CMV Real-TM Quant

In Vitro Kullanım için
Sadece Profesyonel Kullanım için
CMV Real-TM
Quant
El
Kitabı
Sitomegalovirüs (CMV) Kalitatif Tespiti için
Real Time PCR Testi
REF V7-100FRT
100
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
1. KULLANIM AMACI
CMV Real-TM Quant PCR kiti klinik materyallerdeki (periferik kan plazma, amniyotik sıvı, beyin
omurilik sıvısı (likör), tükürük, orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri, bronkoalveoler lavaj, tam insan
kanı, beyaz kan hücreleri ve iç organlar biyopsi) real-Süre hibridizasyon-floresans temeline dayanarak
insan sitomegalovirüs DNA’sının tespit edilmesini sağlayan in vitro nükleik asit amplifikasyon testidir.
PCR analizinin sonuçları hastalığın kompleks tanısı beraberinde dikkate alınır.
2. PCR TESPİTİNİN İLKELERİ
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve hibridizasyon floresans tespit ile CMV tespiti üç aşama içerir:
klinik örnekten DNA ekstraksiyonu, pathojen genom spesifik bölgenin PCR-amplifikasyonu ve realSüre hibridizasyon floresans tespit. DNA periferik kan plazma, amniyotik sıvı, beyin omurilik sıvısı
(likör), tükürük, orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri, bronkoalveoler lavaj, tam insan kanı, beyaz kan
hücreleri ve iç organlar biyopsi materyallerinden her örnek analizinin görüntülenmesine izin veren iç
kontrol (IC Glob- -globin gen DNA’sı) varlığında ekstrakte edilir.
Endojen iç kontrol (IC Glob - globin gen DNA) PCR analizi, malzeme örnekleme ve depolama
yeterliliği aşamalarının izlenmesini sağlar (DNA izolasyonu ve PCR amplifikasyonu). Ardından, CMV
DNA’sı spesifik primerler ve polimeraz (TaqF) kullanılarak amplifiye edilir.
Globin geni DNA’sı insan genomu DNA’sının bir parçasıdır ve hücrelerden elde edilen DNA
örneklerinde eşit miktarlarda bulunmalıdır. Her örnekte 20 000 genomdan az olmamalıdır ( 10 000
hücreden DNA). Plazma, liquor, amniyotik sıvı, balgam, bronş lavaj ve diğer DNA kontent materyali
içermeyen veya az miktarda içeren hücreler için Iç kontrol (IC) eklenir, her numune için amplifikasyon
kontrol olara iş görür, endojen IC (-globin geni) hücrelerden elde edilen bütün örneklerde (tam kan,
lökosit, biyopsi ve otopsi malzeme, tükürük, bezlerden) bulunur ve sadece analiz basamaklarını kontrol
etmeye değil aynı zamanda örneklerin işlenmesi ve depolanmasının kontrolünü de sağlar.
Real-time PCR’da amplifiye ürün floresans boya kullanılarak tespit edilir. Bu boyalar, termal döngü
sırasında amplifiye ürüne spesifik olarak bağlanan oligonükleotidlere bağlıdır. Real time döngüsü
boyunce floresans şiddetinin Real time görüntülemesi biriken ürünün PCR’dan sonra reaksiyon
tüplerini açma gerekliliği yaratmadan tespit edilmesi sağlanır. CMV Real-TM Quant PCR kiti
spesifik olmayan prime reaksiyonların büyük ölçüde sıklığını azaltan “hot-start” kullanır. "Hot-start"
kimyasal olarak modifiye polimeraz (TaqF) kullanarak nükleotidler ve Taq-polimeraz ayrılmasını ile
güvence altına alınmıştır. Kimyasal olarak modifiye edilmiş polimeraz (TaqF) 15 dakika boyunca 95 °
C'de ısıtma ile aktive edilir.
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
3. İÇERİK
Reaktif
Açıklama
Hacim (ml)
Miktar
PCR-mix-1-FL CMV
renksiz berrak sıvı
0.6
2 tüp
PCR-mix-2-Flu
renksiz berrak sıvı
0.3
2 tüp
Polimeraz (TaqF)
renksiz berrak sıvı
0.03
2 tüp
RNA-tamponu
renksiz berrak sıvı
0.6
1 tüp
DNA kalibratör QS1
renksiz berrak sıvı
0.2
1 tüp
DNA kalibratör QS2
renksiz berrak sıvı
0.2
1 tüp
RNA- tamponu
renksiz berrak sıvı
1.2
1 tüp
Negatif Kontrol(C–)*
renksiz berrak sıvı
1.2
2 tüp
Pozitif Kontrol DNA CMV/
renksiz berrak sıvı
0.1
2 tüp
İnsan DNA**
İç Kontrol(IC)***
renksiz berrak sıvı
0.6
2 tüp
* Ekstraksiyon prosedüründe Ekstraksiyon Negatif Kontrolü: 100 µl C– (Negatif Kontrol) NCE
etiketli;
** Ekstraksiyon prosedüründe Pozitif Kontrol Ekstraksiyon olarak kullanılmalı (PCE): 90 µl C–
(Negatif Kontrol) ve 10 µl DNA CMV/İnsan DNARec Poz kontrol PCE etiketli tüpe;
*** DNA Ekstraksiyon prosedürü sırasında 10 µl İç Kontrol STI-87 direk olarak örnek/lizis karışımına
ekleyin.
