attomol DPD-exon 14-skipping quicktype

attomol® DPD-exon 14-skipping quicktype
İnsan DPD-gen’inde DPD-exon 14-skipping mutasyonun tespitine yönelik mutasyon testi
Sadece in vitro diagnostik kullanım içindir!
20 tespit
sipariş numarası: 1044
1.Giriş
5-florourasil (5-FU), baş ve boyun tümörleri , göğüs kanseri ve gastrointestinal kanserlerde en
sık kullanılan ilaçlardan biridir(van Kuilenburg et al., 2001, Clin Cancer Res, 7(5):11491153). 5-FU’nın tedavi edici etkisi yanında, DNA içine metabolitlerin entegrasyonu
sonucunda toksik özelliklere sahiptir. Bu biyoyararlılık karaciğer enzimi dihidroprimidin
dehidrogenaz (DPD) tarafından düzenlenir ve bu enzim verimsiz ürünlerin içine verilen ilacın
% 85 inin dağılmasına neden olur.
5-FU ile tedavi edilen hastaların 3% de urasil ve timinuria ile beraber kardiyotoksik, mukoza
iltihabı, saç dökülmesi ve nörolojik zayıflıklar gibi yan etkiler görülür. Nadir durumlarda 5FU’le tedavi ölümle bitebilir. Bu intolerans DPD enzim aktivitesinde azalma veya eksiklik
yüzünden olabilir. DPD geninde toplamda 23 mutasyon ve polimorfizm tespit edildi. DPD
geninde exon 14-skipping mutasyonu 5-FU tedavisine bağlı hastaların yaklaşık 30% u ağır ve
ölümcül sonuçlar taşımaktadır. Exon-14'ün GT ekleme konsensusu dizisinde adenin(A) ile
guaninin (G) yer değiştirmesi DPD'in protein dizisinde 55 aminoasidin kaybına neden
olmaktadır. Exon-14 kopyalanmaz ve proteinin toplam fonksiyon kaybına neden olur (Gross
et al., 2002, Zentralbl Gynakol, 124(12):574-579; Vreken et al, 1998, Adv Exp Med Biol,
431:341-346).
Azaltılan veya var olmayan DPD enzim faaliyeti sert yan etkilere sebep olur ve hücrelerde
biriken 5-FU'nun etkisiz metabolizma sonuçlarıdır. Düzenli heterozigot hastalarında toksisite
artış riski görülür ve FU'nun düşürülen dozajıyla tedavi edilmelidir.
Avrupalı nüfusta heterozigot DPD-Exon 14-Skipping mutasyonu 1 ve 2% arasında yaygın
olarak görülür. (Steiner et al., 2002, Dtsch Med Wochenschr, 127:2225).
2. Genel Açıklamalar
• Bu kit sadece in vitro diagnostik uygulamalar için kullanılmalı.
• Bu kiti son kullanma tarihinden sonra kullanmayınız.
•Test çalışması için iyi eğitimli personel ve uygun laboratuar ekipman hususuna dikkat ediniz.
• Test uygulamasının tüm adımlarında eldiven giyiniz.
•Hasta numuneleri, potansiyel enfeksiyonlu madde olarak dikkate alınmalı ve mevcut yasalara
göre hareket edilmelidir.
• PCR*’a yönelik reaktifleri, DNA numuneleri ile amplifikasyon ürünlerinden ayrı saklayın.
3. Dahil olan malzemeler
Sipariş numarası
Reaktif
Hacim
Saklama Isısı
38
deiyonize PCR-H2O
0.2 ml
-20 °C
83
PCR-buffer I
0.5 ml
-20 °C
155
Primer DPD-Exon
Liyofilize primerler -20 °C
14- Skipping
içeren 2 tüp, tüp
(kırmızı renkli
başına 225 μl PCR-
tüpler)
buffer I (#83)
ile
çözündürme
Kitteki tüm reaktiflerin miyadı, kutunun dış yüzeyinde bulunan esas etikette bulunmaktadır.
4. İlave Reaktifler ve Dahil olmayan malzemeler
• Hastaların DNA numuneleri ( genomik DNA kullanın, konsantrasyonu yaklaşık 20 ng/μl,
distile suyla veya TE-buffer çözündürme)
•Qiagen tarafından sağlanan HotStarTaq DNA Polimeraz
• Kontrol template(DPD-Exon 14- Skipping heterozigot DNA)
•Eppendorf-tüpler (0.2 ml; 1.5 ml)
•Mikropipetler (hacim aralığı 0.5-1000 μl) ve steril filtre uçları
•Thermocycler
• Agoroz jel elektroforez ve sarf malzemeleri için ekipman (agoroz veya % 3 prekastlanmış
agoroz jelleri, elektrot buffer, örnek buffer, DNA-boya, UV-transilluminator)
5. Test Prensibi
Quicktype genotipleme işlemi sırasında belirli bir genin her iki allelleri özellikle amplifiye
edilmiş olur. Amplifikasyon ürünlerinin denemesi agoroz jel elektroforezle yapılabilir.
