tc gazi üniversitesi sağlık bilimleri enstitüsü diş hastalıkları ve

advertisement
T.C.
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DİŞ HASTALIKLARI VE TEDAVİSİ ANABİLİM DALI
ENFEKTE KÖK KANALLARINDA TREPONEMA DENTİCOLA,
PORPHYROMONAS GİNGİVALİS VE BU BAKTERİLERE AİT
VİRÜLANS FAKTÖRLERİNİN MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİK
TEKNİKLER İLE İNCELENMESİ
DOKTORA TEZİ
Dt. Özgür İlke ATASOY ULUSOY
TEZ YÖNETİCİSİ
Prof. Dr. Güliz GÖRGÜL
ANKARA
Ekim 2007
T.C.
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DİŞ HASTALIKLARI VE TEDAVİSİ ANABİLİM DALI
ENFEKTE KÖK KANALLARINDA TREPONEMA DENTİCOLA,
PORPHYROMONAS GİNGİVALİS VE BU BAKTERİLERE AİT
VİRÜLANS FAKTÖRLERİNİN MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİK
TEKNİKLER İLE İNCELENMESİ
DOKTORA TEZİ
Dt. Özgür İlke ATASOY ULUSOY
TEZ YÖNETİCİSİ
Prof. Dr. Güliz GÖRGÜL
Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından 03/2005-23
proje numarası ile desteklenmiştir.
ANKARA
Ekim 2007
İÇİNDEKİLER
Kabul ve Onay
i
İçindekiler
ii
Şekiller Resimler Grafikler
iv
Tablolar
v
Semboller, Kısaltmalar
vi
Önsöz
viii
1. GİRİŞ VE AMAÇ
1
2. GENEL BİLGİLER
3
2.1. Bakterilerin Pulpaya Giriş Yolları
4
2.2. Oral Kavitenin Mikrobiyolojisi
5
2.3. Oral Mikroorganizmaların Sınıflandırılması
7
2.3.1. Gram Pozitif Koklar
8
2.3.2. Gram Pozitif Çomaklar ve Filamanlar
9
2.3.3. Gram Negatif Koklar
10
2.3.4. Gram Negatif Çomaklar
10
2.4. Porphyromonas gingivalis
14
2.4.1. Porphyromonas gingivalis’in Virulans Faktörleri
15
2.5. Treponema denticola
19
2.5.1. Treponema denticola’nın Virulans Faktörleri
20
2.6. Kök Kanal Patojenlerinin Saptanmasında Kullanılan Yöntemler
22
2.6.1. Kültür Tekniği
24
2.6.2. Moleküler Biyolojik Yöntemler ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu
25
2.6.2.1. PCR’ın Kullanım Alanları
25
ii
2.6.2.2. PCR’da Kullanılan Bileşenler
28
2.6.2.3. PCR’ın Kültür Yöntemine göre Sağladığı Avantajlar
31
3. GEREÇ ve YÖNTEM
33
3.1. Örnek Seçimi
33
3.2. Kök Kanallarından Örnek Alınması
34
3.3. DNA Ekstraksiyonu
34
3.4. PCR Deneyleri
39
3.4.1. Örneklerde T. denticola ve P. gingivalis DNA’sının Saptanması 40
3.4.2 Treponema denticola DNA’sının Pozitif Saptandığı
Örneklerde msp’nin İncelenmesi
42
3.4.3. Porphyromonas gingivalis DNA’sının Pozitif Saptandığı
Örneklerde prtC’nin İncelenmesi
44
4. BULGULAR
50
5. TARTIŞMA
59
6. SONUÇLAR
68
7. ÖZET
70
8. SUMMARY
71
9.KAYNAKLAR
72
10.ÖZGEÇMİŞ
87
iii
ŞEKİLLER, RESİMLER, GRAFİKLER
Resimler
Resim 1: Porphyromonas gingivalis’in elektron mikroskop görünümü
Resim 2: Treponemaların ultra-ince kesitlerinde msp’nin lokalizasyonu
Resim 3: DNA ekstraksiyonu işlemi sırasında tüplere Proteinaz K’nın
aktarılması
Resim 4: DNA ekstraksiyonu sırasında gerçekleştirilen santrifüj işlemi
Resim 5: Santrifüj işlemi için yerleştirilen tüpler
Resim 6: DNA ekstraksiyonu sırasında gerçekleştirilen inkübasyon
Resim 7: Gerçek zamanlı florometrik PCR cihazına yerleştirilmiş tüplerin
görünümü
Resim 8: Gerçek zamanlı florometrik PCR cihazı
Resim 9: msp DNA’sının araştırılması için kullanılan termal döndürücü
Resim 10: msp DNA’sının araştırılmasında PCR ürünlerinin UV altında
görüntülenmesi
Şekiller
Şekil 1: Çift sarmallı DNA molekülünün yapısı
Şekil 2: Polimeraz Zincir Reaksiyonunda gerçekleşen basamaklar
Şekil 3: Gerçek zamanlı florometrik PCR’da kullanılan sıcaklık döngüleri
Şekil 4: PCR’da kullanılan sıcaklık döngüleri
Şekil 5: Örneklerde bakteri varlığının saptanmasına yönelik Uni152-F,
Uni220-R primer çifti ile Uni177T 5’ hidroliz probunun Escherichia coli 16S
rDNA’sı üzerindeki yerleşimi
Şekil 6: Örneklerde Treponema denticola DNA’sının saptanmasına yönelik
Td1394-f, Td1498-r primer çifti ve Td1444 probunun yerleşimi
Şekil 7: Örneklerde Porphyromonas gingivalis DNA’sının saptanmasına
yönelik Pg-f, Pg-r primer çifti ve Pgs 5’ hidroliz probunun yerleşimi
iv
Şekil 8: Treponema denticola pozitif örneklerde msp genotip 1’in
saptanmasına yönelik tdmsp-f1 ve tdmsp-r1 primer çiftinin yerleşimi
Şekil 9: Treponema denticola pozitif örneklerde msp genotip 2’nin
saptanmasına yönelik tdmsp-f2 ve tdmsp-r2 primer çiftinin yerleşimi
Şekil 10: Porphyromonas gingivalis pozitif örneklerde prtC varlığının
saptanmasına yönelik pgprtc-f, pgprtc-r primerlerinin ve pgprtc-p 5’ hidroliz
probunun prtC’deki yerleşimleri
Şekil 11: Gerçek zamanlı florometrik PCR sonunda cihaza B2 – G9
pozisyonlarına yerleştirilen tüplerden okunan son floresans değerlerinin
gösterilmesi
Şekil 12: ABI Prism 7700 gerçek zamanlı florometrik PCR cihazında
gerçekleştirilen çoğaltma sırasında çeşitli dalga boylarında kaydedilen
floresans ölçümleri ve sıcaklık döngüsü
Şekil 13: ABI Prism 7700 gerçek zamanlı florometrik PCR cihazında
gerçekleştirilen Treponema denticola ve Porphyromonas gingivalis hedef
bölgelerinin çoğaltılması
Şekil 14: Treponema denticola msp genotip 1 ve 2’nin amino asit
dizilerinin karşılaştırılması
Şekil 15: Treponema denticola pozitif bulunan örneklerden tdmsp-f1 ve
tdmsp-r1 primer çifti ile elde edilen msp genotip 1’e ait 320 baz
uzunluğundaki PCR ürünleri
Şekil 16: Treponema denticola pozitif bulunan örneklerden tdmsp-f2 ve
tdmsp-r2 primer çifti ile elde edilen msp genotip 2’ye ait 454 baz
uzunluğundaki PCR ürünleri
Tablolar
Tablo 1: Kültür yöntemi ve diğer yöntemlerle günümüze kadar saptanmış
olan başlıca kök kanal patojenleri
Tablo 2: Tanımlanmış oral streptokok türleri
Tablo 3: Tanımlanmış Aktinomiçes türleri
Tablo 4:Siyah pigmentli Bacteroides türleri ve yeni sınıflandırmadaki adları
Tablo 5: Pigmentsiz oral Bacteroides türleri
Tablo 6: Besin gereksinimlerine göre sınıflandırılmış oral treponemalar
v
Tablo 7: DNA saflaştırma kitinin içerisinde bulunan materyaller ve
miktarları
Tablo 8: Proteinaz K’ ya eklenen su miktarları
Tablo 9: W1 ve W2 solüsyonlarına eklenen etanol miktarları
Tablo 10: Çalışmada kullanılan oligonükleotid primerler, problar ve PCR
yapışma sıcaklıkları
Tablo 11: Patolojileri belirten gruplardaki örnek sayıları
Tablo 12: Çalışmaya alınan hastaların kök kanal örneklerinde T. denticola
DNA’sı varlığının patolojilere göre
Tablo 13: Çalışmaya alınan hastaların kök kanal örneklerinde P. gingivalis
DNA’sı varlığının patolojilere göre dağılımı
Tablo 14: Çalışmaya alınan hastaların kök kanal örneklerinde prtC DNA’sı
varlığının patolojilere göre dağılımı
Tablo 15: Çalışmaya alınan hastaların kök kanal örneklerinde msp DNA’sı
varlığının patolojilere göre dağılımı
Tablo 16: T. denticola/P. gingivalis DNA’sının birlikte saptandığı örnekler
Semboller Kısaltmalar
DNA: Deoksiribonükleik asit
RNA: Ribonükleik asit
PCR: Polimeraz zincir reaksiyonu
Real-time PCR: Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu
prtC: Kollajenaz geni
msp: Major surface protein (Ana yüzey proteini)
CPS: Kapsüler polisakkarit
gtf-A: Glikozil transferaz geni
LPS: Lipopolisakkarit
Hemin: haemin-ferriprotophyrin IX
vi
fim A: Fimbrilin gen
IL-6: İnterlökin 6
MMP: Matrix metalloproteinaz
COX: Siklooksijenaz
dNTP: Deoksiribonükleotid trifosfat
µM: Mikromolar
nPCR: Nested PCR
QRT-PCR: Kantitatif real-time polimeraz zincir reaksiyonu
vii
ÖNSÖZ
Kök kanal enfeksiyonunda varolan spesifik bakterilerin varlığı ile
ağrılı alevlenmeler, periapikal yıkım ve inatçı enfeksiyonlar arasındaki ilişki
endodontide önemli bir yere sahiptir. Bu nedenle bu tip
mikroorganizmaların doğru tanınması son derece güncel bir konudur.
Ancak mikroorganizmaların ve yan ürünlerinin kök kanallarında
tanımlanması amacıyla geliştirilen yöntemler son yıllarda büyük değişim
göstermiştir. Bu amaçla yıllardan beri ‘altın standart’ olarak kabul gören
kültür yöntemlerine alternatif olarak moleküler mikrobiyolojik teknikler
gündeme gelmiştir. Mikroorganizmaların belirli gen bölgelerini taklit eden
sentetik oligonükleotid primerlerin kullanıldığı Polimeraz Zincir Reaksiyonu
çeşitli hastalıklara neden olan bakterilerin tanımlanması ve
prevalanslarının belirlenmesinde devrim niteliğinde bir gelişmedir.
Bu nedenle bu tez çalışmasında çeşitli endodontik enfeksiyonlarda
bulunan bakterileri ve virulans genlerini Polimeraz Zincir Reaksiyonu
kullanıp incelemeye ve bu bakterilerin farklı klinik durumlar olan ilişkisini
incelemeye çalıştık.
Bu tez çalışmasının gerçekleştirilmesindeki destek, yardım ve
doktora eğitimim boyunca büyük bir sabırla hiç esirgemediği ilgi ve
anlayışı nedeniyle danışmanım sayın Prof. Dr. Güliz GÖRGÜL’e, anlayış
ve desteğini asla esirgemeyen bölüm başkanımız sayın Prof. Dr. Tayfun
ALAÇAM’a, katkı ve yardımlarından dolayı Doç. Dr. Meltem Yalınay
ÇIRAK ve Dr. Doruk ENGİN’e, emeği geçen tüm hocalarıma ve bölüm
arkadaşlarıma teşekkür ederim.
Destek, özveri ve sevgilerini asla esirgememiş olan eşime ve
aileme de sonsuz sevgilerimi sunarım.
Özgür İlke Atasoy Ulusoy
viii
1. GİRİŞ VE AMAÇ
Mikroorganizmalar ve ürünlerinin kök kanal enfeksiyonlarındaki
dominant etiyolojik rolü ilk kez 1890’da pulpa dokusunda bakterilerin
gözlemlenmesi
ile
anlaşılmıştır.
Yine
ilk
kez
1960’larda
mikroorganizmaların tanınması ve saptanması amacıyla mikroskopi, aerob
kültür teknikleri ve biyokimyasal reaksiyonlar kullanılmaya başlanmıştır1.
1970’lerde ise endodontik enfeksiyonların çoğunda baskın bakteri türünün
zorunlu anaeroblar olduğu ortaya çıkarılmıştır. Günümüzde kök kanal
enfeksiyonlarının polimikrobiyal olduğu ve tek bir enfekte kök kanalında
sayısı 3-12 arasında değişebilen bakteri türü bulunduğu bilinmektedir1.
Kök kanal enfeksiyonunda varolan spesifik bakterilerin varlığı ile
ağrılı alevlenmeler, periapikal yıkım ve inatçı enfeksiyonlar arasındaki
ilişki, bir çok çalışmada gösterilmiştir2,3,4. Bu nedenle bu
mikroorganizmaların iyi tanınması son derece önemlidir. Ancak
yeryüzünde yaşayan bakterilerin büyük çoğunluğunun kültürü
yapılamamaktadır. Birçok kara ve su ekosistem araştırmaları,
mikroorganizmaların % 99’undan fazlasının laboratuvar koşullarında
üremeye direnç gösterdiğini ortaya koymuştur5,6,7. İnsan vücudunda ve
oral kavitede kolonize olmuş mikrobiyal kompleksin şimdiye kadar kültüve
edilemeyen bir çok türü olduğu söylenebilir. Son 15 yıl boyunca mikrobiyal
patojenler ve spesifik hastalıklar arasındaki ilişki moleküler yaklaşımlar
kullanılarak açığa çıkarılmıştır.
‘Kırmızı kompleks’ olarak adlandırılan Porphyromonas gingivalis,
Treponema denticola ve Tannerella forsythia üçlüsünün kök kanal
enfeksiyonlarındaki varlığı ile periapikal hastalığın şiddeti arasında pozitif
bir ilişki bulunmaktadır. Bu mikroorganizmalar sahip oldukları çeşitli
virulans faktörleri ve birbirleri ile gösterdikleri sinerji nedeniyle akut ve
kronik apikal periodontitisin gelişmesinde başrol oynamaktadır. Bu
bakterilerin, gereksinim duydukları özel üreme koşullarınının sağlanması
çok güç olduğu için konvansiyonel kültür yöntemleri ile incelenmeleri zor
olmaktadır. Dolayısıyla moleküler mikrobiyolojik tekniklerdeki ilerlemeden
önce, bu mikroorganizmaların kök kanallarında saptanan düşük
prevalansları, kök kanal enfeksiyonunun ilerlemesindeki baskın rollerini
gölgelemekte idi.
Mikroorganizmaların tanımlanması amacıyla kullanılan genotip
tabanlı moleküler mikrobiyolojik yöntemlerden günümüzde en popüler
olanı, 16S ribozomal RNA genlerindeki özel bölgelerinin çoğaltıldığı
‘Polimeraz Zincir Reaksiyonu’dur (PCR). Daha hassas ve özgül bir yöntem
1
olan PCR’ın araştırma laboratuvarlarına girmesiyle, yıllardan beri ‘altın
standart’ olarak kabul görmüş kültür yöntemlerinin bu özellikleri
sorgulanmaya başlanmış ve PCR’la karşılaştırıldığında can sıkıcı ve
zaman alıcı olarak nitelendirilmiştir. Anaerobik bakterilerin tanımlanması,
geleneksel kültür yöntemleri kullanıldığında, 7-14 gün gerektirirken, PCR
ile yalnızca birkaç saatte başarılabilmektedir.
Bakteri tanımlanması için genellikle basit bir PCR turu kullanılırken,
nested PCR, multipleks PCR, Real-time PCR (Gerçek Zamanlı Florometrik
Polimeraz Zincir Reaksiyonu) gibi varyasyonlara da başvurulmaktadır. Bu
yöntemlerin çoğu niteliksel veya yarı nicelikseldir. Real-time PCR ise
reaksiyon boyunca ürünlerin devamlı olarak ölçülmesi ile karakterize olup,
diğer PCR yöntemlerine göre daha pratik ve hassastır.
Mikroorganizmaların sahip oldukları patojenite derecelerine
‘virülans’ adı verilir. Mikroorganizmalar bünyelerinde barındırdıkları çok
çeşitli virülans faktörleri nedeniyle endodontik hasar oluşturabilmektedir.
Kollajenaz, P.gingivalisin bağ dokuyu parçalamasına neden olan yıkıcı bir
enzimdir ve prt C geni ile kodlanmaktadır. Ana Yüzey Proteini,
T.denticola’nın dış membranında bulunan düzgün altıgen yapıda bir
adezindir. T.denticola’nın hücre iskeletinin düzenlenmesinde etkileri
bulunur ve msp geni ile kodlanır.
Mikroorganizmaların enfekte kök kanallarında görülme sıklıklarının
PCR ile belirlendiği çalışmalar mevcuttur8-12, ancak literatür gözden
geçirildiğinde virülans faktörlerinin Real-time PCR kullanılarak saptandığı
çalışmaya rastlanılmamıştır. Bu çalışmanın amacı; üç ayrı klinik durumda,
enfekte kök kanallarından elde edilen örneklerden, Porphyromonas
gingivalis ve Treponema denticola’nın varlığının ve prevalansının özgül ve
hassas bir moleküler mikrobiyolojik teknik olan Real-time PCR ile
belirlenmesinin ardından pozitif çıkan örneklerde msp ve kollajenaz (prtC)
genlerinin
araştırılmasının
yapılmasıdır.
İncelenecek
vakalar
semptomlarına göre ‘Akut Apikal Periodontitis’, ‘Kronik Apikal Periodontitis’
ve ‘Akut Apikal Abse’ gruplarına ayrılmış; bu üç patolojik durum ile adı
geçen bakteriler ve virülans genlerinin varlığı arasında bir ilişkinin bulunup
bulunmadığı incelenmiştir.
2
2. GENEL BİLGİLER
Kök kanalına girerek periapikal bölgede hasar oluşturan
mikroorganizmaların büyük çoğunluğu bakterilerdir13. Bakterilerin kök
kanalında kolonize olduğu bir asırdan daha fazla zamandır bilinmektedir14.
Oral florada bulunan mikroorganizmalar, ağız içinde patojen olmasa bile,
metabolizma ürünleri, fizikokimyasal değişimler ve virülans faktörleri ile
kanal içinde belirgin doku değişimlerine yol açabilmektedir13.
İnsan vücudunda bulunan ortalama bakteri sayısının (104), memeli
hücre sayısından (103) 10 kat daha fazla olduğu tahmin edilmektedir15.
Bakterilerin dokuya invazyonu hasar oluşturduğunda enfeksiyon meydana
gelir. Pulpal ve periradiküler endodontik hasar, mikroorganizmaların
patojenik etkisiyle buna karşı verilen doku cevabı sonucu oluşur1.
Belirli bir bakteri türünü davet edecek koşullar konak dokuda
oluştuysa, o bakteri türünün er ya da geç o dokuda kolonize olması
organizmanın tüm dokularında olduğu gibi kök kanalı için de geçerli olan
bir beklentidir. Bakterinin hangi yolu izleyerek oraya geldiğinin klinik
açıdan bir önemi yoktur16.
Pulpa ve periapikal inflamasyonda bakterilerin birincil etyolojik
rolünün önemi yıllar boyunca değişim göstermiştir17. Son yıllarda yapılan
çalışmalar, herhangi bir mikroorganizmanın kök kanalında bulunduğu
sürece önemli sayılması gerektiğine işaret etmektedir6,18,19. Deneysel
çalışmalar, akut ve kronik enfeksiyonlarda özellikle anaerob bakterilerin
önemini vurgulamaktadır20,21,22.
Enfekte kök kanalının mikroflorası karışıktır. Kök kanallarında
yaklaşık 10 farklı bakteri türü farklı kombinasyonlarda ve etkinlik
seviyelerinde bulunmaktadır20. Bu bakteri türlerinden %70’i zorunlu
anaeroblar ve mikroaerofiliklerdir. Tedavi boyunca bakteri türlerinin sayısı
yapılan tedavi seansları sayesinde azalır ve anaeroblar çoğunlukla elimine
edilir. Ancak bazı fakültatif anaerob veya gram pozitif bakteriler başarısız
endodontik
tedavi
görmüş
kök
kanallarında
varlıklarını
sürdürebilmektedir20,23.
Kök kanallarında mikroorganizmaların varlığı pulpal ve periapikal
patolojik oluşumların gelişmesine neden olmaktadır. Endodontik
enfeksiyonlar çoğunlukla polimikrobiyaldir ve endodontik hasar
mikroorganizmalar arasındaki kooperasyon sonucu gelişir. Spesifik
bakterilerin varlığı ile ağrılı alevlenmeler, periapikal yıkım ve inatçı
enfeksiyonlar arasındaki ilişki, bir çok çalışmada gösterilmiştir2,3,4,6,24,25. Bu
3
nedenle bu mikroorganizmaların iyi tanınması son derece önemlidir.
Ancak yeryüzünde yaşayan bakterilerin büyük çoğunluğunun kültürü
yapılamamaktadır7. Birçok kara ve su ekosistem araştırmaları,
mikroorganizmaların %99’undan fazlasının laboratuvar koşullarında
üremeye direnç gösterdiğini ortaya koymuştur6,7,26. İnsan vücudunda ve
oral kavitede kolonize olmuş mikrobiyal kompleksin şimdiye kadar kültüve
edilemeyen bir çok türü olduğu söylenebilir. Son 15 yıl boyunca mikrobiyal
patojenler ve spesifik hastalıklar arasındaki ilişki moleküler yaklaşımlar
kullanılarak açığa çıkarılmıştır7.
