CMV Real-TM Quant

In Vitro Diagnostic Kullanım
Sadece Profesyonel Kullanım için
CMV Real-TM Quant
El Kitabı
Sitomegalovirüs (CMV) Kantitatif Tespiti için Real
Time PCR Testi
REF V7-100/2FRT
100
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
1. KULLANIM AMACI
CMV Real-TM Quant PCR kiti klinik materyallerdeki (periferik kan plazma, amniyotik sıvı, beyin
omurilik sıvısı (likör), tükürük, orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri, bronkoalveoler lavaj, tam insan
kanı, beyaz kan hücreleri ve iç organlar biyopsi materyali) gerçek zamanlı hibridizasyon-floresans
temeline dayanarak insan sitomegalovirüs DNA’sının tespit edilmesini ve kantifikasyonunu sağlayan in
vitro nükleik asit amplifikasyon testidir.
PCR analizinin sonuçları hastalığın kompleks tanısı beraberinde dikkate alınır.
2. PCR TESPİTİNİN İLKELERİ
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve hibridizasyon floresans tespit ile CMV tespiti üç aşama içerir:
klinik örnekten DNA ekstraksiyonu, pathojen genom spesifik bölgenin PCR-amplifikasyonu ve realSüre hibridizasyon floresans tespit. DNA periferik kan plazma, amniyotik sıvı, beyin omurilik sıvısı
(likör), tükürük, orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri, bronkoalveoler lavaj, tam insan kanı, beyaz kan
hücreleri ve iç organlar biyopsi materyallerinden her örnek analizinin görüntülenmesine izin veren iç
kontrol (IC Glob- -globin gen DNA’sı) varlığında ekstrakte edilir.
Endojen iç kontrol (IC Glob - globin gen DNA) PCR analizi, malzeme örnekleme ve depolama
yeterliliği aşamalarının izlenmesini sağlar (DNA izolasyonu ve PCR amplifikasyonu). Ardından, CMV
DNA’sı spesifik primerler ve polimeraz (TaqF) kullanılarak amplifiye edilir.
Globin geni DNA’sı insan genomu DNA’sının bir parçasıdır ve hücrelerden elde edilen DNA
örneklerinde eşit miktarlarda bulunmalıdır. Her örnekte 20 000 genomdan az olmamalıdır ( 10 000
hücreden DNA). Plazma, liquor, amniyotik sıvı, balgam, bronş lavaj ve diğer DNA kontent materyali
içermeyen veya az miktarda içeren hücreler için Iç kontrol (IC) eklenir, her numune için amplifikasyon
kontrol olara iş görür, endojen IC (-globin geni) hücrelerden elde edilen bütün örneklerde (tam kan,
lökosit, biyopsi ve otopsi malzeme, tükürük, bezlerden) bulunur ve sadece analiz basamaklarını kontrol
etmeye değil aynı zamanda örneklerin işlenmesi ve depolanmasının kontrolünü de sağlar.
Real-time PCR’da amplifiye ürün floresans boya kullanılarak tespit edilir. Bu boyalar, termal döngü
sırasında amplifiye ürüne spesifik olarak bağlanan oligonükleotidlere bağlıdır. Real time döngüsü
boyunce floresans şiddetinin Real time görüntülemesi biriken ürünün PCR’dan sonra reaksiyon
tüplerini açma gerekliliği yaratmadan tespit edilmesi sağlanır. CMV Real-TM Quant PCR kiti spesifik
olmayan prime reaksiyonların büyük ölçüde sıklığını azaltan “hot-start” kullanır. "Hot-start" kimyasal
olarak modifiye polimeraz (TaqF) kullanarak nükleotidler ve Taq-polimeraz ayrılmasını ile güvence
altına alınmıştır. Kimyasal olarak modifiye edilmiş polimeraz (TaqF) 15 dakika boyunca 95 ° C'de
ısıtma ile aktive edilir.
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
3. İÇERİK
Reaktif
Açıklama
Hacim (ml)
Miktar
PCR-mix-1-FL CMV
PCR-mix-2-Flu
renksiz berrak sıvı
renksiz berrak sıvı
0.6
0.3
2 tüp
2 tüp
Polimeraz (TaqF)
renksiz berrak sıvı
0.03
2 tüp
RNA-tamponu
renksiz berrak sıvı
0.6
1 tüp
DNA kalibratör QS1
renksiz berrak sıvı
0.2
1 tüp
DNA kalibratör QS2
renksiz berrak sıvı
0.2
1 tüp
RNA- tamponu
renksiz berrak sıvı
1.2
1 tüp
Negatif Kontrol(C–)*
renksiz berrak sıvı
1.2
2 tüp
Pozitif Kontrol DNA CMV/
İnsan DNA**
renksiz berrak sıvı
0.1
2 tüp
İç Kontrol(IC)***
renksiz berrak sıvı
0.6
2 tüp
* Ekstraksiyon prosedüründe Ekstraksiyon Negatif Kontrolü: 100 µl C– (Negatif Kontrol) NCE
etiketli;
** Ekstraksiyon prosedüründe Pozitif Kontrol Ekstraksiyon olarak kullanılmalı (PCE): 90 µl C–
(Negatif Kontrol) ve 10 µl DNA CMV/İnsan DNARec Poz kontrol PCE etiketli tüpe;
*** DNA Ekstraksiyon prosedürü sırasında 10 µl İç Kontrol STI-87 direk olarak örnek/lizis karışımına
ekleyin.