(bkz DNA/RNA Prep REF K2-9 ve DNA-sorb-В REF K-1-1/B protokolleri).
4. EK GEREKLİLİKLER
DNA ekstraksiyon kit.
Tek kullanımlık tozsuz eldiven ve laboratuvar önlüğü.
Pipetler (5’den 20 µlye ve 20’den 200 µlye ayarlanabilir).
Aerosol bariyerli steril pipet uçları ( 100 µl veya 200 µl).
Tüp rakları.
Vortex karıştırıcı/masaüstü santrifüjü.
2 mllik reaksiyon tüpleri için masaüstü rotorlu santrifüj. PCR kutusu.
Real Süre PCR cihazı
PCR veya PCR-plaka için tek kullanımlık polipropilen mikrotüp.
2-8 ° C için buzdolabı.
≤ -16 ° C için derin dondurucu.
Kullanılan pipet uçları için atık kutusu.
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
5. GENEL ÖNLEMLER
In Vitro Tanısal Tıbbi Cihaz
Sadece In Vitro Tanısal Kullanım için
Kullanıcı aşağıdakilere her zaman dikkat etmelidir:
Aerosol bariyerli pipet ucu kullanın ve her prosedür için farklı pipet ucu kullanın.
Amplikonları diğer reaktif ve ajanlardan uzakta ele alın.
Tespit prosedürüne başlamadan önce bütün reaktifleri oda sıcaklığına getirin.
Çözdükten sonra bileşenleri karıştırın ve kısaca santrifüj edin.
Numuneler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven ve göz koruması kullanın
laboratuvar önlüğü giyin. Sonrasında ellerinizi güzelce yıkayın.
Çalışma alannda yemek yemeyin, sıvı tüketmeyin, sigara içmeyin, makyaj yapmayın veya kontak
lenslerinizi çıkarıp-takmayın.
Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın.
Tüm örnekler ve kullanılmayan reaktifleri yerel düzenlemelere uygun olarak atın.
Örnekler uygun biyogüvenlik uygulamalarına uygun olarak potansiyel bulaşıcı olarak kabul edilmeli
ve bir biyolojik kabin içinde ele alınmalıdır.
% 0,5 'lik sodyum hipoklorit ya da diğer uygun bir dezenfektan kullanılarak bütün numune veya
reaktiflerin tüm döküntülerini temizleyin ve dezenfekte edin.
Deri, göz ve mukozanın örnek ve reaktiflerle temasından kaçının. Eğer özelti temas ederse, su ile
yıkayınız ve hemen bir doktora başvurun.
Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) istek üzerine sağlanır.
Bu ürünün kullanımı DNA amplifikasyonunda eğitilmiş personel ile sınırlı olmalıdır.
Labarotuvardaki çalışma akışı tek yönlü işlemelidir. Ekstraksiyon alanında başlamalı PCR ve
ardından tespit alanına doğru devam etmelidir. Önceki basamakların gerçekleştirildiği alanlara örnek,
ekipman ve reaktif taşımayın.
Kitin bazı bileşenleri koruyucu olarak Sodyum azid içerir. Reaktifin taşınması
sırasında metal tubing kullanmayın.
PCR analizi, nakliye ve depolama için biyolojik maddelerin örneklemesi
üreticinin el kitabında ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Bu el kitabının işin
başlamadan önce okunması tavsiye edilir.
6. ÖRNEKLERİN HAZIRLANMASI VE İŞLENMESİ
CMV Real-TM Quant aşağıdakilerden ekstrakte edilmiş DNA’lar ile çalışabilir:
Plazma:
CMV Real-TM Quant ile EDTA tüpleri kullanılabilir. Örnek tüpü üreticisinin talimatlarını
takip edin.
EDTA’da toplanan tam kan altı saat içerisinde plazma ve hücresel komponentlere ayrılması için
800-1600 x g’de 20 dakika santrifüj edin. zole edilmiş plazma, steril bir polipropilen tüp içine
transfer edilmek zorundadır. Plazma ek 3 gün boyunca 2-8 ° C'de saklanabilir. Alternatif olarak,
plazma bir aya kadar - 18°C’de ve bir yıla kadar da - 70°C’de saklanabilir.
Tam kanı
dondurmayın.
Sacace™
CMV
Real-TM Quant
VER 11.11.2011
Antikoagülan olarak heparin kullanılan kanlar bu teste uygun değildir.
Donmuş numuneleri kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin.
