immunolojik tanı yöntemleri
advertisement
İMMUNOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ Prof. Dr. Bekir KOCAZEYBEK I- GENEL BAKIŞ; • KLİNİK İMMUNOLOJİDE HASTALIĞIN TANISI İÇİN a) Çok iyi bir ÖYKÜ alınması b) FİZİKİ İNCELEME yapılması c) Uygun TANI TESTİNİN yapılması ZORUNLUDUR a)ÖYKÜ: KLİNİK İMMUNOLOJİ UZMANINA BAŞVURU NEDENLERİ(sıklık sırasıyla); • ENFEKSİYONLAR (en sık) Yineleyen enfeksiyon Çocuklarda bulaşıcı ÜSYE çok sıktır Bu çocuklarda sekonder olarak ♣ Otit, sinüzit, bronşit gelişebilir Bu hastalıklar diğer çocuklara görülmesine göre daha sıksa ♣ Antibiyotik almayı gerektiriyorsa Ig G alt sınıf yetersizliği vardır Deri ve ÜSYE’nin; ♣ 6-12 aydan sonra başlaması ♣ Sık ve birincil olması Ig yetersizliğini gösterir Çok ağır enfeksiyonlar Ağır viral enfeksiyonlar T hücre yetersizliği Ağır bakteri enfeksiyonlar B hücre yetersizliğini gösterir Fırsatçı mikroorganizmalarla enfeksiyon Hastane enfeksiyon etkenleri KİT’ de CMV enfeksiyonu Doğal ve özgül immunitede ♣ Özellikle T hücre bozukluğu Kendine özgü mikroorganizmlarla enfeksiyon Aspleniklerde Pnömokok enfeksiyonu Enflamasyonsuz enfeksiyon Aplastik anemi, nötropenik ve disfonksiyonel nötrofiliklerde Pyojenik bakterilere dirençsizlik Kronik enfeksiyon Kronik ishal yada büyüme bozukluğu olanlarda sIgA yada T hücre yetersizliği ♣ Rotavirus, G. lamblia enfeksiyonu • İMMUN YETERSİZLİĞE BAĞLI; HASTALIK BELİRTİLERİ Allerjik Artrit Deri değişiklikleri MALİGN HASTALIKLARLA İLGİLİ BELİRTİLER b)FİZİKİ İNCELEME: • Hastada enfeksiyon bulunup bulunmadığı; VARSA; Hastanın genel yanıtı, sağlık durumunun gözlenmesi • Hastalarda; Solgunluk Kanama odakları Deride kolay morarma Döküntü • Hastanın; Lenf bezleri ve bademcikleri var olup olmadığı Büyüklüğü saptanmalıdır Ağır T hücre yetmezliğinde lenf bezi ele gelmez Bademcikler görünmez • Normal bebeklerde dalağın alt ucu ele gelir Ancak dalak yokluğu (aspleni ile) Bakteriyel (kapsüllü) enfeksiyonlar sıktır • Ağızda pamukçukların olması T hücre yetersizliği Candida sp • Bazı özel sendromlara spesifik; Hastalık ve/veya bulguların olması Di George sendromunda Neonatal tetanoz ve KKH Wiskott-Aldrich sendromu Egzama Kolay kanama eğilimi Peteşi c)TANI TESTLERİ: • UYGUN TANI TESTİ NE DEMEK? Hastanın kliniğine paralel doğru seçilmiş Laboratuvar da özenle yapılmış Sonucu titizlikle açıklanmış testtir UYGUN TANI TESTİ İSTEMENİN NEDENLERİ İmmun sistem çevre ile dinamik bir dengede olduğu için; Çoğu testin spektrumu geniştir İmmunolojik testlerin BAZILARI; BİOASSAY (yaşam sürecinde inceleme) olduğundan Test sırasında kontrol edilemeyen değişken faktörlerden etkilenirler Bundan dolayı testler ♣ Aynı yaş ve zamanda Hasta ve kontrol gruplarında yapılmalıdır Bazı testler ilgili laboratuvarda az yapılır Bundan dolayı Bu birim sürekli nitelik kontrolü yapması gerekir Test sonuçları Klinik durumla paralel açıklanması gerekir ÇÜNKÜ; Başka ikincil hastalıklar Veya metabolik bozukluklar sonuçları etkiler İmmunolojik testler Özel araç- gereç ve uzman ekipmanlı laboratuvarlar gerektirdiğinden pahalıdır IMMUNOLOJİK TESTLERDE KLİNİK ÖRNEKLER • Venöz damardan kan alınabilir • Mikrobiyal antijen tayini ile ilgili Serum, dışkı, balgam, idrar, Boğaz salgısı, BOS, PMNL Diğer enfekte doku, salgı ve sekresyonlar • Humoral immuniteyle (antikor tayini) ilgili Serum (antikoagulansız kan) • Hücresel immuniteyle ilgili Heparinlenmiş taze kan ve eriyik maddeler İnvivo uygulamalar (cilt testleri) • İmmuno genetik çalışmalarla ilgili Kan örnekleri Taze veya fikse edilmiş dokular ENFEKSİYON HASTALIKLARININ TANISINDA • İmmunolojik (Serolojik) Testler ♦ Enfeksiyon hastalığının tanısına sıklıkla indirekt, (bazende direkt) yardımcı olurlar ♦ Çeşitli klinik örneklerde mikroorganizmalara özgül antijen (Ag) veya antikorları (Ab) arama testleridir ♦ Ag araştıran testlerde duyarlılık erken ve tedavi edilmeyen durumlarda yüksektir ♦ Ab araştıran testlerde primer immun yanıt 7-21 gün içinde geliştiğinden çok erken evrede yalancı negatif olabilir ♦ Erken tedavi edilen ve bağışıklık yetmezliği olan olgularda antikor yanıtı gelişmemektedir ♦ Bu testler Ag-Ab birleşme temelli testlerdir ♦ Bu testler duyarlılığı ve özgüllüğü farklı YÖNTEMLERLE invitro olarak yapılmaktadır ♦ Bu yöntemlerin ANALİTİK duyarlılığı farklıdır – Hücresel İmmun Yanıt (Fakültatif yada zorunlu H.İ.B) gelişir • İnvivo deri testleri • İnvitro sentezlenen Quanteferon miktarı ya da Quanteferon sentezleyen hücre miktarı ölçülür. İmmunolojik yöntemlerin analitik duyarlılıkları (µg/ml- ng/ml) Yöntemler Analitik duyarlılıklar Protein elektroforezi 100 mg/dl Immun elektroforez 5-10 mg/dl Tek Yönlü Immundiffüzyon <1-2 mg/dl Çift Yönlü Immundiffüzyon <1 mg/dl Elektroimmundiffüzyon <0,5 mg/dl Nefakometre? 0.1 mg/dl Aglütinasyon/KBD 1 mikrog/dl RIA-EIA-FIA- Kemilüminesans-IA <5pg/ml Presipitasyon MİKROBİYAL ENFEKSİYONLARDA SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK) YÖNTEMLERİN AMACI(I) 1- TANIDA; • ÖRNEĞĠN; VĠRUSLARIN TANIMLANMASINDA; ♦ Kültürle izolasyonu; • Olanaksız, güç veya uzun zaman aldığından • örneğin HIV enf uygun hayvan yok • Tam donanımlı laboratuvarlar ve deneyimli elemanlar gerektirdiğinden • Virus izolasyonu için uygun örnek almak, transport etmek, saklamak hususlarındaki sorunlardan dolayı • RUTĠN TANIDA PRATĠK DEĞĠLDĠR VİRUS ENFEKSİYONLARINDA SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK) YÖNTEMLERİN AMACI(I) *Viruslerin mikroskobisinde; -EM ve inklüzyon cisimciği aranmasının pratikte kullanımı sınırlı, zahmetli ve pahalı olması -Subjektif değerlendirmelere (deneyimli eleman) açık olması, yalancı pozitiflik ve negatiflikler olabilir VİRUS ENFEKSİYONLARINDA SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK) YÖNTEMLERİN AMACI(I) ♦Viral nükleik asidin saptanmasında; -Moleküler Yöntemlerin *Her sağlık merkezinde uygulanamaması * Uygulandığı laboratuvarlara teknik donanım yetersizliği ve deneyimli ekipman azlığı * Her virus için deneysel olarak optimize edilememesi -Yalancı pozitif ve negatiflik sorunu * Her virus için uygulamasının olmaması - Özgül primer sorunu • Mikrobiyal Enfeksiyonlarda İmmunolojik (serolojik) Test Yöntemlerinin amacı; ÖRNEĞİN; BAKTERİYAL ETKENİN TANIMLANMASINDA İzolasyonun olanaksız, güç veya zaman gerektirdiği durumlar; Lepra, Sifiliz, Brucelloz, Tularemi Derin yerleşimli bir enfeksiyonda örneği elde etmek veya üretmede zorluk; Coxiella endokarditinde endokard örneği almak veya kanda üretme zorluğu Legionella, Chlamydophila, atipik pnömosinde BAL yada NFS almak veya üretme zorluğu Geçirilmiş bir enfeksiyon veya taşıyıcılık durum belirlemede: ARA veya AGN’ de ASO düzeyi Tifo’da Anti-Vi varlığı