolarak homojen bir görünüm kazandığı ve bazı bölgelerde de sarkolemma bütünlüğünde bozulma olduğu gözlenmekteydi (Şekil 21). Bu bölgelerde çok sayıda değişik büyüklükte membranla çevrili lipid damlacıklarının tek veya kümeler oluşturacak şekilde yer aldıkları görülmekteydi. Dejenerasyonun belirgin olduğu hücrelerde sarkoplazma içerisinde litik alanların oluştuğu (Şekil 21), mitokondriyonlar arasında iç içe kıvrılmış zarlar şeklinde membranöz yapıların bulunduğu ve diskus interkalarislerde de yapısal değişikliklerin meydana geldiği dikkati çekmekteydi (Şekil 18). Bazı mikrograflarda sarkoplazma içerisinde küçük kümeler ya da kalın bantlar oluşturacak şekilde dağılım gösteren filamentöz yapılar bulunmaktaydı. Filamentöz birikimin olduğu bölgelerde sitoplazmik yapının bozulduğu izlenmekteydi (Şekil 17,19,22). Hücreler arası bölgedeki bağ dokusu içerisinde yerleşen kan damarlarının kontrol grupları ile karşılaştırıldığında normal yapılarını kaybettikleri dikkati çekmekteydi (Şekil 20). Bazı mikrograflarda hücreler arası bölgede kollajen lifler artarak kalın demetler oluşturmuşlardı (Şekil 23). V.Grup Doksorubisin + Melatonin kombinasyon tedavisi uygulanan grupta, kalp kası hücreleri genel olarak normal sarkomer yapısına sahiplerdi. Sarkoplazma birbirine paralel olarak seyreden miyofibrillere sahipti ve bu miyofibrillerin aralarında sıralar halinde mitokondriyonlar yerleşim göstermekteydiler (Şekil 24). Sarkoplazma içerisinde yer yer lipid damlacıklarına rastlanmakla birlikte, doksorubisin uygulanan deney grubuna ait kesitler ile karşılaştırıldığında lipid miktarının oldukça azaldığı dikkati çekmekteydi (Şekil 25). Miyofibriller arasında dağınık halde küçük elektron dens glikojen partikülleri ve sarkoplazmik retikuluma ait tübül yapıları izlenmekteydi. Hücre çekirdeği genel olarak ince, uzun görünümdeydi ve normal kromatin dağılımına sahipti (Şekil 25,26). Komşu kalp kası hücreleri arasında, bağlantı komplekslerini içeren elektron dens görünümlü diskus interkalarisler bulunmaktaydı (Şekil 26). Kalp kası hücrelerinin genel olarak normal yapıda ince bir sarkolemmaya sahip olduğu gözlenmekteydi (Şekil 25). Bazı kalp kası hücrelerinde mitokondriyonlarda sayıca artış gözlenmekteydi. Ancak bu hücrelerde mitokondriyonlar ardarda uzun sıralar halinde dizilmekle birlikte, doksorubisin grubunda rastlanan geniş topluluklar yerine yer yer küçük gruplar oluşturmuşlardı. Genel olarak pleomorfizm gösteren mitokondriyonlara ve büyük hacimli mitokondriyonlara daha az rastlanmaktaydı (Şekil 24,26). Bazı mikrograflarda mitokondriyal membranlarda parçalanma ve dejeneratif değişiklikler görülmekle beraber bunun doksorubisin grubuna kıyasla oldukça azaldığı dikkati çekmekteydi (Şekil 27). Bu bölgelerde mitokondriyal dejenerasyona bağlı vakuoler oluşumlar gözlenmekte ve sarkolemmanın yer yer küçük alanlarda düzensizlik göstermekle beraber genellikle normal yapıda olduğu izlenmekteydi (Şekil 27). Mitokondriyal dejenerasyonun bulunduğu hücrelerde doksorubisin grubunda gözlenen miyofibril dejenerasyonu bulunmamakta olup normal sarkomer düzenlenmesi korunmaktaydı. Hücreler arasında retiküler lifler içeren ince bir bağ dokusunun bulunduğu ve burada yer alan mikropinositotik vesiküllerden zengin endotel hücreleriyle döşeli kapillerlerin genellikle normal yapılarını korudukları görülmekteydi (Şekil 27). 4.3.1. Elektron Mikroskobik ġekiller ġekil 8. I. Grup. Diskus interkalarislerle (D) birbirlerine bağlanmış normal sarkomer düzenlenmesine sahip kalp kası hücreleri izlenmektedir. Mitokondriyonlar (M), sarkolemma (Sl). 16.100. ġekil 9. I. Grup. Aralarında çok sayıda mitokondriyon (M) ve glikojen partikülleri (Gl) bulunan miyofibriller ve normal yapıda hücre çekirdeği (Ç) izlenmektedir. 16.000. ġekil 10. I. Grup. Kalp kası hücreleri arasında yerleşim gösteren normal yapıda kapiller (Kap), sarkolemma (Sl) altında yerleşim gösteren mitokondriyonlar (M) ve hücre çekirdeği (Ç) görülmektedir. 16.100. ġekil 11. II. Grup. Normal sarkomer düzenlenmesine sahip kalp kası hücreleri ve bunları birbirine bağlayan diskus interkalarisler (D) gözlenmektedir. Mitokondriyon (M), kapiller (Kap). 12.400. ġekil 12. II. Grup. Merkezi yerleşimli, normal kromatin dağılımına sahip hücre çekirdeği (Ç) ve miyofibriller arasında değişik büyüklükte mitokondriyonlar (M) görülmektedir. 12.400. ġekil 13. II. Grup. Miyofibriller arasında değişik büyüklükte pleomorfik mitokondriyonlar (M) ve merkezi yerleşim gösteren hücre çekirdeği (Ç) görülmektedir. 8.100. ġekil 14. III. Grup. İnce bir sarkolemma ile sarılı (Sl), normal sarkomer düzenlenmesine sahip, diskus interkalarislerle (D) bağlanmış kalp kası hücreleri ve mitokondriyonlar (M) görülmektedir. 10.100. ġekil 15. III. Grup. Miyofibriller arasında yerleşim gösteren normal yapıda mitokondriyonlar (M), lipofuksin granülleri (Lg) ve hücreler arası bölgede kapiller (Kap) izlenmektedir. Hücre çekirdeği (Ç), diskus interkalaris (D). 8.100. ġekil 16. III. Grup. Normal kromatin dağılımına sahip oval şekilli hücre çekirdeği (Ç), aralarında mitokondriyonların (M) bulunduğu düzenli miyofibriller izlenmektedir. 