OTam kan 2-25°C ‘de transfer edilmeli ve toplandıktan sonra 6 saat içinde işlenmelidir. Plazma
2-8°C veya donmuş olarak transfer edilebilir.
Liquor (CSF) “Eppendorf” tüpe toplanması:
Liquor 2-8°C ‘de 1 gün saklanabilir. Alternatif olarak, -18°C’de bir aya kadar, -70°C’de bir yıla
kadar saklanabilir.
Amyonik sıvı “Eppendorf” tüpte toplanır:
1,0 ml örneği 8000-9000 x g’de 10 dakika santrifüj edin. Süpernatantı atın 200 µl çözelti bırakın.
Tüpü vorteksleyin, 100 µl DNA Ekstraksiyonu kullanın.
Beyaz kan hücreleri. Antikoagülant içeren tüplere standart prosedürüne uygun olarak 2.5-10 ml
kan örneği toplayın ( önerilen antikoagülan EDTA’dır). Örnekleri ~1500-2000 X g’de 10-15
dakika santrifüj edin. Bu kanı üst plazma katmanı orta kırmızı kan hücreleri katmanı ve buffy coat
olarak da adlandırılan ince bir ara yüzey halinde beyaz kan hücreleri katmanı olarak ayıracaktır.
Plazmayı bir pipet ile ayırın, bunu yaparken beyaz kan hücrelerini dağıtmamaya dikkat edin.
Beyaz kan hücresi sayısı yüksek olan örneklerde buffy coat daha kalın olacaktır. Açığa çıkmış
beyaz kan hücrelerinden 0.5 ml veya daha az almak için bir pipet kullanın. Görünen bütün buffy
coal materyalini yavaşça aspire edin. Beyaz kan hücrelerinin altta yatan kırmızı kan hücreleri ile
kontamine olması olasıdır.
Elde edilen lökosit örneği tüpüne 300 µl Lizis çözeltisi ekleyin
(DNA/RNA- Prep protokolü için).
Numuneler +2-8°C’de 12 saate kadar veya -20°C ile -80°C aralığında dondurularak saklanabilir .
Klinik örneklerin etyolojik ajanların taşınması işi için ülke, federal, eyalet ve yerel yönetmeliklere
uygun olmalıdır.
7. ÇALIŞMA KOŞULLARI
CMV Real-TM Quant PCR kit 18–25 °C’de kullanılmalıdır.
8. PROTOKOL
8.1. DNA Ekstraksiyonu
Aşağıdaki nükleik asit ekstraksiyon kitlerinin kullanılması önerilir:
DNA/RNA-prep, REF K-2-9.
DNA-sorb-В, REF K-1-1/B.
DNA’yı üreticinin talimatlarına uygun olarak ekstrakte edin.
DNA, bütün örneklerden iç kontrol varlığında ekstrakte edilmiştir (İç Kontrol
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
IC (her örneğe 10 µl IC eklenmiştir)).
C– ile etiketlenmiş tüpe 100 µl Negatif Kontrol ekleyin.
PCE ile etiketlenmiş tüpe 90 µl Negatif Kontrolve 10 µl Pos DNA
CMV/İnsan DNAekleyin.
8.2. PCR Hazırlığı
Toplam reaksiyon hacmi 25 µl, DNA örneği hacmi 10 µl’dir.
8.2.1 PCR için Tüp Hazırlığı
1.
PCR-mix-2-Flu ve polimeraz (TaqF) karışımını hazırlayın. Polimeraz (TaqF) (30 µl)
içeren tüpün içeriğini PCR-mix-2-FRT (300 µl) içeren tüpe transfer edin ve köpüklenmesine izin
vermeden karıştırın.
Hazırlanan karışım 60 numune analizi için tasarlanmıştır. Karışım 2 ºC ile 8 ºC’de
3 aya kadar saklanabilir. İhtiyaç olduğunda kullanın.
Karışım 3 aya kadar kullanılamazsa daha küçük miktarlarda hazırlayın. Örneğin,
150 µl PCR-mix-2-FRT ve 15 µl polimeraz (TaqF) karıştırın. Hazırlanan karışım
30 numune analizi için tasarlanmıştır.
2. Reaksiyon karışımını hazırlayın. Nitel biçiminde bile bir klinik DNA örneği analizi için, bu PCR
Amplifikasyon aşamasında iki kontrolü de çalışmanın gerekli olduğunu unutmayın: Pozitif Kontrol
(DNA kalibratörü QS2) ve Amplifikasyon Negatif Kontrolü (RNA-tamponu). Bir klinik DNA
örneğinin kantitatif formatı için dahi PCR Amplifikasyonunda 5 kontrol çalışılmalıdır: Iki kalibratör
(QS1 ve QS2) ikişer halde ve Amplifikasyon Negatif Kontrolü (RNA-tamponu). Buna ek olarak,
ekstra bir reaksiyon için reaktifler almalıdır.
3.