Bakteri ve ürünleri pulpa odasına en fazla çürük yoluyla
ulaşmaktadır. Ayrıca, mine, sement, dentinin belirgin demineralizasyonu,
travma ve konjenital durumlar sonucu pulpa ekspoze olabildiği gibi, dentin
tübülleri, mine lamelleri ve anakorezis yoluyla da enfekte
olabilmektedir27,28,29,30.
2.1. Bakterilerin Pulpaya Giriş Yolları
1. Koronal yol: Mikroorganizmalar, pulpa dokusuna en çok kron yoluyla
invaze olmaktadır. Pulpa irritanlara karşı kendini tersiyer dentin oluşumu
ve dentin remineralizasyonu ile korumaya çalışır. Bununla birlikte hasarın
yayılması çoğu defa tamir olayından daha hızlı ilerlediği için mikrobiyal
yayılım pulpaya ulaşır. Pulpanın açılması ve bakteriyel bulaşma iyatrojenik
perforasyonlarda ve travma sonucu kırılan dişlerde görülebilir. Ayrıca
abrazyon, erozyon ve atrizyon da pulpanın bakterilerce istila edilmesine
neden olabilir17. Operatif işlemlerde mikroorganizmalar, tükürük
kontaminasyonu ve çürük lezyonu aracılığıyla pulpaya ulaşabilmektedir.
Derin çürüklü lezyonlarda çok sayıda mikroorganizma pulpal ekspozür
oluşarak veya oluşmadan pulpaya ulaşarak pulpitis geliştirebilir. Normal
koşullarda pulpadaki fagositler az sayıda bakteriyi yokederken, sayı,
virülans ve direnç arasındaki denge bozulduğunda iltihabi reaksiyon ilerler.
2. Retrograd yol: Periodontal hastalığın pulpa hasarına neden olduğu
görüşü hala devam etmektedir31,32,33,34. Mikroorganizmalar ile yan ürünleri
pulpa odasına kök apeksinden veya diğer aksesuvar, lateral ve furkasyon
kanallarından girebildiği gibi, kök kazıma ve düzleştirme işlemleri sırasında
da pulpayı enfekte edebilmektedir17. Yapılan bir çalışmada periodontal
kaynaklı abselerde %30-%58 oranlarında spiroket bulunurken, endodontik
kaynaklı abselerde bu oranın en fazla %10 olduğu gösterilmiştir. Bu
nedenle, endodontik hastalıktaki mikrofloranın marjinal periodontitistekine
tam olarak benzemediği, yani periodontal hastalığın, endodontik
enfeksiyona neden olamayacağı da ileri sürülmektedir14.
4
3. Hematojen Yol /Anakorezis: Mikroorganizmaların pulpaya giriş
yollarından biri de, kan veya lenf dolaşımıdır. Ancak anakorezisin
insanlarda
belirgin
hasar
oluşturmaya
yardım
etmediği
düşünülmektedir35,36. Yine de anakorezis, travmaya uğramış dişlerin
enfekte olma nedenlerinden biri olarak kabul görmektedir37.
2.2. Oral Kavitenin Mikrobiyolojisi
Oral kavite, insan vücudundaki mikroorganizmaların bir çoğunu
barındırmaktadır. Günümüze kadar 700’den fazla tür saptanabilmiştir38. Bu
oral türlerin %50’si henüz kültüve edilememiştir39. Kültür bağımsız
teknikler, sağlıklı ve hastalıklı oral kavitenin bakteri çeşitliliğini daha iyi
tayin etmek için kullanılmaktadır.
Sağlıklı Oral Kavite
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) kullanılarak yapılan bir
çalışmada, sağlıklı oral kavitede bulunan 9 farklı bölge incelenmiştir38.
Dilin dorsumu, lateral kenarları, bukkal epitel, sert ve yumuşak damak, diş
yüzeyleri, subgingival plak, maksiller anterior vestibülde bulunan
mikroorganizmaların %60’ından fazlası kültüve edilememiştir. Bazı
bakteriler tüm bölgelerde saptanırken, bazıları yalnızca bölgeye özgü
bulunmuştur. Örneğin Streptococcus sangius, Streptococcus gordonii,
Abistrophia defectiva, Actinomyces türleri özellikle diş yüzeyinde kolonize
olmaktadır38.
Çürük Kavitesinin Bakteri Kompozisyonu
Çürük kavitelerinde floranın incelendiği bir PCR çalışmasında, 224
bakteri türü ve filotipi saptanmıştır40. Bu çalışmanın bulgularına dayanarak;
Streptococcus mutans, Lactobacillus, Bifidobacterium ve Atopobiu’dan
başka türlerin de çürük oluşmasında etkili olduğu söylenebilir. Ayrıca
Actinomycesler ve mutans olmayan Streptokoklar da çürük başlangıcında
etkilidir.
5
Kök Kanal Enfeksiyonundaki Bakteri Kompozisyonu
Baumgartner’a41 göre, ilk kez 1890 yılında pulpa hastalığı ile bakteri
varlığı arasında bir ilişki olduğu ileri sürülmüştür. 1965 yılında yapılan bir
çalışmada, bakterilerin pulpal ve periradiküler hasara neden oldukları
kanıtlanmış olup, bu çalışmada pulpaları ekspoze edilen farelerde
mikroorganizma bulunmadığında kendi kendine iyileşme gözlenirken,
mikroorganizma varlığında pulpa nekrozu ve periradiküler lezyon oluşumu
saptanmıştır41.
Endodontik
enfeksiyonlar
polimikrobiyaldir
ve
endodontik
enfeksiyonlardaki bakterilerin çoğu anaerobiktir. 1970’den önce kültür
yöntemlerindeki kısıtlılıklar nedeniyle endodontik enfeksiyonlardan
yalnızca birkaç tür izole edilebilmekteydi. Kültür yöntemlerindeki
gelişmeyle, endodontik enfeksiyonlarda, apikal lezyonla ilişkili her enfekte
kanal başına saptanabilen mikroorganizma sayısı 12’ye ulaşmıştır.
Enfekte kanallardaki bakteri sayısı ile periradiküler radyolüsensilerin
boyutu arasında pozitif bir ilişki bulunmaktadır42. Tablo 1, şimdiye kadar
endodontik enfeksiyonlardan en sık izole edilen mikroorganizmaları
göstermektedir.
6
Tablo 1: Kültür yöntemi ve diğer yöntemlerle günümüze kadar saptanmış olan
41
başlıca kök kanal patojenleri
a.
Oral Mikroorganizmaların Sınıflandırılması
Bakterilerin farklı hücre yapıları nedeniyle, çeşitli kimyasallarla farklı
renklerde boyanmasına ‘Gram boyama’ denir16. Gram pozitif bakterilerin
hücre duvarlarında peptidoglikan (mukopeptid) tabakası daha kalındır ve
bu kalın tabaka gram negatif bakterilerde bulunmayan teikoik asit
içermektedir. Gram negatif bakterilerin hücre duvarı ise lipopolisakkaritten
oluşmuştur. Kristal viyole ile lugol, hücre duvarlarından geçerek bakterileri
boyar. Gram pozitiflerde bu boyalar hücre çeperinden zor ayrılan bileşikler
yaparak alkol uygulandığında mor renklerini kaybetmezler. Gram
negatiflerde ise hücre çeperinde bulunan lipitler, alkolle çözünerek, boyayı
7
verirler ve bu tür bakteriler fuksinle boyandığında pembe-kırmızı renge
boyanır16.
2.3.1. Gram Pozitif Koklar 43
a) Streptokoklar
Streptokoklar oral mikrofloranın geniş çoğunluğunu temsil
etmektedir ve ağzın tüm bölgelerinden izole edilebilmektedir. Geleneksel
olarak oral streptokoklar, basit biyokimyasal ve fizyolojik testlerle
sınıflandırılabilmekte ve birbirinden ayrılabilmektedir. Günümüze kadar
tanımlanmış oral streptokoklar Tablo 2’de gösterilmiştir.
Tablo 2. Tanımlanmış oral streptokok türleri
43
Grup
mutans grubu
Tür
S.mutans, serotip c,e,f
S.sabrinus serotip d,g
S.cricetus serotip a
S.rattus serotip b
S.ferus
S.macacae
S.downei serotip 4
salivarius grubu
S.salivarius
S.vestibularis
S.constellatus
S.intermedius
S.anginosus
Anginosus grubu
mitis grubu
S.sangius
S.gordonii
S.parasonguis
S.oralis
S.mitis
S.crista
Diğer oral streptokoklar S. pyogens, P. micros, P. magnus, P.
anaerobius, P. micros’tur.
8
b) Enterokoklar
Enterokoklar, normal bağırsak florasının üyeleri olarak
bilinmektedir. Ayrıca enfekte yara sahası, üriner sistem enfeksiyonları ve
kan dolaşımındaki en sık karşılaşılan patojenlerdir44,45. Enterokoklara
immün ve medikal olarak baskılanmış hastalarda sıkça rastlanılmaktadır.
Uygun seçici ortam kullanıldığında, çeşitli oral bölgelerden düşük sayıda
izole edilebilmektedir. En sık karşılaşılan enterokok, Enterococcus
faecalistir. Fakültatif anaerob gram negatif bir kok olan E. faecalis, özellikle
başarısız endodontik tedavi görmüş dişlerin kök kanallarında sıklıkla
bulunmaktadır, çünkü bu bakteri antimikrobiyal ajanlara son derece
dirençlidir46.
c) Stafilokoklar, Mikrokoklar ve Stomatokoklar
Bu gruptaki mikroorganizmalar, oral kaviteden çok sıklıkla izole
edilemezler. Ancak stafilokokların, protez kullanan hastaların plak
örneklerinde saptandığı bildirilmiştir43. Ayrıca çeşitli oral enfeksiyonlardan
ve immun olarak baskılanmış hastalardan elde edilen plak örneklerinde de
rastlanmıştır.
2.3.2. Gram-Pozitif Çomaklar ve Filamanlar43
Genellikle dental plaktan izole edilirler. Bu bakterilerin
sınıflandırılmasında
kemotaksonomik
metodlar,
(hücre
duvar
kompozisyonu, asidik fermentasyon ürünlerinin profili,vb.) ve serolojik
yaklaşımlar kullanılmaktadır. Actinomyces, Eubacterium, Lactobacillus,
Propionibacterium bu gruba dahil edilmektedir. Actinomyces grubunun
türleri Tablo 3’ de gösterilmektedir.
9
Tablo 3: Tanımlanmış Aktinomiçes türleri
43
Günümüzdeki ismi
Actinomyces georgiae
Önceki Sınıflama
Subgingival Actinomyces sp.
Actinomyces gerencseriae
A. israelii serotip 2
A. israelii
A. israelii serotip 1
A. odontolyticus
A. odontolyticus
A. naeslundii genotipler 1
A. naeslundii serotip 1
A. naeslundii genotipler 2
A. naeslundii serotip 2 & 3
A. viscosus serotip 2
A. meyeri
A. meyeri
A. bernardiae
A. radingae
A. neuii
A. europaeus
A. graevenitzii
A. turicensis
2.3.3. Gram Negatif Koklar47
Bu grup, Neisseriaceae ve Veillonellae familyasından oluşur.
Neisseriaceae familyasına Neisseria, Branhamella, Moraxella, Kingella ve
Actinobacter cinsleri dahil edilebilir47. Veillonellae familyası, oral kavitenin
bir çok bölgesinden izole edilmekteyse de en fazla dental plakta
bulunmaktadır. Bu grup V. parvula, V. dispar ve V. atypica türlerinden
oluşmaktadır.
2.3.4. Gram Negatif Çomaklar47
a) Fakültatif Anaerob ve Kapnofilik Genera
Ağızdaki fakültatif anaerob gram negatif
rodların çoğu,
Haemophilus genusuna aittir. Genellikle saliva, dental plak ve epitelyal
bölgelerde bulunurlar. H. parainfluenzae (biyotip 1,2 ve 3), H. segnis
(biyotip 5), H. paraphrophilus (biyotip 5), H. aphrophilus (biyotip 10), H.
haemolyticus (biyotip 10,5), bu gruba dahil edilebilir. Bu türler çene
10
enfeksiyonları ve enfektif endokardit vakalarından izole edilmiş olsa da
patojenik özellikleri çok düşüktür. Diğer fakültatif anaerob gram negatif
rodlar arasında enfektif endokardit, abse ve periodontal hasarlardan sıkça
izole edilen Eikenella corrodens bulunmaktadır.
Capnocytophaga, CO2 bağımlı gram negatif rodlar olup subgingival
plak ve gingivitis vakalarından izole edilmektedir. Bu türlere, C. gingivalis,
C. ochracea, C. sputigena, C. granulosa ve C. haemolytica dahil edilebilir.
Actinobacillus actinomycetemcomitans, adelosanlardaki agresif
periodontal hasardan sorumlu mikroaerofilik, kapnofilik ve fakültatif
anaerob bir mikroorganizmadır. A. actinomycetemcomitans, lökotoksin,
kollajenaz ve proteaz gibi çeşitli virülans faktörlerine sahiptir.
Simonsiella, insan ve hayvanlardaki oral kavitenin epitel
yüzeylerinden izole edilen gram negatif anaerob bir mikroorganizmadır.
b) Zorunlu Anaerobik Gram negatif Rodlar
Bu gruptaki mikroorganizmalar süperoksit dizmutaz ve katalaz
enzimine sahip değildir41. Zorunlu anaerobik gram negatif bakterilerin
sınıflandırılması oldukça zordur. Bazı türler o kadar zor üremektedir ki,
fermentasyon ve enzim aktivitesi gibi testlerde net sonuçlar elde
edilememektedir, çünkü metabolitlerin konsantrasyonu memnun edici bir
analiz için çok düşüktür. Bu mikroorganizmaların tanımlanabilmesi için
geleneksel kültür yöntemleri ile sağlanamayan özgüllük, moleküler
mikrobiyolojik yöntemlerin gelişimi ile başarılabilmektedir. Hatta
laboratuvar koşullarında kültüve edilemeyen yeni türler, DNA-DNA
hibridizasyon ve 16S rRNA genin çoğaltılmasını esas alan PCR gibi
yöntemlerle tanımlanabilmektedir8,10,48,49.
Oral anaerobik gram negatif rodların büyük çoğunluğu, Bacteroides
genusunun içinde yer almaktadır. Bu gruptaki bazı organizmalar, kanlı
agarda üretildiklerinde karakteristik kahverengi veya siyah pigmentli
koloniler meydana getirmektedir. Bu nedenle siyah pigmentli anaeroblar
olarak
bilinirler
ve
endodontik
enfeksiyonlarla
yakın
ilişki
41,50
50
içerisindedirler
. Nisengard’a göre, ilk kez 1921’de Oliver ve Wherry
bu mikroorganizmaları oral bölgeden izole etmişler ve başlangıçta bu
siyah pigmentin ‘melanin’ olduğunu ileri sürmüşlerdir. Ancak yakın
zamanda ‘protoheme’ olduğu anlaşılan bu pigment, oksijenin toksik
etkilerinden hücreleri korumaya yardım eden bir defans mekanizması gibi
davranır13,41,50. Ayrıca ‘haemin’ de siyah pigmentli mikroorganizmalar için
hayati bir büyüme faktörü olarak bilinmektedir41.
11
Yeni sınıflandırmada asakkoralitik ve sakkoralitik oral türler sırasıyla
Porphyromonas ve Prevotella generasının içinde yer almaktadır.
Prevotella genusunda yer alan sakkarolitik bazı türler asetik süksinik
(acetic succinic) ve glukozun diğer asitlerini üretmektedir. Bu türlerin
başlıcaları ve yeni sınıflandırmadaki adları Tablo 4’ de gösterilmektedir.
Tablo 4: Siyah pigmentli Bacteroides türleri ve yeni sınflandırmadaki adları
41
Porphyromonas: Siyah-pigmentli (asakkarolitik Bacteroides türleri)
Porphyromonas asaccharolyticus
Porphyromonas gingivalis
Porpyromonas endodontalis
Prevotella: Siyah-pigmentli (sakkarolitik Bacteroides türleri)
Prevotella melaninogenica
Prevotella denticola
Prevotella loescheii
Prevotella intermedia
Prevotella nigrescens
Prevotella corporis
Prevotella tannerae
Pigmentsiz oral sakkoralitik türler ve yeni sınıflandırmadaki adları
ise Tablo 5’ de gösterilmiştir.
Tablo 5: Pigmentsiz oral Bacteroides türleri
41
Prevotella: Pigmentsiz (sakkarolitik Bacteroides türleri)
Prevotella buccae
Prevotella bivia
Prevotella oralis
Prevotella oris
Prevotella oulorum
Prevotella ruminicola
Sakkarolitik pigmentsiz türler olarak tanımlanan, ancak metabolik
son ürünlerine, fermentasyon profillerine ve esas enzimlerine göre
farklılaşma gösteren bakteri türleri Bacteroides capillosus, Bacteroides
forsythus, Bacteroides pneumosintes’i kapsamaktadır43. Yeni sınflandırma
ile B. forsythusun adı Tannerella forsythia; B. pneumosintes’in adı ise
Dialister pneumosintes olarak değişmiştir10,41.
12
Zorunlu anaerob gram negatif bakterilerin bir başka ana grubu
Fusobacterium genusuna ait bakterilerdir. Çoğu zaman asakkarolitik
olarak tanımlanan ve uzun filamanlar halinde bulunan bu hücreler;
Fusobacterium alocis, F.sulci, F.periodonticum, F.nucleatum (alt grupları;
F.subsp. nucleatum, F.subsp. polymorphum, F.subsp. fusiforme),
F.vincentii’i kapsamaktadır.
Diğer gram negatif anaerobik ve mikroaerofilik bakteriler
Leptotrichia buccalis, Wolinella succinogens ve Campylobacter türlerini
içermektedir. Campylobacter türleri Campylobacter concisus, C. showae,
C. sputarum, C. curvus, C. rectus ve C. gracilis’tir. C. curvus, C. rectus ve
C. gracilisin eski sınıflandırmadaki adları sırasıyla Wolinella curva ve
Wolinella recta ve Bacteroides gracilis’tir.
Kök kanal tedavisindeki akut alevlenmeler ve çevre dokulardaki
yıkıcı harabiyetlerle özellikle siyah pigmentli mikroorganizmalar arasında
anlamlı bir ilişki olduğu düşünülmektedir. Prevotella ve Porphyromonas
türleri gibi pulpal lezyonlarda varolan siyah pigmentli bakteriler, iltihabi
mediatörlerin, doku yıkımı ve kemik rezorpsiyonunda rol oynayan yıkıcı
enzimlerin aktivasyonu ile klinik semptomların gelişiminde önemli rol
oynamaktadır 51,52,53,54.
Socransky ve arkadaşları55, checkboard DNA-DNA hibridizasyon
metodunu kullanarak periodontal hasarın ciddiyeti ile en fazla ilişkili
buldukları ‘P. gingivalis, T. forsythia ve Treponema denticola’ üçlüsüne
‘kırmızı kompleks (red complex)’ adını vermişlerdir. Bu kompleksin, aktif
marjinal periodontitisin ilerlemesinde önemli role sahip olduğu bilinse de,
son çalışmalarda bu birleşim, enfekte kök kanallarında da yüksek
oranlarda saptanmış ve periapikal hasarla yakın ilişkili bulunmuştur18,56.
Periapikal enfeksiyonlarda en sık rastlanan siyah pigmentli anaerob
rodlar P.endodontalis, P.gingivalis, Prevotella intermedia, P.nigrescens’
tir57,58. Siyah pigmentli bakterilere üye olmamasına karşın Treponema
denticola kırmızı komplekse dahildir. P.gingivalis ile sinerjist ilişkisi bulunur
ve bu sinerjinin akut periapikal semptomlarla yakın ilişkili olduğu
gösterilmiştir18,25,56,59.
T. denticola, T. forsythia ve P. gingivalis’in bir özellikleri de
geleneksel kültür yöntemleriyle kültüve edilmelerinin çok zor olmasıdır. Bu
nedenle bu mikroorganizmalar ‘zor üreyen’ mikroorganizmalar olarak da
tarif edilirler57.
13
2.4. Porphyromonas gingivalis
P.gingivalis, non-fermenter, siyah pigmentli zorunlu gram negatif bir
anaerob roddur60. Boyutları 0.5 µm-1.2 µm arasındadır ve kokobasil
görünümündedir41,43 (Resim 1). Bu morfoloji besiyerinin özelliklerine göre
değişmektedir. P.gingivalis, birincil ekolojik ortamı oral kavitede bulunan
önemli bir periodontal patojendir61,62. Çoğunlukla subgingival bölgelerde ve
dişeti oluğunda bulunur; dil ve tonsillerden de izole edilebilmektedir. Daha
çok periodontal sorunlu dişlerin periodonsiyumlarında rastlanılsa da, son
yıllarda yapılan moleküler mikrobiyolojik çalışmalar P.gingivalisin enfekte
kök
kanalının
da
başlıca
patojenlerinden
biri
olduğunu
56,58,60,63
göstermiştir
. P.gingivalis, kök kanalındaki karışık anaerobik
floranın bir üyesidir. Özellikle abseli dişler ve semptomatik periradiküler
lezyonlardan izole edilebilmektedir60.
Resim 1: Porphyromonas gingivalis’in elektron mikroskop görünümü
43
(N. Mordan, Eastman Dental Institude)
P.gingivalis, son on yıl içerisinde üzerinde en fazla durulan iki oral
patojenden biridir. Beslenme gereksinimi, konaktaki davranış biçimi, çoğu
diş ve dişeti enfeksiyonunda yer alması ve birçok yıkıcı virülans faktörüne
sahip olması nedeniyle endodontide ayrı bir öneme sahiptir41.
Hemin (haemin-ferriprotophyrin IX), siyah pigmentli diğer
mikroorganizmalar için olduğu gibi, P.gingivalis için de önemli bir faktördür.
P. gingivalis, üremek için değil ancak hastalık yapabilmek için en az 0.5
µg/ml konsantrasyonda hemine ihtiyaç duyar. Heminden zengin
besiyerinde üretilen P.gingivalisin hastalık yapabilme yeteneği de daha
fazladır. P.gingivalisin kendisine hemin sağlayabilecek iki kaynağı bulunur:
14
1) Floradaki başka bakterilerin katabolik artıkları 2) Konak dokunun
kendisi. P.gingivalis heminden fakir ortamda içerisi toksik enzimlerle dolu
ekstraselüler veziküller oluşturur. Bu şekilde konak dokuya zarar verir13.