10.100. ġekil 17. IV. Grup. Miyofibriller arasında lipid damlacıkları (L), elektron dens mitokondriyonlar (M) ve filamentöz bant yapıları (Fil) dikkati çekmektedir. Diskus interkalaris (D). ×20.000. ġekil 18. IV. Grup. Miyofibriller arasında çok sayıda elektron dens mitokondriyonların (M), lipid damlacıklarının (L) ve membranöz yapıların (My) bulunduğu, diskus interkalaris (D) yapılarının bozulduğu görülmektedir. ×12.400. ġekil 19. IV. Grup. Çekirdek yakınında (Ç) yerleşim gösteren filamentöz bantlar (Fil), miyofibriller arasında değişik büyüklükte lipid damlacıkları (L) ve mitokondriyonlar (M) görülmektedir. ×16.100. ġekil 20. IV. Grup. Parçalanmış miyofibriller arasını dolduran litik mitokondriyonlar (M), lipid damlacıkları (L), hücreler arası bölgede kapillerlerde (Kap) harabiyet dikkati çekmektedir. ×8.100. ġekil 21. IV. Grup. Kalp kası hücresinde sarkolemma (Sl) yapısının ve sarkomer düzenlenmesinin bozulduğu, miyofibrillerin parçalandığı ve litik alanların bulunduğu (*), Z çizgisinde koyulaşma olduğu (Z) görülmektedir. Lipid damlacıkları (L), dev mitokondriyonlar (DM). ×12.400. ġekil 22. IV. Grup. Filamentöz bantların (Fil) sarkoplazmayı tamamen doldurduğu ve bu bölgede miyofibrillerin ve hücre organellerinin bulunmadığı gözlenmektedir. ×6.300. ġekil 23. IV. Grup. Kalp kası hücreleri arasında kollajen liflerde (Kol) aşırı artma ve miyofibriller arasında büyük hacimli elektron dens mitokondriyonlar ( M ) gözlenmektedir. ×12.400. ġekil 24. V. Grup. Aralarında çok sayıda mitokondriyonlar (M) bulunan ve düzenli bir dizilim gösteren miyofibriller (ok) izlenmektedir. Kapiller (Kap). ×6.300. ġekil 25. V. Grup. Çok sayıda mitokondriyon (M), birkaç lipid damlacığı (L) içeren kalp kası hücrelerinin ince bir sarkolemma (Sl) ile sarılı olduğu ve hücreler arasında ince kollajen lif bantlarının (Kol) bulunduğu görülmektedir. Çekirdek (Ç). ×12.400. ġekil 26. V. Grup. Normal yapıda hücre çekirdeği (Ç), değişik şekil ve büyüklükte mitokondriyonlar (M) ve hücreler arası bağlantıyı sağlayan diskus interkalarisler (D) görülmektedir. ×10.000. ġekil 27. V. Grup. Normal sarkomer düzenlenmesine sahip kalp kası hücresinde bazı mitokondriyonlarda (M) dejenerasyon ve vakuoler yapılar (V) görülmektedir. Kapiller (Kap). ×12.400. 5. TARTIġMA Antrasiklin grubu antibiyotiklerden olan doksorubisin güçlü etkili ve geniş spektrumlu bir antineoplastik ilaç olmakla birlikte, geri dönüşümsüz dilate kardiyomiyopati ve konjestif kalp yetmezliği ile karakterize doza bağımlı kardiyak toksisite oluşturması nedeniyle klinik kullanımı sınırlıdır8,16,45. Doksorubisin tedavisi alan hastalarda ve deneysel olarak doksorubisin uygulanan hayvanlarda ilaca bağlı olarak gelişen akut ve kronik kardiyovasküler değişiklikler tanımlanmıştır46. Doksorubisinin miyokardda oluşturduğu akut ve kronik zedelenme birkaç temel etkiye bağlıdır. Bunlar sarkolemmal sodyum/kalsiyum alış verişinin bozulması (özellikle akut kardiyotoksik etkide rol oynar), miyokard hücrelerinin enerji metabolizmasının bozulması ve doksorubisine bağlı olarak çok miktarda serbest oksijen radikalinin oluşmasıdır1. Doksorubisin serbest oksijen radikallerinin oluşumuna sebep olmakta ve bu yolla lipid peroksidasyonuna ve hücre membranı bütünlüğünde değişikliğe yol açmaktadır9. Bundan dolayı son zamanlarda doksorubisinin kardiyotoksik etkisini azaltmak ve bu şekilde klinik yararlığını arttırmak için doksorubisin ile birlikte antioksidan bir ajanın kullanımı ile ilgili araştırmalar yapılmış olmuştur olup, bu konuda 2,5,7,12,14,16,17,47,48,49,50,51 üzerinde çalışılan ajanlardan birisi de melatonin . Çalışmamızda doksorubisin uyguladığımız deney grubuna ait sıçanların kalp kası hücrelerinde özellikle mitokondriyonlarda yapısal değişikliklerin belirgin olduğu dikkati çekmektedir. Mitokondriyonlarda sayı artışı, belirgin şekil ve hacim değişiklikleri, matriks dansitesinde artış gözlenmekte olup, dejenerasyonun fazla olduğu hücrelerde mitokondriyonların matrikslerinin lizise uğradığı ve kristalarının parçalandığı izlenmektedir (Şekil 20,21). Mitokondriyonlarda meydana gelen bu yapısal değişikliklerde doksorubisinin etkisi ile oluşan serbest radikallerin rolü olduğu ve serbest radikallerin mitokondriyal membranlarda lipid peroksidasyonuna yol açmaları sonucunda mitokondriyal yapı ve fonksiyonların bozulduğu düşünülmektedir. Hücrenin enerji gereksinimini karşılayan ve sayıları enerji ihtiyacına göre hücreden hücreye değişen organeller olan mitokondriyonlarda lipid peroksidasyonu neticesinde membran stabilitesi ve permeabilitesi bozulmakta olup bu durum oksidatif fosforilasyon ve ATP üretimi için gerekli enzimatik aktivitelerde azalmaya yol açmaktadır. Bunun sonucunda hücrede gerçekleşen tüm metabolik reaksiyonlar azalmakta ve bu durum hücrenin giderek ölümüne neden olmaktadır. Çalışmamızda gözlemlediğimiz, mitokondriyonların sayılarında ve hacimlerinde meydana gelen artışın hücrenin metabolik aktivitesini gerçekleştiren tüm reaksiyonların gerektirdiği enerjinin karşılanabilmesi için hücrenin kompansatuar bir cevabı olabileceği düşünülmektedir. Gerçekten de doksorubisinin miyokard hücrelerinde oluşturduğu mitokondriyal değişiklikleri inceleyen bazı çalışmalarda, doksorubisin tarafından stimüle edilen serbest radikal metabolitlerinin üretiminin mitokondriyal membranlarda lipid peroksidasyonuna yol açtığı52, doksorubisinin mitokondri içerisinde gerçekleşen oksidatif fosforilasyona etki etmesi ile respiratuar aktivitenin53,54 ve hücre içi ATP seviyesinin azaldığı55 rapor edilmiştir. Wassermann ve arkadaşları8, yaptıkları deneysel çalışmada doksorubisin ile tedavi edilen sıçanlarda mitokondriyonlarda hipertrofi ayrıca matriks volümünde meydana gelen artışa bağlı olarak yüksek dansiteli mitokondriyonlar ve dış kompartmanda daralma saptamışlardır. Mitokondriyal yapı ve fonksiyon birbirleri ile yakından ilişkilidir. Nicolay ve arkadaşları56, yaptıkları deneysel çalışmada fluoresans mikroskop ile doksorubisinin mitokondriyonlara bağlandığını ve kardiyak enerji metabolizmasının direkt olarak doksorubisin-mitokondriyon etkileşimine bağlı olarak önemli bir şekilde etkilendiğini saptamışlardır. Ultrastrüktürel olarak mitokondriyonlarda şişme gözlemişler ve doksorubisine bağlı olarak gelişen kardiyotoksisitede, doksorubisinin mitokondriyonlarda oluşturduğu fonksiyon bozukluğunun etkisinin büyük olduğunu belirtmişlerdir. Yanlızca iç mitokondriyal membranda yerleşim gösteren ve burada lipidlerin %20 kadarını oluşturan bir fosfolipid olan kardiyolipin, doksorubisinin majör hedefidir8,56. Doksorubisinin amino grubunun pozitif olarak yüklenmesi karşısında kardiyolipin negatif olarak yüklenmeye yüksek afinite gösterir52,56. Sonuçta güçlü ve spesifik bir kompleks oluşur ve bu reaksiyon muhtemelen geri dönüşümsüzdür8,56. Zhou ve arkadaşları9, doksorubisinin neden olduğu kardiyotoksisitede primer sebebin