Bileşim aşağıdaki oranlara yeni bir tüp içinde önceden hazırlanmış PCR-mix-1-FL CMV ve
PCR-mix-2-Flu karışımını ve polimeraz (TaqF)’I karıştırın.
10 µl PCR-mix-1-FL CMV,
5 µl PCR-mix-2-FRT ve polimeraz (TaqF).
Klinik ve kontrol örnekleri için gerekli reaksiyon sayısını hesaplayın. Bkz ek 1.
Eğer 60 örnek eş zamanlı analiz edilirse, karışım hazırlanmasının
basitleştirilmiş bir versiyonu kullanılabilir: PCR-mix-2-Flu ile dolu olan ve
Polimeraz (TaqF) ile dolu olan tüplerin içeriğini PCR-mix-1-FL CMV
screen/monitor içeren tüpe boşaltın.
4. Klinik ve kontrol DNA örneklerinin Amplifikasyonu için gerekli miktarda tüp alın.
Her tüpe 15 µl karışım koyun.
5. Klinik veya kontrol örneklerinden elde edilen 10 µl DNA reaksiyon karışımı bulunan tüplere
ekleyin.
6. Kalitatif analiz için:
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
NCA
- 10 µl RNA-buffer NCA (Amplifikasyon Negatif Kontrol) etiketli tüpe ekleyin.
C+
- 10 µl DNA kalibratörü QS2 , C+ (Pozitif Kontrol Amplifikasyon) etiketli tüpe ekleyin.
Kantitatif analiz için:
NCA
- 10 µl RNA-tamponu NCA (Negatif Kontrol Amplifikasyon) etiketli tüpe ekleyin.
Standartlar
QS1 & QS2
- 10 µl QS1 iki tüpe ve 10 µl QS2 diğer iki tüpe ekleyin.
8.2. 2. Amplifikasyon
1. Termocyclerı üretici manueli, rehberler ve Tablo 1 ve 2’ye göre programlayın.
2.
Cihazınızda ısı profilini aşağıdaki gibi oluşturun:
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
Tablo 1
Basamaklar
Bekle
Döngü 1
Döngü 2
Sıcaklık,
°С
95
95
60
72
95
Rotor-tip cihazlar için program1
Süre
15 dak
5s
20 s
15 s
5s
60
20 s
72
15 s
Floresans tespiti
–
–
–
–
–
FAM/Yeşil, JOE/Sarı,
ROX/Orange
–
Döngü
tekrarı
1
5
40
Tablo 2
Plate veya modüler tip cihazlar için program
Step
1
Sıcaklık,
°С
95
95
60
72
95
Süre
15 dak
5s
20 s
15 s
5s
Floresans tespiti
2
Döngü
tekrarı
1
–
–
2
–
5
–
–
FAM, HEX/JOE/Cy3,
3
60
30 s
40
ROX/Texas Kırmızısı
72
15 s
–
Floresans FAM/Yeşil, HEX/JOE/Cy3 Sarı ve ROX/Orange/Texas Kırmızısı florometre
kanallarında ikinci basamakta (60 °C) tespit edilir.
1
For example, Rotor-Gene 6000/Q (Qiagen), or equivalent.
2 For example, iQ5™ (BioRad); Mx3005P™ (Stratagene), ABI® 7300/7500/StepOne (Applied), SmartCycler®
(Cepheid), LineGeneK® (Bioer) or equivalent.
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
9. VERİ ANALİZLERİ
β-Globin geni DNA (IC Glob) FAM/Yeşil kanalda tespit edilir, CMV DNA (Pozitif Kontrol DNA
CMV ve insan DNA) , JOE/HEX/Sarı kanalında , İç Kontrol STI-87 (IC) DNA, ROX/Orange
kanalında tespit edilir.Hücre süspansiyonundan (tam kan, beyaz kan hücreleri, iç organlar biyopsi)
toplam DNA izole edilirse, sonuçlar iki kanalda tespit edilir - β-globin gene DNA (IC Glob)
FAM/Yeşil kanalında, CMV DNA, JOE/HEX/Sarı/Cy3 kanalında.
Eğer periferik kan plazma, amniyotik sıvı, beyin omurilik sıvısı (likör), tükürük, orofaringeal sürüntü,
idrar örnekleri ve bronşalveol lavajdan izole edilen toplam DNA İç kontrol örnekleri ile izole
edilmişse sonuçlar iki kanalda tespit edilir: CMV DNA, JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında, İç Kontrol(IC)
DNA, ROX/Orange/Texas Red kanalında.
Sonuçların Yorumlanması
Sonuçlar eşik hattı ile floresan eğrisinin çakışmasına göre (ya da çakışmamasına ) aygıtın yazılımı
tarafından yorumlanır.
