2008–2009 ÖöRETøM YILI FEN BÖLÜMÜ YARIùMA PROJESø øLAÇ TAùIMA SøSTEMLERøNøN GELøùTøRøLMESøNE YÖNELøK ELEKTROKøMYASAL UYGULAMALAR Proje Dalı: Kimya Proje Danıúmanı: Binnur ORAL (AKINERø) Proje Ö÷rencileri: Ebru Donk ve Deniz Yi÷iter (10-A sınıfı ö÷rencileri) GøRøù Elektrokimyasal sensörler (elektrokimyasal algılayıcı sistemler) Analitik Kimya’da oldukça yaygın kullanımı olan cihazlardır. Bu cihazlara IUPAC tarafından literatürde getirilen tanım úu úekildedir: “Kimyasal bileúiklere ya da iyonlara seçici ve tersinir bir úekilde cevap veren ve konsantrasyona ba÷ımlı elektriksel sinyaller oluúturan küçültülmüú cihazlara elektrokimyasal sensörler “denir (1). Bu sensörler, yapılarına enzim, hücre, doku, antikor, DNA, vb. biyolojik maddelerin eklenmesiyle BøYOSENSÖR adını almıúlardır. Nitel ve nicel analiz yapabilen kompleks cihazlar olan biyosensörler, “biyo” (=biyolojik kökenli) ve “sensör” (= algılayıcı) kelimelerinden oluúmaktadır. Di÷er bir tanım ise; “Biri biyokimyasal, di÷eri ise elektrokimyasal özellikte, birbiri içine geçmiú iki çeviriciden oluúan algılayıcı cihazdır” denilebilir. Biyokimyasal çevirici analizlenecek madde ile etkileúerek onu tanır. Bu etkileúme sonucunda oluúan madde (biyokimyasal ürün), elektrokimyasal çevirici tarafından okunabilir bir sayısal de÷ere çevirilir. Nükleik asitlerden oluúan tanıma yüzeyleri, Analitik Kimya alanında her geçen gün daha ilgi çekici konular halini almaktadır. Bu tür tanıma yüzeyleri, bilinen elektrokimyasal biyosensörlere yeni ve ender boyutlarda özellikler eklemektedir. Bu geliúme ile, elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin gelecekte hasta baúında yapılacak doktor gözetimindeki analizlerde çok önemli bir rol oynayaca÷ı kesindir. Elektrokimyasal yöntemlerle birlikte DNA’nın nitel ve nicel analizini yapma amacına yönelik tasarlanan biyosensörlerde tanıma yüzey katmanı olarak DNA kullanılmasına ilgi artmaktadır (2-4). Nükleik asit(DNA) tanıma yüzeyi içeren biyosensörler, bu yüzey ile etkileúime giren analizlenecek maddenin (karsinojen maddeler, ilaçlar vb.) etkileúim mekanizmasının aydınlatılması veya miktarının tayininde veya DNA’daki baz dizisi belli bölgelerdeki hibridizasyon olaylarının izlenmesi gibi amaçlarla kullanılabilir (527). Analizlenecek maddenin, DNA ile etkileúmesi sonucunda, incelenen maddenin veya DNA’daki bir bazın sinyalinde meydana gelecek de÷iúiklikler sayesinde tayini yapılabilmektedir. Bazı ilaç molekülleriyle DNA' nın etkileúmesi (özellikle de antikanser özellik taúıyan ilaç molekülleri ile etkileúim) ve bu etkileúmenin geliútirilen yeni yöntemlerle tayin edilmesi; yeni ilaç tasarımları için çok önemlidir. Yine bazı maddelerin (çevresel kirlilik ajanları, toksik molekül, vb.) çift sarmal DNA ile interkalasyon (düzlemsel yapıdaki maddenin DNA çift sarmalı arasına girerek yerleúmesi), baza seçimli ba÷lanma vb. yollarla etkileúimi sonucu bir ürünün oluúması, bu ürüne