(bkz DNA/RNA Prep REF K2-9 ve DNA-sorb-В REF K-1-1/B protokolleri).
4. EK GEREKLİLİKLER
DNA ekstraksiyon kit.
Tek kullanımlık tozsuz eldiven ve laboratuvar önlüğü.
Pipetler (5’den 20 µlye ve 20’den 200 µlye ayarlanabilir).
Aerosol bariyerli steril pipet uçları ( 100 µl veya 200 µl).
Tüp rakları.
Vortex karıştırıcı/masaüstü santrifüjü.
2 mllik reaksiyon tüpleri için masaüstü rotorlu santrifüj. PCR kutusu.
Real Süre PCR cihazı
PCR veya PCR-plaka için tek kullanımlık polipropilen mikrotüp.
2-8 ° C için buzdolabı.
≤ -16 ° C için derin dondurucu.
Kullanılan pipet uçları için atık kutusu.
5. GENEL ÖNLEMLER
In Vitro Tanısal Tıbbi Cihaz
Sadece In Vitro Tanısal Kullanım için
Kullanıcı aşağıdakilere her zaman dikkat etmelidir:
Aerosol bariyerli pipet ucu kullanın ve her prosedür için farklı pipet ucu kullanın.
Amplikonları diğer reaktif ve ajanlardan uzakta ele alın.
Tespit prosedürüne başlamadan önce bütün reaktifleri oda sıcaklığına getirin. Çözdükten
sonra bileşenleri karıştırın ve kısaca santrifüj edin.
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
Numuneler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven ve göz koruması kullanın
laboratuvar önlüğü giyin. Sonrasında ellerinizi güzelce yıkayın.
Çalışma alannda yemek yemeyin, sıvı tüketmeyin, sigara içmeyin, makyaj yapmayın veya kontak
lenslerinizi çıkarıp-takmayın.
Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın.
Tüm örnekler ve kullanılmayan reaktifleri yerel düzenlemelere uygun olarak atın.
Örnekler uygun biyogüvenlik uygulamalarına uygun olarak potansiyel bulaşıcı olarak kabul edilmeli ve
bir biyolojik kabin içinde ele alınmalıdır.
% 0,5 'lik sodyum hipoklorit ya da diğer uygun bir dezenfektan kullanılarak bütün numune veya
reaktiflerin tüm döküntülerini temizleyin ve dezenfekte edin.
Deri, göz ve mukozanın örnek ve reaktiflerle temasından kaçının. Eğer özelti temas ederse, su ile
yıkayınız ve hemen bir doktora başvurun.
Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) istek üzerine sağlanır.
Bu ürünün kullanımı DNA amplifikasyonunda eğitilmiş personel ile sınırlı olmalıdır.
Labarotuvardaki çalışma akışı tek yönlü işlemelidir. Ekstraksiyon alanında başlamalı PCR ve ardından
tespit alanına doğru devam etmelidir. Önceki basamakların gerçekleştirildiği alanlara örnek, ekipman ve
reaktif taşımayın.
Kitin bazı bileşenleri koruyucu olarak Sodyum azid içerir. Reaktifin taşınması
sırasında metal tubing kullanmayın.
PCR analizi, nakliye ve depolama için biyolojik maddelerin örneklemesi
üreticinin el kitabında ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Bu el kitabının işin
başlamadan önce okunması tavsiye edilir.
6. ÖRNEKLERİN HAZIRLANMASI VE İŞLENMESİ
CMV Real-TM Quant aşağıdakilerden ekstrakte edilmiş DNA’lar ile çalışabilir:
Plazma:
CMV Real-TM Quant ile EDTA tüpleri kullanılabilir. Örnek tüpü üreticisinin talimatlarını takip
edin.
EDTA’da toplanan tam kan altı saat içerisinde plazma ve hücresel komponentlere ayrılması için 8001600 x g’de 20 dakika santrifüj edin. zole edilmiş plazma, steril bir polipropilen tüp içine transfer
edilmek zorundadır. Plazma ek 3 gün boyunca 2-8 ° C'de saklanabilir. Alternatif olarak, plazma bir
aya kadar - 18°C’de ve bir yıla kadar da - 70°C’de saklanabilir.
Tam kanı dondurmayın.
Antikoagülan olarak heparin kullanılan kanlar bu teste uygun değildir.
Donmuş numuneleri kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin.