MİKROBİYAL ENFEKSİYONLARDA ETKENİ TANIMLAMADA SEROLOJİK (İMMUNOLOJİK) DEĞERLENDİRME KRİTERLERİ (I) Antikor tayin temelli dört kriter vardır a) Tek bir serum örneğinde; Yüksek titrede spesifik IgM yanıtı -Rubella IgM, M.pneumoniae IgM Veya IgM negatif IgG pozitif ise; Akut-konvelasan dönem (2-3 hafta sonra) serumda 4 kat titre artışı -EBV IgG, C. pneumophila IgG ≥512 b) Akut ve konvelasan dönem (2-3 hafta) serumda 4 kat titre artışı Total antikor yanıtında Paul Bunnel testi (EBV) Bruselloz tanısında Wright Testi 1/20den > 1/160 c) Nadir görülen enfeksiyonlarda; Tek serum örneğinde Özgül IgM antikor yanıtı Kuduz, Botulismus d) IgG AVİDİTE TESTLERİ AFİNİTE: Multivalan bir antikorun monovalan bir antijenle bağlanma kuvveti AVİDİTE: Multivalan bir antikorun multivalan bir antijenle bağlanma kuvveti Primer ve sekonder enfeksiyon ayırımında kullanılır Olası Serolojik Profiller IgG (-) IgM (+) Yeni Kazanılmış enfeksiyon IgG (+) IgM (-) Önceden Geçirilmiş ve Kazanılmış Bağışıklık IgG (+) IgM (+) BU DURUM; Re-enfeksiyonlarda Toplumda yaygın dolaşan viruslar; CMV, HSV gibi Re-aktivasyonlarda CMV, HSV, EBV, VZV gibi latent viruslar Akut ve Subklinik Enfeksiyon Sonrası Uzamış Serokonversiyonda GÖRÜLEBİLİR Toksoplazmoz IgG AVİDİTE TESTLERİNDE PRENSİP (I) • Primer enfeksiyonlarda viruse özgül IgG aviditesi düşük; Sekonder enfeksiyonlarda Yüksek Re-enfeksiyon/aktivasyon Primer enfeksiyonlarda oluşan antikorlar zaman ilerledikçe(>4 ay), olgunlaşır ve antijenlere bağlanma gücü artar Bunun nedeni; Yüksek aviditeli B lenfositlerin seçilmesindendir • İMMUNOKOMPETAN KİŞİLERDE AVİDİTE OLGUNLAŞMA SÜRELERİ CMV 4 ay RUBELLA 2 ay TOXOPLASMA 6 ay EBV 2.5 ay HIV 6 – 12 ay IgG AVİDİTE TESTLERİNDE PRENSİP (II) • Hamile kadınların; CMV, Rubella konjenital enfeksiyonlarında; Primer ve sekonder enfeksiyon ayrımında önemlidir Enfeksiyon primerse konjenital geçiş yüksektir Sekonder ise virusun geçişi düşüktür • Immunsuprese Olgularda CMV, EBV ve HHV-6 enfeksiyonların primer yada sekonder ayrımında kullanılır • ETKENİ TANIMLAMADA ANTİJEN TAYİNİ: Duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek tanı yöntemleriyle • Doğru yerden ve uygun şekilde alınan örneklerde Ag tayini PMNH / pp65’in IF ile CMV tanısı Serum örneklerinde HBsAg’nin EIA ile HBV tanısı C.trachomatis Ag tayini ancak epitel hücre içeren üretral yada endoservikal sürüntü yada akıntı H.pylori HpsA tayininde fazla sulu yada katı olmayan dışkı Ag Tayininin Yapıldığı Durumlar; • İzolasyonda(Kültür) sorunlar – Kültürde zor üreyen bakterilerin tanısında; » Örn: - C. trachomatis - L. pneumophila – Kültürü geciken yada uzun süren mikroorganizmaların tanısında; » Bakteriler - H.pylori » Viruslar - CMV/pp65 » Parazitler - E. granulosus » Mantarlar -C. neoformans • Kısa sürede, hızlı tanı konulması gereken ACİL-CİDDİ durumlarda; – Özellikle mikrobiyal menenjit tablosunda » Örn: S.agalactia yenidoğan menenjiti – Tonsillofarenjit » S.pyogenes • Toksijenik Ag’lerin tayini ile Bakteriyolojik Tanısında – C. difficile • Karışık ortamlardaki bakterilerin hızlı tanısında – Campylobacter • İndirekt bakteriyal tür tanısında – Shigella spp Immunolojik(Serolojik) tanı neleri amaçlar?(II) 2. Enfeksiyon hastalığını doğrulama Direkt Aglutinasyon Testi -Kültürde üreyen bakterinin antijenine karşı hasta serumundaki antikor yanıtının saptanması M.tuberculosis enfeksiyonunda Quanteferon testi HIV’ de EIA ile Anti- HIV’ in WB ile doğrulanması 3. Bir kişinin ya da toplumun bağışıklığını saptama Anti-HAV IgG, Anti-HBs 4. Etkenlerin serogrup, serotip veya immuno tiplendirilmesi E. coli’de ETEC, EPEC gibi 5. Hastalığın prognozu HAV IgM yanıtı, HBV’de hepatit belirteçleri Serolojik(İmmunolojik) Tanıda Klinik Örnek Uygunluğu • Serum, plazma, plevra-periton-eklem sıvısı, BOS ve doku kesitleri • Ab Arama amaçlı serumun eldesi aseptik koşullarda olmalı ve Hemolizli, lipemik, fibrinli olmamalı • Ag Arama temelli klinik örnekler; CMV/ pp 65 PMNH bakılabilir RSV/Ag Nazofarengiyal yıkama suyu veya aspirat • Serolojik testler test kuralına göre çalışılmalı Örneğin: Soğuk aglütinasyon • Taze serumla çalışılmalı, Çalışılamıyorsa; Testlerin özelliğine göre 40C, -22, -40, -700C’ de saklanmalı • Serumlarda dondurma ve çözme işlemi bir kez yapılmalı • Bazı hastalıklarda kan alım aralığı önemli Örneğin: HIV’de ortalama 1.5 ay sonra Serolojik Tanıda İnvitro Test Prensipleri IgG’nin moleküler yapısı Antijen (Ag)- Antikor (Ab) birleşmesinin özellikleri • Antijen-antikor birleşmesi kimyasal bir reaksiyondur – Çünkü ısı açığa çıkar • Özgül bir reaksiyondur – S. flexneri‘ye karşı hazırlanan Ab – S. dysenteria ile birleşmez • Geriye dönüşür bir reaksiyondur – Ag+AbAgAb – Ag ile Ab arasında meydana gelen denge K ile gösterilen denge sabiti ile açıklanır • K=(AgAb) / (Ag) (Ab) • K ne kadar yüksek olursa birleşme o kadar özgüldür. • Antijen ve antikor uygun oranlarda bir araya getirildiğinde maksimum reaksiyon oluşur • İki safhalı reaksiyondur: 1. safha; -Çok kısadır, Gözle görülmez -Elektrolitlere gereksinim yoktur 2. safha; - Uzundur, gözle görülür. - Elektrolitlere gereksinim vardır. - Isı ve nötral pH reaksiyonu hızlandırır Antijen-antikor birleşmesinde rol oynayan kuvvetler 1- Elektrostatik kuvvetler - Ag ve Ab moleküllerinin yüzeyinde birbirine zıt yüklü yapıların birbirini çekmesidir - Bu hücrelerdeki çekme gücü 2 molekül arasındaki uzaklığın karesi ile ters orantılıdır. F=(1/d2) -Bu kuvvetler Ag ve Ab birbirine yaklaştıkça artar - Örneğin NH+ grubu ise iyonize COO- grupları birbirine çeker. 2- Hidrojen bağları -Hidrofilik gruplar arasında meydana gelen bağlardır -Zayıf ve geriye dönüşümlü bağlardır -Bu bağların oluşmasında iki molekülün birbirine yaklaşması gerekmektedir. 