Hücre süspansiyonundan (tam kan, beyaz kan hücreleri, iç organlar biyopsi) toplam DNA
ekstrakte edilir ise sonuçlar aşağıdaki şekilde yorumlanır:
1. CMV DNAsı için örneklerin pozitif sayılması: JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalındaki bir Ct değeri pozitif
sonuç Ct değerini aşmaz ise (Ct< 38). Floresans eğrisi eşik çizgisi ile üstel büyüme bölgesindenda
çakışmalıdır.
2. Kalitatif analiz için, CMV DNA’nın Ct değeri JOE/HEX/Sarı/Cy3 kanalında sonuç sisteminde
tanımlanmamışsa ve FAM/Yeşil kanalındaki Ct değerlri 38’I geçmemiş ise örnek negatif sayılır.
Kantitatif analiz için, CMV DNA’nın Ct değeri JOE/HEX/Sarı kanalında sonuç sisteminde
tanımlanmamışsa ve IC Glob DNA miktarı reaksiyon başına 2000 kopyadan fazla ise reaksiyon
negatif sayılır.
3. Kalitatif analiz için, Ct değeri JOE/HEX/Sarı kanalında sonuç sisteminde tanımlanmamışsa ve
FAM/Yeşil kanalındaki Ct değerlri 38’I geçmemiş ise örnek geçersiz sayılır.
Kantitatif analiz için, Ct değeri JOE/HEX/Sarı/cy3 kanalında sonuç sisteminde tanımlanmamışsa ve
IC Glob DNA miktarı reaksiyon başına 2000 kopyadan az ise reaksiyon geçersiz sayılır. Bu durumda
örneğin PCR amalizi tekrarlanmalıdır.
4. JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Ct değeri sınır Ct değerini geçen (> 38), örnekler belirsiz sayılır.
Bu DNA örnekleri ikişer adet çalışılmalıdır. Eğer tekrarlanabilir bir Ct değeri elde edilirse sonuç
pozitif sayılılr. Eğer sonuçlar iki çalışmada onaylanmazsa geçersiz sayılır.
Kalitatif analiz için, FAM/Yeşil kanalındaki Ct değeri 38’I aşarsa , negatif sonuç geçersiz sayılır.
Kantitatif analiz için , IC Glob DNA miktarı is 2000 kopya/reaksiyondan az ise kantitatif negatif
veya pozitif sonuç geçersiz sayılır.
Kalitatif analiz için, analizin sonuçları sadece amplifikasyon için hem pozitif hem negatif kontroller
ve ekstraksiyon negatif kontrol doğru ise güvenilir sayılır. Kantitatif analiz için, C+ ‘daki sonuçlar bu
CMV Real-TM Quant bilgi formunda belirtilen aralıkta olmalıdır.
Toplam DNA'nın hücre süspansiyonu ( insan tam kan, beyaz kan hücreleri ve iç organ biyopsisi
) izole edilmesi halinde sonuçlar;
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
Kanalda Ct
Kontrol
FAM/Yeşil
Kontrol
için yer
JOE/HEX/Sarı
Kantitatif
format
Kalitatif
format
Kantitatif
format
Neg
OK
Ct değeri veri
formunda
belirtilen aralıkta
OK
Neg
OK
–
OK
NCE
DNA
Ekstraksiyon,
Amplifikasyon
Neg
Neg
Neg
PCE
DNA
Ekstraksiyon,
Amplifikasyon
Pos
(< sınır
değer)
Pos
(< sınır
değer)
Pos
(< sınır
değer)
NCA
Amplifikasyon
Neg
C+
Amplifikasyon
Neg
Pos
(< sınır
değer)
Neg
Pos
(< sınır
değer)
QS1,QS2
Amplifikasyon
Yorumlama
Kalitatif
format
–
–
Ct değeri ve
hesaplanan
konsantrasyon
belirlenmiş
–
Ct değeri ve
hesaplanan
konsantrasyon
belirlenmiş
OK
Kantitatif analizlerde, toplam DNA İnsan bütün kanı, beyaz kan hücreleri ve biyopsi malzemeden
ekstrakte edildi ise , kontrol ve test örneklerinde standart hücre miktarı başına CMV DNA (105) bir
log konsantrasyonu aşağıdaki formülle hesaplanır:
log { PCR örneğindeCMV DNA kopyaları x 2*105}= log {CMV DNA kopya/105 hücre}.
Glob DNA kopyaları PCR örneğinde
Standart hücre miktarı (örneğin, 105 için) başına CMV DNA konsantrasyonu ifade etmek için,
aşağıdaki hesaplama oranı kullanın:
105 hücre = 2*105 insan genomik eşdeğeri
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
Toplam DNA, Periferik kan plazmasından, amniyotik sıvı, beyin omurilik sıvısı (likör),
tükürük, orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri ve bronkoalveoler lavajdan izole ise, sonuçlar
aşağıdaki gibi yorumlanır:
1.
Ct değeri JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında sonuç sisteminde tanımlanan pozitif sonuç Ct değerini
(< 38) aşmaz ise, örnek CMV DNA için pozitif sayılır. Floresan eğrisi eşik çizgisi ile katlanarak
büyüme bölgesinde çakışmalıdır.