mitokondriyal kalsiyum regülasyonundaki bozulma olduğunu belirtmişlerdir. Yaptıkları deneysel çalışmada doksorubisin tedavisi uygulanan sıçanların kalp kası hücrelerinde mitokondriyonlarda ultrastrüktürel olarak şişme, erime ve kristalarda düzensizlik şeklinde mitokondriyal hasar saptamışlardır. Doksorubisin tarafından serbest radikal üretiminin artışı neticesinde mitokondriyal porlarda oksidatif değişikliklerin oluştuğu, ADP/ATP translokaz içeriğinde azalmanın olduğu ve tüm bunların neticesinde de mitokondriyal kalsiyum yükleme kapasitesinde doza bağımlı ve geri dönüşümsüz azalma oluştuğunu belirtmişlerdir. Doksorubisin uyguladığımız deney grubunda gözlenen dev mitokondriyonların (Şekil 21), ATP üretiminde serbest radikaller aracılığıyla oluşan azalma neticesinde, hücre içi reaksiyonların gerçekleşmesi için gereken enerji ihtiyacını karşılamaya yönelik bir yanıt olarak meydana geldiği düşünülebilir. Ayrıca komşu mitokondriyonların füzyona uğrayarak mitokondriyal oksijen tüketimini azalttıkları ve böylece serbest oksijen radikallerinin oluşumunu kısıtladıkları da ileri sürülebilir. Gerçektende Wakabayashi ve arkadaşları57, megamitokondriyon oluşumunda serbest radikallerin oluşturduğu oksidatif stresin önemli bir rol oynadığını rapor etmişlerdir. Serbest radikal oluşumunu arttıran bazı ajanların kullanımı neticesinde lipid peroksidasyonunun kayda değer derecede arttığı gösterilmiş olup, bunun mitokondriyal membranlarda morfolojik ve biyokimyasal bir takım değişikliklere yol açtığı ve bu değişiklikler neticesinde de komşu mitokondriyon membranlarının füzyona uğradığı ve sonuçta megamitokondriyonların oluştuğu bazı araştırmacılar tarafından rapor edilmiştir. Bazı antioksidant ajanlar kullanıldığında ise serbest radikallerin azaldığı ve sonuçta megamitokondriyon oluşumunun da ortadan kalktığı gösterilmiştir57,58,59. Wakabayashi59, mitokondriyonların megamitokondriyon oluşumu yolu ile oksijen tüketimini azaltarak hücre içi reaktif oksijen radikallerinin seviyesini azaltmaya çalıştığını ve bunu başardıkları takdirde mitokondriyonların hem yapısal hem de fonksiyonel olarak normale dönebileceğini ve ATP sentez yeteneğinin düzeleceğini rapor etmiştir. Doksorubisin uygulanan deney grubuna ait mikrograflarda, sarkomer düzenlenmesinin bozulduğu, miyofibrillerin parçalandığı (Şekil 21) ve sarkoplazma içerisinde yer yer bandlar oluşturacak şekilde filamentöz yapıların bulunduğu görülmekteydi (Şekil 17,19,22). Bu hücrelerde aynı zamanda Z çizgisinde koyulaşma ve diskus interkalarislerin yapısında da bozulma bulunmaktaydı (Şekil 18,21). Işık mikroskobik inceleme sonucunda da kalp kası hücrelerinde dejenerasyon ve miyofibrillerde harabiyet dikkati çekmekteydi (Şekil 4,5). Doksorubisin toksisitesinde muhtemelen birden fazla mekanizma fonksiyon görmektedir. Serbest oksijen radikallerinin oksidatif değişiklikler neticesinde miyofibrillerde de düzensizlik, yıkım ve sonuçta kayba yol açmaları muhtemeldir. Doksorubisinin neden olduğu toksik etkilerden birisi de DNA sentezinin inhibisyonudur. Yapılan çalışmalarda doksorubisinin DNA’ya bağlandığı ve neticede DNA’da fragmentasyona ve DNA sentezinde inhibisyona neden olduğu saptanmıştır4,8. Serbest radikallerin yol açtığı lipid peroksidasyonuna bağlı olarak geliştiği düşünülen mitokondriyal hasar ve enzimatik süreçlerde oluşan bozukluklar protein metabolizmasını olumsuz yönde etkileyeceklerdir. Doksorubisinin kalp kası hücrelerindeki proteinöz yapılara bağlanmasıyla gelişen bir takım yapısal değişiklikler sonucu, kalp kası hücrelerinde kontraktil proteinler de dahil olmak üzere tüm proteinöz yapılarda dejenerasyon oluşabilecektir. Özellikle aktinde oluşan yapısal bozukluklar nedeniyle, aktinin yapısında yer aldığı Z çizgisi ve diskus interkalarislerde dejeneratif değişikliklerin oluştuğu ve sarkomer düzenlenmesinin bozulduğu düşünülebilir. Nitekim doksorubisinin kalp kasında hücre membranı, DNA’yı oluşturan nükleik asitler ve sitoiskelet ile ince filamentleri oluşturan kardiyak miyofibriler proteinleri etkilediği yapılan bazı çalışmalarda bildirilmiştir60,61. Yapılan pek çok çalışmada doksorubisin kullanımı neticesinde miyofibrillerde harabiyet ve kayıp oluştuğu rapor edilmiştir9,13,46,62,63,64,65,66,67,68,69. Mariano ve arkadaşları yaptıkları in vitro çalışmada60 doksorubisinin karakteristik olarak aktinin polimerizasyonuna yol açtığını saptamışlar ve elektron mikroskobunda bu aktin polimerlerinin sitoplazmada kısa, kalın ve düzensiz yapıda filamentler olarak gözlendiğini ayrıca bunların normal ince filamentler gibi fonksiyon görmediklerini ve bunun doksorubisine bağlı olarak gelişen kardiyomiyopati ile direkt ilişkili olabileceğini rapor etmişlerdir. Lewis ve Gonzalez61, doksorubisinin protein sentezini inhibe ettiğini, kardiyak sitoplazmik ve kontraktil proteinler ile filamentlerde toksik etki oluşturarak hücresel hasar yaptığını, sitoplazmik aktin seviyesinin azaldığını ve geniş bir sitoplazmik sahada düzensiz filamentlerin oluştuğunu saptamışlardır. Ayrıca sitoplazmik aktin seviyesindeki azalmanın doksorubisinin neden olduğu kalp kası hastalığında gözlenen kontraktil fonksiyon bozukluğu ile ilişkili olabileceğini rapor etmişlerdir. Doksorubisinin toksik etkilerini inceleyen bazı çalışmalarda ise ultrastrüktürel olarak miyofibril harabiyeti ve mitokondriyal dejenerasyon yanında diskus interkalarislerde de yapısal değişiklikler olduğu bildirilmiştir56,69. Doksorubisinin antitümör aktivitesinin protein ve nükleik asit sentezini inhibe etmesine bağlı olarak oluştuğu bilinmektedir. Bu mekanizma, miyofibril kaybı ve diğer hücresel değişikliklere de ayrıca neden olmaktadır46. Doksorubisinin, DNA yapısı ve fonksiyonlarında ayrıca protein sentezinde oluşturduğu bozukluklar yanında; kalp kasında kreatin kinaz M izoformu, miyozin hafif zincir 2, troponin ve α aktinin gen ekspresyonunu selektif olarak inhibe ettiği ve bunun da doksorubisin tarafından oluşturulan kardiyomiyopati ile ilişkili miyofibril kaybını açıklayabileceği