3- Hidrofobik bağlar - Bu bağlar 2 molekülün birbirine yaklaşması sırasında su moleküllerini iterek birleşmesinde etkendir 4- Van der Walls kuvvetleri - Bu kuvvetler Ag ve Ab molekülünü saran elektron bulutları ile ilgili kuvvetlerdir. - Bu kuvvetlerin etkinliği için Ag ve Ab moleküllerinin birbirine çok yaklaşmaları gerekir. - Bu kuvvetlerin etkinliği Ag ve Ab arasındaki uzaklığı 7 ile ters orantılıdır F=1/d7 SEROLOJİK TEST YÖNTEMLERİ 1)PRESİPİTASYON; • Çözünür haldeki antijen ve özgül antikorların Optimum konsantrasyonda karıştırılması ve Birleşmesine bağlı gelişen reaksiyona denir Reaksiyon sonucu Kompleks (presipitat)gözle görülür Birkaç dakikadan,1-2 güne kadar uzayabilir • Reaksiyonda Optimum Ag ve Ab miktarı önemlidir AYRICA; PH, elektrolit ve ısı da önemlidir Presipitasyon reaksiyonları; • Pasif difüzyon şeklinde Sıvı ortamda difüzyon Halka ve kapiller tüp N. menengitidis, S. pneumoniae, H.influenzae Ag Jel (agar)ortamda difüzyon Tek yönlü difüzyon Quidin tüp dif. Çeşitli virus ve bakteri Ag belirlenmesinde kullanılır Radyal, Mancini plak dif. CRP, serum Ig ve kompleman düzeyleri ♣ Türbidimetrik ve nefolometrik cihazlar geliştirilmiştir ♣ Çok sayıda kan değerlendirilmesi için Çift yönlü (quchterlonoy plak) difüzyon Aspergilloz, histoplasmoz, blastomikoz Ag’lerin belirlenmesinde Immuno-double diffusion ■ ELEKTRO- İMMUN DİFÜZYON Elektrikli ortamda; Antijenler elektriksel alanda ayrılırlar (elektroforez) Elektroforez için değişik matriksler; Kağıt Sellüloz asetat Agar Poliakrilamid kullanılır İmmun difüzyon ve elektroforezin birleştirilmiş tekniğine İMMUNELEKTROFOREZ denir Serum proteinlerinin tanımlanmasında Ig sınıfları ve ağır, hafif zincirlerdeki anormalliklerin saptanmasında Basit, tek yönlü (laurell)(roket elektroforezi) ♣ Titresi bilinmeyen bir antijenin titresini belirler Karşıt( zıt yönlü) IEF ♣ HBV Ag ve Ab saptanmasında ♣ Septik menenjit, pnömoni, septik artrit vb etken Antijen saptanmasında 2) AGLUTİNASYON: • Doğal olarak antijen taşıyan Bakteriler, Eritrositler, Lökositler • Yüzeylerinde yapay olarak antijen bulunan Eritrosit, Latex, Bentonit Polistren gibi sentetik parçacıkların Elektrolitli bir ortamda Taşıdıkları antijenlerle, Spesifik antikorların ♣ Kümeleşme yaparak çökmesine denir • Lamda, tüpte mikroplaklarda yapılırlar • İkiye ayrılır Aktif aglutinasyon Pasif aglutinasyon • AKTİF AGLUTİNASYON; DİREKT Aglutinasyonda rol alan antijen partikülün kendisidir Bakterilerin antijenleri Gruber- Widal, Wright, WF Kan grubu antijenleri Aktif hemaglutinasyon ♣ ABO, Rh, Vd Forward Reverse ♣ Cross-Matching Major Minor ♣ Soğuk aglutinasyon M.pneumoniae ♣ Paul- Bunnel EBV • AKTİF AGLUTİNASYON; İNDİREKT Antijen ve antikorun bağlanmasında ikincil bir antikorun kullanılması Antiglobulin Ab (tavşan kaynaklı - ticari) Direk Coombs ♣ Eritroblostasis fetalisli çocukların eritrosit yüzeyindeki Ab saptanır İndirekt Coombs ♣ Rh (-) annenin serumdaki Anti-Rh Ab’ler saptanır PASİF AGLUTİNASYON • ANTİKOR (Ab) ARANIYORSA Aglutinasyonda rol alan antijenler Polisakkarit veya Proteinler (tannik asitle) Eritrosite bağlanırsa ♣ HEMAGLUTİNASYON VZV, Rubella, CMV, T.gondii Latex partikülleri, bentonit, kömür vb PASİF AGLUTİNASYON • ANTİJEN (Ag) (TERS PASİF) ARANIYORSA; Eritrosit, latex, bentonit, kömür S.aureus covan 1 Antikorun Fc’sine bağlanır Latex Agg (LA) Ko Agg (CoA) ♣ Serum, BOS, idrarda Bakteriyal polisakkarit Ag’leri N.menengitidis Hib S.pneumoniae C.neoformans Streptokok gruplandırılması, S.aureus koagulaz deneyi Çeşitli bakteri ve virusta ag tayinleri • Hemaglutinasyon- inhibisyon (HI) testi Hemaglutinasyonu engelleyici antikorların saptandığı testtir Hastanın serumu seri dilusyon edilir Üzerine standardize sabit virus antijeni konulur Eritrositler eklenir Serumda Ab’ler varsa Hemaglutinasyonun görülmediği son titre pozitif sonuçtur İnfluenzae, Kabakulak, Rubella enfeksiyonlarında 3)KOMPLEMAN BAĞLAMA TESTİ • Antijen ve antikor birleşmesinin komplemanı uyarmasına dayanarak geliştirilen iki basamaklı testtir • Antikor (sıklıkla) ve antijen saptayabilen yarı kantitatif bir yöntemdir • Test birbirinden farklı üç komponent içerir Test sistemi Hasta serumu (inaktif/aranan Ab) Antijen (bilinen) KOMPLEMAN(kobay veya tavşan serum) İndikatör sistemi (hemolitik sistem) Koyun eritrositleri Koyun eritrositlerine karşı Ab DEĞERLENDİRME; • Hasta serumunda Ab varsa Ag ve Ab birleşecek (klasik yol) C, Ag ve Ab’ye bağlanacak Ortamda C kalmayacağı için Hemolitik sisteme bağlanamayacak Hemoliz olmayacak Bazı viral, riketsiyal ve fungal hastalıkların tanısında 1990’lı yıllarda Sifiliz için KOLMER 4)FLOKÜLASYON – Kardiolipin antijenin sifilitik hasta serumlarındaki reaginlerle birleşerek oluşturdukları, – VE; Toksin ile anti toksinin uygun miktarda karşılaştıklarında meydana getirdikleri KÜMECİKLERE denir – Bu kümecikler gözle yada küçük büyütmelerle görülebilir. Toksoid aşıların miktar tayininde kullanılır AYRICA; Sifilizin tarama testlerinde; Rapid plazma reagin (RPR) direkt, VDRL kadar ise serum inaktif edilerek çalışılır. Bunlar tüplerde veya özel lambalarla kalitatif (RPR) ve kantitatif (VDRL) olarak yapılabilirler. RPR, 4+’dan (-) kadar, VDRL de ise ½ den başlayan ve yukarı titrelere kadar varan titrede sonuç verilir. 5)NÖTRALİZASYON • Bir virusun enfektivitesini Özgül antikoru ile etkileştikten sonra Kaybetmesine denir. Enfektiviteyi nötrleyen antikorların ortaya çıkarılması testidir. BİRÇOK VİRAL ENFEKSİYON TANISI Nötrolizan Ab’lerin saptanması Çift serumda Ab titresinin artışıyla sağlanır Poliovirus/Serum Doku Kültürüne Kabakulak virusu/Serum Embriyonlu Yumurta Kuduz Aşısı/Serum Fareye • Nötralizasyon İnvitro ve invivo yapılabilir İN VİVO 3 ŞEKİLDE YAPILABİLİR: Deney Hayvanlarında En sık Fare kullanılır Doku Kültüründe En sık bu yöntem kullanılır Prensip CPE’nin yok edilmesidir. CP’nin görülmediği titre nötr. titresidir. Embriyonlu Yumurta İnfluenzae- Kabakulak Allantoik keseye Çiçek-Herpesviruslar Karioallantoik zara İN VİTRO OLARAK ASO deneyi AGBHS’ de Streptolysin O’ya karşı Anti- Streptolysin O oluşur Nötrolizasyon sonucu İndikatör olarak eritrositlerde erime olmaz METABOLİK İNHİBİSYON TESTİ • • • • Nötralizasyon Testi gibidir Virus/Serum karışımı Üzerine hücre süspansiyonu konur Fenol kırmızısı(İndikatör) Nötralizasyon varsa renk SARI Nötralizasyon yoksa renk KIRMIZI Örneğin; Enteroviruslarda renk kırmızı kalır, Adenoviruslarda renk değişikliği olur. G)İMMUNOASSAY TESTLER • İşaretli antikorların kullanılmasıyla 1942’de; FA Fluoresan Antikor (Fluorokromlar) 1954’de; IFA (İndirekt Fluoresan Antikor) 1960’da; RIA (Radyoizotopla- iyotla) 1970’de; EIA (enzimle) kullanıma girmiştir Antikor yada antijen saptamak için kullanılırlar I- İmmun Fluoresan (IF) testler • FLUORESANS Fluorokrom veya florofor boyaların Ultraviyole ışık altında Işık enerjisini emerek Bu enerjiyi farklı dalga boyuna çevirmesine denir • Antikorlar en sık fluoresin isotiyosiyanat (FITC) ile işaretlenir. BUNA GÖRE; Direk fluoresan antikor (DFA) Katı fazda klinik örnek (Ag) Üzerine FITC’li Ab Pozitif sonuç (fluoresan-yeşil görüntü) Bakteri ve viruslerin hızlı tanıda ♣ Kuduzda negri cisimciği ♣ Kolera tanısında İndirek fluoresan antikor (İFA) Katı fazda hazır Ag Hasta serumu(aranan Ab) FITC’li Anti-Ig Pozitif sonuç (fluoresan görüntü) Birçok bakteri virus enf ve otoimmun hast. ♣ FTA- Abs (T.pallidum) ♣ ANA, AMA vb • IF yöntemiyle klinik örneklerden hem Ag hem Ab aranır • Fluoresan mikroskobu olması ve uzman kişi gereklidir II-Radioimmuno Assay (RIA) • Yöntem aynı IF ve EIA gibidir • Antikorda işaretliyici madde olarak Radyoaktif madde I. 125 ve I. 132 kullanılır Gamma sayaçlarında değerlendirilir Radyoaktif madde kullanımından dolayı sınırlıdır Özellikle hormon testlerinde (TSH, T3, T4) kullanılır Radyo allergo sorbent (RAST) deneyi Allerjene spesifik IgE tayininde kullanılır Radioimmunosorbent (RIST) Serumda total IgE tayininde VI. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbend Assay) – Antikoru ENZİMLE İŞARETLEME yöntemidir Peroksidaz, alkalin fosfataz ve beta galaktozidaz gibi enzimler Spesifik substratları renkli ürünlere çevirirler Peroksidaz/Orthofenilendiamin Alkali fosfataz/Nitrofenil fosfat Renkli ürünler spektrofotometrede belirli dalga boylarında olurlar – Yöntemin; Kullanılan reaktifler uzun ömürlü olması Artık maddelerle ilgili radyasyon sorunu olmaması Uygulamasının basit ve otomatize edilebilmesi yönleriyle Aynı prensipli (işaretleme) RIA ve IF’ye göre avantajlıdır • Dezavantajları ise; Antijen saptamada klinik örneğin uygunluğunun değerlendirememesi Bazı viral enfeksiyonlarda düşük Ag yoğunluğu saptanmaması IgM saptanmasında RF-IgM ile çatışmanın olması Bunun için Absorblama işlemi olması – Antijen veya antikorun çeşitli vücut sıvılarında <5pg düzeyinde saptandığı için yüksek ANALİTİK DUYARLILIKTA olması – UYGULAMA PRENSİPLERİ Ag ve Ab (sınıfa özgül) saptayabilir Katı faz olarak; Plastik tabanlı mikrotitrasyon plakları Boncuk veya filtre kullanılır Bazı ELIZA uygulama şekilleri: 1)İNDİREK ELIZA ile Ab Tayini • • • • • • • • Ag kaplı kuyucuk Hasta serumu (Aranan Ab) Yıkama Enzim işaretli ikincil Ab Yıkama Substrat H2SO4 (Reaksiyonu durdurur) Spektrofotometre Yarışmasız İndirekt ELISA ile Ab saptama 2)Sandwich ELIZA ile Ag Tayini • • • • • • • • Katı yüzeyde capture monoklonal yada poliklonal Ag içeren hasta serum örneği Yıkama Enzimle işaretli saptayıcı monoklonal yada poliklonal Yıkama Substrat H2SO4 (Reaksiyonu durdurma) Spektrofotometrede okuma 3) İNDİREK SANDWİCH ELIZA ile Ag Tayini • • • • Katı yüzeyde capture Ab Ag içeren hasta serum örneği Yıkama Spesifik bir saptayıcı antikor ilave edilir antijene bağlanır • Ag iki antikor arasında kalır • Enzimle işaretli ikincil Ab saptayıcı antikora Fc bölgesinden bağlanır • HRP ile işaretli • • • • Yıkama Substrat H2SO4 (Reaksiyonu durdurma) Spektrofotometrede okuma 4) YARIŞMACI (KOMPETATİF)ELISA: –Serumda Ag Arama (Sıklıkla kullanılır) Katı yüzeyde Ab Şüpheli serum (Ag aranan klinik örnek) ve enzimli işaretli antijenin beraber konulduğu antijen rekabet (Competetive) yöntemidir. İşaretli antijen katı yüzeye bağlanırsa, substratla da birleşir RENK OLUŞUR. Bu sonuç klinik örnekteki Ag’nin olmadığı bir sonuçtur. Fakat klinik örnekteki antijen katı faza bağlanırsa enzim olmadığından substratla reaksiyon olmaz. RENK OLUŞMAZ. 5) YAKALAMALI (CAPTURE)ELISA: Sıklıkla; Enfeksiyoz etkene yönelik, Spesifik IgM ve IgG saptama testidir 1)Spesifik Ag saptama Katı faza poliklonal veya M.ab’lar konulur Poli Ab’ler, M Ab’lere göre Farklı Ag epitoplarını bağladığı için güvenilirdir 2)Spesifik Ab (IgM) saptama • Katı faz formu IgM’in Fc bölgesine karşıt anti-IgM Ab katı faza bağlanır Üzerine hasta serumu (IgM?) konulur Üzerine viral antijen Enzimle işaretli antikor Substrat… • Konjugat faz formu Katı fazda viral Ag Hasta serumu (IgM?) ENZİMLE İŞARETLİ anti IgM Ab (KONJUGAT) Substrat… • UYGULAMA CİHAZ SİSTEMLERİ – MİKROELİSA TEMELLİ AÇIK SİSTEMLER Klasik Cihazlar İlk yıllarda kullanılan bağımsız yıkayıcı ve okuma cihazlarından ibaret sistem Yarı Otomatik veya Tam Otomatik Cihazlar Örnek yükleme, Yıkama ve okuma cihazları entegre sistemler • MAKROELİSA TEMELLİ KAPALI SİSTEMLER – Kan bankası rutin çalışmalarına son yıllarda giren sistemlerdir. – Çalışma sistemleri ve Prensipleri; Kapalı bir cihaz ve bu cihazda çalışmaya uygun kitler ile cihaza bağlı bilgisayar ve yazıcı. – Piyasada en sık bulunan sistemlerde kullanılan kitler; Enzyme-linked flureskent assay (ELFA) Mikro partikül enzim immuno assay (MPEIA) Fluoresan polorizasyon immuno assay (FPIA) Chemiluminescent Assay (CA) yöntemleri ile çalışmaktadır. MİNİ VİDAS-ELFA • Bu sistemlerin; – BAŞLICA AVANTAJLARI Duyarlılık ve özgüllükleri yüksektir. Tam otomatik (inkübasyon, yıkama, reaktif pipetleme işlemleri) 24 saat kesintisiz çalışmaktadırlar. Açık sistemlere göre kontaminasyon, teknisyen hataları son derece azalmaktadır. Random acces(Rastgele erişimli) Çok sayıda farklı testi aynı anda ve aralıklı yapan sistem İstenilen bir test istenilen bir örnekten istenilen bir durumda(acil)yapabilmeye uygun STAT girişli (tek örnek ve bir örneklik reaktif kullanımı) olmalarıdır. Reaktif kompartmanlarının 2-8 0C sahip olmalarıdır ve cihazlarda atık torbalarının olması. Bunların yanında gerek cihaz donanımı gerek kitlerin hazırlanma tekniklerine ilişkin olarak avantajları vardır. –DEZAVANTAJLARI Kurumu tek cihaza ve buna bağlı olarak tek kite zorunlu kılmaları Açık sistemlere göre pahalı olmaları IV-WESTERN- BLOT • Viral lizat veya rekombinant antijenler Sodyum dodesilsulfat yardımıyla (SDS) POLİACRYLAMİD JEL zemininde, molekül ağırlıklarına göre elektroforetik olarak ayrılır. • Polipeptit antijenler, ikinci bir elektroforez ile NİTROSELÜLOZ MEMRAN ŞERİTLER ÜZERİNE transfer edilir. • Hasta serumu ile şerit üzerindeki antijenler özel bir testte temas ettirilir (elektroforetik yöntem) • Hasta serumunda aranılan antikorlar varsa, şerit üzerindeki antijen bulunan BANDLARDA RENK KOYULUĞU (KOYU-ZAYIF-RENKSİZ) oluşur. • Kitin internal Pozitif ve Negatif kontrollerindeki band renkleri değerlendirmede önemlidir. • Ve band için, HANGİ ANTİJEN VARSA REAKTİF kabul edilir. • Şeritlerin üzerindeki bandların pozitifliğine göre o hasta için, etkenin sonuç virulansı patternlerine göre POZİTİF-NEGATİF VEYA SAPTANMAYAN sonuç verilir. Etkene özgü IgM, IgG, IgA antikorlarına göre test yapılabilir. HIV, H.pylori ve T.pallidum enfeksiyonlarının tanısında özgüllüğü yüksek olarak kullanılmaktadır. Western blot (WB) III-HÜCRESEL İMMUNİTE ÖLÇÜM YÖNTEMLERİ • HÜCRESEL İMMUNİTEYE YÖNELİK TEST YÖNTEMLERİ İKİ BAŞLIK ALTINDA İNCELENİR A) İNVİTRO TEST YÖNTEMLERİ B) İNVİVO TEST YÖNTEMLERİ A)İNVİTRO TEST YÖNTEMLERİ 1)LÖKOSİT SAYIM VE FENOTİPLEMESİ • LÖKOSİT SAYIMI Mikroskopik yöntemlerle Hemositometrik hücre sayımı Işık mikroskobu (40’lık) Thoma ve Neabaur lamları %0.4’lük tripan mavisi ♣ Rutinde Pek kullanılmıyor Gelişmiş immuno hemotolojik cihazlar En uygun yöntemdir Piyasada farklı firma cihazları var • LÖKOSİT FENOTİPLEMESİ Vücudun değişik bölgelerinde Kemik iliği, kan, dalak ve lenf nodüllerinde Lökositlerin sayı ve tipleri ♣ Lenfositlerin B lenfositleri T lenfositleri T4 ve T8 ♣ Monositlerin ♣ Granülositlerin