duyarlı elektrokimyasal DNA biyosensör tasarımını getirmiútir. Bir kimyasal maddenin veya metabolitin DNA ile etkileúimi sonrasında DNA’da oluúabilecek yan ürünlerin (=adduct) kısa zamanda tespiti kanser araútırmaları için çok önemlidir (9). Madde-DNA etkileúiminin sonucunda, çalıúmanın türüne göre elde edilen madde sinyali ya da DNA’daki bir bazın sinyalindeki artma veya azalmaya ba÷lı olarak elektrokimyasal tayin gerçekleútirilmektedir. Bu amaçla kullanılan DNA modifiye edilmiú camsı karbon elektrotlar (GCE), karbon pastası elektrotlar (CPE), perde baskılı karbon (SCPE) ve altın perde baskılı elektrotlar (Au-SCPE), Altın elektrotlar (AuE) ve asılı civa damla elektrodu (HMDE) incelenen maddelerin mikromolar ve hatta nanomolar konsantrasyonlarının dahi, kısa bir biriktirme aúaması sonrası güvenli ölçümlerini mümkün kılmaktadır (10-14). Çalıúmamızın amacı, manyetik partikül yüzeyine tutturulan antikanser ilaç olan Daunorubisin (DNR)’in, etkin manyetik ayırma ve tek kullanımlık elektrokimyasal sensör teknolojisi ile tayin etmek ve gelecekte hedeflenen ilaç taúıma sistemlerinin izlenmesine yönelik mevcut yöntemlere kıyasla daha kolay, daha ucuz, daha hızlı, daha seçimli ve güvenli bir úekilde tanımlanmasına yönelik alternatif bir yöntem tasarlamaktır. GELøùME ELEKTROKøMYA Maddenin elektrik enerjisi ile etkileúmesini ve bunun sonucunda oluúan kimyasal dönüúümleri, fiziksel de÷iúiklikleri ve kimyasal enerjinin elektrik enerjisine çevrilmesini inceleyen bilim dalı, elektrokimya olarak tanımlanır. Elektrokimyasal tepkimeler, yükseltgenme-indirgenme türü tepkimelerdir; elektron transferi veya geçiúi söz konusudur ve elektrokimyasal hücre adı verilen bir hücrede yürütülür. Analizi yapılacak çözelti, bir elektrokimyasal hücrenin parçası oldu÷unda çözeltinin elektrokimyasal özelliklerine dayanan bir grup kantitatif analitik yöntemin incelenmesi “elektroanalitik kimya”nın kapsamına girmektedir. Elektroanalitik teknikler, çok düúük tayin sınırlarına ulaúabilirler ve elektrokimyasal yöntemlerin uygulanabildi÷i sistemler hakkında, bilgileri de içeren çok fazla sistemi karakterize eden bilgiler verirler. Elektroanalitik yöntemler, di÷er analiz yöntemlerine göre bazı üstünlüklere sahiptirler. Birincisi, elektrokimyasal ölçümler ço÷u kez bir elemente, moleküle veya tepkime sonunda oluúan ürüne özel bir yükseltgenme basama÷ı için spesifiktir. Elektroanalitik yöntemlerin ikinci bir önemli üstünlü÷ü de, kullanılan cihazların di÷er yöntemlerde kullanılan cihazlara nispeten ucuz olmasıdır. Bir elektrokimyasal tepkimenin oluúabilmesi için, incelenen maddeyi içeren bir çözelti, maddenin kimyasal dönüúüme u÷radı÷ı elektrot sistemi (genellikle üçlü elektrot sistemi) ve bu elektrotları birbirine ba÷layan bir çevirim sistemi (transducer) gereklidir. Çözelti olarak elektriksel iletkenli÷i sa÷lamak amacıyla tampon çözelti kullanılır. Çeúitli elektrolitik yöntemler ile Do÷ru akım (DC), Diferansiyel Puls (DPV), Dönüúümlü Voltametri (CV) vb. de belirli potansiyel aralı÷ında tarama yapılarak meydana gelen akım úiddeti ölçülür. Akım, difüzyona ba÷lı olarak oluútu÷undan dolayı burada ölçülen difüzyon akımıdır. Difüzyon hızı akım ile do÷ru orantılıdır. Difüzyon, elektrot yüzeyinin yakınındaki difüzyon tabakasında oluúur. VOLTAMETRø VE ESASLARI Elektroda uygulanan gerilimin(potansiyelin) bir fonksiyonu olarak akımın ölçülmesine dayanan elektrokimyasal yönteme voltametri denir. Uygulanan gerilimin ölçülen akım de÷erlerine karúı çizilen grafi÷ine voltamogram denir. Voltametride, herhangi bir maddenin elektrokimyasal davranıúını incelemek için elektroda uygulanabilecek gerilim aralı÷ının sınırları, kullanılan çalıúma elektrodunun ve kullanılan çözücü ve elektrolit türlerine ba÷lıdır. Tarihsel olarak, voltametri Çekoslavak kimyacı Jaroslav Heyrovsky tarafından 1920 ‘lerin baúında geliútirilen ve voltametrinin özel bir tipi olan polarografi tekni÷ine dayanarak geliútirilmiútir. Voltametrinin hala önemli bir kolu olan polarografinin di÷er voltametrik tekniklerden en büyük farkı çalıúma elektrodu olarak bir damlayan civa elektrodunun (DCE) kullanılmasıdır. Voltametri, inorganik, fiziko ve biyokimyacılar tarafından çeúitli ortamlarda oluúan yükseltgenme ve indirgenme iúlemlerinin incelenmesi, yüzeydeki adsorpsiyon iúlemlerinin araútırılması ve kimyasal olarak modifiye edilmiú elektrot yüzeylerinde gerçekleúen elektron aktarım mekanizmalarının aydınlatılması gibi analitik olmayan amaçlar için de oldukça yaygın bir úekilde kullanılmaktadır. Voltametrik Cihazlar: Voltametrik analizde kullanılacak cihazlar, elektrokimyasal hücre, analizlenecek madde ve destek elektrolit adı verilen elektrolitin aúırısını içeren bir çözeltiye daldırılmıú üç elektrottan yapılmıútır. Tanım olarak; 1) Çalıúma elektrodu; tasarımı yapılacak bir biyosensör bu üçlü sistemlerde kullanılabilmektedir. Bu elektrot, yüzeyinde analizlenecek maddenin yükseltgendi÷i veya indirgendi÷i elektrottur. 2) Referans elektrot; Referans elektrot, potansiyeli deney süresince sabit kalan bir elektrottur. Ag / AgCl veya doygun kalomel elektrot (DKE) kullanılabilir. 3)Yardımcı elektrot; Platin bir tel veya bir civa havuzu úeklinde olan ve elektri÷in çözelti içinden çalıúma elektroduna aktarılmasını sa÷layan karúıt elektrottur. Bu elektrot, çalıúma elektrodu ile bir çift oluúturan fakat ölçülen potansiyelin büyüklü÷ünün tayininde rol oynamayan bir elektrottur. ùekil-1, üçlü elektrot sistemini göstermektedir. ùekil 1 : Üçlü elektrot sistemi Voltametride kullanılan çalıúma elektrotları Çalıúma elektrodunun yapımında kullanılan iletken malzeme, platin ya da altın gibi inert bir metal; karbon, pirolitik grafit ya da camsı karbon; kalay oksit ya da indiyum oksit gibi yarı-iletken veya bir civa filmi ile kaplanmıú bir metal olabilir. Bu elektrotlar çeúitli úekil ve büyüklükte olabilmektedirler ve