Her iki allel de Wild tip dizisi taşırsa (homozigot wild tip), agoroz jeli yalnızca 305 bp te
specifik bir bant içerir. Eğer bir allel Wild tip dizisi ve diğeri mutasyon dizisi(heterozigot)
taşırsa, sırasıyla 305 bp ve 345 bp te iki bant olacaktır. DNA numunesi homozigot olarak
mutasyona uğramışsa jelde 345 bp te sadece tek bir bant gözükür. Jeldeki bantların
kalibrasyonunda sonuçları daha iyi doğrulamak için referans olarak bir heterozigot DNA
numunesi kullanmalısınız (Fig. 1'i gör).
Tek başına bir diagnostik metodun sonuçlarından klinik tanıya gidilmemelidir. Doktor mevcut
tüm laboratuar ve klinik sonuçları dikkate almalıdır.
6. Manuel
Hastaların numunelerine ek olarak PCR reaksiyonlarını kontrol etmek için aşağıdaki
kontrolleri eklemeniz önerilir:
1. Negatif kontrol (PCR-blank)
2. Pozitif kontrol (bir heterozigot kontrol template kullanın [genotiplendirilmiş, genomik
DNA])
Kontrol template ayrı olarak üreticisinden de sipariş edilebilir(sipariş numaranızı 161). Doğru
şekilde genotiplendirilmiş olan hasta numuneleri kullanıcı tarafından kontrol template olarak
da kullanılabilir.
Protokol:
 • Standart prosedürlere göre hasta kanından DNA-hazırlama
• Tüp başına 225 μl PCR-buffer I kullanarak (sipariş numarası 83) primerleri çözündürün,
PCR Premix içinde pipet kullanarak uygun şekilde karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dk. İnkübe
edin.
Dikkat: 225 μl’den daha az PCR premixe ihtiyacınız varsa geri kalanı
-20 ° C de
saklayabilirsiniz.
• PCR premix’e hot start Taq DNA polimeraz ilavesiyle PCR mix hazırlama
Bir reaksiyon için kullanılıcak toplam PCR premixin miktarını hesaplamak için her bir
numune ve kontrol sayıları ile premix miktarı (20 μl) çarpılmalıdır ve bir miktar fazla hacim
eklenmelidir
(8 reaksiyon için örnek: 8 x 20 μl + 10 μl fazladan hacim = 170 μl PCR
premix).
Daha sonra, hot start Taq DNA polimeraz (5 U / μl) premix içine son dilüsyon 1:100 olacak
şekilde ilave edilmelidir. (örneğin: 170 μl PCR premix + 1,7 μl 5 U / μl polimeraz). Şimdi,
PCR mix iyice karıştırılmalıdır.
• PCR mixi 0.2 ml lik tüplerde eşit hacimlere ayırma:
Negatif kontrol:
Pozitif Kontrol:
Hasta numuneleri:
20 μl PCR mix
20 μl PCR mix
20 μl PCR mix
+ 5 μl PCR-H2O
+ 5 μl kontrol template
+ 5 μl DNA (ca. 20 ng/μl)
(ca. 20 ng/μl)
• PCR thermocyclerde aşağıda listelenen sıcaklık rejimi kullanılarak yapılmaktadır:
İlk denatürasyon: 15 dak. 95 °C
5 döngü: 1 dak. 94 °C
1 dak. 58 °C
1 dak.72 °C
30 döngü: 30 s 94 °C
30 s 58 °C
30 s 72 °C
Final sentezi: 2 dak. 72 °C
Durdurma: 4 °C zaman sınırı yok
•  PCR ürünlerinin analizleri uygun laboratuvar şartlarında bir agoroz jel üzerine (2,5 % 3)
10 μl PCR ürünü ilavesi ve sonra elektroforez ile gerçekleştirilir.
• Hasta numunelerinin genotiplemesi kontroller ile numunelerin bant modeli kıyaslanarak
yapılır(Fig. 1'i gör).
Genotipler:
WT= homozigot Wild Tipi
HZ=HeteroZigot
Test uygulaması sırasında sorunlar ile ilgili olarak üretici veya distribütör firmayla bağlantı kurmakta
tereddüt etmeyin.
EK 1
Kit etiketlerinde kullanılan sembollere genel bakış
Sembollerin açıklaması
Üretici
Lot numarası
Son kullanma tarihi
2 ° C ve 6 ° C arasında saklayın
Max. -20 ° C de saklayın
Katalog numarası
In vitro diagnostik medikal ürünler
<n> determinations için yeterli içerik
Kullanım talimatına bakınız