Nötrofiller Bazofiller Eozinofiller İmmuno hematolojik cihazlar, Flowsitometrik cihazlarla Hücre yüzey moleküllerinin (Marker) fenotiplemesi CD (cluster of differntiation – farklılaşma kümeleri) antijenleri Hematopoetik hücrelerin yüzeyinde yer alırlar 250’ye yakın CD tanımlanmıştır ♣ Örneğin CD4 T, CD8 T, CD45 B lenfosit gibi Lökositlerin yüzeyindeki CD antijenik epitopları ♣ Monoklonal antikorların (MAbs) Fluoresan boyalar Enzimlerle konjuge edilerek Fluoresan mikroskobuyla Flow sitometri cihazlarıyla( EN SIK) * Kantitatif analizi ve * Hücre ayrımı ve tanımlaması yapılır FLOWSİTOMETRİ ÇALIŞMA PRENSİBİ; • Fluoresanlanmış (FITC ile) M Ab ile işaretlenmiş hücreler • Sıvı bir ortamda sıra halinde uyarıcı ışıktan (Argon lazer) 488nm’de geçirilirler Uyarıcı ışığı Hücreler kırarlar veya Florokromla işaretlenmiş m Ab’lerin bağlandığı hücre tarafından emilir ve yayılır Bu yayılan ışığın şiddetini ve niteliğini algılayan dedektörler bilgisayara aktarırlar Buna göre; ♣ Hücrenin tipi ve sayısı belirlenir 1’den 10’a kadar renk eklenebilir – ve bu sayı artmaktadır • KLİNİK KULLANIMI Lökosit fenotiplemesi (EN SIK) Konjenital veya kazanılmış immun yetersizlik tanısı (en sık AIDS) HIV pozitifliğinde prognoz değerlendirilmesi İmmun yetersiz hastalarda immuniteyi yada kemoterapi monitörizasyonu KİT yapılan hastalarda yeni immun durumun takibi Tümör hücre fenotiplemesi Lösemi ve lenfoma tanı ve sınıflaması B lenfositlerinde klonal tayini ve lenfoma ve lösemi ayırımında Hücre içi antijenlerin (myeloperoksidaz miktarı) tayini Hematopoetik hücrelerin (CD4) Hematopoetik olmayan Tümörler ve hücrelerden ayırt edilmesi • DNA analizi Anöploidi tayini Hücre siklüsu kinetiğinin belirlenmesi Apoptozis • Nötrofil fonksiyon analizleri O2’nin oluşumunun tayini ile; Granulomatoz hastalık tayini • Diğer kullanım alanları Retikülosit sayımı Transplant hastalarında Cross-Match Sitogenetik • ENFEKSİYON HASTALIKLARINDA Mikroorganizma- hedef hücre ilişkisi; Apoptozisin incelenmesi HIV ile enfekte kişilerde ♣ Monunükleer hücrelerinde apoptosis oranları CD8 T ve CD19 B hücrelerinde en sıktır Konak hücreye ait proteinlerdeki değişimler EBV ile enfekte B lenfositlerinde; ♣ BCR2 ekpresyonu HIV ile enfekte T lenfositlerinde; ♣ CD4 ekpresyonu CMV ile fibroblastlarda; ♣ MHC I ekpresyonu Mikroorganizmanın hücreye bağlanmasının incelenebilmesi EBV’nin ♣ B lenfositlerine ♣ Epitel hücrelerine CR2 reseptörüne Poliovirus ♣ MNH CD14 reseptörlerinde Kızamık virusu ♣ Hedef hücrelerin CD46 reseptöründe Hücre içi ve yüzeyi mikroorganizma antijenlerini incelem VZV ile enfekte hücre yüzeyinde ♣ gp1 HIV ile enfekte CD4 T lenfositlerinde ♣ gp 160/120 İnfluenzae ile enfekte hücrelerde ♣ HA antijenileri Klinik virolojide kullanılmaktadır Enfekte kişilerin hücrelerinden Virusle enfekte olanları süratle belirler ♣ CMV ile enfekte MNH’ler kantitatif olarak ♣ HIV seropozitif kişilerde MNH’ lerde kantitatif Ag tayini Böylelikle; *Antiviral tedavinin izlemi Spesifik antikor tayini CMV, HSV, HIV gibi viruslara H. pylori gibi bakterilere T.gondii gibi parazitlere karşı Gelişen spesifik Ab’ler ölçülebilir 2-LENFOSİT SAYIMI VE AKTİVASYON TESTLERİ a) Lenfosit izolasyonu • Dansite- Gradient Santrifüj Yöntemi Kan hücre grupları birbirinden farklı dansite özelliğine sahiptir 3 ml ficol-isopak (Dansite 1077 gr/lt) konur 3 ml heparinli periferik kan konur 1500 devirde, 45 dakika santrifüj edilir Lenfositler orta tabakada yoğunlaşırlar En altta eritrosit ve granülositler ♣ Dansiteleri 1077 ‘den fazla En üstte buff-coat toplanır ♣ Dansiteleri 1077’den düşük ♣ Buff- Coat’dan Trombositler (santrifüj) Monositler petri kabında tutularak uzaklaştırılır b) Lenfosit ayırımı • T lenfosit ayırımı Rozet testi Koyun eritrositlerine karşı CD2 reseptörü vardır Periferik kanda E-Rozet yapan %65-70 T lenfosit vardır B lenfositi E-Rozet yapmaz • B lenfosit ayırımı Direkt immun fluoresan yöntemi Fluoresanlanmış (FITC) anti- Ig Ab ile yapılır Toplam lenfositlerin %20-25’i B lenfositleridir • Periferik kandaki T ve B lenfosit oranını saptamak İmmun yetmezlik hastalıklarının tanısında Lenfosit lösemi ve lenfomadaki lenfosit tipinin tayininde Otoimmun hastalıklar ve kanserli olgularda hücresel immun yanıtın değerlendirilmesinde kullanılır • NK sitotoksisite ölçümü Antikora bağımlı hücresel sitotoksisite ölçümü CR 51 ile işaretlenmiş ve yıkanmış hedef hücrelere Anti- hedef hücre Ig G ile FcR bulunan effektör hücreler (NK, makrofajlar eklenir Hedef hücrelerden CR 51 salınır Gamma sayacında CR 51 ölçülür CR 51 miktarı, ♣ NK hücre sayı ve aktivite düzeyi ile doğru orantılıdır c) Lenfosit Aktivasyon testleri(LAT) • Lenfosit uyarımı Otoimmunite Kanser patogenezinde İntraselüler enfeksiyonlarda Hücresel immun yanıtın ölçümünde uygulanmaktadır • Genelde T hücre bazen B hücre yanıtı değerlendirilir • Aktive olan T hücreleri Morfolojik ve fenotipik değişikliğe uğrarlar Büyüklüğü değişir Histolojik boyamada kromatik değişiklik Dinlenme halinde olmayan Ancak; aktive olduğunda ortaya çıkan yüzey proteinleri meydana gelir • LAT; Hasta lenfositlerinin Özgül antijenle Veya özgül olmayan antijenlerle İnvitro uyarılmasına dayanır İki tipi vardır 1)Yüzey fenotipi (aktivasyon belirteçleri) değişikliklerini belirlemek Aktivasyon belirteçleri Ya enflamasyon bölgesinden direkt hücrelerden Ya da invitro uyarılan lenfositlerden aranır ♣ FLOWSİTOMETRİ ile belirlenir 2) Uyarı sonrası lenfositin proliferasyon yeteneğini ölçmek Lenfoblast transformasyon testi (LTT) 96 kuyucuklu plaklarda yapılır T hücre uyaranları olarak Fitohemaglutin (PHA) Konkovalin A (ConA)gibi lektinlerle Süperantijenler gibi bakteriyel toksinlerle B hücre uyaranları olarak, Süperantijenler LPS kullanılır LTT TESTİNDE; Antijen ve lenfositlerin 72 saat kültürü yapılır H timidin eklenir H timidin çoğalan DNA yapısına girer Radyoaktif veya fluoresan boya ile DNA sentez hızı ve miktarı ölçülür ♣ Hasta ve kontrol karşılaştırmaları ile yorumlanır Karışık lenfosit kültürü Alıcı ve verici kanından ayrılan lenfositler İnvitro besiyerinde karıştırılarak Lenfosit kültürü yapılır ♣ Antijenik farklılık varsa ♣ Biri diğerini aktive eder ♣ Blastik dönüşümle DNA miktarı artar DNA sentezinin kantitatif ölçümü yapılır Bazen verici lenfositleri ♣ X ışınları ile işleme sokulur ♣ Blastik dönüşüm olmaz ♣ Alıcının lenfositleri uyarılır ♣ Alıcının verilecek Dokuya karşı reaksiyon ölçülür Buna tek yönlü karışık lenfosit kültürü denir Doku transplantasyonunda * HLA- D (LD antijenleri) antijenleri saptanır Sitolitik T hücre yanıtının değerlendirilmesinde Lenfositotoksik test Test prosedürü HLA antijeni saptanacak total lenfositler veya CD 19 B