biyosensör tasarımı için en uygun úekilde geliútirilmektedirler. Bu tür elektrotların kullanıldı÷ı potansiyel aralı÷ının tespiti çok önemlidir. Özellikle de bu potansiyel aralı÷ı, sulu çözeltilerde sadece elektrot malzemesine de÷il, aynı zamanda bu elektrotların daldırıldı÷ı çözeltinin bileúimine ba÷lı olarak da de÷iúir. Pozitif potansiyel sınırları genellikle moleküler oksijen verecek úekilde, suyun yükseltgenmesi sonunda oluúan büyük akımlarca belirlenir. Negatif potansiyel sınırları yine suyun indirgenmesi sonunda oluúan hidrojenden kaynaklanır. Kullanılan çalıúma ortamına göre çalıúma elektrotları için seçilen potansiyel aralıkları ; civa elektrodu için 1 M H2SO4 çalıúma ortamında, (-0,8 V) ile (+0,4 V) aralı÷ı ve 1 M KCl çalıúma ortamında, (-1,6 V) ile (+0,2 V) aralı÷ıdır. Karbon elektrodu için ise, 1 M HClO4 ortamında, (+0,2 V) ile (+1,8 V) aralı÷ı ile, 0,1 M KCl ortamında (-1,0 V) ile (+1,2 V) aralı÷ıdır. Karbon elektrotlar : Karbon elektrotlar, özellikle çok ucuz olmaları ve geniú bir potansiyel aralı÷ında çalıúma yapılmasına olanak verdi÷inden dolayı elektrokimyasal analizlerde sık kullanılır. Ancak, karbonun, yüksek bir yüzey aktivitesi vardır ve bu nedenle organik bileúikler tarafından kolayca kirletilebilir. Hidrojen, hidroksil ve karboksil grupları ve hatta kinonlar ile karbon yüzeyinde ba÷lar oluúabilmektedir. Bu fonksiyonel grupların varlı÷ı nedeniyle karbon yüzeyine birçok de÷iúik madde tutturulabilir. Karbon elektrotların çeúitleri: Karbon Pastası Elektrodu (CPE): Grafit tozunda bulunan karbon moleküllerinin düzlemsel ve aromatik halkalar halinde dizilimi, ùekil-2' de görülmektedir. Zayıf S ba÷ları ile birbirine ba÷lanmıú olan bu tabakalar arasında hızlı bir elektron alıúveriúi olabilmektedir. ùekil 2. Grafit tozunda bulunan karbon moleküllerinin dizilimi. ùekil 3. Karbon pastası elektrodu. CPE, ucuz olması, yüzey yenilenmesinin kolay olması, düúük artık akımlar oluúturması nedeniyle tercih edilmektedir (15,16). Ba÷layıcı madde olarak, Nujol (mineral ya÷), parafin ya÷ı, silikon ya÷ı ve bromonaftalen kullanılmaktadır. Elektrot aktivitesine pasta bileúiminin büyük etkisi vardır. Ba÷layıcı organik sıvı oranı arttıkça, elektron transfer hızı azalmaktadır. CPE'nin en önemli sakıncası, yeterli miktarda organik çözgen içeren çözeltilerde kullanıldı÷ı zaman, karbon pastası çözeltide da÷ılmaktadır. Kalem grafit elektrodu: Çalıúmada kullanılan kalem grafit elektrot (PGE); grafitten oluúmuú olup, Tombo HB kalem uçlarının 3 cm boyutunda kesilmesiyle hazırlandı. ùekil 4: Kalem ucu elektrot. BøYOSENSÖR Biyosensörler biyolojik tepkimelerde hedef analizlenecek maddeleri tayin etmek için kullanılan küçük algılayıcı cihazlardır. Birbiri içine geçmiú biri biyokimyasal, di÷eri elektrokimyasal özellikteki iki çeviriciden oluúmaktadır. Biyokimyasal kısmın görevi analizlenecek maddeyle etkileúerek onu tanımaktır. Bu tanıma olayının sonucunda bir biyokimyasal