OTam kan 2-25°C ‘de transfer edilmeli ve toplandıktan sonra 6 saat içinde işlenmelidir. Plazma 2-8°C
veya donmuş olarak transfer edilebilir.
Liquor (CSF) “Eppendorf” tüpe toplanması:
Liquor 2-8°C ‘de 1 gün saklanabilir. Alternatif olarak, -18°C’de bir aya kadar, -70°C’de bir yıla kadar
saklanabilir.
Amyonik sıvı “Eppendorf” tüpte toplanır:
1,0 ml örneği 8000-9000 x g’de 10 dakika santrifüj edin. Süpernatantı atın 200 µl çözelti bırakın. Tüpü
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
vorteksleyin, 100 µl DNA Ekstraksiyonu kullanın.
Beyaz kan hücreleri. Antikoagülant içeren tüplere standart prosedürüne uygun olarak 2.5-10 ml kan
örneği toplayın ( önerilen antikoagülan EDTA’dır). Örnekleri ~1500-2000 X g’de 10-15 dakika santrifüj
edin. Bu kanı üst plazma katmanı orta kırmızı kan hücreleri katmanı ve buffy coat olarak da
adlandırılan ince bir ara yüzey halinde beyaz kan hücreleri katmanı olarak ayıracaktır. Plazmayı bir
pipet ile ayırın, bunu yaparken beyaz kan hücrelerini dağıtmamaya dikkat edin. Beyaz kan hücresi
sayısı yüksek olan örneklerde buffy coat daha kalın olacaktır. Açığa çıkmış beyaz kan hücrelerinden 0.5
ml veya daha az almak için bir pipet kullanın. Görünen bütün buffy coal materyalini yavaşça aspire
edin. Beyaz kan hücrelerinin altta yatan kırmızı kan hücreleri ile kontamine olması olasıdır.
Elde edilen lökosit örneği tüpüne 300 µl Lizis çözeltisi ekleyin (DNA/RNA-
Prep protokolü için).
Numuneler +2-8°C’de 12 saate kadar veya -20°C ile -80°C aralığında dondurularak saklanabilir .
Klinik örneklerin etyolojik ajanların taşınması işi için ülke, federal, eyalet ve yerel yönetmeliklere
uygun olmalıdır.
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
7. ÇALIŞMA KOŞULLARI
CMV Real-TM Quant PCR kit 18–25 °C’de kullanılmalıdır.
8. PROTOKOL
8.1. DNA Ekstraksiyonu
Aşağıdaki nükleik asit ekstraksiyon kitlerinin kullanılması önerilir:
DNA/RNA-prep, REF K-2-9.
DNA-sorb-В, REF K-1-1/B.
DNA’yı üreticinin talimatlarına uygun olarak ekstrakte edin.
DNA, bütün örneklerden iç kontrol varlığında ekstrakte edilmiştir (İç Kontrol IC (her
örneğe 10 µl IC eklenmiştir)). C– ile etiketlenmiş tüpe 100 µl Negatif Kontrol ekleyin.
PCE ile etiketlenmiş tüpe 90 µl Negatif Kontrolve 10 µl Pos DNA CMV/İnsan
DNAekleyin.
8.2. PCR Hazırlığı
Toplam reaksiyon hacmi 25 µl, DNA örneği hacmi 10 µl’dir.
8.2.1 PCR için Tüp Hazırlığı
1.
PCR-mix-2-Flu ve polimeraz (TaqF) karışımını hazırlayın. Polimeraz (TaqF) (30 µl) içeren
tüpün içeriğini PCR-mix-2-FRT (300 µl) içeren tüpe transfer edin ve köpüklenmesine izin vermeden
karıştırın.
Hazırlanan karışım 60 numune analizi için tasarlanmıştır. Karışım 2 ºC ile 8 ºC’de 3
aya kadar saklanabilir. İhtiyaç olduğunda kullanın.
Karışım 3 aya kadar kullanılamazsa daha küçük miktarlarda hazırlayın. Örneğin, 150
µl PCR-mix-2-FRT ve 15 µl polimeraz (TaqF) karıştırın. Hazırlanan karışım 30
numune analizi için tasarlanmıştır.
2. Reaksiyon karışımını hazırlayın. Nitel biçiminde bile bir klinik DNA örneği analizi için, bu PCR
Amplifikasyon aşamasında iki kontrolü de çalışmanın gerekli olduğunu unutmayın: Pozitif Kontrol
(DNA kalibratörü QS2) ve Amplifikasyon Negatif Kontrolü (RNA-tamponu). Bir klinik DNA
örneğinin kantitatif formatı için dahi PCR Amplifikasyonunda 5 kontrol çalışılmalıdır: Iki kalibratör
(QS1 ve QS2) ikişer halde ve Amplifikasyon Negatif Kontrolü (RNA-tamponu). Buna ek olarak, ekstra
bir reaksiyon için reaktifler almalıdır.
3.