lenfosit Hangi HLA’ya ait olduğu bilinen anti-serum Kompleman Tripan mavisi veya eozin boyası ♣ Antijen + antikor birleşir ♣ Kompleman bağlanır ♣ Lenfosit zarı zedelenir ♣ Boya lenfosit içine girer ♣ Mikroskopta %50’den fazla boyanan lenfosit miktarı Denenen lenfositleri, bilinen anti- HLA tipine ait olduğunu gösterir Doku transplantasyonunda * HLA A,B,C antijenlerin göstermede kullanılır • Sitokin sentezini belirleme testleri Aktive T hücreler değişik sitokinler üretirler Enflamasyon bölgesinden elde edilen T lenfositler İnvitro kültürü yapılır Total sitokin sentezini verir ELISPOT (Enzimle işaretli immunspot) Gama- IFN (Quantiferon) sentezleyen hücre sayısı yüzde olarak belirlenir ELISA ile TH1’lerce sentezlenen gama IFN (Quantiferon) miktarı kantitatif olarak saptanır Flowsitometrik yöntemle Tüm farklı sitokin sentezleri ölçülebilir 3- MONOSİT/MAKROFAJ TESTLERİ M/M Hücreleri • Doğal bağışıklıkta rol alırlar Ve özgül bağışıklığı sitokinlerle koordine ederler • Spesifik patojenleri yok eden efektör hücrelerdir • Apoptosizde apoptotik hücreleri temizlerler Bu hücreler doku örnekleri yada hücre süspansiyonlarından MAbs ile saptanırlar Monositin en iyi belirlenmesi; FLOWSİTOMETRİDE Anti, CD14 mAbs ile olur Ayrıca CD11b, CD11c, CD16, CD32, CD64 gibi taşıdıkları reseptörlerle tanımlanmaları yapılır Histokimyasal boyama olarak Non spesifik esteraz Boyaması Monositer lösemi tanısında kullanılır MAKROFAJ GÖÇÜNÜ ÖNLENİM TESTİ • Duyarlı lenfosit ile antijen teması sonucu Salgılanan MIF (Makrofaj göçünü önleyen faktör Saptama testidir Kapiller tüpte Lenfosit Özgün antijen varsa MIF pozitiftir MIF TESTİNİN POZİTİFLİĞİ ♣ O antijene karşı hücresel immun yanıtı gösterir 4-NÖTROFİL FONKSİYON TESTLERİ • Polimorf nüveli nötrofiller (PMN) Doğal immunitenin efektör (fagositik) hücreleridirler Enflamasyon bölgesine ilk gelen hücrelerdir PMN yetersizliği Ya PMN sayısal azlığı Yada PMN fonksiyon bozukluğu şeklinde olabilir Bakteriyel enfeksiyonlara yatkınlık sağlar Yetersizlik ölçüm testleri; a) b) c) d) e) f) g) Nötrofil sayısal değerlendirmesi testleri Nötrofil adhezyon değerlendirme testleri Kemotaksi değerlendirme testleri Opsonizasyon değerlendirme testleri Fagositoz yapmayı saptama testleri Oksidatif patlama ve degranülasyon değerlendirmesi Bakteriyel öldürmeyi değerlendirme testleri olarak sınıflandırılır a)Nötrofil sayısı • Nötropeni 500/ml kanda olması Kemik iliği, malignite, otoimmunite ve kemoterapiye bağlı gelişir Mikroskobik boyama yöntemleri Gelişmiş hematoloji ve immuno hemotoloji cihazlarıyla saptanır FLOWSİTOMETRİ b) Kemotaksi(KT) testleri • Nötrofillerin Enflamasyon bölgesine hareketine (migrasyonu) KT denir Bakteri ürünleri (endotoksin, hücre duvar yapıları, bakteri enzimleri) Konak faktörleri (C3a ve C5a, LTB4) rol oynar Bu kemotaktik moleküllere yanıtsızlık; Defektif migrasyon (göç) yanıtı ile sonuçlanır Defektif göçü saptamada BOYDEN odacık testi kullanılır Filtre üzerinde; ♣ Kemotaktik madde ♣ Nötrofillerle yapılır Petride agaroz jelde; ♣ Kemotaktik maddeler ♣ Nötrofillerle yapılır Kemotaksi testleri İdyopatik immun yetersizlik hastalıklarının tanısında kullanılır c) Nötrofil adhezyonu NÖTROFİLLERİN • Endotele adhezyonu ve enflamasyon bölgesine göçü L-selectin ve İntegrinle sağlanır Bu iki adezindeki yetersizliğe Lökosit adhezyonu yetersizliği (LAY) denir Bu durumda; ♣ Nötrofil enflamasyon bölgesine ulaşamaz ♣ Bakteriyel enfeksiyon yayılır ♣ Abse oluşmaz • LAY hastalarında CD11a/CD 18a LFA-1 (lenfosit fonksiyon antijen-1) lökosit integrini yoktur Mabs’lerle FLOWSİTOMETRİ ile belirlenir d) Opsonizasyon testleri OPSONİN • Mikroorganizmaların fagositlere bağlanmasını sağlayarak fagositozu kolaylaştıran moleküllere den IgG1,3 ve IgM, C3b ve iC3b’dir Opsoninler için Nötrofillerde FcγR III (IgG ve IgM) CR1 ve CR3 (C3b ve iC3b) Makrofajlarda FcγR I,II,III (IgG ve IgM) reseptörleri bulunur • OPSONOSİTOFAJİK TEST Amacı;opsonizasyon-fagositoz sürecini göstermektir. I-tüpe Norm serum + norm lök + kuşkulu bakteri II-tüpe İmmun (hasta) serum + norm lök + kuşkulu bakteri 37ºC’de 20 dakika inkübasyon .Her iki tüpden ayrı preparat hazırlanır May –Grunwald – Giemsa boyama Lökositlerin içine girmiş bakteri sayılır Normal serumda ve immun serumda ♣ Ayrı sayılan bakterilerin toplamı sayılan lökosit sayısına bölünür ♣ Bir lökosite düşen bakteri sayısı bulunur Buna fagositoz endeksi (FE) denir İS/NS oranı OPSONİK ENDEKSİ’ni verir Oranın büyüklüğü İS’deki Ab titresi ile orantılıdır • ERİTROSİT –AMBOSEPTÖR-KOMPLEMAN(EAC) TESTİ Kompleman C3b parçasına karşı Nötrofillerde bulunan reseptörlerin belirlenme testine denir Koyun eritrositleri Özgül antikorları ile birleşir Kompleman bağlarlar ♣ Hemoliz oluşur Kompleman C5 parçası eksik olarak deneye sokulursa ♣ E+Ab/C kompleksi C3b reseptörlü nötrofillerle rozet yaparlar e) Fagositoz • Mikrobiyal öldürmenin ilk basamağıdır • Antikor ve komplemanla opsonize mikroorganizmanın PNL ve makrofajlarla temasından sonra İçeriye alınma işlemidir • Fagositoz testleri Opsonize partiküller ile Nötrofillerin inkübasyonu sonucu Mikroskopta partikülleri içine alan Nötrofiller görülür Opsonize olmuş Ancak hücre içine alınmamış partiküller Asit muamelesi ile uzaklaştırılırlar Fluoresan veya radyoaktif madde ile işaretlenirler ♣ Direkt sayımları yapılır f) Oksidatif patlama ve degranülasyonun değerlendirilmesi I- Oksidatif patlamaya yönelik • Nötrofillerin fonksiyonun değerlendirilmesinde En sık uygulanan test Süperoksit sentez yeteneğinin değerlendirilmesidir • Kronik granülomatöz hastalığın taramasında Bu değerlendirme kullanılır ÇÜNKÜ; Bu hastalık fagositoz defekti sonucu gelişir ♣ Nötrofil içinde NADPH’ı (nikotin amid adenin di nükleotid fosfat de hidro genaz) etkileyen oksidaz enzimdeki bozukluktur • Dört test yöntemi kullanılır 1)NBT (Nitroblue tetrazolium test) • Testin prensibi NBT’ in redüksiyonuna dayanan bir testtir Redükte olduğunda sarı renkten koyu mora dönüşür Nötrofiller; NBT içinde 37 ºC’ de 15 dakika tutulur NBT, nötrofil içine alınır Pyridine ile ekstrakte edilir 515 nm dalga boyunda spektrofotometrede okunur Veya mikroskopta boyanarak görülebilir • Testin değerlendirilmesi Nötrofiller içinde süperoksit ve H2O2 oluşur Bunların redüktan etkisiyle NBT redükte olur (renk değişir) Öldürme işlemi olduğunu gösterir • Lökositlerin mikroorganizmaları öldürme işlemi bozuk olan hastalıklarda Kronik granülamatöz hastalık Chediak- Higashi sendromu Myeloperoksidaz yetmezliği olanlar Glukoz- 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği olanlarda Akut lösemi Down sendromu Akut enfeksiyonu olanlarda NBT negatiftir 2)Sitokrom b ölçülmesi ■ Fagositlerde bulunan; Oksidaz enziminin parçası olan sitokrom –b’ nin İmmunolojik cihazlar Ve biokimyasal yöntemlerle ölçülmesidir 3) Flowsitometrik , DCF (dichlorofluoresan) yöntemi ■ Bu test H2O2 oluşumunu ölçer ■ Kronik granülomatoz hastalığın tanısında kesin sonuç verir 4)Kemülimunisans’a Dayalı immuno hematolojik cihazlar ■ H2O2, O-, O2 radikallerini ölçmeye dayanır II- Degranülasyona dayalı testler • Degranülasyon Fagozom ve lizozomların füzyonu sonucunda Fagolizozomun içine lizozom içeriğinin boşalmasıdır • ELISA yöntemiyle Lizozom içeriğinin Asid hidroloz Lizozim Laktoferrin Katyonik proteinlerin ölçümü yapılır III- Mikrobik öldürme • Mikrobisidal test Hasta ve kontrol grubundan nötrofiller alınır Hastalardan izole edilen bakteri ve mantar ile kültürü yapılır Bir gece beklenir Ertesi gün yaşayan bakteri veya mantar yoksa mikrobik öldürme tamdır B)İNVİVO TEST YÖNTEMLERİ DERİ TESTLERİ; • Geç aşırı duyarlılık reaksiyonunu ölçerek Hücresel bağışık yanıtın değerlendirmesini Belirli bir patojeni veya temas antijenini tanıyan bellekli T lenf varlığını saptar Test pozitifliği ancak klinik öyküyle anlamlıdır • En sık uygulanan model İntraselüler bakteri enfeksiyonlarında Tüberkülin deri testi olarak Old tüberkülin(OT) 1890 yılında R.Koch buldu PPD( purified protein derivide) uygulanır Saybert ve Glen 1941 yılında tanımladılar PPD-s olarak standardize edildi 1-TÜ : 0.00002 mgr PPD-s içerir M.tuberculosis enfeksiyonlarının tanısında kullanılır • AYRICA; Blastomisin (blastomikoz) Histoplazmin (histoplazmoz) Brucellin (bruselloz) Frei testi (LGV) Toksoplazmin (toksoplazmoz) Ekinokokkin(ekinokokkoz) Deri testleride kullanılır • Bunların dışında; Kontak duyarlılığında ilaç, metal, bitkisel maddelere karşı Dermatit tanısında panel antijenler kullanılır Prausnitz-Küstner (PK) reaksiyonu Atopik allerjili bir serum ve spesifik antijenin Diğer bir kişinin deri içine verilmesiyle ♣ Anafilaksinin pasif transferi gösterilir TÜBERKÜLİN DERİ TESTİ PPD; • Montoux deri içi uygulaması ile yapılır 5 T U (0.1ml) ön kol iç yüzeyinin deri içine 48 -72 saat sonra endurasyon değerlendirilir Endurasyonu (Sertliği); ≥10 mm olan, ♣ BCG olmamış çocuk ve yetişkinlerde ♣ Pozitifliği gösterir ≥ 15 mm olan ♣ BCG’li çocuklarda pozitifliği gösterir 5-10 mm arası ♣ BCG aşılanmasına ♣ Atipiklerle çapraz reaksiyona ♣ Anerjiye bağlı olarak görülür • Pozitif deri testinin anlamlı olması için; Klinik belirtilerden önce negatif daha sonra pozitif olması gerekir Tuberculin PPD 2 - 3 gün sonra Cilt üzerinde şişlik ölçülür. Deri testinde teknik hatalar ■ Uygunsuz antijen konsantrasyonu ■ Enjeksiyonun cildin derinine yapılması ■ Subjektif değerlendirme ■ Test yerine dışsal müdahaleler ■ Booster olayı gelişebilir Yaşla BCG aşılaması M.tuberculosis ve atipiklere karşı oluşan aşırı duyarlılık Booster’ı artırır IMMUNOGENETİK TESTLER; • İMMUN SİSTEMİN Bileşeni ve hücrelerin doğal ya da özgül fazlarındaki Naif yapılarını Mutasyonel değişikliklerin Molekülleri genetik yöntemlerle ortaya koyan testlerdir. • ÖRNEĞİN; Antijen sunan hücrelerde(ASH) MHC I ve II moleküllerinin tayini Ig’lerin Fab kısmında variable(v)bölgesini,Fc kısmındaki CH2 gibi aktif bölgelerin genetik yapıtaşlarının belirlenmesi Fagositlerin sentezinde enzim ve sitokinlerin genetik mutasyonlarını ortaya koyan testler Primer veya sekonder immün yetersizliklerin genetik mutasyonlarının ortaya konulmasında İMMUNO GENETİK YÖNTEMLER • Nükleik asit teknolojisine (NAT) dayalı test yöntemleri Klinik immunoloji laboratuvarında tanısal amaçlı daha yenidirler Rutin tanı amaçlı konvansiyonel yöntemlerin yerini ne kadar alacakları zamanla görülecektir ANCAK; Primer ya da seconder immun yetersizliğe bağlı birçok sendrom ve hastalığın, Örneğin X’e bağlı A-gammaglobulin hastalığı Artrit ve oto-immun hastalıklarla seyreder B hücre ve Ig izotiplerinde azalmaya nedeni olan B hücre tirozin kinaz genindeki mutasyonun belirlenmesi gibi Malign bazı hastalıkların; Örneğin;Hodgkin ve Non-Hodgkin lenfoma etiyolojisinde T lenfositlerinde moleküler bozulmaların tayini MOLEKÜLER TANISINDA SIKLIKLA KULLANILMAKTADIRLAR NAT’a dayalı test yöntemleri 1)Hibridizasyon (birleşme) 2)Amplifikasyon (çoğaltma) başlıkları altında incelenir 1)HİBRİDİZASYON • Bir DNA molekülü Kompementerlik (birbirinin tamamlayıcısı) özelliğindedir Isı ya çeşitli kimyasal maddelerle ayrılabilen Uygun ısı, tuz konsantrasyonu, PH’da yeniden birleşebilen İki sarmal zincire sahiptir • İşte tanı amacıyla nükleik asitlerin araştırılması Molekülün bu özelliklerine dayanmaktadır YÖNTEMİN PRENSİBİ • Klinik örnekte varsayılan etkenin nükleik asidi ısı ve kimyasal maddelerle iki zincire ayrılır • Bu zincirlerin varlığı PROB adı verilen işaretli DNA ve RNA parçasıyla gösterilmektedir • PROB adı verilen reaktiflerin işaretlenmesinde Flurokrom Enzim Kemülüminesan madde Radyoizotop kullanılmaktadır • PROBLAR Hedef nükleik asitlerin belirli bölgelerine komplementerdir 50 bp’den küçüktürler HİBRİDİZASYON TEKNİKLERİ a)Sıvı faz hibridizasyonu • Sıvı ortamda prob ve hedef nükleik asit serbesttir DNA/DNA DNA/RNA b)Katı faz hibridizasyonu I-MAKROARRAY( makroskobik dizinleme) yöntemi – Nitro selüloz ve Naylon gibi porlu yüzeylerde yapılır • Southern blot DNA’lar; Agaroz jel elektroforezle, nitroselluloz ve naylon membran kağıda aktarılır Restriksiyon enzimleri ile klinik örnek temas ettirilir DNA/DNA (32p-Biotin/Avidin peroksidaz) Nokta mutasyonları, delesyonlar ve translokasyon sonucu farklılıkların saptanmasıyla hematolojik malignitelerin özelliklerinin belirlenmesinde kullanılır Burkitt lenfoma, Foliküler lenfoma Kronik myeloid lösemi Philadelphia kromozomu AYRICA; B hücre lenfomalarında ♣ B hücre klonizitesinin incelenmesinde T hücre lenfomasında ♣ T hücre klonizitesinin incelenmesinde Nükleik asit boyutları konusunda yardımcı olur • Northern blot RNA’lar, Nitroseluloz kağıtlara aktarılır mRNA /cDNA-cRNA hibridlemesinde 32p-Biotin/AP işaretlemesi kullanılır • Dot blot DNA’lar, Nitroselüloz kağıtlarda DNA/DNA 32 p-Biotin/AP işaretlemesi kullanılır II-MİKROARRAY • Porsuz yüzeyleriyle plastik, cam ve silikon kullanılır • Klinik örnekten Nükleik asidin pürifikasyonu Amplifikasyonu Hibridizasyonu Tespiti 25- 75 mm’lik slaytlarda yapılmaktadır • Uygulama alanları Antimikrobiyal ilaç keşfi ve geliştirilmesi ile aşı çalışmaları Konak bağışıklık sistemindeki polimorfizmler Gen up ve downregülasyonları Apoptozis mekanizmalarında Kanserlerin sınıflandırması ve derecelendirmesinde Microarray c) İn Situ Hibridizasyon • Doku yada hücrelerdeki; Nükleik asitleri saptar • DNA/DNA hibridlemesinde; Biotin/AP işaretlemesi kullanılır • 16S/23S r-RNA’ları