ürün de oluúabilmektedir. Biyosensörün ikinci kısmı olan elektrokimyasal kısım ise, bu tanıma olayını okunabilir (ölçülebilir) bir sayısal de÷ere çevirmekle görevlidir (15). ùekil 5: Biyosensörün yapısı. ødeal bir biyosensörün sahip olması gereken özellikler: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Seçicilik Kullanım Ömrü Kalibrasyon Gereksinmesi Tekrarlanabilirlik Stabilite Yüksek Duyarlılık Yeterli Düzeyde Tayin Sınırı Geniú Ölçüm Aralı÷ı Hızlı Cevap Zamanı Hızlı Geriye Dönme Zamanı Basitlik ve Ucuzluk Küçültülebilirlik ve Sterilize edilebilirlik DENEYSEL BÖLÜM KULLANILAN CøHAZLAR VE KøMYASAL MADDELER Ölçümler ve deneyler esnasında kullanılan tüm cihaz, donanım ve yazılımlar; Terazi (Mettler Toledo AB204-S ) pH-metre (Orion 420A) Manyetik karıútırıcı (Biosan MS 3000) Vorteks (Biosan V1) Potansiyostat (AUTOLAB 302, GPES 4,9 yazılımlı; Eco Chemie,Hollanda) Manyetik Ayırıcı (Sigris, A.B.D) Ag/AgCl referans elektrot (BAS) Platin tel (Yardımcı elektrot olarak kullanıldı) Çalıúma elektrodu (kalem grafit elektrot-PGE) Asetik Asit (%99-100) (Merck) Manyetik partiküller (Dynal Biotech ASA)) Hidroklorik asit (%37) (Merck) Sodyum Hidroksit (Merck) Daunorubisin (Sigma) Tris (hidroksimetil)aminometan hidroklorür (Sigma) Sodyum klorür (Sigma) Tüm çalıúmalarda sterilize edilmiú deiyonize su kullanıldı. Deneysel çalıúmalar oda sıcaklı÷ında (25.0 r 0.5) q C’ de gerçekleútirildi. ùekil 7. Deneylerde kullanılan bilgisayara ba÷lı elektrokimyasal ölçüm cihazı ùekil 8. Deneylerde kullanılan üçlü elektrot sistemi. Kullanılan elektrotların hazırlanıúı Kalem Ucu Grafit Elektrot (PGE) hazırlanıúı: Grafit uç içeren kalem elektrodun tekrarlanabilirli÷inin daha iyi olması, daha düúük tayin sınırı, ucuz ve tek kullanımlık olması sebebiyle bu elektrodun kullanılmasına artan bir ilgi bulunmaktadır (16,22). Çalıúmada kullanılan kalem ucu elektrot; Tombo HB kalem uçlarının 3 cm boyutunda kesilmesiyle hazırlandı. Manyetik partiküllere dayalı sistemin ilaç algılamaya yönelik uygulamaları: Çalıúmamızda manyetik partiküller (MNP) ve bu partiküllerin prosedüre göre hazırlanması ve ayrılmasında, MCB 1200 Biyomanyetik ayırma platformu kullanıldı. Antikanser ilaç Daunorubisin (DNR)’nin manyetik partikül yüzeyine tutturulması iúlemlerinde aúa÷ıdaki prosedür izlenerek gerçekleútirildi (16): 3 μL manyetik partiküller (MNP) 1.5 mL’lik ependorf tüpüne transfer edildi ve üzerine 50 μL, 5 mM Tris tampon (TBS) çözeltisi ilave edilerek 5 dakika yıkandı ve daha sonra yıkama çözeltisi ortamdan uzaklaútırıldı. Ortama farklı konsantrasyonlardaki DNR çözeltisinden 25 μL ilave edildi ve 5 dakika boyunca karıútırılarak DNR’nin partikül yüzeyine tutturulması sa÷landıktan sonra çözelti ortamdan uzaklaútırıldı. Manyetik partiküller, 5 mM fosfat tamponu (PBS) ile 5 dak süreyle yıkandı. Daha sonra yıkama çözeltisi ortamdan uzaklaútırıldı. Yıkama iúleminden sonra partiküllere, alkali hidroksit