2.4.1. Porphyromonas gingivalis’in Virülans Faktörleri
Mikroorganizmalar tarafından oluşturulan patojeniteye ‘virülans’
denir . P.gingivalis’in başlıca virülans faktörleri şunlardır:
41
a)Kapsül
Kapsül, P.gingivalislerin çoğunda bulunan önemli bir virülans
faktörüdür. P.gingivalis’te 6 adet kapsüler serotip bulunmaktadır ve
kapsüler serotipe bağlı olarak virülans da değişim göstermektedir64.
Kapsül, K antijeninin varlığı ile yakın ilişkilidir65. K antijeninin varlığı
P.gingivalis’in serum direncini, düşük kemiluminesansını ve fagositoza
direncini sağlar66.
P. gingivalis CPS (kapsüler polisakkarit) ile aşılanmış farelerin
P.gingivalis’in yol açtığı oral kemik kaybından korunduğu gösterilmiştir67.
Bu veri, P.gingivalis CPS’ nin, bakteriye bağlı oral kemik kaybından
korunmada aşı adayı olduğunu göstermektedir.
b) Fimbriya
P. gingivalis fimbriyaları, immunojenlik, çeşitli konak proteinlerine
bağlanma, sitokin üretimi ve kemik rezorpsiyonunun teşviki gibi çok çeşitli
biyolojik aktiviteye sahiptir68. P.gingivalis’in hücre yüzeyinde 2 farklı tipte
fimbriyası bulunur. Fimbrilin genin (fimA) DNA dizisi, genin yapısında türler
arası farklılıklar olduğunu ancak ortak immunolojik özgüllüklerin kaldığını
göstermektedir69. Son zamanlarda, P.gingivalis’in ana fimbriyası, fimA
genindeki çeşitliliğe dayanarak 6 tipe (I-V ve Ib) ayrılmıştır70. Tip II fimA
klonlarının, diğer tiplerdeki fimA klonlarına göre daha fazla adeziv ve
invaziv yeteneğe sahip olduğu gösterilmiştir. Ayrıca fimbriyalı P.
gingivalislerin fimbriyasız olanlara göre insan dendritik hücrelerine daha
kolay girebildiği in vitro olarak gösterilmiştir71. Sonuç olarak, bu tür fimbriya
farklılıkları yumuşak doku enfeksiyonlarının gelişimini etkilemektedir.
c) Glikozil Transferaz gtf-A geni
Narimatsu ve arkadaşları72 yaptıkları çalışmada, varsayılan bir
glikozil transferaz genini, Porphyromonas gingivalis’ten izole etmişler ve
gtfA olarak adlandırmışlardır. Morfolojik olarak gtfA’ya sahip olmayan
15
P.gingivalis olgun fimbriyadan yoksundur. Ayrıca daha düşük
otoagregasyon ve hücrelere bağlanma yeteneği göstermiştir. gtfA geni
hücrelere bağlanmak için olduğu kadar otoagregasyon için de
P.gingivalis’e gerekmektedir. gtfA geni adezyonu düzenlemek suretiyle
P.gingivalis’in patojenitesinde önemli rol oynamaktadır.
d) Asetilnörominik ve glukoronik asit
P.gingivalisin konak hücrelere bağlanmasında önemli role sahiptir20.
e) İnvazyon
Konak dokuya ve hücrelere invaze olabilme yeteneği P.gingivalis
için önemli bir virülans faktörüdür. P.gingivalis’in gingival epitelyal
hücrelere girebilme oranları yüksektir ve bakteriler konak hücre
çekirdeğinin çevresindeki bölgede birikirler73.
P.gingivalis, konak hücrelerin içinde 24 saatten daha uzun bir süre
kalabilir. Hücrelerin şekil ve boyutlarındaki değişiklikler ile birlikte aktin
hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesini teşvik eder. P.gingivalis,
endodontik giriş yolunu kullanarak koroner arter endotelyal hücrelerine
doğru ilerleyebilir74.
Kök kanal enfeksiyonuyla ilişkili mikroorganizmalar, kardiyovasküler
hücrelerin primer kültürlerine invaze olabilmektedir75. P. gingivalis, P.
intermedia, A. actinomycetemcomitans ve T. forsythia aterosklerozun
gelişimi ve ilerlemesinde rol oynamaktadır76,77. Fare modellerinde,
P.gingivalisle uzun süreli temasın aterojenik plak oluşumunu arttırabileceği
gösterilmiştir78.
f) Kollajenaz (prtC)
Kollajenaz, P.gingivalis tarafından salgılanan önemli ve etkin bir
virülans faktörüdür. Siyah pigmentli anaerob diğer bakteriler kollajenaz
üretiyor olsa da, gerçek kollajenaz üreten tek bakteri P.gingivalis’tir79,80.
Kollajenaz geni, periradiküler hasarda P.gingivalis için olası bir
yayılma faktörü olarak düşünülmektedir81. Kato ve arkadaşları82, prtC
genini düzenleyerek prtC gen ürününün enzimatik analizini yapmışlardır.
prtC gen ürününü, tip1 kollajeni ve azokolü enzimatik olarak
parçalayabilen 37.8 kDa dimeri olarak karakterize etmişlerdir.
Slots ve arkadaşları83, prtC primerleri kullanarak yaptıkları bir
çalışmada, endodontik enfeksiyonlardan izole edilen tüm P.gingivalis
izolatlarının prtC geni içerdiği gösterilmiştir. Tam tersine Bodinka ve
16
arkadaşları84, prtC’nin 548 baz çiftlik parçasını 21 P.gingivalis’in ancak
16’sında saptamışlardır.
Odell ve arkadaşları81, P.gingivalis’in 16 klinik izolatının hepsinde
kollajenaz genine rastlamışlardır.
g) Toksinler
Lipopolisakkarit (LPS), konak dokunun harabiyetine neden olan
biyolojik aktiviteleri yöneten bir moleküldür85. Lipopolisakkarit, P.gingivalis
için çok önemli bir virülans faktörüdür ve kemik rezorpsiyonunda rol
oynayan ana etken olduğu ileri sürülmektedir20. P.gingivalis LPS ile teşvik
edilen kemik rezorpsiyonu ve gingival dokudaki interlökin-6 (IL-6) üretimi,
CD14’e karşı geliştirilen antikor tarafından engellenir. CD14, insan gingival
fibroblastları ve gingival epitelyal hücrelerdeki LPS için belirgin bir
reseptördür20.
Lipopolisakkarit ve periapikal lezyon varlığı arasında bir doğru
orantının var olduğu düşünülmektedir20,85. Apikal periodontitisli dişlerin
pulpalarında, yüksek seviyelerde LPS bulunduğu bildirilmiş ve bakterilerin
bu mekanizma ile apikal lezyon oluşturdukları ileri sürülmüştür86. Ayrıca
enfekte pulpa nekrozlarındaki gram negatif bakterilerin prevalansı ile LPS
seviyeleri arasında güçlü bir ilişkinin var olduğu da gösterilmiştir86.
h) Proteaz ve Proteaz İnhibitörleri
Non-fermenter P. gingivalis büyümek için proteinlerin hidrolizinden
elde edilen peptitlere ihtiyaç duyar. Bu enzim virülans belirleyici ana
faktördür ve sistein proteinaz ile karakterize olup gingipain adını alır87. P.
gingivalisin bu sistein proteinazları, genellikle periodontal patojenlerin
başlıca virülans faktörleridir88,89. O-Brien-Simpson ve arkadaşları90,
gingipainleri
mikrobiyal
vampirlerin
moleküler
dişleri
olarak
nitelendirmişlerdir.
Bradikinin ve trombin, sinerjist çalışan proinflamatuar ajanlardır ve
kemik rezorpsiyonunu tetikleyen güçlü bir etkiye sahiptir. Bu proteinazlar
rgpA, rqpB ve kgp genleriyle kodludur. Arjinine özgü proteolitik aktivite
rgpA/b ile, lys-spesifik aktivite ise kgp ile
kodlanır5. Nadkarni ve
arkadaşları91, yaptıkları bir çalışmada P.gingivalis’in biyotiplerini Lysgingipain (kgp) gene göre sınıflandırmıştır.
Lourbakos ve arkadaşları92, arjinine özgü gingipain-R’lerin (rgpB ve
HRgpA), insan trombositlerindeki hücre içi kalsiyumda artışa neden
olduğunu ve trombinle yarışacak etkinlikte trombosit kümelenmesi
sağladığını bildirmişlerdir. HRgp, P. gingivalis’in virülansında fosfolipit
17
bağlayan ve enzim aktivitesini düzenleyen hemaglütinin/adezyon etki alanı
varlığı nedeniyle rgpB’den daha önemlidir93.
Gingipainler,
ayrıca
konak
matriks
metalloproteinazların
kontrolünde güçlü etkiye sahiptir. Gingipainlerin P.gingivalis ve T.forsythia
arasındaki patolojik sinerjismde de önemli olabileceği düşünülmektedir94.
P. gingivalisin Konak Enzim Ekspresyonundaki Rolü
Siyah pigmentli anaerobik bakterilerin proteazları, insan
prokollajenazlarını aktive ederek kollajen dokuyu parçalar. Yani bakteri
ürünleri konak hücre cevabını tetikleyerek yüksek seviyelerde enzim
salımına neden olur. Bakteriler bu şekilde, indirekt olarak da doku yıkımını
etkilemektedir95.
Matriks metalloproteinaz (MMP), konak bağ dokunun fizyolojik ve
patolojik döngüsünde rol oynayan ve hücre dışı matriks elemanlarının
salgılanmasına neden olan bir grup endopeptidazdır96. Yara iyileşmesinde,
doku tamirinde, anjiyogenezde ve gelişimsel doku morfogenezinde önemli
rol
oynamaktadır.
Matriks
metalloproteinazların
aktivasyonunun
endodontik hasarın patogenezinde de önemli rolü bulunmaktadır, çünkü
P.gingivalis gibi siyah pigmentli mikroorganizmalardan salınan virülans
faktörleri, MMP’nin de içinde bulunduğu bazı konak enzimleri aktive
ederek doku yıkımına neden olmaktadır85. P.gingivalis, P.endodontalis gibi
bakterilerin süpernatantları, MMP seviyelerini arttırarak da pulpal ve
periapikal hasar oluşmasına neden olmaktadır51. Dolayısıyla bu bakteri
türlerinin hareketini anlamak, pulpal ve periapikal lezyonların tedavilerinde
önemli bir yer tutmaktadır .
Özellikle P.gingivalis’in içinde bulunduğu siyah pigmentli
mikroorganizmaların, siklooksijenaz 2 (COX-2), interlökin-6, interlökin-8
gibi inflamasyonda rol oynayan konak doku mediatörlerinin
ekspresyonlarını da belirgin biçimde arttırdığı gösterilmiştir52,53,54.
Yang ve arkadaşları97, siyah pigmentli mikroorganizmaların
vasküler endotelyal büyüme faktörünün ekspresyonunu arttırarak kalp
dokusuna hasar verebileceklerini yaptıkları bir çalışmada göstermişlerdir.
Bate ve arkadaşları98, PCR kullanarak yaptıkları bir çalışmada,
enfektif endokardit ile ilişkili olan stafilokokal fibronektin-bağlayıcı protein
(FgBP) ve streptokokal fibronektin-bağlayıcı proteinin (FnBP) enfekte kök
kanallarında mevcut olduğunu göstermişlerdir. Streptokokal FnBP
primerleri kullanarak P.gingivalis’te de bir PCR bandı amplifiye edilmesi
ilginç bir sonuç olup; bu bakterinin de streptokoklar gibi enfektif
endokardite neden olabileceği düşüncesini akla getirmektedir.
18
2.5.Treponema denticola
Spiroketler (treponema), insan vücudunun birçok bölgesindeki
enfeksiyonlarla ilişkili bulunmaktadır. Son yıllarda, spiroketlerin oral
hasarların gelişimindeki önemi ve patojenik potansiyeli üzerinde
durulmaktadır. Çoğu spiroket türünün, besin ve çevresel gereksinimlerinin
sağlanması zordur; bu nedenle kültüre edilmelerinin çok zor, hatta bazen
olanaksız olabileceği bilinmektedir99.
Morfolojik özelliklerine göre oral spiroketler genellikle küçük, orta
boy ve büyük olarak sınıflandırılabilir. Besin gereksinimlerine göre oral
treponema türleri Tablo 6’da görülebileceği gibi ikiye ayrılabilir100;
Tablo 6: Besin gereksinimlerine göre sınıflandırılmış oral treponemalar
100
1.Sakkoralitik oral treponemalar:
T. pectinovorum
T. socranskii
T. amylovorum
T. lecithinolyticum
T. maltophilum
T. parvum
2. Asakkoralitik oral treponemalar
T. denticola
T. medium
T. vincentii
T. putidum
Oral spiroket türleriyle endodontik enfeksiyonlarda farklı
prevalanslarda karşılaşılmaktadır6,100,101,102,103,104,105. Üretilebilen oral
spiroket türlerinin en iyi karakterize edilebileni T.denticola’dır, ancak bu
bakterinin kültüve edilmesi çok zordur99. T.denticola, hareketlilik özelliği
yüksek, helezonik kıvrım gösteren asakkarolitik, anaerobik gram negatif bir
bakteridir. Uzun zamandır periodontal hasarla ilişkilendirilen T.denticolanın
patojenitesine katkıda bulunan birçok virülans faktörü bulunmaktadır.
Fibroblastlara, epitelyal hücrelere, eritrositlere, fibronektine, hyalürona,
serum ve dişeti sıvısına bağlanabilme yeteneğine sahiptir99.
Sinerji,
birden
fazla
mikrorganizmanın
aynı
ortamda
bulunduklarında birbirlerinin etkilerini güçlendirmelerine verilen addır.
Bakteri türleri arasındaki sinerji, bakterilerin yaşama şanslarını ve konak
dokudaki zararlı etkilerini arttırmaktadır56. ‘Kırmızı kompleks’in iki üyesi
olan P.gingivalis ve T.denticolanın arasındaki sinerji bir çok çalışmada
gösterilmiştir ve bu sinerjinin kök kanal enfeksiyonunun ilerlemesinde
19
önemli bir role sahip olduğu düşünülmektedir18,56,106. Hatta bu sinerjinin bu
bakterilerin sahip oldukları bazı virülans faktörlerinden kaynaklanıyor
olabileceği ileri sürülmektedir107.
2.5.1. Treponema denticola’nın Virülans Faktörleri
T.denticolanın başlıca virülans faktörleri, Major Surface Protein
(msp-Ana Yüzey Proteini) ve kemotripsin benzeri proteaz kompleksi
(CTLP) gibi sitotoksik aktiviteli yüzey proteinleri; hücre dışı veya
membranla ilişkili proteolitik, hidrolitik enzimler ve metabolitlerdir108.
T.denticola’nın bazı yüzey proteinleri adeziv, sitotoksik etkiler gösterir ve
doku yıkıcı aktivitelere sahiptir. Bu proteinlerin başlıcaları Msp ve
CTLP’dir108,109.
a) Adezyon ve İnvazyon
T.denticola, konak hücrelere ve diğer doku elemanlarına adezyon
gösterebilir. Ayrıca hücrelere ve dokulara invaze olabilme yeteneği de
bulunmaktadır108. T.denticola, adezyon yeteneği ile konak hücrelerine
tutunur ve onların harabiyetine neden olur. Fibronektin, T.denticolanın
insan gingival fibroblastlarına adezyonunda çok önemli bir yer tutmaktadır.
Anti fibronektin antikorlarının varlığının bu adezyonu engellediği
gösterilmiştir110. Ayrıca adezyon, mannoz ve galaktoz tarafından da
engellenebilir.
b) T.denticola, immunomodüler (bağışıklık düzenleyici) özelliğe sahiptir.
Polimorfonükleer lökositlerin degranülasyonunu sağlayarak, onların
kollajenaz, jelatinaz ve elastaz salgılamalarına neden olur. Süperoksit ve
hidrojen peroksit üretimini engeller.
c) T.denticolanın eritrositlerin biraraya gelmesini sağlayıcı etkileri ve
hemolitik aktiviteleri bulunur.
d) Ana Yüzey Proteini (msp)
msp, T.denticola’nın dış membranında bulunan düzgün altıgen
yapıda
bir
adezindir111.
T.denticolanın
konak
hücrelere
ve
ekstraselüler(hücredışı) matrikse bağlanmasını düzenler ve bağlandığı
yüzeylerde por oluşturucu aktivite gösterir111,112. msp’nin T.denticola’nın
hücre iskeletinin düzenlenmesinde de etkileri bulunur109.
Ana yüzey proteini, hem epitelyal hücre yüzey reseptörlerine hem
de sitoplazmik proteinlere bağlanır ve msp kompleksi epitelyal hücrelerin
20
sitoplazmik membranlarındaki iyon kanallarını oluşturur113. Bu özellikler,
T.denticolanın konak epitel hücrelerindeki sitopatik etkilerine yardımcı olur.
Resim 2: Treponemaların ultra-ince kesitlerinde Mspnin lokalizasyonu. Oklar, dış ve
112
sitoplazmik membranları göstermektedir .
e) CTLP (Chymotrypsin-like protease complex) (Kemotripsin benzeri
proteaz kompleksi)
Bazı T.denticola türlerinin dış membranlarında bulunan ve
adezyonda etkili olan bu protein kompleksine ‘dentisilin’ adı da
verilmektedir114. Bu kompleks, jelatin, laminin, fibronektin, IgA, IgC,
albumin, transferrin, fibrinojen ve diğer biyoaktif peptidleri salgılayan geniş
bir substrata karşı enzimatik etkilidir. CTLP ayrıca doku yıkımına neden
olan kollajenolitik konak enzimlerinin aktivasyonuna yol açabilir ve T.
denticola Msp’nin lokalizasyonuna ve oligomerleşmesine katkıda bulunur.
Dentisilin, spiroketlerin konak dokuya invazyonuna ve enfeksiyonu
yaymalarına neden olmaktadır109.
21
f) Flajella
Spiroketlerin hareket yeteneği, endodontik ve periodontal hasarın
gelişiminde önemli rol oynamaktadır. Hareketliliği sağlayan flajella önemli
bir virülans faktörüdür ve flajellaya sahip olmayan spiroketler konağı
enfekte etmekte başarısız olmaktadır109. T.denticola gibi spiroketlerin
yalnızca flajellaya bağlı hareket sistemleri bulunmaz; bu tip spiroketler
aynı zamanda kamçısal hareketi yöneten kemotaksis için de gereken
genleri içermektedir109. T. denticolanın epitelyal dokulara göçü, hareketlilik
ve kemotaksise bağlıdır. flgE, cheA, dmcA ve dmcB genlerinde mutasyon
olan T.denticolalar, gingival epitelyal hücrelere penetrasyonda yetersiz
kalmışlardır115,116.
g) Kısa zincirli yağ asitleri, uçucu sulfur bileşenleri, ekstraselüler veya
yüzey proteolitik ve hidrolitik enzimleri oral spiroketlerin diğer virülans
faktörleri arasında sayılabilir117.
Kök kanallarında varlığını sürdüren en küçük bakteri yükünün bile
endodontik hasar oluşturabileceği düşünülmektedir. Bu nedenle kök
kanalında var olduğu ileri sürülen her tür mikroorganizmanın saptanması
ve tanımlanması son derece önemlidir.
Diş hekimliğinde çoğu oral enfeksiyon, belirli bir etyolojik ajan
tanımlanmadan emprik olarak tedavi edilmektedir. Örneğin çoğu abse
penisiline cevap verir ve periodontal enfeksiyonların çoğu tetrasiklinle
tedavi edilmektedir. Ancak bu emprik yaklaşım her zaman çok başarılı
olmamaktadır. Klinik mikrobiyolojide en doğru ve iyi yaklaşım etyolojik
mikroorganizmayı tanımlamak, daha sonra uygun tedaviyi seçmek
olmalıdır.
2.6. Kök Kanal Patojenlerinin Saptanmasında Kullanılan Yöntemler 50
1) Direkt İnceleme
Mikroskopi
Gram Boyama
2) Kültür ve Duyarlılık Testleri
a)Kültür Teknikleri
Aerobik ve Anaerobik Teknikler
22
b)Özelleştirme Teknikleri
Gaz-sıvı Kromatografi
DNA-DNA Hibridizasyon
c)Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri
Broth Dilusyon Testleri
Broth Disk Testi
Bakteriyel Disk Difüzyon Testi
Antimikrobiyal Duyarlılık için Hızlı Test
3) Immunolojik Testler:
İmmunofloresans (IF)
Enzim Immunoassays (EIA)
Latex Aglutinasyon
Immunodot/Blot
Flow Sitometri
Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
4)Diğer Testler
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
Antikorların Tanımlanması (ELISA)
Bu yöntemlerden en güncel olanı bakteri tanımlanmasında hala
‘altın standart’ olarak kabul edilen kültür yöntemleri ile bakterilerin özgül
DNA dizilerini taklit eden oligonükleotid primerlerin kullanıldığı ‘Polimeraz
Zincir Reaksiyonu (PCR)’dur.
23
2.6.1. Kültür Tekniği
Kültür işlemleri, mikroorganizmaların laboratuvarda suni büyüme
koşullarında üretilmesini esas almaktadır41. Bu teknik, bir örnek
içerisindeki çok çeşitli mikrobiyal türlerin tanımlanmasına izin vermektedir.
Ayrıca bakterilerin mikrobiyal duyarlılıklarının incelenmesine de olanak
sağlamaktedır. Bu avantajlarına karşın kültür yönteminin sahip olduğu bazı
kısıtlılıklar ve eksik yönler bulunmaktadır19,118,119,120.
a)
Kültür yöntemleri, bir çok mikroorganizmayı zor üretmekte veya hiç
üretememekte,
bu
nedenle
yanlış
negatif
sonuçlar
doğurabilmektedir.
b)
Çoğu zaman diagnostik bir sonuç almak için çok yavaş kalmaktadır.
c)
Bakterilerin fenotipik özellikleri nedeniyle düşük özgüllüğe sahiptir
ve bu nedenle mikrobiyal türlerin birbirinden ayrılmasında belirgin
sınırlamaları bulunur.
d)
Düşük sayıdaki ve zor üreyen mikroorganizmaları hesaplamada
düşük duyarlılığa sahiptir.
e)
Örneklerin taşınma tipine göre sonuçlar değişkenlik gösterebilir.