Bileşim aşağıdaki oranlara yeni bir tüp içinde önceden hazırlanmış PCR-mix-1-FL CMV ve
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
PCR-mix-2-FRT karışımını ve polimeraz (TaqF)’I karıştırın.
10 µl PCR-mix-1-FL CMV,
5 µl PCR-mix-2-FRT ve polimeraz (TaqF).
Klinik ve kontrol örnekleri için gerekli reaksiyon sayısını hesaplayın. Bkz ek 1.
Eğer 60 örnek eş zamanlı analiz edilirse, karışım hazırlanmasının basitleştirilmiş bir
versiyonu kullanılabilir: PCR-mix-2-Flu ile dolu olan ve Polimeraz (TaqF) ile dolu
olan tüplerin içeriğini PCR-mix-1-FL CMV
screen/monitor içeren tüpe boşaltın.
4. Klinik ve kontrol DNA örneklerinin Amplifikasyonu için gerekli miktarda tüp alın.
Her tüpe 15 µl karışım koyun.
5. Klinik veya kontrol örneklerinden elde edilen 10 µl DNA reaksiyon karışımı bulunan tüplere
ekleyin.
6. Kalitatif analiz için:
NCA
- 10 µl RNA-buffer NCA (Amplifikasyon Negatif Kontrol) etiketli tüpe ekleyin.
C+
- 10 µl DNA kalibratörü QS2 , C+ (Pozitif Kontrol Amplifikasyon) etiketli tüpe ekleyin.
Kantitatif analiz için:
NCA
- 10 µl RNA-tamponu NCA (Negatif Kontrol Amplifikasyon) etiketli tüpe ekleyin.
Standartlar
QS1 & QS2
- 10 µl QS1 iki tüpe ve 10 µl QS2 diğer iki tüpe ekleyin.
8.2. 2. Amplifikasyon
1. Termocyclerı üretici manueli, rehberler ve Tablo 1 ve 2’ye göre programlayın.
2.
Cihazınızda ısı profilini aşağıdaki gibi oluşturun:
Tablo 1
Rotor-tip cihazlar için program1
Sıcaklık,
°С
Basamaklar
Bekle
95
95
Döngü 1
60
72
Sacace™ CMV Real-TM Quant
Süre
15 dak
5s
20 s
15 s
Floresans tespiti
–
–
–
–
Döngü
tekrarı
1
5
VER 11.11.2011
95
Döngü 2
60
72
5s
20 s
15 s
–
FAM/Yeşil, JOE/Sarı,
ROX/Orange
–
40
Tablo 2
Plate veya modüler tip cihazlar için program2
Sıcaklık,
°С
95
95
60
72
95
Döngü
Floresans tespiti
tekrarı
–
1
–
2
5
–
–
–
FAM, HEX/JOE/Cy3,
3
40
ROX/Texas Kırmızısı
60
30 s
72
15 s
–
Floresans FAM/Yeşil, HEX/JOE/Cy3 Sarı ve ROX/Orange/Texas Kırmızısı florometre kanallarında
ikinci basamakta (60 °C) tespit edilir.
Step
1
Süre
15 dak
5s
20 s
15 s
5s
1 For example, Rotor-Gene 6000/Q (Qiagen), or equivalent.
2 For example, SaCycler-96™ (Sacace), iQ5™ (BioRad); Mx3005P™ (Stratagene), ABI®
7300/7500/StepOne (Applied), SmartCycler® (Cepheid), LineGeneK® (Bioer) or equivalent.
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
9. VERİ ANALİZLERİ
β-Globin geni DNA (IC Glob) FAM/Yeşil kanalda tespit edilir, CMV DNA (Pozitif Kontrol DNA CMV
ve insan DNA) , JOE/HEX/Sarı kanalında , İç Kontrol STI-87 (IC) DNA, ROX/Orange kanalında
tespit edilir.
Hücre süspansiyonundan (tam kan, beyaz kan hücreleri, iç organlar biyopsi) toplam DNA izole edilirse,
sonuçlar iki kanalda tespit edilir - β-globin gene DNA (IC Glob) FAM/Yeşil kanalında, CMV DNA,
JOE/HEX/Sarı/Cy3 kanalında.
Eğer periferik kan plazma, amniyotik sıvı, beyin omurilik sıvısı (likör), tükürük, orofaringeal sürüntü,
idrar örnekleri ve bronşalveol lavajdan izole edilen toplam DNA İç kontrol örnekleri ile izole edilmişse
sonuçlar iki kanalda tespit edilir: CMV DNA, JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında, İç Kontrol(IC) DNA,
ROX/Orange/Texas Red kanalında.
Sonuçların Yorumlanması
Sonuçlar eşik hattı ile floresan eğrisinin çakışmasına göre (ya da çakışmamasına ) aygıtın yazılımı
tarafından yorumlanır.