çözeltisi ile muamele edildi. Alkali muamelesi basama÷ından sonra örnek üzerine, asetat tamponu (ABS) ilave edildikten sonra, çözelti viyal içine transfer edildi. Daha sonra yüzeyi aktive edilmiú elektrot PGE, adsorpsiyon iúlemi için, bu viyallere daldırıldı. Elektrotlar süre sonunda ABS ile yıkandıktan sonra, DPV ölçümü için, ABS içeren elektrokimyasal hücredeki üçlü elektrot sistemine yerleútirildi. Voltametrik ölçüm: Üçlü elektrot sistemi elektrokimyasal hücre içine daldırıldı ve daha sonra voltametrik ölçüm gerçekleútirildi. DNR yükseltgenme sinyali, DPV tekni÷i ile ölçüldü. Aynı deneysel úema, ortamda DNR yokken tekrarlandı. BULGULAR VE TARTIùMA: Manyetik partiküllere dayalı sistemin ilaç algılamaya yönelik uygulamalar ile ilgili bulgular: Manyetik partiküllere dayalı sistemde, farklı konsantrasyonlarda DNR’nin partikül yüzeyine tutturulması sonrasında +0.55 V civarında görülen DNR yükseltgenme sinyali DPV yöntemiyle ölçüldü. Elde edilen voltamogram ve histogram sırasıyla, úekil 9 ve 10’da gösterildi. ùekil 9: Manyetik partiküllere dayalı sistemde, farklı DNR konsantrasyonlarında PGE ile ölçülen DNR yükseltgenme sinyallerini gösteren voltamogram: (a) 0, (b) 2, (c) 4, (d) 6, (e) 8, (f) 10 ve (g) 12 PM DNR konsantrasyonlarında ölçülen DNR yükseltgenme sinyallerini göstermektedir. ùekil 10: Manyetik partiküllere dayalı sistemde, farklı DNR konsantrasyonlarında PGE ile ölçülen DNR yükseltgenme sinyallerini gösteren histogram. Manyetik partiküllere dayalı sistemin ilaç algılamaya yönelik uygulamalara iliúkin tartıúma ve sonuç: Manyetik partiküllere dayalı sistemde, 2-12 μM aralı÷ında de÷iúen konsantrasyonlarda DNR’nin partikül yüzeyine herhangi bir ba÷layıcı ajan kullanılmaksızın tutturulması sonrasında, +0.55 V civarında görülen DNR yükseltgenme sinyalleri kalem grafit elektrot (PGE) ile ölçüldü ve elde edilen histogram (úekil 9 ve 10) incelendi÷inde, DNR yükseltgenme sinyalinin, 2-10 μM aralı÷ında de÷iúen DNR konsantrasyonlarında aúamalı bir úekilde arttı÷ı, 10 μM DNR konsantrasyon de÷erinden itibaren azaldı÷ı görüldü. Literatürde farklı ilaçların di÷er ilaç taúıma sistemlerinin yüzeylerine tutturulmasına yönelik çalıúmalar sonucunda, elde etti÷imiz sonuca paralel sonuçlar gözlendi÷i saptandı (28). Çalıúmamızda geliútirdi÷imiz bu sensör teknolojisi ile, daha az madde kullanılarak, partikül yüzeylerine ilaçların immobilize edilebilece÷i gösterilirken; bu sayede, gelecekte tedavide kullanılabilecek ilaç taúıma sisteminin ve daha duyarlı, daha ucuz bir yöntemle, daha kısa sürede sonuçlanabilecek bir elektrokimyasal ilaç analizininde mümkün olabilece÷i düúünülmektedir. TEùEKKÜR Çalıúmalarımız sırasında bize danıúmanlık yapan Doç. Dr. Kadriye Arzum Erdem Gürsan’a, doktora ö÷rencisi Hakan Karadeniz’e, yüksek lisans ö÷rencisi Ecz. Ayfer Turan’a ve Özel Ege Lisesi Kimya ö÷retmeni Binnur Oral’a (Akıneri); gereksinim duydu÷umuz cihaz ve malzemelerinin kullanımına izin veren Ege Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi’ ne teúekkür ederiz. KAYNAKÇA 1. Wang, J.; Rivas, G.; Cai, X.; Palecek, E.; Nielsen, P.; Shiraishi, H.; Dontha, N.; Luo, D.; Parrado, C.; Chicharro, M.; Farias, P. A. M.; Valera, F. S.; Grant, D. H.; Ozsoz, M.; Flair, M. N. Anal. Chim. Acta, 1997, 347, 1. 