Örneklerin taşınma ortamı anaerobik bakterilerin yaşamasına izin
vermelidir.
f)
Zaman alıcı ve pahalıdır.
Ayrıca bazı mikroorganizmalar aşağıdaki nedenlerden dolayı
üretilememektedir41,121:
1)
Suni kültür ortamları bakteriler için gereken besinleri ve büyüme
faktörlerini içermemektedir. Mikroorganizmaların konak dokuda
yaşamaları için gereken özel büyüme faktörleri hakkında çok az
bilgi bulunmaktadır. Ayrıca kültür ortamının kendisi bazı türler için
toksik olup büyümeyi engelleyebilir.
2)
Örnekteki diğer mikroorganizmalar, hedef türlerin üremelerini
engelleyecek maddeler salgılayabilir.
3)
Bir tür büyümek için başka bir türe gereksinim gösterebilir. Örneğin
Tannerella forsythia N-asetil muramik aside muhtaçtır, bu nedenle
saf kültürde çok zor ürerken diğer türlerin varlığında
büyüyebilmektedir.
24
Sonuç olarak eğer bir mikroorganizma kültüve edilemiyorsa fenotip
bağımlı metodlarla tanımlanamaz.
2.6.2. Moleküler Biyolojik Yöntemler ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Endodontik patojenleri tanımlamada, çok çeşitli moleküler biyolojik
teknik kullanılmaktadır. Moleküler metodların çoğu mikroorganizmaları
tanımlamak için kültüve edilmelerine gerek duymadan, ribozomal RNA
genleri başta olmak üzere, varlığı gösterilmek istenen bakteriyel patojenin
özgül DNA dizilerinin saptanmasına dayanır. 16S rRNA geni tüm
bakterilerde bulunmaktadır. 16S rDNA’nın tüm bakteriler için aynı olan
bazı bölgeleri bulunurken, bir türden diğer türe değişim gösteren dizileri de
bulunmaktadır; ki bunlar mikroorganizma türlerinin tanımlanmasında ve
birbirinden farklılaştırılmasında rol oynar41.
Mikroorganizmaların tanımlanması amacıyla kullanılan genotip
tabanlı moleküler mikrobiyolojik yöntemlerden günümüzde en popüler
olanı, 16S ribozomal RNA genlerindeki özel bölgelerinin çoğaltıldığı
‘Polimeraz Zincir Reaksiyonu’ (PCR) dur. Akar’a122 göre, 1983 yılında Kary
Mullis tarafından ilk kez bilim dünyasına sunulan Polimeraz Zincir
Reaksiyonu, modern bilimi tamamen değiştirmiştir. Kary Mullis bu
buluşundan dolayı 1993 yılında Nobel Kimya Ödülüne hak kazanmıştır7.
Klinik olarak periradiküler lezyon oluşturan bakteri yükü konusunda
uzlaşma yoktur. Bu nedenle, kök kanallarında oluşabilecek en küçük
sayıdaki bakteri hücrelerinin bile saptanması büyük önem taşır. PCR,
diğer saptama yöntemlerinden en az 10- 100 kat daha duyarlıdır ki bu
yüksek duyarlılık onu bu amaç için ideal kılar7. Ayrıca PCR yönteminde,
saptama için kültür yönteminde olduğu gibi bakteri üretilmesi işlemine
gerek duyulmamaktadır. Bu özellik, endodontik enfeksiyonlarda sıkça
rastlanan ve zor üreyen anaerobik bakterilerin tanımlanmasında önemli bir
avantaj oluşturur.
2.6.2.1. PCR’ın Kullanım Alanları122
1. Kalıtsal hastalıklarda hastanın ve taşıyıcının tanısında
2. Prenatal tanıda
3. Klinik örneklerde patojen organizmaların tanısında
25
4. Adli tıpta
5. Onkogenezisin araştırılmasında
6.Probların
oluşturulmasında,
araştırmalarında
klonlamada,
gen
ekspresyon
7. DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında
8. Bilinmeyen dizilerin tayininde
9. Geçmiş DNA’nın incelenmesi ve evriminin aydınlatılmasında
10. RFLP “Restriction Fragment Length Polymorphism” analizinde
11. In vitro fertilizasyon yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik
testlerin yapılması ve sonra implantasyon gerçekleştirilmesi ile bebeğin
normal doğmasının sağlanmasında
12. DNA protein etkileşiminin araştırılmasında (footprinting) kullanılabilir.
PCR yönteminin icadı ve gelişimi, kuşkusuz son yüzyılda moleküler
teknolojideki en önemli ilerlemedir. Biyolojik ve tıbbi araştırmalara PCR’ ın
etkisi oldukça fazladır. PCR, gen ve genom çalışmalarının sayısını
dramatik şekilde arttırmıştır. Günümüzde PCR kullanarak herhangi bir
organizmadan herhangi bir geni çoğaltmak mümkündür. Yöntem, DNA’ nın
in vitro replikasyonu ve basit reaksiyonların tekrarlayan döngülerinden
oluşmaktadır7. Temel olarak, ardı ardına 25-35 siklusta DNA polimeraz
enzimi hedef DNA’yı çoğaltmaktadır. PCR bir çeşit in vitro klonlama olarak
da tanımlanabilir.
Öncelikle ısı çok yükseltilerek çift sarmallı DNA’nın (Şekil 1) tek
sarmala denatüre olması sağlanır (denatürasyon). Isı düşürüldüğünde bir
çift oligonükleotid primer hedef DNA dizisindeki tamamlayıcı eşlerine
yapışır (annealing)(Şekil 2). Primerler kopyalanacak DNA bölgesinin
limitlerini tanımlar. Biraz daha arttırılan sıcaklıkta DNA polimeraz enzimi
primerlere bağlanarak, nükleotidleri ikinci sarmalı uzatmak için ekler.
Devam eden döngülerde bu basamaklar daha fazla DNA kopyası
oluşturmak için tekrar edilir. 30 döngüden sonra tek bir başlangıç
molekülünden hedef dizinin milyonlarca kopyası üretilebilir41.
26
Şekil 1: Çift sarmallı DNA molekülünün yapısı
Şekil 2: Polimeraz Zincir Reaksiyonunda gerçekleşen basamaklar (denatürasyon,
yapışma, uzama)
27
Amplifikasyon ürünün saptanması ise; kopyaları çıkarılan primerler
arasında kalan belli baz çifti büyüklüğündeki bölgenin jel üzerinde veya
amplifikasyon yapılan bölgeye uygun tamamlayıcı prob ile hibridizasyon
sonrası belirlenmesi ile gerçekleşmektedir.
2.6.2.2. PCRda Kullanılan Başlıca Bileşenler 7,122,123
1. Hedef DNA
İncelenmek istenen örneğin DNA’ sı PCR reaksiyonuna tek veya çift
zincirli olarak eklenebilir. DNA’nın uzunluğu PCR’ın etkinliği için önemli bir
faktör değildir, ancak uzunluk bir restriksiyon enzimi ile kısaltılırsa, sonuç
daha başarılı olur.
2.Oligonükleotid Primerler
Hedef DNA’nın dizilerini tamamlayan tek zincirli sentetik
oligonükleotid primerler reaksiyona genellikle 1mM konsantrasyonda
eklenir. Bu miktar, çoğunlukla 30 döngülük bir PCR için yeterlidir.
Primerlerin yüksek konsantrasyonları, ektopik bölgelere yapışmalarına
neden olarak, istenen hedef DNA dışındaki bölgelerde çoğalma meydana
getirebilir. Yetersiz konsantrasyonları ise PCR ürününün çok az miktarda
oluşmasına neden olur. Primer tasarımında dikkat edilmesi gereken
kurallar şunlardır:
-Oligonükleotid dizisi özgün olmalı
-3’ ucunda G-C olmalı
-Baz dağılımı ve kompozisyonu rastgele olmalı (G/C oranı % 45-55)
-Primer uzunluğu optimum 18-25 bazlık olmalı
-İki primer aralığı 100-600 bç (baz çifti) olmalı
-Primer kendisi ya da diğer primer ile komplementer (tamamlayıcı) diziler
içermemelidir.
3. 4-deoksiribonükleotid trifosfat (dNTP)
DNA sentezi sırasında serbest deoksiribonükleotid trifosfatlara
ihtiyaç duyulmaktadır. PCR reaksiyonu sırasında en fazla özgüllüğü
sağlamak için dNTP’lerin konsantrasyonu 200 µM düzeyinde olmalıdır.
Ardarda yapılacak dondurma-çözdürme işlemleri de dNTP’nin raf ömrünü
28
kısaltacağından; daha sonra kullanılacak miktarlar ayrılıp +20 ºC’ de
saklanmalıdır.
4. Tamponlar
Standart PCR tamponunun 10 x konsantrasyonundaki stoğu, 500
mM KCl, 100 mM Tris-Cl, 15 mM MgCl2 içermektedir. PCR sırasında 1 x
konsantrasyona sulandırılan tampondan gelen Mg+2 iyonunun optimal
konsantrasyonu oldukça düşük olduğundan (1.5 mM), kalıp DNA
hazırlanırken yüksek konsantrasyonda şelasyon yapıcı ajanların
bulunmaması gerekir. Ayrıca fosfatlar gibi negatif yüklü iyonik gruplar
olmamalıdır.
Bir PCR ilk kez yürütüldüğünde, Mg+2 konsantrasyonu,
optimizasyonu sağlamak için ayarlanmalıdır. Burada TrisCl (10mM) ve KCl
(50mM) sabit tutulup MgCl2 konsantrasyonu 0.05-5 mM arasında (0.5 mM
artışla) denenir. dNTP, DNA ve proteinlerin tümü Mg+2 iyonunu
bağladıklarından, her PCR protokolünde Mg+2 konsantrasyonu ampirik
olarak ayarlanmalıdır.
Serbest magnezyumu etkileyen faktörler şunlardır:
-DNA örneği
-Örnekte EDTA, sitrat gibi şelasyon yapan ajanların olması
-d NTP
-Protein
5. DNA Polimeraz
DNA polimerizasyonunda en önemli nokta DNA polimerazın
doğruluğudur. Saflaştırılmış DNA polimerazlar, moleküler biyolojinin en
önemli araçlarından biridir. En çok kullanılan DNA polimeraz Thermus
aquaticus adı verilen termofilik bakteriden izole edilen ve yüksek
sıcaklıklara dayanabilen bir enzimdir7,122,123. DNA’ nın DNA polimerazlar
aracılığıyla sentezi, hem çok kompleks hem de önemli ölçüde sıralı bir
işlemdir.
DNA polimerazın reaksiyona fazla miktarda konması ile oluşan
PCR ürününün miktarı artmaz, ancak hata oluşma şansı artar. Serbest
Mg+2 konsantrasyonunun azalması ve reaksiyonun pH’ının düşürülmesi ile
Taq polimerazın doğruluğu arttırılabilir.
29
PCR basamakları için gereken en uygun ısılar, denatürasyon için
94 ºC, annealing için 40-72 ºC , polimerizasyon için 72 ºC’ dir123. Bu üç
basamak 25-40 kere tekrarlanır, daha sonra reaksiyonun soğuması için
ürünler, PCR tipine göre 4 ºC’ye alınır veya oda sıcaklığında bırakılır.
Mikrobiyolojik örneklerde bakteri tanımlanması için genellikle
yukarıda anlatıldığı gibi konvansiyonel bir PCR döngüsü kullanılırken,
zaman zaman in-situ PCR, nested PCR, multipleks PCR, Real-time PCR
(Gerçek zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu), Arms-PCR, RFLP
(Restriction fragment length polimorfism), SSCP (Single-Strand
Conformation Polymorphism), Q-PCR (Quantitive PCR) gibi varyasyonlara
da başvurulmaktadır7,123. Diş hekimliği biliminde örneklerin incelenmesi
amacıyla en sık kullanılan PCR yöntemleri, aşağıda açıklanmaktadır:
Nested PCR
PCR’ın hem duyarlılığını hem de özgüllüğünü arttırmak için
geliştirilmiş bir yöntemdir1. Nested PCR tekniğinde, bir set primer
kullanılarak yapılan ilk amplifikasyonu, ilk PCR ürünündeki daha küçük
spesifik dizileri tamamlayan 2. setin kullanılması ile yapılan
reamplifikasyon takip eder. nPCR, PCR ile karşılaştırıldığında, daha
yüksek duyarlılık ve özgüllük göstermektedir104,123. Eğer amplifikasyonun
ilk aşamasında spesifik olmayan diziler oluşur ise, bu non-spesifik ürünler
genellikle 2. turda kullanılan nested primerleri tamamlamayacaktır.
Amplifikasyonun 2. turu, azaltılmış bir doku debrisi ve ilk turda amplifiye
edilemeyen diğer DNA dizileri ile yürütülür104. Yine de manüplasyon
sırasında yapılan yanlışlıklar, yanlış pozitif sonuçlara neden olabilir; bunu
önlemek için özel stratejiler belirlenmelidir123.
Multipleks PCR
Multipleks PCR, farklı bakteri türlerinin aynı anda saptanmasına
olanak veren bir yöntemdir10. Her biri hedef bakteri türlerine özgü olan bir
dizi farklı primer çifti, tek tüplü amplifikasyon reaksiyonunda kullanılır. Bu
yaklaşım, analiz süresini, gerekli ayıraç ve kalıp miktarını asgariye indirir.
Ancak bir multipleks PCR protokolü geliştirmek primer kombinasyonları ve
reaksiyon durumları bağlamında çok kompleks bir süreçtir123.
Real-time PCR
Çoğu PCR yöntemi niteliksel veya yarı nicelikseldir. Real-time PCR
ise bundan farklı olarak reaksiyon boyunca ürünlerin devamlı olarak
ölçülmesi ile karakterizedir. Bu ölçümün yapılabilmesi için, DNA’ya
bağlanma yeteneğine sahip floresan boyalar kullanılabileceği gibi, hedef
diziye özgül floresan maddeler ile işaretli oligonükleotid problar da
30
kullanılabilemektedir. Prob kullanılan deneylerde, probun özgül diziye
hibridizasyonu çoğunlukla floresans rezonans enerji transferi (FRET)
yöntemi ile saptanmaktadır. Genellikle iki yaklaşım vardır:
Birincisi, bildirici (reporter) boya ile baskılayıcı (quencher) boyanın
birbirinden ayrılması ile ortaya çıkan floresans; ikincisi ise, iki boyayı
birbirlerine çok yakın bir uzaklığa getirerek oluşturulan floresan
yayılımıdır123. Birinci yaklaşıma TaqMan sistemi, ikinci yaklaşıma ise Light
Cycler örnek olarak gösterilebilir. Özgül primer çiftine ek olarak, TaqMan
sistemi, 5’- ucunda florasan reporter boya, 3’- ucunda da quencher
boyadan oluşan florojenik probu kullanır26. Prob, PCR işlemi boyunca
amplikonun tamamlayıcı zincirine bağlandığında, Taq DNA polimeraz,
probu, primerlerden birinin uzaması sırasında parçalar ve boya molekülleri
yer değiştirir ve ayrılır. Elektronik olarak uyarılmış reporter boya, artık
quencher boya tarafından baskılanmaz ve floresan yayılımı, floresan
detektörü tarafından görüntülenir. Her PCR siklusunda floresan yayılımının
izlenmesi suretiyle reaksiyonun ilerlemesi gerçek zamanlı olarak kaydedilir
ve örnekteki DNA miktarı belirlenir124. Light Cycler yaklaşımı, iki florasanla
işaretli 2 oligonükleotide dayanır ki; bu oligonükleotidler, hedef PCR
ürününün komşu bölgelerine yapışır. Bir boya, ışık kaynağı ile
hareketlenir, enerjisini ikinci boyaya aktarır ve bu da daha sonra
saptanacak olan belli bir dalga boyu yayar. Bu 2 boyanın spesifik florasan
işareti üretmek için fiziksel olarak birbirlerine yakın olmaları gerekir. Eğer
işaretlenmiş iki prob, spesifik PCR amplikonunun yakın bölgelerini
hibridize ederse, iki boya arasındaki sonuç FRET, ürünün miktarı ile
orantılı olarak floresanda bir yükselmeye neden olur. Real-time PCR
ölçümleri, klinik örneklerdeki total bakteri sayısının yanı sıra, tek tek hedef
türlerin de miktarının belirlenmesine olanak verir ve birkaç dakikada bile
bakterileri saptayabilir26,120,123,125.
2.6.2.3. PCR’ın Kültür Yöntemine Göre Sağladığı Avantajlar:41,126
1.
Hem kültürü yapılabilen hem de yapılamayan bakteri türlerini
saptayabilmektedir.
2.
Yüksek özgüllük gösterir
tanımlanmasına olanak sağlar.
3.
Klinik örneklerdeki mikrobiyal türleri üretilmelerine gerek
duymaksızın
saptayabilmektedir.
Başka
bir
deyişle
mikroorganizmaları tanımlamak amacıyla onların canlılıklarına
gerek duymamaktadır.
ve
mikrobiyal
türlerin
kesin
31
4.
Kültür yöntemine ve diğer moleküler biyolojik yöntemlere göre daha
duyarlıdır.
5.
Genellikle daha kısa zaman gerektirmektedir.
6.
Örnekleme ve taşıma sırasında kontrollü anaerobik ortamlara
gereksinim göstermemektedir. Zor üreyen bakteriler taşıma
sırasında canlılıklarını yitirseler bile saptanabilmektedir.
7.
Antimikrobiyal tedavi sırasında da kullanılabilmektedir.
8.
Az sayıda mikroorganizmayı bile saptayabilen bir yöntem olduğu
için örnek miktarının az olması sorun yaratmaz.
9.
Epidemiyolojik çalışmalar için çok sayıda örnek kullanıldığında ,
örnekler düşük sıcaklıklarda saklanıp bir seferde incelenebilir.
32
3. GEREÇ VE YÖNTEM
Bu çalışmada çeşitli pulpa ve periapikal doku hastalık tiplerinden
elde edilen örnekler, Real-time PCR yöntemi kullanılarak incelendi.
İncelenen bu örneklerde Porphyromonas gingivalis ve Treponema
denticolanın varlığı ve prevalansı saptandı. Porphyromonas gingivalis
DNA’sının pozitif saptandığı örneklerde prtC geninin, Treponema denticola
DNA’sının pozitif bulunduğu örneklerde ise Msp geninin varlığı ve
prevalansı saptandı. P.gingivalis, T.denticola ve bu iki virülans geninin
varlığı ile belirli klinik patolojiler arasındaki ilişki değerlendirildi.
3.1. Örnek Seçimi
Bu tez çalışmasında enfekte kök kanallarından örnek almak için
öncelikle Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurul’undan Etik Kurul
Raporu alındı. Gazi Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Diş Hastalıkları ve
Tedavisi Anabilim Dalı’na başvuran, kök kanal tedavisi endikasyonu konan
ve yaş aralığı 18-70 arasında değişen 60 hastanın enfekte pulpaları
incelendi. Hastaların son üç ay içerisinde herhangi bir antibiyotik
kullanmamış olmalarına dikkat edildi. Seçilen dişler, daha önce endodontik
tedavi görmemiş, tek kanallı, nekrotik pulpalı ve periapikal
radyografilerinde değişen derecelerde radyolüsensiye sahip olan dişlerdi.
Dişler, periapikal hasarın tipine göre üç gruba ayrıldı. Periradiküler hasarın
sınıflandırılması, Torabinejad ve Walton127 tarafından yapılan çalışmada
göz önüne alınan kriterlere göre gerçekleştirildi:
1. Akut Apikal Periodontitis: Akut ağrı, perküsyon hassasiyeti ve spontan
ağrı semptomlarından birinin ya da hepsinin var olduğu durumlar bu gruba
dahil edildi.
2. Kronik Apikal Periodontitis: Hiçbir belirgin semptomun bulunmadığı
periapikal radyolüsensi gösteren dişler bu gruba dahil edildi.
3. Akut Apikal Abse: Bu gruba dahil edilen tüm örneklerde sorunlu dişle
ilgili drenaj gösteren veya göstermeyen lokalize veya diffüz bir şişlik
bulunmaktaydı. Bazı vakalarda ağrı şikayeti de mevcuttu.
Seçilen tüm dişlerin belirgin bir periodontal sorun göstermemesine
ve 4 mm’yi geçen derinliklerde periodontal cep içermemesine dikkat edildi.
33
3.2. Kök Kanallarından Örnek Alınması
Örnek alınacak tüm dişlere pomza ve su ile temizleme yapıldıktan
sonra rubber-dam izolasyonu uygulandı. Operasyon sahası önce %3’lük
hidrojen peroksit ile temizlendi; ardından % 2.5’ lik sodyum hipoklorit
(NaOCl) ile dekontamine edildi. Endodontik giriş kaviteleri steril elmas
fissür frezlerle (Brasseler Dental Products, Savannah, A.B.D.), su spreyi
kullanılmadan açıldı. Pulpa odasını da içeren operasyon sahası, % 2.5’luk
sodyum hipoklorit ile yıkandı. Ardından bu solusyon % 5’lik sodyum
tiyosülfat kullanılarak inaktive edildi. Eğer kök kanalı kuruysa az miktarda
steril salin solüsyonu kanala uygulandı. 15 numaralı K tipi eğe (Dentsply,
Maillefer, İsviçre) kullanılarak tanı radyografisinde saptanan çalışma
boyutundan 1 mm kısa olacak şekilde, kök kanalında çevirme ve hafifçe
kazıma işlemi yapıldı. Ardışık numaralı iki kağıt kon (Diadent, Kore), aynı
seviyeye kadar yerleştirilip kanaldaki sıvıyı emmesi sağlandı. Her iki kağıt
kon kanal içerisinde birer dakika bekletildi. Daha sonra K tipi eğe ve kağıt
konlar 1mL steril fosfat tamponlanmış salin solüsyonu (pH 7.6) içeren
kriyotüplere
(Taşlıkaya,
Türkiye)
yerleştirildi.