rapor edilmiştir69. Sussman ve arkadaşları67, doksorubisin tedavisi sonrasında miyofibriler düzenin bozulduğunu ve yapısal bütünlüğün kaybolduğunu, hızlı ve yaygın bir şekilde ince filamentlerde dejenerasyon oluştuğunu ve ince filamentlerin doksorubisine çok hassas olduğunu belirtmişlerdir. Doksorubisin tedavisi sırasında protein kinazın aktive olduğunu ve bunun miyofibriler proteinlerde fosforilasyona yol açtığını ve sonuçta miyofibriler dejenerasyon oluştuğunu göstermişlerdir. Doksorubisin tedavisi sonucu oluşan değişiklikleri ışık mikroskobik düzeyde inceleyen çalışmalarda da kalp kası hücrelerinde atrofi ve dejenerasyon, sitoplazmik vakuolizasyon ile miyofibrillerde düzensizlik ve kayıp bildirilmiştir7,9,65,70. Doksorubisin uyguladığımız deney grubunda saptadığımız sarkolemma bütünlüğündeki bozulmanın (Şekil 21) hücre membranının yapısında bulunan yağ asitlerinde lipid peroksidasyonu neticesinde oluşan yapısal bozukluklar sebebiyle oluştuğu düşünülebilir. Genellikle serbest radikallerin ilk hedefinin hücre membranı olduğu kabul edilmektedir13. Hücre membranında serbest radikallerin en büyük etkisi lipid peroksidasyonuna yol açarak membran akıcılığının ve neticede membran permeabilitesinin değiştirilmesidir. Membranda oluşan lipid peroksidasyonu poliansatüre yağ asitlerinin kaybına yol açmakta ve neticede bir takım yapısal değişiklikler oluşmaktadır7,46. Xu ve arkadaşları7,13, yaptıkları deneysel çalışmada, doksorubisinin kalp hücresi membranlarında lipid peroksidasyonuna yol açtığını ve sonuçta membran permeabilitesinin arttığını rapor etmişler ve doksorubisinin neden olduğu hücresel hasarda oksijen kökenli radikallerin çok önemli bir rol oynadığını belirtmişlerdir. Zeidan ve arkadaşları69, doksorubisinin lipofilik özelliğine bağlı olarak hücre membranının yapısında bulunan lipidleri etkilediğini ve bu nedenle hücre membranının yapısının ve fonksiyonunun bozulduğunu, ayrıca burada yerleşim gösteren taşıyıcı enzim ve moleküllerin de inaktive olduğunu bildirmişlerdir. Doksorubisin uygulanan deney grubunda bazı alanlarda hücreler arası bölgelerde kollajen liflerin artarak kalın demetler oluşturdukları gözlenmekteydi (Şekil 23). Lipid peroksidasyonunun oluşturduğu hasar ve lipid peroksidasyon ürünlerinin kollajen sentezini stimüle etmesi neticesinde muhtemelen kollajen lif yapımı artacak ve neticede oluşabilecektir. Nitekim Quintana ve arkadaşları66, doksorubisin tedavisi fibrozis sonrasında endomisyum ve perimisyumda ekstrasellüler matriksde kayıp ve azalmanın olduğunu buna karşılık anormal düzenlenmeye bağlı olarak kalp kası hücrelerinin bazal membranı boyunca ve kas lifi demetleri arasında fibriler materyalin anormal bir şekilde biriktiğini ve perimisyumda kalınlaşma oluştuğunu rapor etmişlerdir. Kollajen ekstrasellüler matriksin en fazla bulunan komponentidir. Ekstrasellüler matriksde kollajen birikimine yol açan 3 mekanizma ileri sürülmektedir. Bunlar kollajen sentezinde görevli enzimlerden birisi olan protokollajen prolil hidroksilaz aktivitesinde artma, fibroblast proliferasyonu ve kas hücrelerinin nekrozu neticesinde kollajen üretiminde oluşan artışdır66. Lipid peroksidasyonu ve belirli lipid peroksidasyon ürünleri, fibrozis oluşturan mekanizmalarda (kollajen sentezinde artma gibi) anahtar rol oynayan moleküller olan fibrojenik sitokinlerin genetik olarak oluşumunu stimüle ederler. Sitokin geni üzerinde oksidatif stresin etkisi, konnektif doku birikiminin ilerlemesi açısından önemli bir mekanizma olarak görülür71. Hem deneysel hem de klinik çalışmalarda fibrozis gelişimi ile lipid peroksidasyonu arasında ilişki olduğu gösterilmiştir71,72. Parola ve arkadaşları72 , yaptıkları deneysel çalışmada oksidatif reaksiyonların direkt olarak prokollajen Tip I geninin ekspresyonunu stimüle ettiğini ve bu durumun fibrozis gelişimine katkıda bulunduğunu rapor etmişlerdir. Doksorubisin uyguladığımız deney grubunda çok sayıda değişik büyüklükte membranla çevrili lipid damlacıkları yer almaktaydı (Şekil 20,21). Yağ asitlerinin sentezi sitoplazmada gerçekleşmekte olup, mitokondriyonlarda yağ asitlerinden gerçekleşmektedir. enerji üretimini Doksorubisine sağlayan bağlı olarak ß-oksidasyon meydana ise gelen mitokondriyal harabiyet neticesinde ATP üretimi azalmakta ve oluşan enzimatik değişiklikler sonucu mitokondriyonlarda gerçekleşen ß-oksidasyon mekanizması bozulmaktadır. İlaveten lipid yapımı ve yıkımı arasındaki dengenin de bozulmasıyla birlikte yıkılamayan yağ asitlerinin hücre içerisinde biriktiği düşünülmektedir. Gerçektende doksorubisinin kalp üzerindeki etkilerini araştıran Singal ve arkadaşları46, doksorubisin tedavisi sonrasında hücrede lipid birikimi olduğunu rapor etmişlerdir. Serbest radikaller çeşitli klinik bozuklukların patogenezinde rol oynarlar. Hücre membranlarındaki doymamış yağ asitlerinden hidrojen atomunun uzaklaşması ile başlayan lipid peroksidasyonu oksidatif stresin en tipik göstergesidir. Çalışmamızda doksorubisin uyguladığımız gruba ait dokularda ölçülen malondialdehit değerleri kontrol grubuna göre anlamlı bir şekilde yüksek (p<0.05) bulundu. Lipid peroksidasyonu sonucu ortaya çıkan aldehit yapılı bir bileşik olan malondialdehitteki bu artışın doksorubisin tedavisi sırasında oluşan serbest radikallere bağlı olarak oluştuğu düşünüldü. Doksorubisinin oluşturduğu kardiyotoksisitede asıl sorumlu mekanizma olarak düşündüğümüz lipid peroksidasyonunun doksorubisin tedavisi neticesinde arttığı birçok araştırmacı tarafından da rapor edilmiştir4,7,13,14,17,46,73,74. Serbest radikaller çeşitli kimyasal olayların sonucu olarak vücutta sürekli olarak ortaya çıkmaktadır. Serbest radikallere karşı doğal antioksidan savunma sistemleri arasında süperoksit dismutaz, glutatyon peroksidaz, katalaz ve melatonin vardır. Serbest radikaller ile antioksidan savunma sistemi arasındaki hassas dengenin prooksidan ve oksidan maddelerin lehine kayması oksidatif stresin gelişmesine yol açar. Doksorubisine bağlı olarak oluşan kardiyomiyopatide en