2.
Ct değeri JOE/HEX/Sarı/Cy3 kanalında sonuç sisteminde tanımlanmaz ve ROX/Orange /Texas
Red kanalındaki sonuç sisteminde Ct değeri < 38 ise örnek CMV DNA için negatif sayılır.
3.
Ct değeri JOE/HEX/Sarı/Cy3 kanalında sonuç sisteminde tanımlanmaz ve ROX/Orange /Texas
Red kanalındaki sonuç sisteminde Ct değeri > 38 ise Analiz sonuçları geçersiz sayılır. Bu tip klinik
örnekler için PCR analizi tekrarlanmalıdır.
4.
JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Ct değeri sınır Ct değerini geçen (> 38), örnekler belirsiz sayılır.
Bu DNA örnekleri ikişer adet çalışılmalıdır. Eğer tekrarlanabilir bir Ct değeri elde edilirse sonuç
pozitif sayılılr. Eğer sonuçlar iki çalışmada onaylanmazsa geçersiz sayılır.
Kalitatif analiz için, analizin sonuçları sadece amplifikasyon için hem pozitif hem negatif kontroller
ve ekstraksiyon negatif kontrol doğru ise güvenilir sayılır. Kantitatif analiz için, C+ ‘daki sonuçlar bu
CMV Real-TM Quant bilgi formunda belirtilen aralıkta olmalıdır.
Tablo. Toplam DNA’nın periferik kan, amniyon sıvısı, beyin omurilik sıvısı (likör), tükürük,
orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri ve bronşalveol lavaj örneklerinden iç kontrol ile birlikte
izole edildiği durumda kontroller için sonuçlar:
Kanalda Ct
Kontrol
NCE
PCE
Kontrol içi yer
DNA
Ekstraksiyon,
Amplifikasyon
DNA
Ekstraksiyon,
Amplifikasyon
NCA
Amplifikasyon
C+
Amplifikasyon
QS1,QS2
Amplifikasyon
JOE/HEX/Sarı/Cy3
ROX/Orange/Texas Red
Kalitatif
format
Kantitatif
format
Neg
Neg
Pos
(< sınır
değer)
Neg
Pos
(< sınır
değer)
–
Yorumlama
Kalitatif
format
Pos
(< sınır
değer)
Kantitatif
format
Pos
(< sınır
değer)
Ct değeri Veri
Kartında
belirtilen
aralığındadır
Pos
(< sınır
değer)
Pos
(< sınır
değer)
OK
Neg
Neg
Pos
(< sınır
değer)
Neg
OK
–
OK
–
Ct değeri ve
hesaplanan,
konsantrasyon
belirlenen
–
Ct değeri ve
hesaplanan,
konsantrasyon
belirlenen
OK
OK
Kantitatif analizlerde, toplam DNA periferik kan, amniyon sıvısı, beyin omurilik sıvısı (likör), tükürük,
orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri ve bronşalveol lavaj örneklerinden ekstrakte edildi ise , örnek
başına CMV DNA (КP CMV DNA) bir log konsantrasyonu aşağıdaki formülle hesaplanır:
КP CMV DNA = КCMV DNA/ КIC х IC katsayı (kopya/ml)
КCMV DNA , DNA örneğindeki CMV DNA kopya sayısıdır;
Кic DNA örneğinde IC DNA kopya sayısıdır;
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
IC katsayısı DNA örneğindeki IC DNA’sı kopyası ile ilgilidir. Reaktif kitinin her lotu ile verilen
Veri Formu CMV Real-TM Quant için belirtilir. Bu katsayı her bir lot için özeldir.
CMV Real-TM Quant PCR kiti İç Kontrol IC (insan beta- globine gen) içerir, hücresel materyalin
varlığını kontrol eder. Eğer örnek doğru şekilde hazırlanmamışsa veya epitel hücre miktarı yetersizse
İç Kontrol tespit edilmez.
Ekstraksiyonun Negatif Kontrolü (NCE), Ekstraksiyonun Pozitif Kontrolü (PCE), Negatif
Amplifikasyon Kontrol (NCA), Pozitif Amplifikasyon Kontrol (C+) her çalışmada bulunmalıdır. Eğer
kontroller beklenen aralığın dışında ise ( Kontroller için sonuçlar tablosuna bakın) bütün numune ve
kontroller örnek hazırlığı aşamasından itibarren yeniden işlenmelidir.
10. PROBLEMLERİN GİDERİLMESİ
Analiz sonuçları aşağıdaki durumlarda dikkate alınmaz:
1. JOE/Sarı/HEX/Cy3 FAM/Yeşil,
ve ROX/Orange/Texas kanallarında Negati Kontrol
Amplifikasyon (NCA) sonuçları için elde edilen tabloda herhangi bir Ct varlığı ve
JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Negatif Kontrol Ekstraksiyon (C–) için gözlenen herhangi bir Ct
varlığı reaktif veya örneklerde kontaminasyon olduğunu gösterir. Bu durumda, CMV DNA’nın
tespit edildiği yerde PCR analizi bütün örnekler için DNA ekstraksiyon basamağından
başlanarak tekrarlanmalıdır.