Tüpler,
DNA
ekstraksiyonundan önce -80 ºC’ ye ayarlanmış derin donduruculara
aktarıldı ve burada bekletildi (Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji
Laboratuvarı).
Abseli dişlerden alınan pü örnekleri, oral mukozanın % 2’ lik
klorheksidinle dezenfekte edilmesinin ardından steril bir şırınga (Set,
Türkiye) aracılığıyla aspire edilerek elde edildi. Örnekler yine 1 mL steril
fosfat tamponlanmış salin solüsyonu (pH 7,6) içeren kriyotüplere
yerleştirildi ve -80 ºC’de donduruldu.
a. DNA Ekstraksiyonu
Tüplerdeki örneklerin DNA ekstraksiyonları, filtreli kolon DNA
saflaştırma kiti (AbsoGene Genomic DNA Isolation KIT, Türkiye)
kullanılarak yapıldı. DNA saflaştırma kitinin içerikleri Tablo 7’de
gösterilmektedir.
34
Tablo 7: DNA saflaştırma (ekstraksiyon) kitinin içerisinde bulunan materyaller ve
miktarları
Materyaller
10 test için
50 test için
Proteinaz K
DL Solüsyonu
B Solüsyonu
W1 Solüsyonu
W2 Solüsyonu
E Solüsyonu
Spin kolonlar
Toplama tüpleri (2 ml)
Toplama tüpleri (1.5
ml)
4 mg
3 ml
3 ml
4 ml
6 ml
2.5 ml
10 adet
30 adet
10 adet
20 mg
11 ml
13.75 ml
19 ml
28.5 ml
11 ml
50 adet
150 adet
50 adet
100
test
için
40 mg
22 ml
27.5 ml
38 ml
57 ml
22 ml
100 adet
300 adet
100 adet
DNA Ekstraksiyon Protokolü
1.
Örnekleri içeren her tüpe 200 µl DL solüsyonu ve 20 µl Proteinaz K
eklendi (Resim 3).
2.
Tüpler vortekslenerek karıştırıldı ve 56 ºC’ de 2 saat inkübe edildi.
3.
Tüplere 250 µl B solüsyonu eklendi ve 20 kez vortekslenerek
karıştırıldı.
4.
Kısa bir santrifüj yapıldı ve 15 dakika boyunca 65 ºC’de 3 dakikada
bir karıştırılmak suretiyle inkübe edildi (Resim 4, Resim 5, Resim 6).
5.
% 96-100’ lük 200 µl etanol eklendi ve 20 kez vortekslenerek
karıştırıldı.
6.
Kısa bir santrifüj işleminin ardından karışım, 2 ml’lik toplama tüpü
üzerindeki filtreli kolona aktarıldı.
7.
10.000 devirde 1 dakika santrifüj yapıldı, filtreli kolon yeni bir 2 ml’lik
toplama tüpüne aktarıldı.
8.
700 µl W1 solüsyonu eklendi ve 10,000 devirde 1 dakika santrifüj
yapıldı. Filtreli kolon yeni bir 2 ml’ lik toplama tüpüne aktarıldı.
9.
700 µl W2 solüsyonu eklendi ve 10,000 devirde 1 dakika santrifüj
yapıldı. Filtreli kolon yeni bir 2 ml’lik toplama tüpüne aktarıldı.
35
10.
Tüpler 14,000 rpm’de 30 saniye santrifüj edilerek arda kalan yıkama
çözeltisi uzaklaştırıldı.
11.
Filtreli kolon, 1.5 ml’lik toplama tüpüne aktarıldı.
12.
Önceden 70 ºC’ye kadar ısıtılan 200 µl E solüsyonu kolon filtresini
tamamen ıslatacak şekilde eklenerek 3 dakika oda sıcaklığında
inkübasyon yapıldı.
13.
Tüpler 14,000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.
14.
Santrifüj sonunda filtreli kolonlar uzaklaştırılarak toplama tüplerine
elüe edilen DNA çözeltisi polimeraz zincir reaksiyonu deneylerine
kadar –20 °C’de saklandı.
Bu işlemler sırasında W1, W2 solüsyonları ve Proteinaz K’ya üretici
firmanın talimatları doğrultusunda etanol ve su eklendi. Eklenmesi gereken
uygun miktarlar Tablo 8 ve Tablo 9’ da gösterilmektedir.
Tablo 8: Proteinaz K’ ya eklenen su miktarları
Kit Boyutu
Proteinaz K (mg)
10
50
100
4 mg
20 mg
2x20 mg
Eklenen
(ml)
0.2 ml
1 ml
2x1 ml
H2O
miktarı
Tablo 9: W1 ve W2 solüsyonlarına eklenen etanol miktarları
Kit boyutu W1
(ml)
10
4
50
19
100
38
Kit boyutu W2
(ml)
10
6
50
28.5
100
57
Solüsyonu Eklenen etanol miktarı Toplam
(ml)
hacim (ml)
4
8
19
38
38
76
Solüsyonu Eklenen etanol miktarı Toplam
(ml)
hacim (ml)
2
8
9.5
38
19
76
36
Resim 3: DNA ekstraksiyonu işlemi sırasında tüplere Proteinaz K’nın aktarılması
Resim 4: DNA ekstraksiyonu sırasında gerçekleştirilen santrifüj işlemi
37
Resim 5: Santrifüj işlemi için yerleştirilen tüpler
Resim 6: DNA ekstraksiyonu sırasında gerçekleştirilen inkübasyon
38
b.
PCR Deneyleri
Örneklerde 16S rRNA Geni Saptanması
DNA
saflaştırma
işleminin
her
örnek
için
başarıyla
gerçekleştirildiğinin doğrulanması amacıyla üniversal bakteriyel primerler
(Uni152-F ve Uni220-R) ve floresan işaretli TaqMan prob (Uni177T)
kullanılarak gerçek zamanlı florometrik polimeraz zincir reaksiyonu
gerçekleştirildi. Bu amaçla her örnek için 20 µl’lik reaksiyon karışımı, 1x
konsantrasyonunda TaqMan reaksiyon çözeltisi, Uni152-F ve Uni220-R
primerlerinin her birinden 1 µM, UniCC probundan 0,2 µM içerecek şekilde
hazırlandı. Tüplere hasta örneklerinden elde edilen 4 µl DNA çözeltisi
eklendi. Hazırlanan tüpler ABI Prism 7700 gerçek zamanlı florometrik PCR
cihazında, 50 °C sıcaklıkta 2 dakika inkübasyonun ardından 95 °C
sıcaklıkta denatüre edildi. Denatürasyonun ardından 95 °C’de 15 saniye
60 °C’de 1 dakika olarak belirlenen sıcaklıklar 40 döngü uygulandı. Her
döngüde florometrik okumalar 60 °C sıcaklıkta gerçekleştirildi (Şekil 3).
Reaksiyonun sonunda, reaksiyon boyunca elde edilen florometrik
okumalar cihazın yazılımı kullanılarak analiz edildi ve 16S rRNA geni
çoğaltılabilen tüplerde saptandı. Kullanılan primer ve prob dizileri Tablo
10’da gösterilmiştir.
Şekil 3. Gerçek zamanlı florometrik PCR’da kullanılan sıcaklık döngüleri.
Florometrik okumalar Evre II boyunca gerçekleştirilmiştir. X: Tablo 10’da belirtilen
yapışma sıcaklığı.
39
Tablo 10. Çalışmada kullanılan oligonükleotid primerler, problar ve PCR yapışma
sıcaklıkları
Primer adı
Oligonükleotid dizisi
pgprtc-f
5’-cccgaatacgtctatacggtctg-3’
pgprtc-r
5’-tatgaactctccatcataggtgc-3’
pgprtc-p
5’-FAM-aggcttcgatcgcttctttgtagcag-TAMRA-3’
pg-f
5’-cctacgtgtacggacagagctata-3’
pg-r
5’-aggatcgctcagcgtagcatt-3’
Pgs
5’-FAM-tcgcccgggaagaacttgtcttca-TAMRA-3’
Td1394-f
5’-agagcaagctctcccttaccgt-3’
Td1498-r
5’-taagggcggcttgaaataatga-3’
Td1444T
5’-FAM-cagcgttcgttctgagccaggatca-TAMRA-3’
tdmsp-f1
5’-gataagccgtatttaggtatgg-3’
tdmsp-r1
5’-gagatgggtaagtctgaagtc-3’
tdmsp-f2
5’-tgcggaacaggtactaaatatcag-3’
tdmsp-r2
5’-ggctttatccacattgagtcg-3’
Uni152-F
5’-cgctagtaatcgtggatcagaatg-3’
Uni220-R
5’-tgtgacgggcggtgtgta-3’
Uni177T
5’-FAM-cacggtgaatacgttcccgggc-TAMRA-3’
Yapışma
sıcaklığı (°C)
Hedef bölge/
amplikon
uzunluğu
60
16SrDNA/83
60
rgp2 / 70
60
16SrDNA/83
58
msp / 320
58
msp / 454
59
16SrDNA/68
3.4.1. Örneklerde Treponema denticola ve Porphyromonas gingivalis
DNA’sının Saptanması
P. gingivalis ve T. denticolaya özgül (spesifik) bakteriyel primerler
ve TaqMan problar kullanılarak gerçek zamanlı florometrik polimeraz zincir
reaksiyonu (Real-time PCR) gerçekleştirildi. Bu amaçla her örnek için 20
µl’lik reaksiyon karışımı, 1x konsantrasyonunda TaqMan reaksiyon
çözeltisi, T. denticola’ya özgül Td1394-f ve Td1498-r primerlerinin her
birinden 1 µM, Td1444T probundan 0,2 µM; P.gingivalis’e özgül Pg-f ve
pg-r primerlerinin her birinden 1 µM ve PgS probundan 0,2 µM içerecek
şekilde hazırlandı. Tüplere hasta örneklerinden elde edilen DNA
ekstraktından 4 µl eklendi. Hazırlanan reaksiyon tüpleri ABI Prism 7700
gerçek zamanlı florometrik PCR cihazında, 50 °C sıcaklıkta 2 dakika
inkübasyonun ardından 95 °C sıcaklıkta denatüre edildi (Resim 7, Resim
8) Denatürasyonun ardından 95 °C’de 15 saniye 60 °C’de 1 dakika olarak
belirlenen sıcaklıklar 40 döngü uygulandı. Her döngüde florometrik
okumalar 60 °C sıcaklıkta gerçekleştirildi. Reaksiyonun sonunda,
reaksiyon boyunca elde edilen florometrik okumalar cihazın yazılımı
40
kullanılarak analiz edildi ve T. denticola 16S rRNA geni çoğaltılabilen
tüpler saptandı. Kullanılan primer ve prob dizileri Tablo 10’da
gösterilmiştir.
Resim 7. Gerçek zamanlı florometrik PCR cihazına yerleştirilmiş tüplerin
görünümü
41
Resim 8. Gerçek zamanlı florometrik PCR cihazı
3.4.2. Treponema denticola DNA’sının Pozitif Saptandığı Örneklerde
Msp’nin İncelenmesi
Real-time PCR kullanılarak Treponema denticola saptanan
örneklerde Msp varlığı PCR ile araştırıldı. Bu amaçla, bu virülans geninin
1. ve 2. genotipi için özgül tdmsp-f1, tdmsp-r1, tdmsp-f2, tdmsp-r2
primerleri kullanıldı (Tablo 10). Her örnek için 50 µl PCR karışımı 50 mM
KCl, 8.3 pH’ya sahip 10 mM Tris-HCl, 0.001% (w/v)jelatin, 2 mM MgCl2,
200 µM dNTP, 0.6 µM forward ve reverse primer, 0.03 U/µl Taq DNA
polimeraz (Applied Biosystems, A.B.D.) ve yaklaşık 0.5 µg DNA örneği
içerecek şekilde hazırlandı. Msp’ye özgül PCR Pelkin Elmer 9700 termal
döndürücüde gerçekleştirildi (Resim 9). DNA denatürasyonu için reaksiyon
tüpleri 95 ºC’ de 3 dakika inkübe edildi. Ardından 45 döngü boyunca
95ºC’de 15 saniye, 57ºC’de 45 saniye annealing(yapışma) ve 72ºC’de 1
dakika extension(uzama) gerçekleştirildi. Son uzama için tüpler 72 ºC’de 7
dakika inkübe edildi (Şekil 4).
Elde edilen PCR ürünleri %2’lik agaroz jele yüklendi ve 100 V’da 45
dakika elektroforez işlemi uygulandı. Elektroforezi takiben jel 30 dakika 0.5
µg/ml’lik etidyum bromidde boyandı. Ardından 260 nm UV (ultraviyole) ışık
altında transiluminasyon ile görüntülendi ve jel dökümantasyon sistemi
42
(Syngene, USA.) kullanılarak fotoğraflandı (Resim 10) 320 ve 454 baz
çiftlik DNA bandları, Msp’ye özgü PCR için kabul edildi.
Resim 9: Msp DNA’sının araştırılması için kullanılan termal döndürücü
Şekil 4. PCR’da kullanılan sıcaklık döngüleri. X: Tablo 10’da belirtilen yapışma
sıcaklığı.
43
Resim 10: Msp DNA’sının araştırılmasında PCR ürünlerinin UV altında
görüntülemesi
3.4.3. Porphyromonas gingivalis DNA’sının Pozitif Saptandığı Örneklerde
prtC’nin İncelenmesi
P.gingivalisin varlığının Real-time PCR ile belirlenmesinin ardından,
pozitif çıkan örneklerde prtC’nin saptanması amacıyla yine Real-time PCR
kullanıldı. Bu amaçla her örnek için 20 µl’lik reaksiyon karışımı, 1x
konsantrasyonunda TaqMan reaksiyon çözeltisi, prtC (kollajenaz geni)’ye
özgü pgprtc-f ve pgprtc-r primerlerin her birinden 1 µM, pgprtc-p
probundan 0,2 µM içerecek şekilde hazırlandı. Tüplere P. gingivalis için
pozitif çıkan hasta örneklerinden elde edilen 4 µl DNA çözeltisi eklendi.
Hazırlanan tüpler ABI Prism 7700 gerçek zamanlı florometrik PCR
cihazında, 50 °C sıcaklıkta 2 dakika inkübasyonun ardından 95 °C
sıcaklıkta denatüre edildi. Denatürasyonun ardından 95 °C’de 15 saniye
60 °C’de 1 dakika olarak belirlenen sıcaklıklar 40 döngü uygulandı. Her
döngüde florometrik okumalar 60 °C sıcaklıkta gerçekleştirildi.
Reaksiyonun sonunda, reaksiyon boyunca elde edilen florometrik
okumalar cihazın yazılımı kullanılarak analiz edildi ve 16S rRNA geni
çoğaltılabilen tüpler saptandı. Kullanılan primer ve prob dizileri Tablo 10’da
gösterilmiştir.
44
Bu çalışmada kullanılan primer ve prob çiftlerinin şematik
yerleşimleri, Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7, Şekil 8, Şekil 9 ve Şekil 10’da
gösterilmiştir.
Şekil 5. Örneklerde bakteri varlığının saptanmasına yönelik Uni152-F, Uni220-R
primer çifti ile Uni177T 5’ hidroliz probunun Escherichia coli 16S rDNA’sı
üzerindeki yerleşimi. (Gene Bank kayıt numarası AM184252)
Şekil 6. Örneklerde Treponema denticola DNA’sının saptanmasına yönelik Td1394f, Td1498-r primer çifti ve Td1444T probunun yerleşimi (T. denticola 16S rDNA Gene
Bank kayıt numarası TRPRR16SA)
45
Şekil 7. Örneklerde Porphyromonas gingivalis DNA’sının saptanmasına yönelik Pgf, Pg-r primer çifti ve Pgs 5’ hidroliz probunun yerleşimi. (P. gingivalis prtC, Gene
Bank kayıt numarası PGU85038)
46
Şekil 8. Treponema denticola pozitif örneklerde msp genotip 1’in saptanmasına
yönelik tdmsp-f1 ve tdmsp-r1 primer çiftinin yerleşimi (msp Gene Bank kayıt
numarası TDU66255)
47
Şekil 9. Treponema denticola pozitif örneklerde msp genotip 2’nin saptanmasına
yönelik tdmsp-f2 ve tdmsp-r2 primer çiftinin yerleşimi (Msp Gene Bank kayıt
numarası TDU66256)
48
Şekil 10. Porphyromonas gingivalis pozitif örneklerde prtC varlığının saptanmasına
yönelik pgprtc-f, pgprtc-r primerlerinin ve pgprtc-p 5’ hidroliz probunun prtC’deki
yerleşimleri (Porphyromonas gingivalis Gene Bank kayıt numarası AY633706)
Verilerin analizinde SPSS 13.0 (SPSS Inc., USA) programı
kullanıldı. Klinik patolojiler ile bakteri ve virülans genlerinin varlığı
arasındaki ilişki Ki-kare testi kullanılarak değerlendirildi. Ki-kare p
değerinin 0.05’ten küçük bulunması istatistiksel olarak önemli kabul edildi.
49
4. BULGULAR
Real-time PCR ile incelenen toplam 60 adet örneğin tümünde
bakteri DNA’sı tespit edildi. Böylece kullanılan DNA ekstraksiyonu metodu
doğrulandı ve PCR’ın kan, tükrük, vb. materyallerle inhibe olmadığı ve
doğru olarak yürütüldüğü kesinleştirildi.
Çalışmamızda klinik tanısı belirlenen vakalardan elde edilen toplam
60 adet örneğin 26’sı Akut Apikal Periodontitis, 7’si Akut Apikal Abse, 27’si
ise Kronik Apikal Periodontitis grubuna dahil edildi.
Klinik bulgulara dayanarak tanı konulan gruplar ve gruplardaki
örnek sayıları Tablo 11’de gösterilmiştir.
Tablo 11. Klinik bulgularına göre tanı konulan gruplardaki örnek sayıları
Klinik Tanı
Akut apikal periodontitis
Prevalans (%)
26 (43,30)
Akut apikal apse
7 (11,70)
Kronik apikal periodontitis
27 (45,00)
Toplam
60 (100,00)
Real-time PCR’la incelenen 60 örneğin 25’inde (% 44.1) T.
denticola DNA’sı saptandı. Akut Apikal Periodontitis grubundaki toplam 26
vakanın 12’inde, Akut Apikal Abse grubundaki 7 vakanın 1’inde ve Kronik
Apikal Abse grubundaki 27 örneğin 12’sinde T. denticola saptandı. Bu
patolojik durumlarla T. denticolanın varlığı arasında istatistiksel olarak
anlamlı bir ilişki bulunmadı. (p = 0.29) (Tablo 12)
50
Tablo 12. Çalışmaya alınan hastaların kök kanal örneklerinde T. denticola DNA’sı
varlığının klinik tanı tiplerine göre dağılımı.
T. denticola PCR
Patoloji
Negatif (%)
Pozitif (%)
AAP
14 (23,33)
12 (20,00)
Toplam (%)
26 (43,33)
AAA
6 (10,00)
1 (1,67)
7 (11,67)
KAP
15 (25,00)
12 (20,00)
27 (45,00)
35 (58,33)
25 (41,67)
60 (100,00)
Toplam
p = 0,29
Real-time PCR ile incelenen 60 örneğin 10’unda (16.67) P.
gingivalis DNA’sı saptandı. Akut Apikal Periodontitis grubundaki 26
vakanın 3’ünde, Akut Apikal Abse grubundaki 7 vakanın 2’inde, Kronik
Apikal Periodontitis grubundaki 27 vakanın 5’inde P. gingivalis DNA’sı
olduğu belirlendi. Bu üç patolojik durum ile P.gingivalisin varlığı arasındaki
ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p = 0.53) (Tablo 13).
Tablo 13. Çalışmaya alınan hastaların kök kanal örneklerinde P.gingivalis DNA’sı
varlığının klinik tanı tiplerine göre dağılımı.
P. gingivalis PCR
Patoloji
Negatif (%)
Pozitif (%)
Toplam(%)
AAP
23 (38,33)
3 (5,00)
26 (43,33)
AAA
5 (8,33)
2 (3,34)
7 (11,67)
KAP
22 (36,67)
5 (8,33)
27 (45,00)
Toplam
50 (83,33)
10 (16,67)
60(100,00)
p = 0,53
P.gingivalis DNA’sına sahip olan toplam 10 adet örneğin 9’ unda
prtC (kollajenaz geni) saptandı. prtC DNA’sı, Akut Apikal Periodontitis
grubundaki toplam 3 vakanın tamamında, Akut Apikal Abse grubundaki
toplam 2 vakanın 1’ inde, Kronik Apikal Periodontitis grubundaki toplam 5
vakanın tamamında tespit edildi. prtC varlığı ile herhangi bir klinik patolojik
51
durum arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı değildir (p = 0.17) (Tablo
14).
Tablo 14. Çalışmaya alınan hastaların kök kanal örneklerinde prtC DNA’sı varlığının
klinik tanı tiplerine göre dağılımı.
prtC PCR
Patoloji
Negatif (%)
Pozitif (%)
AAP
0 (0,00)
3 (30,00)
Toplam (%)
3 (30,00)
AAA
1 (10,00)
1 (10,00)
2 (20,00)
KAP
0 (0,00)
5 (50,00)
5 (50,00)
Toplam
1 (10,00)
9 (90,00)
10 (100,00)
p = 0,17
T. denticola DNA’sına sahip olan toplam 25 adet örneğin 7’sinde
msp geni saptandı. msp DNA’sı, Akut Apikal Periodontitis grubundaki
toplam 12 vakanın 4’ünde, Akut Apikal Abse grubundaki toplam 1 vakanın
1’inde, Kronik Apikal Periodontitis grubundaki toplam 12 vakanın 2’sinde
tespit edildi. msp varlığı ile herhangi bir klinik patolojik durum arasındaki
ilişki istatistiksel olarak anlamlı değildir (p = 0.17) (Tablo 15).