büyük etken olarak düşündüğümüz serbest radikallerin etkisini ortadan kaldırmak amacıyla çalışmamızda antioksidan bir ajan olan melatonini kullandık. Doksorubisin ile birlikte melatonin uyguladığımız deney grubunda bazı kalp kası hücrelerinde mitokondriyonlarda sayıca artış gözlenmekle birlikte bu artış tek başına doksorubisin uygulanan gruba kıyasla daha azdı. Genel olarak, pleomorfizm gösteren mitokondriyonlara ve büyük hacimli mitokondriyonlara daha az rastlanmaktaydı (Şekil 24,26). Bazı hücrelerde mitokondriyal membranlarda parçalanma ve dejeneratif değişiklikler gözlenmekle birlikte bunun doksorubisin grubuna kıyasla oldukça azaldığı dikkati çekmekteydi. Sarkolemma genellikle normal yapıda olup doksorubisin grubunda gözlenen miyofibril dejenerasyonu bulunmamakta ve normal sarkomer düzenlenmesi korunmaktaydı (Şekil 27). Işık mikroskobik inceleme sonucunda da kalp kası hücrelerindeki dejenerasyonun ve miyofibril harabiyetinin azaldığı veya ortadan kalktığı gözlenmekteydi (Şekil 6,7). Doksorubisin grubunda kalp kası hücrelerinde belirgin dejeneratif değişiklikler gözlenirken tedaviye melatonin eklendiğinde meydana gelen düzelmenin melatoninin antioksidatif etkisine bağlı olduğu düşünülmektedir. Melatonin lipid peroksidasyonunu inhibe etmekte ve sonuçta hücresel dejenerasyon azalmakta veya ortadan kalkmaktadır. Çalışmamızda doksorubisin+melatonin kombinasyon tedavisi uygulanan deney grubuna ait dokularda ölçülen malondialdehit değerleri, tek başına doksorubisin uygulanan deney grubuna göre anlamlı bir şekilde düşük (p<0.05) bulundu. Doksorubisin tedavisi uygulandığında lipid peroksidasyonunda belirgin bir artış saptanırken, tedaviye melatonin eklendiğinde saptanan normal değerlerin melatoninin lipid peroksidasyonunu inhibe edici etkisine bağlı olduğu düşünülebilir. Gerçekten de Morishima ve arkadaşları17 yaptıkları deneysel çalışmada, doksorubisin ile birlikte melatonin verildiği zaman doksorubisin tarafından arttırılan lipid peroksidasyonunun inhibe olduğunu saptamışlardır. Melatoninin bu etkisinin direkt olarak serbest radikal giderici etkisine bağlı olabileceği gibi, antioksidatif enzimlerin aktivitesini artırıcı ( Glutatyon peroksidaz gibi ) ve diğer antioksidantların ( Askorbik asit, α-tokoferol gibi ) etkilerini güçlendirici etkisine bağlı olabileceğini rapor etmişlerdir. Ayrıca doksorubisin uyguladıkları deney grubunda ultrastrüktürel olarak miyofibril kaybı ve düzensizliği ile mitokondriyal dejenerasyon bulunduğunu, doksorubisin + melatonin kombinasyon tedavisi uyguladıkları grupta ise miyofibriler ve mitokondriyal yapının korunduğunu ve kontrol gruplarından farklı olmadığını saptamışlardır. Doksorubisin tedavisi neticesinde lipid peroksidasyonunun anlamlı bir şekilde arttığını buna karşılık tedaviye melatonin eklendiği zaman bu artışın kompanse edildiğini rapor eden başka çalışmalar da bulunmaktadır5,7,12,14. Melatoninin doksorubisin tedavisindeki etkilerini ışık mikroskobik düzeyde inceleyen bazı çalışmalarda da doksorubisin tedavisi sonucunda kalp kası hücrelerinde miyofibrillerde düzensizlik ve kayıp, sitoplazmik vakuolizasyon, intrasellüler ve intersitisyel ödem gözlenirken, tedaviye melatonin eklendiğinde bu dejeneratif değişikliklerin kısmen düzeldiği rapor edilmiştir7,14. Doksorubisin diğer organlarda da serbest oksijen radikallerinin oluşumuna neden olmakla birlikte bu radikallerin miyokardda oluşturduğu hasar daha belirgindir. Bunun iki nedeni vardır; bunlardan birisi doksorubisinin miyokardda diğer dokulara göre daha fazla toplanması ve serbest radikal üretiminin daha fazla olması, diğeri ise miyokard hücrelerinin bu radikalleri nötralize eden katalaz ve süperoksit dismutaz enzimlerinden nispeten fakir olmasıdır1. Antioksidan enzimler organizmanın savunmasında oksidatif strese karşı yaşamsal öneme sahiptirler. Süperoksit radikalinin ortadan kaldırılmasında bu enzim sisteminin en önemlisi süperoksit dismutazdır. Çalışmamızda doksorubisin uyguladığımız deney grubuna ait dokularda bulunan süperoksit dismutaz değerleri ile kontrol gruplarına ait süperoksit dismutaz değerleri arasında anlamlı bir farklılık bulunamadı. Ancak tek başına melatonin uygulanan deney grubu ile doksorubisin + melatonin kombinasyon tedavisi uygulanan deney grubuna ait süperoksit dismutaz değerleri kontrol gruplarından anlamlı bir şekilde yüksek bulundu (p<0.05). Gerçekten de Wahab ve arkadaşları12 yaptıkları deneysel çalışmada tek başına doksorubisin ile tedavi edilen deney hayvanlarında kontrol grubu ile karşılaştırıldığı zaman süperoksit dismutaz aktivitesinde herhangi bir farklılık gözlememişler, ancak tek başına melatonin uygulanan deney grubunda kontrol grubuna göre anlamlı bir artış ve bunun yanında doksorubisin + melatonin kombinasyon tedavisi uygulanan deney grubunda da doksorubisin grubuna göre anlamlı bir artış saptamışlardır. Glutatyon peroksidaz da oksidatif hasara karşı enzimatik defansta anahtar rol oynayan enzimlerden birisidir. Çalışmamızda doksorubisin uyguladığımız deney grubu ile doksorubisin ile birlikte melatonin uyguladığımız deney grubuna ait doku örneklerinde saptanan glutatyon peroksidaz değerleri kontrol grupları ile karşılaştırıldığında anlamlı bir azalma saptandı (p<0.05). İn vivo olarak doksorubisin verilmesini takiben dokularda serbest radikallere karşı üretilen spesifik ve aktif koruyucu bir enzim olan glutatyon peroksidazda inaktivasyon oluştuğu bildirilmiştir. Bu enzim ilaç tarafından indüklenen oksidatif hasara karşı koruyucudur ve neticede inaktivasyonunun doksorubisinin toksik etkilerini şiddetlendirdiği düşünülmektedir5. Agapito ve arkadaşları yaptıkları deneysel çalışmada5 doksorubisin tedavisi neticesinde glutatyon peroksidaz aktivitesinde kontrol grubuna göre anlamlı bir azalma olduğunu buna karşılık tedaviye melatonin eklendiğinde bu azalmanın düzeltilemediğini rapor etmişlerdir. Sonuç olarak çalışmamızda bir kemoterapötik ajan olan doksorubisinin kullanımı sonucu hücrede lipid peroksidasyonunun oluştuğu, antioksidan sistemin baskılandığı ve buna bağlı olarak miyokard hücrelerinde ışık ve elektron mikroskobik düzeyde yapısal değişikliklerin geliştiği saptandı. Doksorubisin + melatonin kombinasyon tedavisi uygulandığında ise melatoninin serbest radikal giderici ve lipid peroksidasyonunu inhibe edici etkisine bağlı olarak hücresel hasarın düzeldiği sonucuna varıldı. 