2. Kalitatif analiz için, (QS2) in JOE/Sarı/HEX/Cy3 (CMV), FAM/Yeşil, veya ROX/Orange/Texas
Red kanallarında Pozitif Kontrol Amplifikasyon (QS2) sonuç tablosunda Ct değeri yoksa, CMV
DNA’nın tespit edilemediği yerde bütün örnekler için amplifikasyonu tekrarlamak gereklidir.
3. JOE/Sarı/HEX/Cy3 (CMV), FAM/Yeşil, veya ROX/Orange/Texas Red kanallarında Pozitif
Kontrol Ekstraksiyon (Pozitif Kontrol DNA CMV ve insan DNAsı) için sonuç tablosunda Ct
değeri yoksa, analiz bütün örnekler için geçersiz sayılır. PCR analizinin bu sonuçlar için
tekrarlanması gerekir.
4. JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Ct değeri yok ise veya sınır Ct değerinin üzerinde ise is ve
FAM/Yeşil and ROX/Orange kanalları için örnek için Ct değeri IC için maximum Ct değerinden
fazla ise, analizin DNA ekstraksiyon basamağından başlanarak tekrarlanması gereklidir. Bu hata
klinik materyallerin yanlış muamele görmesi sebebiyle DNA kaybından veya PCR inhibitörü
varlığı sebebiyle olabilir.
5. JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Örnek için Ct değeri yoksa veya eşik Ct değerini (> 38) aşmış ise ve
FAM/Yeşil ve ROX/Orange kanalında örnek için Ct değeri eşik Ct değerinde aşağı ise, sonuç
belirsiz sayılır. Bu örneklerin analizi çiftler halinde tekrarlanmalıdır. Eğer tekrarlanabilir Ct değeri
elde edilir ise, sonuç pozitif sayılır; aksi durumda, sonuç belirsizdir.
JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Ct değeri yok ise veya sınır Ct değerinin üzerinde ise is ve
FAM/Yeşil and ROX/Orange kanalları için örnek için Ct değeri IC için maximum Ct değerinden
fazla ise, analizin DNA ekstraksiyon basamağından başlanarak tekrarlanması gereklidir. Bu hata
klinik materyallerin yanlış muamele görmesi sebebiyle DNA kaybından veyaVER
PCR
inhibitörü varlığı
Sacace™ CMV Real-TM Quant
11.11.2011
sebebiyle olabilir.
11. TRANSFER
CMV Real-TM Quant PCR kit 2–8 ºC’de 5 günden uzun sürmeyecek şekilde transfer
edilmelidir.
12. KARARLILIK VE DEPOLAMA
CMV Real-TM Quant PCR kitinin bütün bileşenleri kullnılmadıkları zaman -20ºC’de saklanmalıdır.
CMV Real-TM Quant PCR kitinin bütün bileşenleri etiketlerinin üzerinde yazan son kullanma tarihine
kadar kararlıdır. Aksi belirtilmediği sürece, reaktiflerin ilk kullanımdan önce ve sonraki raf ömrü
aynıdır.
PCR-mix-1-FL CMV screen/monitor ışıktan korunmalıdır.
13. ÜRÜN KULLANIM KISITLAMALARI
Tüm reaktifler sadece in vitro diagnostik olarak kullanılabilir. Bu ürünün kullanımı DNA amplifikasyon
teknikleri konusunda eğitim personeli (EN375) ile sınırlı olmalıdır. Kullanım kılavuzu ile tam uyumlu
PCR çalışması en iyi sonuçlar için gereklidir. Bileşenlerin kutu ve etiketleri üzerinde yazılı son
kullanma tarihlerine dikkat edilmelidir. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın.
14. KALİTE KONTROL
Ürün kalitesinden emin olmak için Sacace’s ISO 13485- Sertifikalı Kalite Yönetim Sistemi ile uyumlu
olarak, her lot önceden belirlenmiş özelliklere uygun olarak test edilmiştir.
15. ÖZELLİKLER
15.1 Hassasiyet
CMV Real-TM Quant PCR kitin doğrusal aralığı 500–10.000.000 kopya/ml’dir. Eğer sonuçlar
500.000 kopya/ml’den büyük ise, bu sonucun 10.000.000 CMV DNA kopya/ml’den fazla olduğunu
gösterir. Eğer sonuç 500 kopya/ml’den az ise, bu the result is less than 500 CMV DNA copy/ml
şeklinde belirtilecektir.