Hücre süspansiyonundan (tam kan, beyaz kan hücreleri, iç organlar biyopsi) toplam DNA
ekstrakte edilir ise sonuçlar aşağıdaki şekilde yorumlanır:
1. CMV DNAsı için örneklerin pozitif sayılması: JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalındaki bir Ct değeri pozitif
sonuç Ct değerini aşmaz ise (Ct< 38). Floresans eğrisi eşik çizgisi ile üstel büyüme bölgesindenda
çakışmalıdır.
2. Kalitatif analiz için, CMV DNA’nın Ct değeri JOE/HEX/Sarı/Cy3 kanalında sonuç sisteminde
tanımlanmamışsa ve FAM/Yeşil kanalındaki Ct değerlri 38’i geçmemiş ise örnek negatif sayılır.
Kantitatif analiz için, CMV DNA’nın Ct değeri JOE/HEX/Sarı kanalında sonuç sisteminde
tanımlanmamışsa ve IC Glob DNA miktarı reaksiyon başına 2000 kopyadan fazla ise reaksiyon negatif
sayılır.
3. Kalitatif analiz için, Ct değeri JOE/HEX/Sarı kanalında sonuç sisteminde tanımlanmamışsa ve
FAM/Yeşil kanalındaki Ct değerlri 38’I geçmemiş ise örnek geçersiz sayılır.
Kantitatif analiz için, Ct değeri JOE/HEX/Sarı/cy3 kanalında sonuç sisteminde tanımlanmamışsa ve IC
Glob DNA miktarı reaksiyon başına 2000 kopyadan az ise reaksiyon geçersiz sayılır. Bu durumda
örneğin PCR amalizi tekrarlanmalıdır.
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
4. JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Ct değeri sınır Ct değerini geçen (> 38), örnekler belirsiz sayılır. Bu
DNA örnekleri ikişer adet çalışılmalıdır. Eğer tekrarlanabilir bir Ct değeri elde edilirse sonuç pozitif
sayılılr. Eğer sonuçlar iki çalışmada onaylanmazsa geçersiz sayılır.
Kalitatif analiz için, FAM/Yeşil kanalındaki Ct değeri 38’I aşarsa , negatif sonuç geçersiz sayılır.
Kantitatif analiz için , IC Glob DNA miktarı is 2000 kopya/reaksiyondan az ise kantitatif negatif veya
pozitif sonuç geçersiz sayılır. Kalitatif analiz için, analizin sonuçları sadece amplifikasyon için hem pozitif
hem negatif kontroller ve ekstraksiyon negatif kontrol doğru ise güvenilir sayılır. Kantitatif analiz için, C+
‘daki sonuçlar bu CMV Real-TM Quant bilgi formunda belirtilen aralıkta olmalıdır.
Toplam DNA'nın hücre süspansiyonu ( insan tam kan, beyaz kan hücreleri ve iç organ biyopsisi )
izole edilmesi halinde sonuçlar;
Kanalda Ct
Kontrol
NCE
Kontrol için
yer
DNA
Ekstraksiyon
NCA
DNA
Ekstraksiyon,
Amplifikasyon
Amplifikasyon
C+
Amplifikasyon
PCE
QS1,QS2 Amplifikasyon
FAM/Yeşil
Kalitatif
format
Kantitatif
format
Neg
Neg
Pos
(< sınır
değer)
Neg
Pos
(< sınır
değer)
Pos
(< sınır
değer)
Neg
–
–
Ct değeri ve
hesaplanan
konsantrasyo
n belirlenmiş
JOE/HEX/Sarı
Kalitatif
Kantitatif
format
format
NCE
PCE
NCA
C+
QS1,QS2
DNA
Ekstraksiyon
Yorumlam
a
Kalitatif
Neg
Pos
(< sınır
değer)
Neg
Pos
Amplifikasyon (< sınır
değer)
DNA
Ekstraksiyon,
Amplifikasyon
Amplifikasyon
Amplifikasyon
–
Kantitatif analizlerde, toplam DNA İnsan bütün kanı, beyaz kan hücreleri ve biyopsi malzemeden ekstrakte
edildi ise , kontrol ve test örneklerinde standart hücre miktarı başına CMV DNA (105) bir log
konsantrasyonu aşağıdaki formülle hesaplanır:
log { PCR örneğindeCMV DNA kopyaları x 2*105}= log {CMV DNA kopya/105 hücre}.
Glob DNA kopyaları PCR örneğinde
Standart hücre miktarı (örneğin, 105 için) başına CMV DNA konsantrasyonu ifade etmek için, aşağıdaki
hesaplama oranı kullanın:
105 hücre = 2*105 insan genomik eşdeğeri
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
Toplam DNA, Periferik kan plazmasından, amniyotik sıvı, beyin omurilik sıvısı (likör), tükürük,
orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri ve bronkoalveoler lavajdan izole ise, sonuçlar aşağıdaki gibi
yorumlanır:
1.
Ct değeri JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında sonuç sisteminde tanımlanan pozitif sonuç Ct değerini (<
38) aşmaz ise, örnek CMV DNA için pozitif sayılır. Floresan eğrisi eşik çizgisi ile katlanarak büyüme
bölgesinde çakışmalıdır.