hedefleyen Fluorokrom’la işaretleme olur FISH (flouresan inn situ hibridizasyon yöntemi) • FISH yöntemiyle; – Belirli genlerin; Kromosomal lokalizasyonunu haritalamak Veya kromozomal bozukluklarının saptanmasında kullanılır T hücre fonksiyonlarının belirlenmesinde 2)NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYONU (ÇOĞALTMA)(NAA) NAA yöntemleri a) Hedef Amplifikasyon Sistemleri b) Prob Amplifikasyon Sistemleri c) Sinyal Amplifikasyon Sistemleri adı altında incelenmektedir a) Hedef Amplifikasyon Sistemleri • İncelenecek örnekteki az sayıda hedef molekülün (DNA, RNA) İnvitro enzimatik replikasyon yöntemleriyle Saptanabilecek düzeylere çıkarılmasıdır Yöntemler • PCR Klinik örnekte DNA aranıyorsa 4 adet deoksinükleik trifosfat (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) Özgül oligonükleotik primerleri (15-30 bazlık) Isıya dayanıklı Tag polimeraz enzimi 94 ºC’de (denatürasyon) 54 ºC’de (bağlama) 72 ºC’de (Genişleme) ♣ Bu işlem 25-30 kez yapılır Southern hibridizasyonla tanımlama yapılır Klinik örnekte RNA aranıyorsa RNA’nın elde edilmesinden sonra Revers-Transkriptaz uygulanarak cDNA’ya çevrilir Daha sonra cDNA amplifiye edilir Değişik PCR tipleri Arbitrarily primer PCR(APP) Multiplex PCR(MP) Nested PCR(NP) RT-PCR(RTP) Kantitatif PCR(KP) Real time PCR(RTİP) Real-time PCR Eş zamanlı Nükleik asit amplifikasyonu Amplifikasyon sırasında saptama yapılır Floresan sinyalin ölçülmesi (Cyber green I) Kantitatif ve kalitatif sonuç Kısa sürede (2-3 saat) alınır REAL TIME PCR özel deteksiyon sistemli PCR cihazı www.biorad.com Real Time PCR • DNA Bağlayıcı Flouroforlar – Etidyum Bromid – Syber Green – Syber Gold • Problar – Lineer Oligo problar “HybProbes” – 5’ Nükleaz Oligo problar “Taq Man” ** – Molecular becon Transkripsiyon temelli Amplifikasyon teknikleri Hedef molekülleri RNA’dır TAS( Transcription based Amp) TMA(Transcription mediated Amp) NASBA (Nükleik Asid Sequence based Amp) Northern blot ile tanımlama yapılır PCR’ IN İMMUNOGENETİK ÇALIŞMA ALANLARI Klinik immunoloji ve moleküler biyoloji lab. İnsan immun sistem bileşenleri genomu ve kanser genotipi incelemelerinde DNA yapısındaki mutasyonlar Gen tayini ve dizilimi saptaması Gen ve genetik polimorfizmi saptama Transkriptlerin özellikleri ve miktarı saptanması Genetik manipülasyonun saptanması B) Prob Hibridizasyon Bazlı (NAA) Yöntemi –Ligasyon yardımı ile prob çoğaltılmasına dayanır –Hedef DNA + Prob Hibridizasyon / Ligaz LCR • C) Sinyal Amplifikasyon Bazlı NAA Yöntemi – Aslında prob hibridizasyon çoğaltma yöntemidir – İki prob kullanılır – Birinci prob hedef NA dizisini tanır • Üzerinde ikinci probu bağlama bölgesi vardır – Çok sayıda sinyal taşıyan 2. prob 1. proba bağlanır • SONUÇTA HEDEF DİZİ +1 Prob/2. Prob hibridi oluşur • Bağlama bölgesindeki bol miktardaki sinyalle HİBRİD oluşur – Örnek : b-DNA (dallanmış DNA) RCA (Rolling Circle Amp) Tek nükleotid polymorfizm Allellik ayrımında kullanılır MAJOR HİSTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC) GEN BÖLGESİNE YÖNELİK TESTLER • MHC ve ÜRÜNLERİ İnsan 6. kromozom kısa kolunda yer alırlar Üç gen bölgesine sahiptirler MHC Sınıf I gen bölgesi HLA-A,B,C,E,F,G antijenleri MHC Sınıf II gen bölgesi HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP antijenleri MHC Sınıf III gen bölgesi Hsp, TNFα, C4A,C4B, C2 HLA molekülleri Glikoprotein yapısındadırlar Transmembranöz yapıda bulunurlar Yüksek polimorfizm (bireyden bireye) gösterirler HLA-I; En fazla lenfosit, lökosit olmak üzere Tüm çekirdekli somatik hücrelerin çoğunda, Eritrositler hariç HLA-II ise; Sınır olup APC (dendritik hücre, makrofaj) B lenfositleri, Aktive T4 lenfositleri, Endotel, böbrek glomerül hücrelerde bulunur HLA Doku tipi tayinindeki amaçlar • Organ ve doku tipi nakillerinde, HLA uyumu • Adli tıpta Babalık tayininde Kimlik tanımlamasında • Bazı otoimmun hastalıkların tanısında HLA-DR4 ile RA HLA-B 5 ile Behçet hastalığı HLA Doku Tipi Tayin Yöntemleri • Üç grup altında yapılmaktadır 1) MOLEKÜLER/DNA TEMELLİ YÖNTEMLER 2) Antikor Temelli Yöntemler 3) Hücre Temelli Yöntemler Moleküler Yöntemler Özgün, esnek, yeni alleller yeni reaktiflerin geliştirilmesi, Canlı hücre gerektirmemesi, Otomasyona uygun olması(serolojik ve hücresel yöntemlere göre), Eşzamanlı çok sayıda örnek ile çalışma HLA genlerindeki tüm çeşitliliklerin gösterilmesi, serolojik olarak tanımlanamayan alllellerin gösterilmesi DNA temelli yöntemler • MHC gen bölgesinde; PCR yöntemi ile; Sekansa spesifik Primerleri (SSP) kullanılır Daha sonra Restriction fragments lenght polymorfizm (RFLP)uygulanarak DNA parçalara ayrılarak spesifik problarla tanımlanır HLA-I ve II tiplemesi yapılır AVANTAJ VE DEZAVANTAJLARI; Sadece bir allel veya allel grubuna özgün DNA segmentlerini çoğaltacak primer seti kullanılır Serolojik yöntemlerin doğrulanmasında Dezavantajı çok sayıda PCR yapılması SSP cihazı HLA-B27 için PCR-SSP ürünü (agaroz jelde) HİBRİDİZASYON YÖNTEMİ İLE; Sekansa spesifik oligonükleotid (SSO) prob hibridizasyonu ile HLA-I ve II tayini AVANTAJLARI; Sekansa özgü oligonukleotitler kullanılarak yapılır Tüm lokusu içine alacak şekilde primer seçilir Strip, tüp, çip (mikroarray), boncuk (luminex teknoloji) Solid organ transp. da yeterli (böbrek, krc transp) Çok sayıda örnekle çalışılabilir Histo spot SSO (full otomatik) SSO hibridizasyon deneyi Sekans (dizi analizi) HLA Tiplemesi PCR ile çoğaltılan HLA gen segmentinin SEKANS CİHAZINDA, nükleotid dizi analizi yapılmaktadır KULLANIM ALANLARI; Böbrek alıcısı gibi hızlı sonuç gerektiren örneklerde Denk olan vericilerin tespit edilebilmesi, diğer yöntemlerle elde edilen karmaşık sonuçların çözülmesi amacıyla sık kullanılmaktadır. DNA Dizi Analizi Aynı hastada Sekans Bazlı Tipleme(SBT) ile (HLA-B genotipi) A lokusu SBT Diğer Yöntemler • SSCP (Single stranded conformational polymorphism)(PAGE)) • Pyrosequencing • Ekzonükleazla released fluorescence gibi IMMUNOGENETİK YÖNTEMLERİN SON YILLARDA KULLANIM ALANLARI • Immunolojide son yıllarda önem kazanan Mikro RNA’lar(Mi RNA) Post transkripsiyon döneminin regülatör proteinleri olarak ortaya çıkan çeşitli kanserlerin ve hastalıkların tanısında kullanılan küçük RNA parçacıklarıdır. A)Mikro-RNA bazlı çalışmalar Mikro-RNA’nın direkt kantitatif tayinidir Mikro-RNA’nın klonlama tayinidir Mikro-RNA ekspresyon ölçümüdür B)Immunolojide bioinformatik gelişmeler Immun genomik sistemlerin moleküler genetik bazlı sayısal veri sunan analiz teknikleriyle bilgisayar ortamında ortaya konmasıdır MiRNA Bazlı Çalışmalarda Kullanılan yöntemler • • • • Mikro array ve genom dizilimi Deep sequencing Quantatif Real Time -PCR Mikrodizi veri analizi
