KimyaKongreleri.org

VIII. Ulusal Kimya Kongresi, Marmara Üniversitesi, 7-11 Eylül 1992, Istanbul
BEZELYE TOHUMUNDAN DİAM IN OKSİDAZ ENZİMİNİN
İZOLASYONU V E SAFLAŞTIRILMASI
Yüksel AVCIBAŞI GÜVENİLİR ve Nuran DEVECİ
İstanbul Teknik Üniversitesi Kbnya-Metcdurjt Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü
80626 Maslak-Istanbul'Tûrkİy e
TH E ISOLATION OF DAO FROM PE A SEEDLING
SUMMARY
In this study the isolation o f enaymes is discussed, concentrating initially on
the principles o f the important separation methods employed. Then the operation o f
these methods is illustrated by considering one specific example, purification o f
enzymes.
During this study, a number o f the studies reported here required the use o f
large quantities o f the peaseedling diamine oxidase (DAO). In order to satisfy this
requirement a purification procedure to obtain homogeneous enzyme in high yield and
in large quantity had to be developed. This enzyme is produced to study comparing
total activity yielded by growing the seedlings under various conditions.
ÖZET
Son yirmibeş yıl içinde pekçok sanayii dalında uygulama alanı bulan enzimler,
günümüzde yeni kullanım alanlarının ortaya çıkması ile giderek önem kazanmaktadır.
Bu çalışmada bezelye tohumu DAO enzimini yüksek verimde saflaştırma işlemini
gerçekleştirmek ve çok miktarda elde etmek amaçlanmıştır. Değişik koşullar altında
büyüyen tohumlann aktivite veriminin karşılaştırılması yapılarak enzim için büyüme
koşullan ve enzimin molekül ağırlığının tespitine çalışılmıştır.
GİRİŞ
Enzimler doğal durumda suda çözünürler. Endüstriyel uygulamaların
çoğu sulu çözeltilerde gerçekleştiğinden katalizör olarak serbest enzimlerin
kullanılması önemli sakıncalara neden olmaktadır. Serbest enzim ile
gerçekleştirilen bir reaksiyonun durdurulması, enzim istenilen anda
ortamdan uzaklaştmlamadığından ancak spesifik inhibitor kullanılarak
sağlanabilir. Bu durumda, serbest enzim tarafından kirletilmiş olan
reaksiyon ürün veya ürünlerine yeni bir kirlilik unsuru katılmış olacaktır(i).
Enzimlerin uygulama alan ve olanağını sınırlayan başlıca etmenler;
aktivite, spesifiklik, kararlılık ve fiyattır.
Enzimin, aktivitesinin yüksek olması ve reaksiyon koşullarından
olabildiğince az etkilenmesi istenir. Enzimlerin hemen hemen tümü bitkisel,
hayvansal ve mikrobiyal hücrelerin oluşturduğu canlı kaynaklardan elde
edilir. Enzimlerin bazı uygulama alanları tamamen saf bir özütün
kullanımını gerektirir, özellikle tıpta ve gıda sanayiinde kullanılan enzimleri
195
KimyaKongreleri.org
VIII. Ulusal Kimya Kongresi, Marmara Üniversitesi, 7-11 Eylül 1992, Istanbul
bu gruba dahil edebiliriz. Bu çalışmada bezelye tohumu DAO enziminin
izolasyonu, saflaştırılm ası ve enzimin özelliklerinin saptanması
amaçlanmıştır.
DENEL BÖLÜM
Biokimyasal ürünlerin ayırma ve saflaştırılmasında kullanılan temel
işlemler, kimya sanayiinde kullanılanlar ile bir paralellik içindedir. Ancak söz
konusu olan bu işlemlerde, biyokimyasal ürünlerin fiziksel, kimyasal ve
biyolojik özelliklerine göre ayarlanıp modifiye edilm iş cihazlar
kullanılmaktadır.
Gerçekleştirilen çalışmalarda kullanılan temel işlemler, presipitasyon,
santrifîgasyon, ekstraksiyon, elektroforez ve kromatografık işlemlerdir(l).
Presipitasyon: Amonyum sülfat kullanılarak söz konusu proteinlerin
çözünürlükleri değiştirilmiştir. Bu şekilde proteinin çözeltiden ayrılması ve
çökelek oluşturması sağlanmışür(2 ,3).
Santrifüjleme: 8000 rpm, 11000 rpm, 12000 rpm ve 18000 rpm devir
hızlarında çalışılarak çözelti içindeki süspansiyon halindeki katı partikülier
uzaklaştırılmıştır.
Ekstraksiyon: Su ve fosfat çözeltisi kullanılarak bezelye tohumu
ekstrakte edilmiştir.
Elektroforez: Poliakrilamid jel elektroforez yapılmıştır.
Kromatografık İşlemler: İyon değişimi ve jel filtrasyonu kullanılmıştır.