CMV Real-TM Quant PCR kitinin analitik hassasiyeti aşağıdaki tabloda verilmiştir:
Klinik materyalin tipi
Periferik kan plazması, amniyotik sıvı, beyin
omurilik sıvısı (likör), tükürük, orofaringeal
sürüntü, idrar örnekleri, bronşalveol lavaj
Tam insan kanı, beyaz kan hücreleri, iç
organ biyopis materyali
Sacace™ CMV Real-TM Quant
Nükleik asit
ekstraksiyon kiti
Hassasiyet
DNA/RNA-prep
400 kopya/ml
DNA/RNA-prep
105 hücre başına5 CMV DNA
kopya
VER 11.11.2011
15.2 Özgünlük
CMV Real-TM Quant PCR kiti insan sitomegalovirüs (CMV) DNA’sı tespiti için kullanılır. CMV
Real-TM Quant PCR kiti spesifik aktivitesi, CMV referans suşu AD 169 ve amplifikasyon
fragmanlarının diziliminden elde edilen sonuçlar ile onaylanır. Diğer virülerin DNA’sı (Epstein-Barr
virüsü, herpes simpleks virüsü tip 1 ve 2, insan herpes virüsü tip 6 ve 8, Varisella Zoster Virüs,
Parvovirus B19, ve diğerleri) ve bakteriyel patojenler (Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogene,
Streptococcus agalactiae, ve diğerleri), ile ilgili olarak PCR kit içeriğinin aktivite göstermez.
REFERANSLAR
PCR detection of cytomegalovirus DNA in serum as a diagnostic test for congenital cytomegalovirus infection. C T
Nelson, A S Istas, M K Wilkerson, and G J Demmler. J Clin Microbiol. 1995 December; 33(12): 3317–3318.
Detection of Cytomegalovirus DNA in Peripheral Blood of Patients Infected with İnsan Immunodeficiency Virus. D.
Shibata, W. John Martin, Maria D. Appleman, Dennis M. Causey, J. M. Leedom, N. Arnheim. J Infect Dis.
(1988) 158 (6): 1185-1192.
Multiplex PCR for six herpesviruses after hematopoietic stem cell transplantation. Sawada A, Koyama-Sato M,
Yasui M, Kondo O, Ishihara T, Takeshita Y, Okamura T, Nishikawa M, Inoue M, Kawa Pediatr Int. 2011 Aug 2. doi:
10.1111/j.1442-200X.2011.03437.
Cytomegalovirus Infections in Non-immunocompromised and Immunocompromised Patients in the Intensive
Care Unit. Florescu DF, Kalil AC. Infect Disord Drug Targets. 2011 Jun 16.
Comparison of PCR, Antigenemia Assay, and Rapid Blood Culture for Detection and Prevention of
Cytomegalovirus Disease after Lung Transplantation. Adriana Weinberg, Tony N. Hodges, Shaobing Li, Guanyung
Cai, M. R. Zamora. Journal of Clinical Microbiology, February 2000, p. 768-772, Vol. 38, No. 2
Optimization of Quantitative Detection of Cytomegalovirus DNA in Plasma by Real-Süre PCR. Michael Boeckh,
MeeiLi Huang, James Ferrenberg, Terry Stevens-Ayers, Laurence Stensland, W. Garrett Nichols, and Lawrence
Corey. Journal of Clinical Microbiology, March 2004, p. 1142-1148, Vol. 42, No. 3
Quantification of İnsan Cytomegalovirus DNA by Real-Süre PCR. Elyanne Gault,Yanne Michel, Axelle Dehée,
Chahrazed Belabani, Jean-Claude Nicolas, Antoine Garbarg-Chenon. J Clin Microbiol. 2001 February; 39(2): 772
Definitions of Cytomegalovirus Infection and Disease in Transplant Recipients. Per Ljungman, Paul Griffiths,
Carlos Paya, …Clin Infect Dis. (2002) 34 (8): 1094-1097
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
KULLANILAN SEMBOLLER İÇİN ANAHTAR
Liste Numarası
Dikkat!
Lot Numarası
<n> test için yeterli
içerik
In Vitro Tanısal Kullanım için
Versiyon
Saklama Koşulları
NCA
Negatif Kontrol
Amplifikasyon
Üretici
C–
Negatif Kontrol
Ekstraksiyon
C+
Pozitif Kontrol
Amplifikasyon
Kullanım Klavuzuna bkz
Son Kullanma Tarihi
IC
İç Kontrol
NOT
*iQ5™ , Bio-Rad Laboratories’in ticari markasıdır.
* Rotor-Gene™ Technology ,Qiagen’in ticari markasıdır.
* MX3005P® ,Agilent Technologies’in ticari markasıdır.
*ABI® ,Applied Biosystems’in ticari markasıdır.
* LineGeneK® ,Bioer’in ticari markasıdır.
* SmartCycler® ,Cepheid’in ticari markasıdır.
Sacace Biotechnologies Srl
via Scalabrini, 44 – 22100 – Como – Italy Tel
+390314892927 Fax +390314892926
mail: [email protected] web: www.sacace.com
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011