2.
Ct değeri JOE/HEX/Sarı/Cy3 kanalında sonuç sisteminde tanımlanmaz ve ROX/Orange /Texas
Red kanalındaki sonuç sisteminde Ct değeri < 38 ise örnek CMV DNA için negatif sayılır.
3.
Ct değeri JOE/HEX/Sarı/Cy3 kanalında sonuç sisteminde tanımlanmaz ve ROX/Orange /Texas
Red kanalındaki sonuç sisteminde Ct değeri > 38 ise Analiz sonuçları geçersiz sayılır. Bu tip klinik
örnekler için PCR analizi tekrarlanmalıdır.
4.
JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Ct değeri sınır Ct değerini geçen (> 38), örnekler belirsiz sayılır. Bu
DNA örnekleri ikişer adet çalışılmalıdır. Eğer tekrarlanabilir bir Ct değeri elde edilirse sonuç pozitif
sayılılr. Eğer sonuçlar iki çalışmada onaylanmazsa geçersiz sayılır.
Kalitatif analiz için, analizin sonuçları sadece amplifikasyon için hem pozitif hem negatif kontroller ve
ekstraksiyon negatif kontrol doğru ise güvenilir sayılır. Kantitatif analiz için, C+ ‘daki sonuçlar bu CMV
Real-TM Quant bilgi formunda belirtilen aralıkta olmalıdır.
Toplam DNA’nın periferik kan, amniyon sıvısı, beyin omurilik sıvısı (likör), tükürük, orofaringeal
sürüntü, idrar örnekleri ve bronşalveol lavaj örneklerinden iç kontrol ile birlikte izole edildiği
durumda kontroller için sonuçlar
Kontrol
NCE
PCE
NCA
C+
Kanalda Ct
JOE/HEX/Sarı/Cy3
Kontrol içi yer
Kalitatif
Kantitatif
format
format
DNA
Ekstraksiyon,
DNA
Ekstraksiyon,
Amplifikasyon
Amplifikasyon
QS1,QS2 Amplifikasyon
Neg
Pos
(< sınır
değer)
Neg
Pos
(< sınır
d ğ )
–
Sacace™ CMV Real-TM Quant
Neg
ROX/Orange/Texas Red
Kalitatif
Kantitatif
format
format
NCE
Ct değeri Veri
Kartında
PCE
belirtilen
Neg
NCA
–
C+
Ct değeri ve
hesaplanan,
konsantrasyon QS1,QS2
DNA
Ekstraksiyon
Yorumlama
Neg
Pos
(< sınır
DNA
değer)
Ekstraksiyon
Amplifikasyon Neg
Pos
Amplifikasyon (< sınır
d ğ )
Amplifikasyon
–
VER 11.11.2011
Kantitatif analizlerde, toplam DNA periferik kan, amniyon sıvısı, beyin omurilik sıvısı (likör), tükürük,
orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri ve bronşalveol lavaj örneklerinden ekstrakte edildi ise , örnek
başına CMV DNA (КP CMV DNA) bir log konsantrasyonu aşağıdaki formülle hesaplanır:
КP CMV DNA = К CMV DNA / К IC х IC katsayı (kopya/ml)
КCMV DNA , DNA örneğindeki CMV DNA kopya sayısıdır;
Кic DNA örneğinde IC DNA kopya sayısıdır;
IC katsayısı DNA örneğindeki IC DNA’sı kopyası ile ilgilidir. Reaktif kitinin her lotu ile verilen
Veri Formu CMV Real-TM Quant için belirtilir. Bu katsayı her bir lot için özeldir.
CMV Real-TM Quant PCR kiti İç Kontrol IC (insan beta- globine gen) içerir, hücresel materyalin
varlığını kontrol eder. Eğer örnek doğru şekilde hazırlanmamışsa veya epitel hücre miktarı yetersizse İç
Kontrol tespit edilmez.
Ekstraksiyonun Negatif Kontrolü (NCE), Ekstraksiyonun Pozitif Kontrolü (PCE), Negatif
Amplifikasyon Kontrol (NCA), Pozitif Amplifikasyon Kontrol (C+) her çalışmada bulunmalıdır. Eğer
kontroller beklenen aralığın dışında ise ( Kontroller için sonuçlar tablosuna bakın) bütün numune ve
kontroller örnek hazırlığı aşamasından itibarren yeniden işlenmelidir.
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
10. PROBLEMLERİN GİDERİLMESİ
Analiz sonuçları aşağıdaki durumlarda dikkate alınmaz:
1.
JOE/Sarı/HEX/Cy3 FAM/Yeşil,
ve ROX/Orange/Texas kanallarında Negati Kontrol
Amplifikasyon (NCA) sonuçları için elde edilen tabloda herhangi bir Ct varlığı ve JOE/Sarı/HEX/Cy3
kanalında Negatif Kontrol Ekstraksiyon (C–) için gözlenen herhangi bir Ct varlığı reaktif veya
örneklerde kontaminasyon olduğunu gösterir. Bu durumda, CMV DNA’nın tespit edildiği yerde PCR
analizi bütün örnekler için DNA ekstraksiyon basamağından başlanarak tekrarlanmalıdır.