Tablo 15. Çalışmaya alınan hastaların kök kanal örneklerinde msp DNA’sı varlığının
klinik tanı tiplerine göre dağılımı.
msp PCR
Patoloji
Negatif (%)
Pozitif (%)
AAP
8 (32,00)
4 (16,00)
Toplam (%)
12 (48,00)
AAA
0 (0,00)
1 (4,00)
1 (4,00)
KAP
10 (40,00)
2 (8,00)
12 (48,00)
Toplam
18 (72,00)
7 (28,00)
25 (100,00)
p = 0,17
52
T.denticola/P.gingivalisin birlikte saptandığı örnek sayısı Akut Apikal
Periodontitis grubunda 2, Akut Apikal Abse grubunda 1, Kronik Apikal
Periodontitis grubunda ise 2’dir. T.denticola ve P.gingivalisin birarada
bulunduğu örnekler ile belirli bir klinik patoloji arasındaki ilişki istatistiksel
olarak anlamlı değidir. İki bakteri türünün birlikte saptandığı örnek sayıları,
yüzdeleriyle birlikte Tablo 16’da gösterilmiştir.
Tablo 16. T.denticola/P.gingivalis DNA’sının birlikte saptandığı örnekler
T.denticola/P.gingivalis PCR
Patoloji
Negatif (%)
Pozitif (%)
AAP
24 (40,00)
2 (3,33)
Toplam (%)
26 (43,33)
AAA
6 (10,00)
1 (1,67)
7 (11,67)
KAP
25 (41,67)
2 (3,33)
27 (45,00)
Toplam
55 (91,67)
5 (8,33)
60 (100,00)
p = 0,832
Real-time PCR sırasında hedef bölgelerin çoğaltılması, floresans
ölçümleri, florometrik okumalar ile ilgili kayıtlar; Msp’nin her iki genotipinin
aminoasit dizileri ve agar jeldeki görüntüsü Şekil 11,12,13,14,15 ve 16’da
gösterilmiştir.
53
Şekil 11. Gerçek zamanlı florometrik PCR sonunda cihaza B2 – G9 pozisyonlarına
yerleştirilen tüplerden okunan son floresans değerlerinin gösterilmesi.
Şekil 12. ABI Prism 7700 gerçek zamanlı florometrik PCR cihazında gerçekleştirilen
çoğaltma sırasında çeşitli dalga boylarında kaydedilen floresans ölçümleri ve
sıcaklık döngüsü. Grafikte x ekseni zaman içinde yapılan floresans ölçümlerini,
üstteki y ekseni floresans birimlerini, alttaki y ekseni ise termal bloktan ölçülen
sıcaklık değerlerini göstermektedir.
54
Şekil 13. ABI Prism 7700 gerçek zamanlı florometrik PCR cihazında gerçekleştirilen
Treponema denticola ve Porphyromonas gingivalis hedef bölgelerinin çoğaltılması.
Grafiğin x ekseni PCR’nin döngülerini, y ekseni ise birim floresansın logaritmasını
göstermektedir. Tepkimenin 40 döngüsü boyunca geometrik çoğalma eğrisi
gösteren 1, 2 ve 3 no’lu tüpler pozitif olarak değerlendirilmiştir. Eşik floresans
değerinin altında kalan 4, 5 ve 6 no’lu örnekler negatif olarak değerlendirilmiştir.
55
Şekil 14. Treponema denticola Msp genotip 1 ve 2’nin amino asit dizilerinin
karşılaştırılması.
56
Şekil 15. Treponema denticola pozitif bulunan örneklerden tdmsp-f1 ve tdmsp-r1
primer çifti ile elde edilen Msp genotip 1’e ait 320 baz uzunluğundaki PCR ürünleri.
(S: 100 baz merdiven DNA moleküler ağırlık standardı; NK: PCR negatif kontrol)
57
Şekil 16. Treponema denticola pozitif bulunan örneklerden tdmsp-f2 ve tdmsp-r2
primer çifti ile elde edilen Msp genotip 2’ye ait 454 baz uzunluğundaki PCR
ürünleri. (S: 100 baz merdiven DNA moleküler ağırlık standardı; NK: PCR negatif
kontrol)
58
5. TARTIŞMA
Kök kanalında var olan gram negatif anaerob mikroorganizmaların
periapikal enfeksiyonun oluşması ve ilerlemesindeki rolü bir çok
araştırmacı tarafından belirtilmiştir3,4,17,21,56,62,63,86,95,128,129. Özellikle ‘kırmızı
kompleks’ olarak bilinen bakteriler aralarındaki sinerji ve içerdikleri bir çok
virülans faktörleri nedeniyle akut ve kronik apikal periodontitisin
oluşmasında başrol oynamaktadır.
Ancak bu mikroorganizmaların geleneksel kültür yöntemleri ile
üretilmeleri çok zor, hatta çoğu zaman imkansız olmaktadır. Bu nedenle
moleküler
mikrobiyolojik
tekniklerin
endodontide
kullanılmaya
başlanmasından önce, bu mikroorganizmalarla kök kanalında ya hiç
karşılaşılmamakta ya da çok düşük prevalanslarda karşılaşılmaktaydı130.
Moleküler mikrobiyolojik tekniklerdeki ilerleme ile zorunlu anaerobik gram
negatif mikroorganizmaların kök kanallarında hiç de azımsanamayacak
prevalanslarda oldukları ortaya çıkmış ve periapikal hasarın
ilerlemesindeki önemleri daha iyi anlaşılmıştır21.
Treponema denticola ve Porphyromonas gingivalis ‘kırmızı
kompleks’in iki önemli üyesi olup kültür tekniğiyle çok zor üretilebilen
mikroorganizmalardır. Bu mikroorganizmalar moleküler mikrobiyolojik
yöntemlerin gelişiminden önce yalnızca periodontal patojenler olarak
bilinmekteydi. Özellikle PCR gibi duyarlılık ve özgüllüğü son derece
yüksek olan tekniklerin kliniklere girmesiyle, bu mikroorganizmaların kök
kanallarının da predominant patojenlerinden olduğu ve periradiküler
hasarla yakın ilişkide bulunduğu ortaya çıkarılmıştır21,56,117.
Ayrıca bazı çalışmalarda bu iki mikroorganizmanın birbiri ile
sinerjizm gösterdiği bildirilmiştir106. Bakteri türleri arasındaki bu sinerji
bakterilerin yaşama şansları ile konak dokuda yarattıkları zararlı etkileri
arttırarak periradiküler hasarın patogenezinde önemli rol oynamaktadır56.
Örneğin Grenier107, P. gingivalis ve T. denticola’yı aynı karışıma inoküle
ettiklerinde her iki bakteri türü tarafından üretilen büyüme faktörlerine bağlı
olarak aralarındaki ilişkinin arttığını gözlemlemişlerdir. Buna karşın bazı
çalışmalar bu iki bakteri türü arasındaki sinerjiyi göstermekte başarısız
olmuştur56.
Mikroorganizmaların mikrobiyal DNA’larını saptayan yöntemler,
klinik ve araştırma laboratuvarlarına girmiştir. Bu yöntemler enfeksiyöz
hastalıklar hakkındaki bilgide önemli ölçüde artışa neden olmakta ve çoğu
hastalığın etkili ve hızlı tanısına olanak sağlamaktadır131,132. Moleküler
mikrobiyolojik teknikler arasında en fazla duyarlılık ve özgüllüğü PCR
59
yöntemi göstermektedir. Örneğin DNA hibridizasyon yöntemi PCR ile
karşılaştırıldığında örnek başına 10³ hücre saptayabilirken, PCR tek bir
hücreyi bile saptayabilecek duyarlılığa sahiptir24.
Mikroorganizmaların tanımlanması için özellikle belirli gen
bölgelerini taklit eden sentetik oligonükleotid primerlerin kullanıldığı PCR
oral mikrobiyolojide çığır açmıştır. Anaerobik bakterilerin tanımlanması,
geleneksel kültür yöntemleri kullanıldığında 7-14 gün gerektirirken, PCR
ile yalnızca birkaç saatte başarılabilmektedir7. Hatta bu yöntemin
ilerlemesi ile ‘altın standart’ özelliğinde olan kültür yöntemlerinin güncelliği
ve etkinliği sorgulanmaya başlanmıştır.
Kültür yöntemleri gibi fenotip tabanlı tanımlama yöntemlerinin insan
patojenleri hakkında verdiği değerli bilgiye karşı çıkmak mümkün
değildir12,133.
Ancak
enfeksiyöz
ajanların
tanımlanması
ve
karakterizasyonu için genotipik özelliklerin daha güvenilir bilgi sağladığının
göz önünde bulundurulması gerekir133. Ayrıca genotipik özellikler,
mikroorganizmaların izolasyonu ve üretilmelerine gerek duyulmadan klinik
örneklerden direkt elde edilebilmektedir134-138. Moleküler biyolojik
çalışmalar, endodontik enfeksiyonlardaki baskın anaerobik bakterilerin
prevalanslarının belirlenmesinde kültüre dayalı yaklaşımların tartışmalı
olduğunu ortaya çıkarmıştır12. Kültür yöntemiyle yıllarca negatif sonuç
alınan enfekte kök kanal örneklerinden genotipe dayalı yaklaşımlar
kullanılarak pozitif sonuçlar alınmıştır. Bu da fenotipe dayalı yaklaşımların
doğal sınırlarını yansıtmaktadır. PCR gibi moleküler tanımlamalar,
anaerobik kültürden kaynaklanan birçok zorluğun üstesinden gelerek
daha önce kök kanallarında çok az sıklıkla saptanan veya hiç
saptanmamış olan bir çok patojen mikroorganizmanın hiç de
azımsanmayacak prevalanslarda olduklarını göstermiştir8,10,48,49,57,99,139,140.
PCR, mikroorganizmaları tanımlamak için onları saf kültürde izole etme
gereği duymadan, klinik örneklerin direkt olarak araştırılmasına olanak
vermektedir. Bu da kültür tekniği ile çok zor üretilen veya hiç üretilemeyen
bir çok anaerobik bakterinin belirlenmesinde önemli yararlar
sağlamaktadır22,24.
Bu çalışmada tüm bu avantajlarından dolayı T.denticola ve
P.gingivalisin araştırılmasında PCR yöntemi tercih edilmiştir. PCR
yönteminin uygulanma tekniğindeki farklılıklar nedeniyle çeşitli
varyasyonları bulunmaktadır. Bizim çalışmamızda, diğer PCR tekniklerine
göre daha duyarlı, özgül ve hızlı ölçüm yapabildiği düşünülen “Real-time
PCR” kullanılmıştır23,141. Konu ile ilgili literatür gözden geçirildiğinde, Realtime PCR’ın yalnızca bir çalışmada P. gingivalis’i saptamak amacıyla
kullanıldığı görülmüştür, ancak bu çalışmada örnekler periodontal cepten
alınmıştır142. Bu nedenle bu çalışmadan farklılık göstermektedir. Enfekte
60
kök kanallarının mikrobiyolojik açıdan değerlendirilmesinde kullanılan
diğer çalışmalarda ise, nPCR, 16S rDNA esas alınarak yapılan PCR veya
yine yüksek duyarlılığa sahip multipleks PCR ve QRT-PCR
kullanılmıştır8,21,23,48,49,99.
P. gingivalis ve T. denticola’nın enfekte kök kanallarındaki
prevalanslarını saptamak için şimdiye kadar yapılan çalışmaların
bazılarında kültür, bazılarında PCR yöntemi kullanılmıştır.
Günümüze kadar yapılmış bazı kültür çalışmalarında P.gingivalis,
endodontik enfeksiyonlarda, düşük oranlarda saptanabilmiştir63,128,143,144.
Gomes ve arkadaşları58, 50 nekrotik dişten aldıkları örneklerde,
P.gingivalis ve bundan başka üç gram negatif bakterinin varlığını hem
kültür hem de PCR kullanarak araştırmışlardır. P.gingivalis’in insidansı
kültür yöntemiyle %1 oranında saptanırken, PCR ile bu oran %38 olarak
belirlenmiştir. Aradaki bu fark PCR’ın kültür yöntemine göre
mikroorganizmaları tanımlamada daha yüksek duyarlılığa sahip olduğunu
doğrulamaktadır. PCR analizleri sonucunda ortaya çıkan bu daha yüksek
prevalansların nedeni kültür işlemleri sırasında üretilmesi zor olan
bakterilerin olası kaybı olabilir.
T. denticola’nın akut klinik semptomlarla istatistiksel olarak anlamlı
ilişkisi bulunmuştur. Bizim çalışmamızın örnek alma prosedürleri, örnek
sayısı ve bakterilerin saptanma prevalans yüzdesi bu çalışma ile benzerlik
göstermektedir. Ancak bizim çalışmamızda ne T.denticola’nın, ne de
P.gingivalis’in her üç patolojik klinik durumla (Akut Apikal Periodontitis,
Akut Apikal Abse, Kronik Apikal Periodontitis) istatistiksel anlamlı ilişkisi
tespit edilememiştir.
Jacinto ve arkadaşları60, karışık endodontik enfeksiyonlarda
P.gingivalis’in insidansını ve antimikrobiyal duyarlılığını kültür yöntemiyle
incelemişler, P.gingivalis’e 70 abseli dişin 20’sinde rastlamışlardır. Bizim
çalışmamızda P.gingivalis, PCR kullanılarak Akut Apikal Abse grubundaki
dişlerin %28’inde saptanmıştır. Bu çalışmada kullanılan teknik bizim
çalışmamızdakinden farklı olsa da, her iki çalışmanın sonuçları benzerlik
göstermektedir. Bu çalışmada kültür yönteminin kullanılmasının bir nedeni,
PCR yönteminin eksik kaldığı bir konu olan antimikrobiyal duyarlılığın
incelenmesi olabilir.
P.gingivalis ve Treponema denticola’nın içinde bulunduğu 10 adet
bakteriyel patojenin incelendiği bir PCR çalışmasında, bu bakteriler kök
kanalında yüksek prevalansta saptanmış, ancak herhangi bir belirgin klinik
semptom ile ilişkisi bulunamamıştır6. Oysa ki bu bakterilerin akut
semptomlarla ilişkisi daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir3,106. Bizim
61
çalışmamızda kullanılan teknik Real-time PCR olmakla birlikte bakterilerin
saptanma oranları ve semptomlarla ilişkileri açısından bulgular, bu
çalışmanınkilerle benzerlik göstermektedir.
Gomes ve arkadaşları145, enfekte kök kanallarını kültür yöntemi
kullanarak mikrobiyolojik olarak incelemişlerdir. Çok çeşitli mikroorganizma
türleri arasındaki kommensal ilişkileri saptamışlar ve bu türlerin
semptomlarla olan ilişkilerini incelemişlerdir. Bu çalışmada P.gingivalise
%6.7 oranında rastlanmıştır ve bu bakteri pürülan eksuda, şişme, ıslak
kanal ve ağrı hikayesi semptomları ile ilişkili bulunmuştur. Bizim
çalışmamızda Akut Apikal Abse grubundaki dişler, pürülan eksuda, ağrı ve
şişme ile karakterizedir. Ancak bu semptomlar ile P. gingivalisin varlığı
arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. Ayrıca P.
gingivalisin %16.7 oranında saptanmış olması, PCR’ın kültür yöntemine
göre daha hassas olduğu sonucunu bir kez daha ortaya koymaktadır.
Polimeraz zincir reaksiyonu ile incelenen örneklerde kültür
yöntemine göre daha yüksek saptanan prevalansların bir nedeni de
PCR’ın mikroorganizmaları tanımlamak için onların canlılıklarına ihtiyaç
duymayışı olabilir. Bir başka deyişle PCR ile bir mikroorganizmanın
yaşamını sürdürüp sürdürmediği anlaşılamamakta dolayısıyla hastalıkların
antimikrobiyal tedavilere verdikleri yanıtlar değerlendirilememektedir. Bu,
PCR’ın eksik kaldığı bir konu olarak düşünülebilir.
Enfekte kanalların apikal üçlüsündeki mikroorganizmaların PCR ile
araştırıldığı bir çalışmada T. denticola’ya %26, P. gingivalis’e de %4
oranında rastlanmıştır12. Bu çalışmada alınan örnekler, çekilmiş dişlerden
ve yalnızca apikal üçlü bölgesinden elde edilmiştir. Dolayısıyla bizim
çalışmamızda olduğu gibi tüm kök kanalında var olan bakteri popülasyonu
değerlendirilmemiştir. Saptanan bakteriyel prevalanslar, kullanılan yöntem
benzer olmasına karşın, bizim çalışmamızdakine göre oldukça düşüktür.
Kapalı periapikal lezyonlardaki siyah pigmentli anaerob rodların
(P.endodontalis, P.gingivalis, Prevotella intermedia ve Prevotella
nigrescens) PCR yöntemi ile araştırıldığı bir çalışmada, P.gingivalis, 20
kapalı periapikal lezyonun yalnızca birinde saptanabilmiştir57. Siyah
pigmentli mikroorganizmaların tedavi görmemiş nekrotik kök kanallarından
ve akut periapikal lezyonlardan sıklıkla izole edilmesine karşın, yıkıcı
endodontik harabiyetle ilişkili kapalı periapikal lezyonlarda bu
mikroorganizmalara çok az rastlanmaktadır9,146,147,148. Bu sonuç, kapalı
periapikal lezyonların göreceli stabil ve kronik doğasıyla açıklanabilir.
Anaerobik bakterilerin endodontik tedaviden sonra yaşayamaması da
kapalı periapikal lezyonlarda daha az rastlanmalarına neden olabilir.
Ayrıca bu çalışmada örnekler, periapikal bölgeye yapılan insizyonla
62
periapikal lezyonlardan direkt olarak elde edilmiştir. Bu örnekleme
prosedürü bizim çalışmamızda ve diğer çalışmalarda kullanılandan
farklıdır. Bizim çalışmamızda, örnekler primer endodontik enfeksiyonlarla
ilişkili enfekte kök kanallarından herhangi bir cerrahi girişim yapılmadan
alınmıştır. Bu nedenle sonuçlarımız direkt olarak bu çalışmanınkilerle
karşılaştırılamaz.
Siqueira ve arkadaşları11, endodontik kaynaklı abselerde farklı
Treponema türlerinin varlığını araştırmışlar ve T.denticola’ya %79
oranında rastlamışlardır. Bu çalışma ayrıca T. pectinovorum, T.
amylovorum ve T. medium’un enfekte kök kanallarındaki varlığını ilk kez
nPCR kullanarak saptamıştır. Bu çalışmada bizimkinden farklı olarak
nested PCR kullanılmışır. Bizim deneyimizde PCR yöntemleri arasında en
fazla hassasiyete sahip olduğu ileri sürülen Real-Time PCR yöntemi
kullanılmıştır ve T.denticola nispeten daha düşük bir prevalansta (% 44.1)
saptanmıştır. Prevalanslar arasında saptanan bu fark, kullanılan PCR
yönteminin tipine, vaka seçimine ve örnek alma işlemindeki farklılıklara
bağlanabilir.
Siqueira ve arkadaşları99, 54 vakada T.denticolanın varlığını
araştırmışlar ve bizim çalışmamızda olduğu gibi vakaları asemptomatik,
semptomatik vakalar ve akut periradiküler abseler olmak üzere 3 gruba
ayırmışlardır. Çalışmalarında 16S rDNA bazlı PCR kullanarak
asemptomatik vakalarda % 34.5, akut vakalarda % 53.3, akut periradiküler
abselerde ise % 50 oranında bu mikroorganizmayı saptamışlardır. Akut ve
asemptomatik vakalardaki prevalanslar, bizim çalışmamızın yine aynı
vakalardaki prevalansları ile benzerlik göstermektedir. Belirli işaret ve
semptomlarla bakteri varlığı arasında pozitif ilişkinin saptanmadığı
çalışmanın bulguları, bu açıdan da bizim çalışmamızın bulgularını
desteklemektedir.
Siqueira ve arkadaşları117, yaptıkları bir başka çalışmada
T.denticola’yı, çürüklü, nekrotik pulpalı ve periradiküler kemik kaybına dair
radyografik bulgu veren 21 vakada % 52.4 oranında saptamışlardır. Bu
çalışmada bakterinin semptomlarla ilişkisine bakılmamıştır. Kullanılan
PCR yöntemi farklı olsa da, sonuçlar bizim çalışmamızdakilerle benzerlik
göstermektedir.
Roças ve arkadaşları56, kırmızı kompleksin kök kanallarındaki
prevalanslarını 16S rDNA’yı esas alan PCR kullanarak incelemişlerdir. Bu
çalışmada T.denticola % 44, P.gingivalis % 30 oranında saptanmıştır ve
belirli klinik semptomlarla bu bakteri türleri arasında bir ilişki
bulunamamıştır. Ayrıca bu bakteri türlerinin birarada bulunduğu örnek
sayısını da inceleyerek T.denticola ile P.gingivalis arasında herhangi bir
63
pozitif ilişkiye, yani sinerjiye rastlamamışlardır. Bizim çalışmamızın
prevalans bulguları ile bu çalışmanınkiler benzerlik göstermektedir. Ayrıca
iki bakteri arasında sinerjinin saptanamamış olması da bizim çalışmamızın
sonuçlarını desteklemekte, ancak Socransky ve arkadaşlarının55
periodontal hasarlı dişlerle yaptıkları çalışma bulgularıyla uyumsuzluk
göstermektedir. Bu fark, kök kanal sistemi ile periodontal cep arasındaki
mikroçevresel koşul farklarından kaynaklanıyor olabilir. Ayrıca,
kompleksteki her bakteri türünün sayısı doku cevabının şiddetini
değiştirebilmektedir.
Literatür gözden geçirildiğinde bu çalışmanın, kök kanallarında
T.denticola ve P.gingivalis’in Real time-PCR kullanılarak saptandığı ilk
çalışma olduğu sonucuna varılmıştır. Ancak Kawada ve arkadaşlarının142
yaptıkları bir çalışmada, P.gingivalisin periodontal hasarlı dişlerin dişeti
ceplerinden alınan örneklerdeki varlığını Real time-PCR kullanarak
araştırmışlardır. Bu bakterilerin prevalansları ile periodontal hasarın
derecesi arasındaki ilişki incelenmiş ve tedavi öncesi ve sonrası bakteri
yükü hesaplanmıştır. Bu çalışma, kullanılan test yöntemi ve hedef bakteri
türü açısından bizim çalışmamız ile benzerlik göstermektedir. Ancak
hastalık türü ve örnek alınan bölge farklıdır. Real-time PCR, tedavi öncesi
ve sonrası bakteri yükünün hızlı ve hassas bir şekilde hesaplanmasına
olanak vererek, endodontik ve periodontal tedavilerin hangi ölçüde bakteri
eliminasyonunu sağladığını gösteren önemli bir ölçüm yöntemidir.