İyon değişimi ve jel fıltrasyonunda filtrasyon ortamı olarak DEAE-Sellüloz,
DEAE-Sepharose, Ultrajel AcA 34 kullanılmıştır.
Bezelye tohumundan DAO izolasyonu ve saflaştırılmasında şu
kademeler izlenmiştir.
-
Bezelye tohumlarının büyümesi,
Genel saflaştırma İşlemi.
Bezelye tohumlan oda sıcaklığında 12 saat damıtık su İle ıslatılmış ve
sonra filizlenme belirene kadar genellikle (24 saat süresince ıslak süzgeç
kâğıdı tabakaları araşma yerleştirilmiştir. Daha sonra alınan tohumlar kaba
kumda birkaç mm derinlikte saçılarak büyütülmüş 7-10 gün sonunda 5-10
cm'lik taze filizler toplanmıştır(4,5).
-
196
KimyaKongreleri.org
Ham ekstrakün hazırlanması,
Ham homogenatın santrifüjlenmesi
Amonyum sülfat ile fraksiyonlama
înert maddelerin çöktürülmesi
Düşük iyonik kuvvette seçici çökelme
Etanol/kloroform çöktürülmesi
Amonyum sülfat ile doyurma
DEAE-Sellüloz kolon
Jel filtrasyonu
VIII. Ulusal Kimya Kongresi, Marmara Üniversitesi, 7-11 Eylül 1992, Istanbul
Tablo 1. Bezelye Tohumu DAO'nun Hazırlanması
Toplam
birim
iün He)
215
Toplam
Protein
Hacim
Jmgl
12600
(mil
340
3600
290
190
0.052
1300
50
170
0.330
360
70
155
0.430
1,600
72
25
70
72
130
1.860
6.800
60
1 Ï0
Öğütm e ve filtrasyon
Santrifüjleme
SA.
S.A.
.... f.u/.mäl...
0.017
(u/mg)
0.062
Verim
Saflaş­
(%)
tırma
0.190*
100
88
3
1
0.470
79
8
30/60 Amon.sülf.
fraksiyonlama
Yüksek pH'da muamele
24 saat diyaliz
EtOH/Kloroform işlemi
-
.
-
-
-
-
-
D ü şü k iyonik kuv.diyaîiz
35
15
120
3.420
12.500
56
200
D EAE-Seîlüloz kolon
25
15
115
4.600
16.800
53
270
i
Ultragei AcA 34 kolon
16
15
108
6.750
24.700
50
400
(
85 % (N H J a Ş O j
SONUÇLAR ve TARTIŞMA
~ Bezelye tohumu DAO saflaştırması için öncelikle bezelye
tohumlarının, büyüme/aktivite profili çıkarılmıştır. Bu sebeple, en yüksek
verimde DAO 7-10 günlük büyüme sonundaki hasatla elde edilmiştir.
Bezelye tohumu DAO, ham homogenat hazırlanması,
santrifüjleme, amonyum sülfat ile fraksiyonlama, inert maddelerin
çöktürülmesi, kolon elektroforez ve DEAE-Sellüloz kolon kroma tografisi
işlemleri ile bezelye tohumundan izole edilerek saflaştırılmıştır. Ham
homogenatta spesifik aktivite 0.017 {ünite/mg) olarak tespit edilmiştir.
İzolasyon ve saflaş tırmalan sırasında, ultrajel kolondan geçirilerek yapılan
son aşamada DAO'nun spesifik aktivitesi 6.750 (ünite/mg) olarak tespit
edilmiştir. Bu saflaştırma işlemleri sonucunda enzim, başlangıç aktivitesine
göre 400 defa daha saf olarak elde edilmiştir.
- Bütün İzolasyon ve saflaştırm a kademelerinde sıcaklık
belirtilmedikçe aktivasyonunun bozunmasını Önlemek için 0-5°C
sıcaklıklarda çalışmak gereklidir.
- İzolasyon işlemi sırasında maksimum verimi elde etmek için
değişik koşullardaki enzimin stabil olması gerekmektedir.
KAYNAKLAR
1. A.Telefoncu, "Temel ve UygulamaU E nzim oloii". Biyokimya Lisr.nsüstü
Yaz Okulu, Ege Üniversitesi, Fen Fakültesi, Izmir (1986).
2. Carnion.W .Jenkins, "D .Alanine-D glutam ate Transam inase"
(1.Purification and Characterization), Journal o f Biological Chemistry,
240, 9, (1965), 3538-3546.
3. G.Mann, "Purification and Properties of the Amine Oxidase of Pea
Seedlings” , Biochem, J., 59, (1955), 609-620.
4. F.Agro, "On the Nature of Chromophore in Pig Kidney DAO, Eur. J.
Biochem, 74 (1977).
5. A.Perin, “Response of Tissue Diamine Oxidase Activity to Polyamine
Administration”, Biochem.J., 234, (1986), 1 19-123.
19 7
KimyaKongreleri.org