2.
Kalitatif analiz için, (QS2) in JOE/Sarı/HEX/Cy3 (CMV), FAM/Yeşil, veya ROX/Orange/Texas
Red kanallarında Pozitif Kontrol Amplifikasyon (QS2) sonuç tablosunda Ct değeri yoksa, CMV
DNA’nın tespit edilemediği yerde bütün örnekler için amplifikasyonu tekrarlamak gereklidir.
3.
JOE/Sarı/HEX/Cy3 (CMV), FAM/Yeşil, veya ROX/Orange/Texas Red kanallarında Pozitif
Kontrol Ekstraksiyon (Pozitif Kontrol DNA CMV ve insan DNAsı) için sonuç tablosunda Ct değeri
yoksa, analiz bütün örnekler için geçersiz sayılır. PCR analizinin bu sonuçlar için tekrarlanması gerekir.
4.
JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Ct değeri yok ise veya sınır Ct değerinin üzerinde ise is ve
FAM/Yeşil and ROX/Orange kanalları için örnek için Ct değeri IC için maximum Ct değerinden fazla
ise, analizin DNA ekstraksiyon basamağından başlanarak tekrarlanması gereklidir. Bu hata klinik
materyallerin yanlış muamele görmesi sebebiyle DNA kaybından veya PCR inhibitörü varlığı sebebiyle
olabilir.
5. JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Örnek için Ct değeri yoksa veya eşik Ct değerini (> 38) aşmış ise ve
FAM/Yeşil ve ROX/Orange kanalında örnek için Ct değeri eşik Ct değerinde aşağı ise, sonuç belirsiz
sayılır. Bu örneklerin analizi çiftler halinde tekrarlanmalıdır. Eğer tekrarlanabilir Ct değeri elde edilir
ise, sonuç pozitif sayılır; aksi durumda, sonuç belirsizdir.
JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Ct değeri yok ise veya sınır Ct değerinin üzerinde ise is ve FAM/Yeşil
and ROX/Orange kanalları için örnek için Ct değeri IC için maximum Ct değerinden fazla ise, analizin
DNA ekstraksiyon basamağından başlanarak tekrarlanması gereklidir. Bu hata klinik materyallerin
yanlış muamele görmesi sebebiyle DNA kaybından veya PCR inhibitörü varlığı sebebiyle olabilir.
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
11. TRANSFER
CMV Real-TM Quant PCR kit 2–8 ºC’de 5 günden uzun sürmeyecek şekilde transfer
edilmelidir.
12. KARARLILIK VE DEPOLAMA
CMV Real-TM Quant PCR kitinin bütün bileşenleri kullnılmadıkları zaman -20ºC’de saklanmalıdır.
CMV Real-TM Quant PCR kitinin bütün bileşenleri etiketlerinin üzerinde yazan son kullanma tarihine
kadar kararlıdır. Aksi belirtilmediği sürece, reaktiflerin ilk kullanımdan önce ve sonraki raf ömrü
aynıdır.
PCR-mix-1-FL CMV screen/monitor ışıktan korunmalıdır.
13. ÜRÜN KULLANIM KISITLAMALARI
Tüm reaktifler sadece in vitro diagnostik olarak kullanılabilir. Bu ürünün kullanımı DNA amplifikasyon
teknikleri konusunda eğitim personeli (EN375) ile sınırlı olmalıdır. Kullanım kılavuzu ile tam uyumlu
PCR çalışması en iyi sonuçlar için gereklidir. Bileşenlerin kutu ve etiketleri üzerinde yazılı son
kullanma tarihlerine dikkat edilmelidir. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın.
14. KALİTE KONTROL
Ürün kalitesinden emin olmak için Sacace’s ISO 13485- Sertifikalı Kalite Yönetim Sistemi ile uyumlu
olarak, her lot önceden belirlenmiş özelliklere uygun olarak test edilmiştir.
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
15. ÖZELLİKLER
15.1 Hassasiyet
CMV Real-TM Quant PCR kitin doğrusal aralığı 500–10.000.000 kopya/ml’dir. Eğer sonuçlar
500.000 kopya/ml’den büyük ise, bu sonucun 10.000.000 CMV DNA kopya/ml’den fazla olduğunu
gösterir. Eğer sonuç 500 kopya/ml’den az ise, bu the result is less than 500 CMV DNA copy/ml
şeklinde belirtilecektir.