6. SONUÇ VE ÖNERĠLER Yapılan çalışmada melatonin, doksorubisin ve doksorubisin-melatonin kombine tedavisi uygulanan deney gruplarına ait sıçanların enzim değerleri ( malondialdehit, glutatyon peroksidaz ve süperoksit dismutaz ), ışık ve elektron mikroskobik bulguları kontrol grupları ile karşılaştırılarak değerlendirildi. Değerlendirmeler sonucunda; 1- Doksorubisin uygulanan deney grubuna ait sıçanlarda bir lipid peroksidasyon ürünü olan malondialdehit seviyeleri anlamlı bir şekilde artarken, doksorubisin ile birlikte melatoninin kombine olarak uygulandığı deney grubunda ise bu değerlerin doksorubisin grubuna göre anlamlı bir şekilde azaldığı ve kontrol değerlere ulaştığı saptandı. 2- Doksorubisin uygulanan deney grubunda süperoksit dismutaz seviyelerinde kontrol grubuna göre anlamlı bir fark gözlenmezken, melatonin uygulanan deney grubu ve doksorubisin ile birlikte melatoninin kombine olarak uygulandığı deney grubunda anlamlı bir artış olduğu görüldü. 3- Doksorubisin uygulanan deney grubu ve doksorubisin ile birlikte melatoninin kombine olarak uygulandığı deney grubunda glutatyon peroksidaz seviyelerinde kontrol grupları ve melatonin uygulanan deney grubuna göre anlamlı bir azalma olduğu, melatoninin doksorubisin etkisi ile oluşan glutatyon peroksidaz seviyelerindeki azalmayı düzeltmediği gözlendi. 4- Işık ve elektron mikroskobik incelemelerde doksorubisin grubunda sarkomer düzenlenmesinde bozulma, miyofibril harabiyeti ve sarkolemma bütünlüğünde bozulma gözlenirken doksorubisin ile birlikte melatonin kullanıldığında bu değişikliklerin büyük oranda düzeldiği gözlendi. 5- Doksorubisin grubunda belirgin mitokondriyal dejenerasyon gözlenirken, doksorubisin ile birlikte melatoninin kombine uygulandığı grupta mitokondriyal dejenerasyonun azaldığı veya ortadan kalktığı saptandı. 6- Doksorubisin grubunda sarkoplazma içerisinde gözlenen filamentöz yapıların, lipid birikiminin ve hücreler arası bölgede gözlenen kollajen doku artımının melatonin tedavisi ile ortadan kalktığı saptandı. Sonuç olarak doksorubisin uygulanan deney grubunda kalp kası hücrelerinde belirgin dejenerasyon gözlenirken tedaviye melatonin eklendiğinde bu dejeneratif değişikliklerin gerilediği ve ortadan kalktığı saptandı. Bu nedenle doksorubisin tedavisine melatonin eklenerek doksorubisinin kardiyotoksik etkisinin büyük oranda önlenebileceği kanaatine varıldı. Bununla birlikte lipid peroksidasyonunun uzun süre devam etmesi durumunda hücre yapısındaki bozulma giderek artacak ve zamanla enerji metabolizmasında yetersizlik, DNA ve hücre membranlarında tamir edilemez düzeyde hasar ile hücre ölümüne (irreversibl hücre zedelenmesi) yol açacaktır. Bu nedenle doksorubisinin uzun süreli kullanımında melatoninin etkisinin biyokimyasal ve ultrastrüktürel düzeyde araştırılmasının yararlı olabileceği düşünüldü. 7. KAYNAKLAR 1. Kayaalp SO. Rasyonel Tedavi Yönünden Tıbbi Farmakoloji. 1. Cilt 6. Baskı, Ankara: Feryal Matbaacılık San. Tic. Ltd. Şti., 1991. 2. Lissoni P, Barni S, Mandala M, Ardizzoia A, Paolorossi F, Vaghi M, Longarini R, Malugani F, Tancini G. Decreased toxicity and increased efficacy of cancer chemotherapy using the pineal hormone melatonin in metastatic solid tumour patients with poor clinical status. European Journal of Cancer, 1999; 35 (12): 1688-1692. 3. Katzung BG. Basic & Clinical Pharmacology. 8th.Ed., New York: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2001. 4. Myers CE, McGuire WP, Liss RH, Ifrim I, Grotzinger K, Young RC. Adriamycin: the role of lipid peroxidation in cardiac toxicity and tumor response. Science, 1977; 197: 165-167. 5. Agapito MT, Antolin Y, del Brio MT, Lόpes-Burillo S, Pablos MI, Recio JM. Protective effect of melatonin against adriamycin toxicity in the rat. Journal of Pineal Research, 2001; 31 (1): 23-30. 6. Ganey PE, Carter LS, Mueller RA, Thurman RG. Doxorubicin toxicity in perfused rat heart. Circulation Research, 1991; 68: 1610-1613. 7. Xu MF, Ho S, Qian ZM, Tang PL. Melatonin protects against cardiac toxicity of doxorubicin in rat. Journal of Pineal Research, 2001; 31 (4): 301-307. 8. Wassermann K, Mølgaard K, Steiness E. Similar changes in cardiac morphology and DNA synthesis induced by doxorubicin and 4’-epi-doxorubicin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 1985;15 (3): 244-252. 9. Zhou S, Starkov A, Froberg MK, Leino RL, Wallace KB. Cumulative and irreversible cardiac mitochondrial dysfunction induced by doxorubicin. Cancer Research, 2001; 61 (2): 771-777. 10. DeAtley SM, Aksenov MY, Aksenova MV, Harris B, Hadley R, Harper PC, Carney JM, Butterfield DA. Antioxidants protect against reactive oxygen species associated with adriamycin-treated cardiomyocytes. Cancer Letters, 1999; 136 (1): 41-46. 11. Doroshow JH. Effect of anthracycline antibiotics on oxygen radical formation in rat heart. Cancer Research, 1983; 43: 460-472. 12. Wahab MHA, Akoul ESEMS, Abdel-Aziz AAH. Modulatory effects of melatonin and vitamin E on doxorubicin-induced cardiotoxicity in Ehrlich Ascites Carcinoma-bearing mice. Tumori, 2000; 86 (2): 157-162. 13. Xu MF, Tang PL, Qian ZM, Ashraf M. Effects by doxorubicin on the myocardium are mediated by oxygen free radicals. Life Sciences, 2001; 68 (8): 889-901. 14. Dzięgiel P, Jethon Z, Suder E, Sopel M, Rabczyński J, Surowıak P, Zabel M. Role of exogenous melatonin in reducing the cardiotoxic effect of daunorubicin and doxorubicin in the rat. Exp Toxic Pathol, 2002; 53 (6): 433-439. 15. Kang YJ, Sun X, Chen Y, Zhou Z. Inhibition of doxorubicin chronic toxicity in catalase-overexpressing transgenic mouse hearts. Chemical Research in Toxicology. 