2. Wang, J.; Cai, X.; Rivas, G.; Shiraishi, H.; Farias, P. A. M.; Dontha, N. Anal. Chem., 1996, 15, 2629. 3. Wang, J.; Rivas, G.; Cai, X.; Dontha, N.; Shiraishi, H.; Luo, Valera, F. S. Anal. Chim. Acta, 1997, 337, 41. 4. Wilson, E. K. Chem. & Engin. News, 1998, 76, 21. 5. Wang, J. Biosensors & Bioelectronics, 1998, 13, 757. 6. Wang, J.; Rivas, G.; Cai, X.; Chicharro, M.; Parrado, C.; Dontha, N.; Begleiter, A.; Mowat, M.; Palecek, E.; Nielsen, P. E. Anal. Chim Acta, 1997, 344, 111. 7. Karadeniz, H.; Erdem, A.; Caliskan A.; Pereira C. M.; Pereira E. M.; Ribeiro J. A.; Electrochemistry Communications, 2007, 9, 2167. 8. Wang, J.; Rivas, G.; Fernandes, J. R.; Paz, J. L. L.; Jiang, M.; Waymire, R. Anal. Chim. Acta, 1998, 375, 197. 9. Mikkelsen, S. R. Electroanalysis, 1996, 1, 8. 10. Millan, K. M.; Saraullo, A.; Mikkelsen, S. R. Anal. Chem., 1994, 66, 2943. 11. Erdem, A.; Kerman, K.; Meric, B; Akarca, U. S.; Ozsoz, M. Electroanalysis, 1999, 11, 586. 12. Erdem, A.; Meric, B.; Kerman, K.; Dalbasti, T.; Ozsoz, M. Electroanalysis, 2001, 13, 219. 13. Erdem, A.; Kerman, K.; Meric, B; Akarca, U. S.; Ozsoz, M., Anal. Chim. Acta, 2000, 422, 139. 14. Karadeniz, H.; Alparslan, L.; Erdem, A.; Karasulu, E. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2007, 45, 322. 15. Coulet, P. R. (1991). What is a Biosensor?, Chapter 1; Biosensor principles and applications, Editörler; L.J.Blum, P.R. Coulet, Marcel Dekker Inc., New York, 1-6 16. Wang, J.; Kawde, A.-N.; Erdem, A.; Salazar M. A.; Analyst, 2001, 126, 2020. 17. Wang, J. Nucl. Acids Res., 2000, 28, 3011. 18. Palecek, E.; Fojta, M. Anal. Chem., 2001, 73, 75A. 19. Erdem, A.; Ozsoz, M. Anal. Chim. Acta, 2001, 437, 107. 20. Erdem, A.; Ozsoz, M. Turkish Journal of Chemistry, 2001, 25, 469. 21. Jelen, F.; Erdem, A.; Palecek, E. Bioelectrochemistry, 2002, 55, 165. 22. Karadeniz, H.; Gulmez, B.; Sahinci, F.; Erdem, A.; Kaya, I.G.; Unver, N.; Kivcak, B.; Ozsoz, M. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2003, 33, 295. 23. Querioz, M.R.P.; Castanheira, E.M.S.; Carvalho, M.S.D.; Abreu, A.S.; Ferreira, P.M.T.; Karadeniz, H.; Erdem, A. Tetrahedron, 2008, 2, 382. 24. Erdem, A.; Ozsoz, M. Electroanalysis, 2002, 14, 965. 25. Wong, E.; Giandomenico, C.M. Chem. Rev., 1999, 99, 2451. 26. Ozsoz M., Erdem A., Kara P., Kerman K., Ozkan D. (2002). Electroanalysis, 15: 613-619. 27. Erdem, A.; Kosmider, B.; Osiecka, R.; Zyner, E.; Ochocki, J.; Ozsoz, M. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2005, 38 (4), 645. 28. D’Emanuele, A.; Attwood, D., Advanced Drug Delivery Reviews, 2005, 57, 2147-62.