Enfekte kök kanallarının PCR kullanılarak mikrobiyolojik yönden
incelendiği çalışmalarda, bakteri prevalansları arasındaki bu farklar,
kullanılan PCR tekniği, DNA ekstraksiyonu ve örnek alma prosedüründeki
farklılıklardan kaynaklanabileceği gibi; çalışılan popülasyonların ırksal ve
coğrafi varyasyonları ile örnekleme işlemi sırasında meydana gelebilecek
olası kontaminasyona da bağlanabilir149,150,151. Herhangi bir patolojik
durum ya da klinik semptom ile belirli bakterilerin varlığı arasındaki
istatistiksel ilişkinin bazı çalışmalarda saptanıp bazı çalışmalarda
saptanamamış olması; vaka seçimine, endikasyon koyarken göz önüne
alınan kriterlere ve gruplardaki örnek sayısına bağlanabilir.
‘Kırmızı kompleks’in önemli iki üyesi olan T.denticola / P.gingivalis
pek çok virülans faktörüne sahiptir. Bu genler, bu iki endodontik patojenin
konağa zarar verme mekanizmasındaki başlıca etkenlerdir. Bu virülans
faktörleri arasından bizim açımızdan önemli sayılan iki tanesi
çalışmamızda incelenmiştir.
P.gingivalisin kollajenaz geninin çok yıkıcı bir enzim olduğu ve
periapikal
bölgedeki
kemik
kaybından
sorumlu
olabileceği
20,79,81,95
düşünülmektedir
. Ancak bu mikroorganizma türünün hepsinde bu
64
genin bulunup bulunmadığı bilinmemektedir ve tarafımızdan araştırılmıştır.
T.denticola’nın msp yüzey geninin onu daha potansiyel bir endodontik
patojen haline getirdiği düşünülmektedir111,114,152,153. Bu çalışmada her iki
virülans faktörünün varlığı ve insidansı pozitif çıkan örneklerde Real-Time
PCR kullanılarak incelenmiştir.
Ana yüzey proteini (msp), ısı ile modifiye edilebilen, proteaza
dirençli, yüksek ağırlıkta immünojenik bir protein kompleksidir154. Bu
protein T.denticola’nın dış yüzeyinde organize olmuştur, dış kılıfın ana
protein bileşenidir ve yüksek miktarlarda salgılanmaktadır. Ana yüzey
proteininin en önemli özelliği bakterinin konak hücrelerine ve doku
proteinlerine adezyonunda rol oynaması ve P. gingivalis ile T.
denticola’nın biyofilm oluşturmasına katkıda bulunmasıdır111,152. Yakın
zamana kadar T.denticola’nın DNA dizilerinden sadece tdpA antijen reaktif
bulunmuştur155. Ancak günümüzde bunun tam tersine tdpA, T.denticolada
düşük seviyelerde eksprese edilirken, msp proteininin daha yüksek
seviyelerde tespit edildiği bildirilmiştir155.
Daha önceki çalışmalarda, msp’nin yalnızca T. denticola’nın adezini
olarak görev yaptığı bildirilmiştir111,153. Ancak P. gingivalis’le biyofilm
oluşumunda bu dış membran proteinin önemli rolünü de gözardı etmemek
ve ileriki çalışmalarda incelemek gerekir. Benzer şekile, prolil-fenilalanine
özgü serin proteaz, (dentisilin-kemotripsin benzer proteaz olarak da bilinir)
T. denticola’nın ürettiği başlıca ekstraselüler (hücre dışı) proteazdır153.
prtP ise dentisilini kodlayan gendir ve Ishihara ve arkadaşları156 tarafından
1996 yılında izole edilmiştir. Dentisilin epitelyal hücrelerin adezyonunda ve
msp proteininin organizasyonunda etkili olmaktadır156.
Ana yüzey proteini, T.denticola’nın P.gingivalis ile biyofilm
oluşturmasında önemli rol oynadığı için msp mutantları, in vitroda biyofilm
oluşturmada
yetersiz
kalmaktadır.
Ayrıca
dentisilin,
msp’nin
organizasyonundan sorumlu olduğu için, prtP mutant T.denticola’lar da
biyofilm oluşturmakta yetersiz kalmaktadır. Daha önceki çalışmalarda,
msp’nin biyofilm oluşturma, T.denticola’nın ekstrasellüler matrikse
bağlanmasını düzenleme, T.denticola’nın hareketsiz laminin ve
fibronektine bağlanma kapasitesini arttırma özellikleri incelenmiştir111,157.
Bizim çalışmamızda T.denticola DNA’sının pozitif saptandığı
örneklerde msp geninin varlığına bakılmıştır. Toplam 25 adet pozitif
örnekte, msp’nin aminoasit dizisindeki farklılıklar nedeniyle, her iki
genotipinin varlığı PCR yöntemi kullanılarak incelenmiştir. Literatür gözden
geçirildiğinde PCR ile msp geninin prevalansının daha önceden
incelenmediği görülmüş olup; bu çalışma bu konudaki ilk çalışma olma
özelliğini taşımaktadır.
65
Çalışmamızda T.denticola pozitif çıkan örneklerin ancak %28’inde
msp’nin saptanmış olması, bu genin her T.denticola zincirinde
bulunmadığı sonucunu ortaya çıkarmaktadır. Bu da, msp’nin
T.denticola’nın adezyonunda ve diğer olası patojenik etkilerinde tek başına
etkili olmadığı düşüncesini akla getirmektedir. Ana yüzey proteininin pozitif
olduğu örneklerle negatif olduğu örnekler arasında endodontik harabiyet
açısından da bir fark yoktur. Ayrıca msp’nin varlığı ile belirli bir klinik
patolojik durum (akut apikal abse, akut apikal periodontitis, kronik apikla
periodontitis gibi) arasındaki ilişki değerlendirildiğinde istatistiksel olarak
anlamlı bir fark çıkmamıştır. Yani msp’nin varlığı ile bazı klinik durumlara
özgü belirgin klinik semptomlar (ağrı, şişme, perküsyon, vs.) arasında
anlamlı bir ilişki yoktur. Sonuçta msp, T.denticolanın patojenitesinde sınırlı
bir etkiye sahip olabilir ve bakterinin patojenitesi diğer olası virülans
faktörleri ile birlikte değerlendirilip incelenmelidir.
Kollajen, insan ve hayvanlardaki gingival dokunun başlıca
bileşenidir158. Periapikal ve periodontal hasarın önemli bir özelliği gingival
kollajen lif yoğunluğundaki azalmadır158.
Takahashi ve arkadaşları159, P.gingivalis’in prtC geninin
ekspresyonu ve klonlamasını ilk kez bildiren araştırmacılardır. Kato ve
arkadaşları82, prtC’nin nükleotid dizisini saptamışlar ve amino asit dizisinin
37.8 kDA proteine eşit olduğunu bildirmişlerdir. Bu çalışmada prtC geni,
ökaryotik kollajenazlarla yapısal benzerlik göstermese de çözünmüş ve
tekrar oluşmuş tip I kollajeni, ısı ile denatüre olmuş (bozulmuş) tipI
kollajeni ve azokolü parçalayabilmiştir. Ancak sentetik kollajenazı
parçalayamamıştır82.
Bazı siyah pigmentli gram negatif mikroorganizmaların nötr proteaz
ürettikleri bildirilmiştir79,80. Ancak hangi bakteriyel proteazların nasıl bir
moleküler mekanizma ile doku hasarı oluşturdukları açık değildir. Bu
virülans faktörleri, konak dokuda direkt olarak harabiyet oluşturdukları gibi,
konak dokuları arasında bulunan kollajenazları (konak dokunun enzimleri)
aktive ederek de periapikal ve periodontal zarar meydana getirebilir79,80.
Bizim çalışmamızda P.gingivalis DNA’sının pozitif saptandığı
örneklerde prtC’nin varlığı ve prevalansı Real-time PCR kullanılarak
incelenmiştir. Kollajenaz geni, yalnızca bir örnek hariç, tüm P.gingivalis
pozitif örneklerde saptanmıştır.
Literatürde yer alan çok sınırlı sayıda çalışmada, endodontik
enfeksiyonlardan elde edilen P.gingivalis’lerin prtC geni açısından
taraması, PCR kullanılarak yapılmıştır. Odell ve arkadaşları81, endodontik
enfeksiyonlardan izole ettikleri tüm P.gingivalis izolatlarında prtC’yi
66
saptamışlardır. Slots ve arkadaşları83, endodontik izolatları prtC primerleri
kullanarak incelemişler ve tüm P.gingivalis izolatlarının prtC’ye sahip
olduklarını bildirmişlerdir. Kullanılan PCR yöntemi farklı olsa da bu
bulgular bizim çalışmamızın sonuçlarını desteklemektedir.
Bodinka ve arkadaşları84, prtC’yi, 21 P. gingivalis izolatının ancak
16’sında saptayabilmişlerdir. Bu bulgu, Odell ve arkadaşları81, Slots ve
arkadaşları83 ve bizim çalışmamızın bulguları ile çelişmektedir. Aradaki bu
farklar, P.gingivalisin nükleotid heterojenliğinden kaynaklanıyor olabilir.
Kollajenaz geninin nükleotid heterojenliği, amplifikasyon etkinliğindeki
farklardan sorumlu tutulabilir.
Bakterilerin potansiyel virülans faktörlerinin direkt etkileri yanında
indirekt etkileri de değerlendirilmelidir. Çünkü virülans genleri, konak
dokudaki bazı enzimlerin ekspresyonlarını arttırarak veya konak dokunun
sahip olduğu bu yıkıcı enzimleri bazı mekanizmalarla aktive ederek de
indirekt hasar yaratabilmektedir59,95,96,98,160,161. Ayrıca bu genlerin
bazılarının, ileride bu bakterilerin meydana getirdikleri doku hasarlarına
karşı
geliştirilmesi
muhtemel
aşı
adayları
olabilecekleri
de
unutulmamalıdır.
Kültür
yöntemiyle
üretilmesi
zor
veya
imkansız
olan
mikroorganizmaların 16S rRNA bölgelerinin PCR kullanılarak çoğaltılması
moleküler mikrobiyolojide çığır açmıştır. PCR kültür yöntemlerine göre
daha hassas, özgül ve hızlıdır; ayrıca daha kesin sonuçlar sağlar. Bu
metodların yerinde kullanımı, endodontik hastalıkların nedenlerinin
belirlenmesine, anlaşılmasına ve tedavi stratejilerinin geliştirilmesine
önemli katkılar sağlayacaktır.
67
6. SONUÇLAR
Enfekte kök kanallarında Treponema denticola ile Porphyromonas
gingivalisin, kollajenaz (prtC) ve ana yüzey proteini (Msp) genlerinin
Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Real-time PCR) ile
incelendiği tez çalışmamızda aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir:
1.
Örnek alınan 60 enfekte pulpanın DNA ekstraksiyonlarının
başarıyla gerçekleştiğinin doğrulanması için üniversal bakteriyel primer ve
problarla yapılan Real-time PCR sonucunda, tüm örneklerde bakteri
DNA’sı saptandı. DNA ekstaksiyonunun kan,tükrük, vb. materyallerle
inhibe olmadığı belirlendi,
2.
Toplam 60 örneğin 25’inde (% 44.1) T. denticola, 10’unda (%16.67)
P. gingivalis DNA’sı saptandı,
3.
Akut Apikal Periodontitis grubuna dahil olan toplam 26 vakanın
12’sinde, Akut Apikal Abse grubundaki 7 vakanın 1’inde, Kronik Apikal
Periodontitis grubundaki 27 vakanın 12’sinde T. denticola DNA’sı
saptandı. T.denticola varlığı ile belirli bir klinik patolojik durum arasındaki
ilişkinin istatistiksel olarak anlamlı olmadığı belirlendi (p>0.05),
4.
Akut Apikal Periodontitis grubuna dahil olan toplam 26 vakanın
3’ünde, Akut Apikal Abse grubundaki 7 vakanın 2’sinde, Kronik Apikal
Periodontitis grubundaki 27 vakanın 5’inde P. gingivalis DNA’sı saptandı.
Bu bakterinin varlığı ile belirli bir klinik patolojik durum arasındaki ilişkinin
istatistiksel olarak anlamlı olmadığı belirlendi (p>0.05),
5.
T.denticola/P.gingivalisin birlikte saptandığı örnek sayısı Akut Apikal
Periodontitis grubunda 2, Akut Apikal Abse grubunda 1, Kronik Apikal
Periodontitis grubunda ise 2’dir. T.denticola ve P.gingivalisin birarada
bulunduğu örnekler ile üç klinik patoloji arasındaki ilişki istatistiksel olarak
anlamlı
bulunmamış,
yani
aralarında
herhangi
bir
sinerjiye
rastlanmamıştır,
6.
P.gingivalis DNA’sının pozitif olarak belirlendiği toplam 10 adet
örneğin 9’unda kollajenaz geni (prt C) saptandı. prtC DNA’sı, Akut Apikal
Periodontitis grubundaki
3 vakanın tamamında, Akut Apikal Abse
grubundaki 2 vakanın 1’ inde, Kronik Apikal Periodontitis grubundaki 5
vakanın tamamında tespit edildi. prtC varlığı ile herhangi bir klinik patolojik
durum arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p>0.05),
68
7.
T. denticola DNA’sına sahip toplam 25 adet örneğin 7’ inde ana
yüzey proteini (msp) geni saptandı. msp DNA’sı, Akut Apikal Periodontitis
grubundaki 12 vakanın 4’ünde, Akut Apikal Abse grubundaki 1 vakanın
1’inde, Kronik Apikal Periodontitis grubundaki 12 vakanın 2’sinde tespit
edildi. Msp varlığı ile herhangi bir klinik patolojik durum arasındaki ilişki
istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p >0.05),
8.
P.gingivalisin kollajenaz geninin hemen hemen tüm P.gingivalis
örneklerinde saptanmış olması, bu virülans faktörünün bakterinin yıkıcı
patojenik etkilerinden sorumlu tutulabileceğini düşündürmektedir. Ancak
Msp’nin yalnızca bazı T.denticola örneklerinde belirlenmiş olması, bu
yüzey proteinine sahip olmayan T.denticolaların patojenitesinde azalma
olasılığını akıllara getirmektedir. Bu konu hakkında daha ileri araştırmalar
gerekmektedir.
9.
Tüm bu sonuçlar dikkate alındığında, T.denticola ve P.gingivalis’in
enfekte kök kanalında yüksek prevalansta var olan potansiyel iki
endodontik patojen olduğu ve kültür yöntemiyle üretilmesi zor olan bu tür
anaerob mikroorganizmaların Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile hassas ve
gerçekçi bir şekilde tanımlanabileceği saptanmıştır. Ayrıca ‘kırmızı
kompleks’in bu iki üyesinin akut ya da kronik semptomlarla direkt olarak
ilişkilendirilemeyeceği; enfekte kök kanalında meydana gelen bu
değişimlerin bir ya da birkaç mikroorganizma kaynaklı değil, polimikrobiyal
ve multifaktöriyel olduğu unutulmamalıdır.
69
Enfekte
Kök
Kanallarında
Treponema
denticola,
Porphyromonas gingivalis ve Bu Bakterilere Ait Virulans
Faktörlerinin Moleküler Mikrobiyolojik Teknikler ile İncelenmesi
7. ÖZET
Bu çalışmanın amacı, enfekte kök kanallarında Treponema
denticola, Porphyromonas gingivalis ve bu patojenlerin msp ve prtC
genlerinin varlığı ve prevalanslarının Real-time PCR ile belirlenmesidir. Bu
iki endodontopatojen ve virulans genleri ile klinik semptomlar arasındaki
ilişki de çalışmamızda değerlendirilmiştir.
60 hastadan elde edilen enfekte pulpalar, akut apikal periodontitis,
kronik apikal periodontitis ve akut apikal abse olmak üzere üç gruba
ayrıldı. DNA ekstraksiyonunun ardından örnekler, T.denticola ve
P.gingivalis için özgül primer ve problar kullanılarak Real-time PCR ile
incelendi. P.gingivalis DNA’sının pozitif saptandığı örneklerde, kollajenaz
geninin belirlenmesi amacıyla prtC’ye özgül bakteriyel primerler ve
TaqMan problar kullanılarak Real-time PCR gerçekleştirildi. T.denticola’nın
pozitif saptandığı örneklerde, msp geninin belirlenmesi amacıyla
konvansiyonel PCR uygulandı.
T.denticola, incelenen tüm örneklerin % 44.1’inde, akut apikal
periodontitis grubundaki 26 vakanın 12’inde, akut apikal abse grubundaki
7 vakanın birinde, kronik apikal periodontitis grubundaki 27 vakanın
12’inde saptandı. P.gingivalis, incelenen tüm örneklerin %16.7’inde, akut
apikal periodontitis grubundaki 26 vakanın 3’ünde, akut apikal abse
grubundaki 7 vakanın ikisinde, kronik apikal periodontitis grubundaki 27
vakanın 5’inde saptandı. msp DNA’sı T.denticola’nın pozitif saptandığı 26
adet örneğin 7’inde, prtC DNA’sı P.gingivalis’in pozitif saptandığı 10
örneğin 9’unda saptandı. Bakteriler ve virülans genleri ile üç klinik patolojik
durum arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. (p>0.05)
Anahtar sözcükler: Kollajenaz, ana yüzey proteini, Porphyromonas
gingivalis, Real-time PCR, Treponema denticola
70
Identification of Treponema denticola, Porphyromonas
gingivalis and Their Virulence Factors in Infected Root Canals by
Molecular Microbiologic Techniques
8. SUMMARY
The aim of this study was to assess the presence and prevalence of
T. denticola, P. gingivalis and their msp and prtC genes in the infected
root canals by Real-time PCR. The relationship between the presence of
these two endodontopathogens, their virulence genes and the clinical
symptomatology was also evaluated.
The infected pulps of 60 patients were divided into the following
three clinical groups: acute apical periodontitis, chronic apical
periodontitis, acute apical abscess. DNA was extracted from samples
which were further analysed using the primers and probes that are specific
for T. denticola and P.gingivalis. In the samples that yielded positive
P.gingivalis DNA amplicon, in order to detect the collagenase gene Realtime PCR were performed using prtC specific bacterial primers and Taq
Man probes. The conventional PCR method was employed to identify msp
in the samples that were positive for T.denticola.
T.denticola was found in 44.1% of the total samples, in 12 of 26
cases with acute apical periodontitis, one of seven cases with acute apical
abscess, and 12 of 27 cases with chronic apical periodontitis. P.gingivalis
was observed in 16.7% of the total, three of 26 cases with acute apical
periodontitis, two of seven cases with acute apical abscess, and five of 27
cases with chronic apical periodontitis. msp DNA was detected in seven of
26 T.denticola positive samples, and prtC DNA was detected in nine of ten
P.gingivalis positive samples. The association between the presence of
the bacteria, the virulence genes and three clinical pathologies was not
statistically significant (p>0.05).
Key words: Collagenase, major surface protein, Porphyromonas
gingivalis, Real-time PCR, Treponema denticola
71
9. KAYNAKLAR
1.
Baumgartner JC. Microbiological and molecular analysis of
endodontic infections. Endodontic Topics 2004; 7: 35-51.
2.
Griffee MP, Patterson SS, Miller CH, Kafrawy AH, Newton CW. The
relationship of Bacteroides melaninogenicus to symptoms associated with
pulpal necrosis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1980;
50: 457-461.
3.
Sjogren U, Hanstrom L, Happonen P, Sundqvist G. Extensive bone
loss associated with periapical infection with Bacteroides gingivalis: a case
report. Int Endod J 1990; 23: 254-62.
4.
Sundqvist G, Johansson E, Sjogren U. Prevalence of blackpigmented bacteroides species in root canal infections. J Endod 1989; 15:
13-9.
5.
Beikler T, Peters U, Ehmke B, Flemmig TF. Sequence analysis of
kgp in Porphyromonas gingivalis isolates from periodontitis patients. Oral
Microbiol Immunol 2003; 18: 393-7.
6.
Fouad AF, Barry J, Caimano M, Clawson M., Zhu Q, Carver R, et
al. PCR-based identification of bacteria associated with endodontic
infections. J Clin Microbiol 2002; 40: 3223-31.
7.
Siqueira JF, Roças IN. PCR methodology as a valuable tool for
identification of endodontic pathogens. J Dent 2003; 31: 333-9.
8.
Siqueira JF, Roças IN. Bacteroides forsythus in primary endodontic
infections as detected by nested PCR. J Endod 2003; 29: 390-3.
9.
Siqueira JF, Roças IN. Polymerase chain reaction-based analysis
of microorganisms associated with failed endodontic treatment. Oral Surg
Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2004; 97: 85-94.
10.
Siqueira JF, Roças IN. Simultaneous detection of Dialister
pneumosintes and Filifactor alocis in endodontic infections by 16S rDNA
directed Multiplex PCR. J Endod 2004; 30: 851-4.
11.
Siqueira JF, Roças IN. Treponema species associated with
abscesses of endodontic origin. Oral Microbiol Immunol 2004; 19: 336-40.
72
12.
Siqueira JF, Roças IN, Alves FR, Santos KRN. Selected endodontic
pathogens in the apical third of infected root canals: a molecular
investigation. J Endod 2004; 30: 638-43.
13.
Alaçam T. Endodonti. 2.Baskı. Ankara: Barış Yayınları; 2000.
p.313-83.
14.
Trope M, Tronstad L, Rosenberg ES, Listgarten M. Darkfield
microscopy as a diagnostic aid in differentiating exudates from endodontic
and periodontal abscesses. J Endod 1988; 14: 35-8.
15.
Henderson B, Wilson M. Commensal communism and the oral
cavity. J Dent Res 1998; 77: 1674-83.
16. Cengiz AT, Mısırlıgil A, Aydın M. Tıp ve Diş Hekimliğinde Genel ve
Özel Mikrobiyoloji. 2.Baskı. Ankara: Güneş Kitabevi; 2004.