2002; 15 (1): 1-6. 16. Unverferth DV, Jagadeesh JM, Unverferth BJ, Magorien RD, Leier CV, Balcerzak SP. Attemt to prevent doxorubicin-induced acute human myocardial morphologic damage with acetylcysteine. J Natl Cancer Inst, 1983; 71 (5): 917-920. 17. Morishima I, Matsui H, Mukawa H, Kazunori H, Toki Y, Okumura K, Ito T, Hayakawa T. Melatonin, a pineal hormone with antioxidant property, protects against adriamycin cardiomyopathy in rats. Life Sciences, 1998; 63 (7): 511-521. 18. Mycek MJ, Harvey RA, Champe PC. Antikanser İlaçlar. Oktay Ş, Berkman K, Onat F, Gören Z. Farmakoloji. 2. Baskı, İstanbul: Tayf Ofset-Savaş Cilt Evi, 1998: 385-386. 19. Turgut M, Baka M, Yurtseven M. Pineal glanddan salgılanan bir nörohormon olan melatoninin etkileri. Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi ARŞİV Kaynak Tarama Dergisi, 2002; 11 (4): 453-470. 20. Arendt J, Skene DJ, Middleton B, Lockley SW, Deacon S. Efficacy of melatonin treatment in jet lag, shift work and blindness. Journal of Biological Rhythms, 1997; 12 (6): 604-617. 21. Sirotkin AV, Schaeffer H-J. Direct regulation of mammalian reproductive organs by serotonin and melatonin. Journal of Endocrinology, 1997; 154 (1):1-5. 22. Reiter RJ, Calvo JR, Karbownik M, Qi W, Tan DX. Melatonin and its relation to the immune system and inflammation. New York Academy of Sciences Annals, 2000; 917: 376-386. 23. Argyriou A, Prast H, Philippu A. Melatonin facilitates short-term memory. European Journal of Pharmacology, 1998; 349 (2-3): 159-162. 24. Halliwell B, Aruoma OI. DNA damage by oxygen-derived species.Its mechanism and measurement in mammalian systems. FEBS Lett, 1991; 281 (1-2): 9-19. 25. Pless G, Frederiksen TJP, Garcia JJ, Reiter RJ. Pharmacological aspects of N-acetyl-5-methoxytryptamine (melatonin) and 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydro-ß-carboline (pinoline) as antioxidants: Reduction of oxidative damage in brain region homogenates. Journal of Pineal Research, 1999; 26: 236-246. 26. Pablos MI, Agapito MT, Gutierrez R, Recio JM, Reiter RJ, Barlow-Walden L, Acuna-Castroviejo D, Menendez-Pelaez A. Melatonin stimulates the activity of the detoxifying enzyme glutathione peroxidase in several tissues of chicks. Journal of Pineal Research, 1995; 19 (3): 111-115. 27. Tan D, Manchester LC, Reiter RJ, Qi W, Zhang M, Weintraub ST, Cabrera J, Sainz RM, Mayo JC. Identification of highly elevated levels of melatonin in bone marrow: its origin and significance. Biochimica et Biophysica Acta, 1999; 1472 (1-2): 206-214. 28. Siu AW, Reiter RJ, To CH. Pineal indoleamines and vitamin E reduce nitric oxide-induced lipid peroxidation in rat retinal homogenates. Journal of Pineal Research, 1999; 27 (2):122-128. 29. Reiter RJ, Carneiro RC, Oh CS. Melatonin in relation to cellular antioxidative defense mechanisms. Horm. Metab. Res., 1997; 29 (8): 363-372. 30. Escames G, Guerrero JM, Reiter RJ, Garcia JJ, Munoz-Hoyos A, Ortiz GG, Oh CS. Melatonin and vitamin E limit nitric oxide-induced lipid peroxidation in rat brain homogenates. Neurosci Lett, 1997; 230 (3): 147-150. 31. Melchiorri D, Reiter RJ, Sewerynek E, Chen LD, Nistico G. Melatonin reduces kainate-induced lipid peroxidation in homogenates of different brain regions. FASEB J, 1995; 9 (12): 1205-1210. 32. De La Lastra CA, Cabeza J, Motilva V, Martin MJ. Melatonin protects against gastric ischemia-reperfusion injury in rats. Journal of Pineal Research, 1997; 23 (2): 47-52. 33. Zieleniewski J, Nowakowska-Jankiewicz B, Juszczak M, Karasek M. Influence of pinealectomy on the mitotic activity of regenerating adrenal cortex in rats. Cytobios, 1986; 47 (189): 85-88. 34. Drobnik J, Dabrowski R. Melatonin suppresses the pinealectomy-induced elevation of collagen content in a wound. Cytobios, 1996; 85: 51-58. 35. Ebadi M, Govitrapong P, Phansuwan-Pujito P, Nelson F, Reiter RJ. Pineal opioid receptors and analgesic action of melatonin. Journal of Pineal Research, 1998; 24 (4): 193-200. 36. Acuna-Castroviejo D, Escames G, Macias M, Munoz Hoyos A, Molina Carballo A, Arauzo M, Montes R. Cell protective role of melatonin in the brain. Journal of Pineal Research, 1995; 19 (2): 57-63. 37. Tan DX, Manchester LC, Reiter RJ, Cabrera J, Burkhardt S, Phillip T, Gitto E, Karbownik M, Li QD. Melatonin suppresses autoxidation and hydrogen peroxide-induced lipid peroxidation in monkey brain homogenate. Neuroendocrinol Lett, 2000; 21 (5): 361-365. 38. Roth JA, Kim BG, Lin WL, Cho MI. Melatonin promotes osteoblast differentiation and bone formation. J Biol Chem, 1999; 274 (31): 22041-22047. 39. Kabuto H, Yokoi I, Ogawa N. Melatonin inhibits iron-induced epileptic discharges in rats by suppressing peroxidation. Epilepsia, 1998; 39 (3): 237-243. 40. Krauchi K, Cajochen C, Möri D, Graw P, Justice AW. Early evening melatonin and S-20098 advance circadian phase and nocturnal regulation of core body temperature. American Journal of Physiology:Cumulative Section, 1997; 272 (4Pt2): R1178-R1188. 41. Hayat MA. Basic Electron Microscopy Techniques. New York: Van Nostrad Reinhold Company, 1972: 53. 42. Luna LG. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institue of Pathology. 3th.Ed., New York: McGraw-Hill Book Company, 1968. 43. Kaya M. Elektron mikroskobi teknikleri. Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, 1984; 9 (1): 1-21. 44. Milloning G. Advantages of a phosphate buffer for osmium tetroxide solutions in fixation. J Appl. Phys., 1961; 32: 1637. 45. Iwasaki T, Suzuki T. Ultrastructural alterations of the myocardium induced by doxorubicin. Virchows Archiv B Cell Pathol, 1991; 60 (1): 35-39. 46. Singal PK, Deally CMR, Weinberg LE. Subcellular effects of adriamycin in the heart: A concise review. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 1987; 19: 817-828. 47. Xu M, Ashraf M. Melatonin protection against lethal myocyte injury induced by doxorubicin as reflected by effects on mitochondrial membrane potential. J Mol Cell Cardiol, 2002; 34 (1): 75-79. 