CMV Real-TM Quant PCR kitinin analitik hassasiyeti aşağıdaki tabloda verilmiştir:
Klinik materyalin tipi
Nükleik asit
ekstraksiyon kiti
Periferik kan plazması, amniyotik sıvı,
beyin omurilik sıvısı (likör), tükürük,
orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri,
DNA/RNA-prep
bronşalveol lavaj
Tam insan kanı, beyaz kan
hücreleri, iç organ biyopis
materyali
DNA/RNA-prep
Hassasiyet
400 kopya/ml
105 hücre başına5 CMV
DNA kopya
15.2 Özgünlük
CMV Real-TM Quant PCR kiti insan sitomegalovirüs (CMV) DNA’sı tespiti için kullanılır. CMV
Real-TM Quant PCR kiti spesifik aktivitesi, CMV referans suşu AD 169 ve amplifikasyon
fragmanlarının diziliminden elde edilen sonuçlar ile onaylanır. Diğer virülerin DNA’sı (Epstein-Barr
virüsü, herpes simpleks virüsü tip 1 ve 2, insan herpes virüsü tip 6 ve 8, Varisella Zoster Virüs,
Parvovirus B19, ve diğerleri) ve bakteriyel patojenler (Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogene,
Streptococcus agalactiae, ve diğerleri), ile ilgili olarak PCR kit içeriğinin aktivite göstermez.
REFERANSLAR
PCR detection of cytomegalovirus DNA in serum as a diagnostic test for congenital cytomegalovirus
infection. C T Nelson, A S Istas, M K Wilkerson, and G J Demmler. J Clin Microbiol. 1995 December;
33(12): 3317–3318. Detection of Cytomegalovirus DNA in Peripheral Blood of Patients Infected with
Human Immunodeficiency Virus. D. Shibata, W. John Martin, Maria D. Appleman, Dennis M.
Causey, J. M. Leedom, N. Arnheim. J Infect Dis. (1988) 158 (6): 1185-1192.
Multiplex PCR for six herpesviruses after hematopoietic stem cell transplantation. Sawada A, KoyamaSato M, Yasui M, Kondo O, Ishihara T, Takeshita Y, Okamura T, Nishikawa M, Inoue M, Kawa Pediatr
Int. 2011 Aug 2. doi:
10.1111/j.1442-200X.2011.03437.
Cytomegalovirus Infections in Non-immunocompromised and Immunocompromised Patients in the
Intensive
Care Unit. Florescu DF, Kalil AC. Infect Disord Drug Targets. 2011
Jun 16.
Comparison of PCR, Antigenemia Assay, and Rapid Blood Culture for Detection and Prevention of
Cytomegalovirus Disease after Lung Transplantation. Adriana Weinberg, Tony N. Hodges, Shaobing Li,
Guanyung Cai, M. R. Zamora. Journal of Clinical Microbiology, February 2000, p. 768-772, Vol. 38,
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
No. 2
Optimization of Quantitative Detection of Cytomegalovirus DNA in Plasma by Real-Time PCR.
Michael Boeckh, MeeiLi Huang, James Ferrenberg, Terry Stevens-Ayers, Laurence Stensland, W.
Garrett Nichols, and Lawrence Corey. Journal of Clinical Microbiology, March 2004, p. 1142-1148,
Vol. 42, No. 3
Quantification of Human Cytomegalovirus DNA by Real-Time PCR. Elyanne Gault,Yanne Michel,
Axelle Dehée, Chahrazed Belabani, Jean-Claude Nicolas, Antoine Garbarg-Chenon. J Clin Microbiol.
2001 February; 39(2): 772
Definitions of Cytomegalovirus Infection and Disease in Transplant Recipients. Per Ljungman, Paul
Griffiths, Carlos Paya, …Clin Infect Dis. (2002) 34 (8): 1094-1097
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011
KULLANILAN SEMBOLLER İÇİN ANAHTAR
Liste Numarası
Dikkat!
<n> test için yeterli
Lot Numarası
içerik
In Vitro Tanısal Kullanım için
Versiyon
Saklama Koşulları
NCA
Negatif Kontrol
Amplifikasyon
Üretici
C–
Negatif Kontrol
Ekstraksiyon
C+
Pozitif Kontrol
Amplifikasyon
Kullanım Klavuzuna bkz
Son Kullanma Tarihi
Sacace™ CMV Real-TM Quant
IC
İç Kontrol
VER 11.11.2011
NOT
*iQ5™ , Bio-Rad Laboratories’in ticari markasıdır.
* Rotor-Gene™ Technology ,Qiagen’in ticari markasıdır.
* MX3005P® ,Agilent Technologies’in ticari markasıdır.
*ABI® ,Applied Biosystems’in ticari markasıdır.
* LineGeneK® ,Bioer’in ticari markasıdır.
* SmartCycler® ,Cepheid’in ticari markasıdır.
* SaCycler™ is a registered trademark of Sacace Biotechnologies
Sacace Biotechnologies Srl
via Scalabrini, 44 – 22100 – Como – Italy Tel +390314892927 Fax
+390314892926 mail: [email protected] web: www.sacace.com
Sacace™ CMV Real-TM Quant
VER 11.11.2011