48. Shug AL. Protection from adriamycin-induced cardiomyopathy in rats. Zeitschrift Fuer Kardiologie, 1987; 76 (5 Suppl.): 46-52. 49. McFalls EO, Paulson DJ, Gilbert EF, Shug AL. Carnitine protection against adriamycin-induced cardiomyopathy in rats. Life Sciences, 1986; 38 (6):497-505. 50. Morishima I, Okumura K, Matsui H, Kaneko S, Numaguchi Y, Kawakami K, Mokuno S, Hayakawa M, Toki Y, Ito T, Hayakawa T. Zinc accumulation in adriamycin-induced cardiomyopathy in rats: Effects of melatonin, a cardioprotective antioxidant. Journal of Pineal Research, 1999; 26 (4):204-210. 51. Granzotto M, Rapozzi V, Decorti G, Giraldi T. Effects of melatonin on doxorubicin cytotoxicity in sensitive and pleiotropically resistant tumor cells. Journal of Pineal Research, 2001; 31 (3): 206-213. 52. Pollakis G, Goormaghtigh E, Ruysschaert JM. Role of the quinone structure in the mitochondrial damage induced by antitumor anthracyclines.Comparison of adriamycin and 5-iminodaunorubicin. FEBS Letters, 1983; 155 (2): 267-272. 53. Mailer K, Petering DH. Inhibition of oxidative phosphorylation in tumor cells and mitochondria by daunomycin and adriamycin. Biochemical Pharmacology, 1976; 25 (18): 2085-2089. 54. Demant EJF, Jensen PK. Destruction of phospholipids and respiratory-chain activity in pig-heart submitochondrial particles induced by an adriamycin-iron complex. Eur. J. Biochem., 1983; 132 (3): 551-556. 55. Seraydarian MW, Artaza L. Modification by adenosine of the effect of adriamycin on myocardial cells in culture. Cancer Research, 1979; 39 (8): 2940-2944. 56. Nicolay K, Fok JJ, Voorhout W, Post JA, Kruijff B. Cytofluorescence detection of adriamycin-mitochondria interactions in isolated, perfused rat heart. Biochimica et Biophysica Acta, 1986; 887 (1):35-41. 57. Wakabayashi T, Adachi K, Matsuhashi T, Wozniak M, Antosiewicz J, Karbowsky M. Suppression of the formation of megamitochondria by scavengers for free radicals. Molec. Aspects Med., 1997; 18: s51-s56. 58. Matsuhashi T, Liu X, Karbowski M, Wozniak M, Antosiewicz J, Wakabayashi T. Role of free radicals in the mechanism of the hydrazine-induced formation of megamitochondria. Free Radical Biology and Medicine, 1997; 23 (2): 285-293. 59. Wakabayashi T. Megamitochondria formation-physiology and pathology. J Cell Mol Med, 2002; 6 (4): 497538. 60. Mariano R, Gonzalez B, Lewıs W. Cardiac actin interactions with doxorubicin in vitro. Experimental and Molecular Pathology, 1986; 44 (1): 7-13. 61. Lewis W, Gonzalez B. Anthracycline effects on actin and actin-containing thin filaments in cultured neonatal rat myocardial cells. Laboratory Investigation, 1986; 54 (4): 416-423. 62. Mortensen SA, Olsen HS, Baandrup U. Chronic anthracycline cardiotoxicity: haemodynamic and histopathological manifestations suggesting a restrictive endomyocardial disease. British Heart Journal, 1986; 55 (3): 274-282. 63. Torti FM, Bristow MM, Lum BL, Carter SK, Howes AE, Aston DA, Brown BW, Hannigan JF, Meyers FJ, Mitchell EP, Billingham ME. Cardiotoxicity of epirubicin and doxorubicin:Assessment by endomyocardial biopsy. Cancer Research, 1986; 46 (7): 3722-3727. 64. Tong J, Ganguly PK, Singal PK. Myocardial adrenergic changes at two stages of heart failure due to adriamycin treatment in rats. Am. J. Physiol., 1991; 260 (3Pt2): H909-H916. 65. Suzuki T, Minamide S, Iwasaki T, Yamamoto H, Kanda H. Cardiotoxicity of a new anthracycline derivative (SM-5887) following intravenous administration to rabbits: Comparative study with doxorubicin. Investigational New Drugs, 1997; 15 (3): 219-225. 66. Quintana DS, Climent V, Martinez VG, Macias D, Hurle JM. Extracellular matrix arrangement in the papillary muscles of the adult rat heart . Alterations after doxorubicin administration and experimental hypertension. Basic Research in Cardiology, 1994; 89 (4): 279-292. 67. Sussman MA, Alvarez SFH, Vilalta PM, Welch S, Kedes L. Involvement of phosphorylation in doxorubicinmediated myofibril degeneration. An immunofluorescence microscopy analysis. Circulation Research, 1997; 80 (1): 52-61. 68. Jaenke RS. Delayed and progressive myocardial lesions after adriamycin administration in the rabbit. Cancer Research, 1976; 36 (8): 2958-2966. 69. Zeidán Q, Strauss M, Porras N, Anselmi G. Differential long-term subcellular responses in heart and liver to adriamycin stress. Exogenous L-carnitine cardiac and hepatic protection. J. Submicrosc. Cytol. Pathol., 2002; 34 (3):315-321. 70. Hirano S, Wakazono K, Agata N, Iguchi H, Tone H. Comparison of cardiotoxicity of pirarubicin, epirubicin and doxorubicin in the rat. Drugs under Experimental and Clinical Research, 1994; 20 (4): 153-160. 71. Poli G, Parola M. Oxidative damage and fibrogenesis. Free Radical Biology & Medicine, 1997; 22 (1/2): 287305. 72. Parola M, Pinzani M, Casini A, Albano E, Poli G, Gentilini A, Gentilini P, Dianzani MU. Stimulation of lipid peroxidation or 4-hydroxynonenal treatment increases procollagen α 1 gene expression in human liver fatstoring cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1993; 194 (3): 1044-1050. 73. Lee V, Randhawa AK, Singal PK. Adriamycin-induced myocardial dysfunction in vitro is mediated by free radicals. American Journal of Physiology, 1991; 261 (4Pt2): H989-H995. 74. Odom AL, Hatwıg CA, Stanley JS, Benson AM. Biochemical determinants of adriamycin toxicity in mouse liver, heart and intestine. Biochemical Pharmacology, 1992; 43 (4): 831-836. 8. ÖZGEÇMĠġ Adı Soyadı : Ebru BALLI Doğum Tarihi ve Yeri : 04.06.1975 / ADANA Medeni Durumu : Evli Adres : Güzelyalı Mah. Turgut Özal Bul. No:84 Altınören Apt. Kat:1 No:1 P.K. 01170 Seyhan/Adana Telefon : 0 322 234 40 07 Fax : E. mail : [email protected] Mezun Olduğu Tıp Fakültesi : Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Varsa Mezuniyet Derecesi : 3. Görev Yerleri : Ç. Ü. Tıp Fakültesi Histoloji-Embriyoloji AD. Dernek Üyelikleri : Elektron Mikroskobi Derneği Alınan Burslar : Yabancı Dil(ler) : İngilizce