17.
Tronstad L, Sunde PT. The evolving new understanding of
endodontic infections. Endodontic Topics 2003; 6: 57-77.
18.
Foschi F, Cavrini F, Montebugnoli L, Stashenko P, Sambri V, Prati
C. Detection of bacteria in endodontic samples by polymerase chain
reaction assays and associations with defined clinical signs in Italian
patients. Oral Microbiol Immunol 2005; 20: 289-95.
19.
Fredricks DN, Relman DA. Application of polymerase chain reaction
to the diagnosis of infectious diseases. Clin Infect Dis 1999; 29: 475-86.
20.
Olsen I, Dahlen G. Salient virulence factors in anaerobic bacteria,
with emphasis on their importance in endodontic infections. Endodontic
Topics 2004; 9: 15-26.
21.
Seol JH, Cha BH, Chung CP, Bae KS. Multiplex polymerase chain
reaction detection of black-pigmented bacteria in infections of endodontic
origin. J Endod 2006; 32: 110-4.
22.
Siqueira JF, Roças IN, Moraes SR, Santos KRN. Direct
amplification of rRNA gene sequences for identification of selected oral
pathogens in root canal infections. Int Endod J 2002; 35: 345-51.
23.
Williams JM, Trope M, Caplan DJ, Shugars DC. Detection and
quantitation of E. faecalis by real-time PCR (qPCR), reverse transcriptionPCR (RT-PCR), and cultivation during endodontic treatment. J Endod
2006; 32: 715-21.
73
24.
Oliveira JCM, Siqueira JF, Alves G, Hirata RJ, Andrade AFB.
Detection of Porphyromonas endodontalis in infected root canals by 16S
rRNA gene-directed polymerase chain reaction. J Endod 2000; 26: 72932.
25.
Yoshida M, Fukushima H, Yamamoto K, Ogawa T, Toda T, Sagawa
H. Correlation between clinical symptoms and microorganisms isolated
from root canals of teeth with periapical pathosis. J Endod 1987; 13: 24-8.
26.
Belgrader P, Benett W, Hadley D, Richards J, Stratton P, Mariella
R, et al. PCR detection of bacteria in seven minutes. Science 1999; 284:
449-50.
27.
Berkovitz BKB, Holland GR, Maxham BJ. A Colour Atlas and
Textbook of Oral Anatomy. 2nd ed. London: Wolfe Medical Publishing;
1992.
28.
Beynon AD. Developing dens invaginatus (dens in dente). Br Dent J
1982; 153: 255-60.
29.
Spratt DA. Significance of bacterial identification by molecular
biology methods. Endodontic Topics 2004; 9: 5-14.
30.
Watts A, Paterson C. Detection of bacteria in histological sections
of the dental pulp. Int Endod J 1990; 23: 1-12.
31. Czarnecki RT, Schilder H. A histological evaluation of the human pulp
in teeth with varying degrees of periodontal disease. J Endod 1979; 5:
242-53.
32.
Langeland K, Rodrigues H, Dowden W. Periodontal disease,
bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg 1974; 37: 257-70.
33.
Mazur B, Massler M. Influence of periodontal disease on the dental
pulp. Oral Surg 1964; 17: 592-603.
34.
Torabinejad M, Kiger RD. A histologic evaluation of dental pulp
tissue of a patient with periodontal disease. Oral Surg 1985; 59: 198-200.
35.
Allard U, Nord CE, Sjoberg L, Stromberg T. Experimental infections
with Staphylococcus aereus, Streptococcus sangius, Pseudomonas
aeruginosa, and Bacteroides fragilis in the jaws of dogs. Oral Surg Oral
Med Oral Pathol 1979; 48: 454-62.
74
36.
Gier RE, Mitchell DF. Anachoretic effect of pulpitis. J Dent Res
1968; 47: 564-74.
37.
Grossman LI. Origin of microorganisms in traumatized, pulpless,
sound teeth. J Dent Res 1967; 46: 551-3.
38.
Aas JA, Paster BJ, Stokes LN, Olsen I, Dewhirst FE. Defining the
normal bacterial flora of the oral cavity. J Clin Microbiol 2005; 43: 5721-32.
39.
Paster BJ, Boches SK, Galvin JL, Ericson RE, Lav CN, Levanos
VA. Bacterial diversity in human subgingival plaque. J Bacteriol 2001; 183:
2770-83.
40.
Aas JA, Dardis SR, Griffen AL, Stokes LN, Lee AM, Olsen I, et al.
Molecular analysis of bacteria associated with caries in permanent teeth, J
Dent Res 2003; 83: IADR Abstract No: 25715.
41.
Baumgartner JC, Hutter JW, Siqueira JF. Endodontic Microbiology
and Treatment of Infections. In: Cohen S, Hargreaves KM, editors.
Pathways of the Pulp. 2nd ed. Canada: Mosby Elsevier; 2006. p. 580-607.
42.
Bystrom A, Happonen RP, Sjogren U, Sundqvist G. Healing of
periapical lesions of pulpless teeth after endodontic treatment with
controlled asepsis. Endod Dent Traumatol 1987; 3: 58-63.
43.
Marsh P, Martin MV. Oral Microbiology. 4th ed. Edinburgh: Elsevier
Science Ltd ; 2002.
44. Creti R, Imperi M, Bertuccini L, Fabretti F, Orefici G, Rosa RD, et al.
Survey for virulence determinants among Enterococcus faecalis isolated
from different sources. J Med Microbiol 2004; 53: 13-20.
45.
Dupre I, Zanetti S, Schito AM, Faddo G, Sechi LA. Incidence of
virulence determinants in clinical Enterococcus faecium and Enterococcus
faecalis isolates collected in Sardinia (Italy). J Med Microbiol 2003; 52:
491-8.
46.
Çolak M, Evcil S, Bayindir YZ, Yiğit N. The effectiveness of three
instrumentation techniques on the elimination of Enterococcus faecalis
from a root canal: an in vitro study. J Contemp Dent Practice 2005; 15: 94106.
47.
Erganiş O, Öztürk A. Oral Mikrobiyoloji & İmmunoloji. Ankara: Nobel
Tıp Kitabevleri; 2003.
75
48.
Siqueira JF, Roças IN. Treponema socranskii in primary endodontic
infections as detected by nested PCR. J Endod 2003; 29: 244-7.
49.
Siqueira JF, Roças IN. Pseudoramibacter alactolyticus in primary
endodontic infections. J Endod 2003; 29: 735-8.
50.
Nisengard & Newman. Oral Microbiology and Immunology. 2nd edn.
USA: W.B. Saunders Company; 1994.
51.
Chang YC, Lai CC, Yang SF, Chan Y, Hsieh YS. Stimulation of
matrix metalloproteinases by black-pigmented Bacteroides in human pulp
and periodontal ligament cell cultures. J Endod 2002; 28: 90-3.
52.
Chang YC, Huang FM, Yang SF, Liu CM, Lai CC, Chan Y, et al.
Induction of cyclooxygenase-2 mRNA and protein expression in human
pulp cells stimulated with black-pigmented Bacteroides. J Endod 2003; 29:
240-3.
53.
Yang LC, Huang FM, Lin CS, Liv CM, Lai CC, Chang YC. Induction
of Interleukin-8 gene expression by black-pigmented Bacteroides, in
human pulp fibroblasts and osteoblasts. Int Endod J 2003; 36: 774-9.
54.
Yang LC, Tsai CH, Huang FM, Liu CM, Lai CC, Chang YC.
Induction of Interleukin-6 gene expression by proinflammatory cytokines
and black-pigmented Bacteroides in human pulp. Int Endod J 2003; 36:
352-7.
55.
Socransky SS, Haffajee AD, Cugini MA, Smith C, Kent RL.
Microbial complexes in subgingival plaque. J Clin Periodontol 1998; 25:
134-44.
56.
Roças IN, Siqueira JF, Santos KRN, Coelho AMA. ‘Red complex’
(Bacteroides forsythus, Porphyromonas gingivalis and Treponema
denticola) in endodontic infections: A molecular approach. Oral Surg Oral
Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2001; 91: 468-71.
57.
Bogen G, Slots J. Black-pigmented anaerobic rods in closed
periapical lesions. Int Endod J 1999; 32: 204-10.
58.
Gomes BPFA, Jacinto RC, Pinheira ET, Sousa ELR, Zaia AA,
Ferroz CCR, et al. Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas
endodontalis, Prevotella intermedia, and Prevotella nigrescens in
endodontic lesions detected by culture and by PCR. Oral Microbiol
Immunol 2005; 20: 211-5.
76
59.
Sorsa T, Ingman T, Suomalainen K, Haapasalo M, Konttinen YT,
Lindy O. Identification of proteases from periodontopathogenic bacteria as
activators of latent human neutrophil and fibroblast-type interstitial
collagenases. Infect Immun 1992; 60: 4491-5.
60.
Jacinto RC, Gomes BPFA, Shah HN, Ferraz CC, Zaia AA, SouzaFilho FJ. Incidence and antimicrobial susceptibility of Porphyromonas
gingivalis isolated from mixed endodontic infections. Int Endod J 2006; 39:
62-70.
61.
Shah HN, Collins MD. Proposal for reclassification of Bacteroides
asaccharolyticus, Bacteroides gingivalis, and Bacteroides endodontalis in
a new genus Porphyromonas. Int J Systemic Bacteriol 1988; 3: 128-31.
62.
Van Winkelhoff AJ, Von Steenbergen TJM, Graaff J. The role of
black pigmented Bacteroides in human oral infections. J Clin Periodontol
1988; 15: 145-55.
63.
Baumgartner JC, Watkins BJ, Bae KS, Xia T. Association of blackpigmented bacteria with endodontic infections. J Endod 1999; 25: 413-5.
64.
Laine ML, von Winkelhoff AJ. Virulence of six capsular serotypes of
Porphyromonas gingivalis in a mouse model. Oral Microbiol Immunol
1998; 13: 322-5.
65.
Laine ML, Appelmelk BJ, von Winkelhoff AJ. Prevalence and
distribution of six capsular serotypes of Porphyromonas gingivalis in
periodontitis patients. J Dent Res 1997; 76: 1840-4.
66.
Van Winkelhoff AJ, Appelmelk BJ, Kippuw N, Graaf J. K-antigens in
Porphyromonas gingivalis are associated with virulence. Oral Microbiol
Immunol 1993; 8: 259-65.
67.
Gonzalez D, Tzianabos AO, Genco CA, Gibson FC. Immunization
with Porphyromonas gingivalis capsular polysaccharide prevents P.
gingivalis-elicited oral bone loss in a murine model. Infect Immun 2003;
71: 2283-7.
68.
Xie H, Kozlova N, Lamount RJ. Porphyromonas gingivalis genes
involved in fimA regulation. Infect Immun 2004; 72: 651-8.
69.
Hamada S, Amano A, Kimura S, Nakagawa I, Kawoboto S,
Morisaki I. The importance of fimbriae in the virulence and ecology of
some oral bacteria. Oral Microbiol Immunol 2004; 13: 129-38.
77
70.
Amano A, Nakagawa I, Okohoshi N, Hamado N. Variations of
Porphyromonas gingivalis fimbriae in relation to microbial pathogenesis. J
Periodont Res 2004; 39: 136-42.
71.
Jotwani R, Cutler CW. Fimbriated Porphyromonas gingivalis is
more efficient than fimbria deficient P. gingivalis in entering human
dendritic cells in vitro and induces an inflammatory Th 1 effector response.
Infect Immun 2004; 72: 1725-32.
72.
Narimatsu M, Noiri Y, Itoh S, Noguchi N, Kawahara T, Ebisu S.
Essential role for the gtf A gene encoding a putative glycosyltransferase in
the adhesion of Porphyromonas gingivalis. Infect Immun 2004; 72: 2698702.
73.
Belton CM, Izutsu KT, Goodwin PC, Pork Y, Lamount RI.
Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas
gingivalis and gingival epithelial cells. Cell Microbiol 1999; 1: 215-23.
74. Dorn BR, Dunn WA Jr, Progulske-Fox A. Porphyromonas gingivalis
traffics to autophagosomes in human coronary artery endothelial cells.
Infect Immun 2001; 69: 5698-708.
75. Dorn BR, Harris LJ, Wujick CT, Vertucci FJ, Progulske-Fox A.
Invasion of vascular cells in vitro by Porphyromonas endodontalis. Int
Endod J 2002; 35: 366-71.
76.
Ishihara K, Nabuchi A, Ito R, Miyachi K, Kuramitsu HK, Okuda K.
Correlation between detection rates of periodontopathic bacterial DNA in
coronary stenotic artery plaque and in dental plaque samples. J Clin
Microbiol 2004; 42: 1313-5.
77.
Mastragelopulus N, Haraszthy VI, Zambon JJ, Zofiropoulos GG.
Detection of periodontal pathogenic microorganisms in atheromatous
plaque. Preliminary results. Chirurg 2002; 73: 585-91.
78.
Li L, Messos E, Botista EL, Levine RA, Amor S. Porphyromonas
gingivalis infection accelerates the progression of atherosclerosis in a
heterozygous apolipoprotein E-deficient murine model. Circulation 2002;
105: 861-7.
79.
Birkedal-Hansen H, Taylor RE, Zambon JJ, Barwa PK, Neiders ME.
Characterization of collagenolytic activity from strains of Bacteroides
gingivalis. J Periodontal Res 1988; 23: 258-64.
78
80.
Uitto VJ, Haapasalo M, Laakso T, Salo T. Degradation of basement
membrane collagen by proteases from some oral microorganism. Oral
Microbiol Immunol 1988; 3: 97-102.
81.
Odell LJ, Baumgartner JC, Xia T, David LL. Survey for collagenase
gene prtC in Porphyromonas gingivalis and Porphyromonas endodontalis
isolated from endodontic infections. J Endod 1999; 25: 555-8.
82.
Kato T, Takahashi N, Kuramitsu HK. Sequence analysis and
characterization of the Porphyromonas gingivalis prtC gene, which
expresses a novel collagenase activity. J Bacteriol 1992; 174: 3889-95.
83.
Slots J, Flynn MJ, Li G. Polymerase chain reaction analysis of the
Porphyromonas gingivalis collagenase gene. Clin Infect Dis 1995; 20: 1678.
84.
Bodinka A, Schmidt H, Henkel B, Fleming TF, Klaiber B, Karch H.
Polymerase chain reaction for the identification of Porphyromonas
gingivalis collagenase genes. Oral Microbiol Immunol 1994; 9: 161-5.
85.
Hang CY, Lin SK, Kok SH, Chang SJ, Lee MS, Wang TM, et al. The
role of lipopolysaccharide in infectious bone resorption of periapical lesion.
J Oral Pathol Med 2004; 33: 162-9.
86.
Trope M, Bergenholtz G. Microbiological basis for endodontic
treatment: can a maximal outcome be achieved in one visit. Endodontic
Topics 2002; 1: 40-53.
87.
Shah HN, Gharbia SE, Knowlesser D, Wilkie E, Brocklehurst K.
Gingipain; a cysteine proteinase isolated from Porphyromonas gingivalis.
Microbiol Ecol Health Dis 1991; 4: 319-28.
88.
Curtis MA, Aduse OJ, Rangarajan M. Cysteine proteases of
Porphyromonas gingivalis. Crit Rev Oral Biol Med 2001; 12: 192-216.
89.
Genco CA, Potempo J, Mikalajezyk PJ, Travis J. Role of gingipains
R in the pathogenesis Porphyromonas gingivalis mediated periodontal
disease. Clin Infect Dis 1999; 28: 456-65.
90.
O-Brien-Simpson NM, Veith PD, Dashpher SG, Reynolds EC.
Porphyromonas gingivalis gingipains: the molecular teeth of a microbial
vampire. Curr Protein Pept Sci 2003; 4: 409-26.
79
91.
Nadkarni MA, Nguyen KA, Chapple CC, Jacques NA, Hunter N.
Distribution of Porphyromonas gingivalis biotypes defined by kgp (LysGingipain) gene. J Clin Microbiol 2004; 42: 3873-6.
92.
Lourbakos A, Yuan YP, Jenkins AL, Travis J, Andrade-Gordon P,
Santulli R, et al. Activation of protease-activated receptors by gingipains
from Porphyromonas gingivalis leads to platelet aggregation: a new trait in
microbial pathogenicity. Blood 2001; 97: 3790-7.
93.
Imamura T, Potempa J, Travis T. Comparison of pathogenic
properties between two types of arginine specific cysteine proteinases
(gingipains-R) from Porphyromonas gingivalis. Microb Pathog 2000; 29:
155-63.
94.
Yoneda M, Hirofuji T, Anan H, Matsumoto A, Hamochi T,
Nakoyamo K, et al. Mixed infection of Porphyromonas gingivalis and
Bacteroides forsythus in a murine abscess model: involvement of
gingipains in a synergistic effect. J Periodont Res 2001; 36: 237-43.
95.
Nakata K, Yamasaki M, Iwato T, Suzuki K, Nakane A, Nakamura H.
Anaerobic
bacterial
extracts
influence
production
of
matrix
metalloproteinases and their inhibitors by human dental pulp cells. J
Endod 2000; 26: 410- 3.
96.
Pattamapun
K,
Tiranathanagul
S,
Yongchaitrakul
T,
Kuwatanasuchat J, Pavasant P. Activation of MMP-2 by Porphyromonas
gingivalis in human periodontal ligament cells. J Periodont Res 2003; 38:
115-21.
97.
Yang LC, Tsai CH, Huang FM, Su YF, Lai CC, Liu CM, et al.
Induction of vascular endothelial growth factor expression in human pulp
fibroblasts stimulated with black-pigmented Bacteroides. Int Endod J
2004; 37: 588-92.
98.
Bate AL, Ma JKC, Pitt Ford TR. Detection of bacterial virulence
genes associated with infective endocarditis in infected root canals. Int
Endod J 2000; 33: 194-203.
99.
Siqueira JF, Roças IN, Favieri A, Oliveira JCM, Santos KRN.
Polymerase chain reaction detection of Treponema denticola in
endodontic infections with root canals. Int Endod J 2001; 34: 280-6.
100. Roças IN, Siqueira JF. Occurrence of two newly named oral
treponemas –Treponema parvum and Treponema putidum- in primary
endodontic infections. Oral Microbiol Immunol 2005; 20: 372-5.
80
101. Baumgartner JC, Khemaleelakul S, Xia T. Identification of
spirochetes (treponemas) in endodontic infections. J Endod 2003; 29: 7947.
102. Jung IY, Chai BK, Kum KY, Yoo YJ, Yoon TC, Lee SJ et al.
Identification of oral spirochetes at the species level and their association
with other bacteria in endodontic infections. Oral Surg Oral Med Oral
Pathol Oral Radiol Endod 2001; 92: 329-34.
103. Roças IN, Siqueira JF, Andrade AFB, Uzeda M. Identification of
selected putative oral pathogens in primary root canal infections
associated with symptoms. Anaerobe 2002; 8: 200-8.
104. Roças IN, Siqueira JF, Andrade AFB, Uzeda M. Oral treponemas in
primary root canal infections as detected by nested PCR. Int Endod J
2003; 36: 20-6.
105. Siqueira JF, Roças IN, Souto R, Uzeda M, Colombo AP.
Microbiological evaluation of acute periradicular abscesses by DNA-DNA
hybridization. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2001; 92:
451-7.
106. Young JI, Bang C, Ki-Yean K, Byoung-Duk R, Seung-Jung L, ChanYoung L, et al. Molecular epidemiology and association of putative
pathogens in root canal infection. J Endod 2000; 26: 599-604.
107. Grenier D. Nutritional interactions between
periodonto-pathogens, Treponema denticola and
gingivalis. Infect Immun 1992; 60: 5298-301.
two suspected
Porphyromonas
108. Fenno JC, McBride BC. Virulence factors of oral treponemas.
Anaerobe 1998; 4: 1-17.
109. Dahle VR, Sunde PT, Tronstad L. Treponemes and endodontic
infections. Endodontic Topics 2003; 6: 160-70.
110. Ellen RP, Dawson JR, Yang PF. Treponema denticola as a model
for polar adhesion an d cytopathogenicity of spirochetes. Microbiology
1994; 2: 114-9.
111. Fenno JC, Müller KH, McBride BC. Sequence analysis, expression,
and binding activity of recombinant major outer sheath protein (Msp) of
Treponema denticola. J Bacteriol 1996; 178: 2489-97.
81
112. Caimano MJ, Bourell KW, Bannister TD, Cox DL, Radolf JD. The
Treponema denticola major sheath protein is predominantly periplasmic
and has only limited surface exposure. Infection and Immunity 1999; 67:
4072-83.
113. Mathers DA, Leung WK, Fenno JC, Hang Y, McBride BC. The
major surface protein complex of Treponema denticola depolarizes and
induces ion channels in HeLa cell membranes. Infect Immun 1996; 64:
2904-10.
114. Fenno JC, Wong GW, Hannam PM, Müller KH, Leung WK, McBride
BC. Conservation of msp, the gene encoding the major outer membrane
protein of oral Treponema spp. J Bacteriol 1997; 179: 1082-9.
115. Lux R, Miller JN, Pork NH, Shi W. Motility and chemotaxis in tissue
penetration of oral epithelial cell layers by Treponema denticola. Infect
Immun 2001; 69: 6276-83.
116. Lux R, Sim J, Tsai JP, Shi W. Construction and characterization of
a che A mutant of Treponema denticola. J Bacteriol 2002; 184: 3130-4.
117. Siqueira JF, Roças IN, Favieri A, Santos KRN. Detection of
Treponema denticola in endodontic infections by 16S rRNA gene directed
polymerase chain reaction. Oral Microbiol Immunol 2000; 15: 335-7.
118. Sixou M. Diagnostic testing as a supportive measure of treatment
strategy. Oral Dis 2003 ; 9: 54-62.
119. Tang YW, Procop GW, Persing DH. Molecular diagnostics of
infectious diseases. Clin Chem 1997; 43: 2021-38.
120. Zambon JJ, Haroszthy VI. The laboratory diagnosis of periodontal
infections. Periodontology 2000; 7: 69-82.
121. Wyss C. Dependence of proliferation of Bacteroides forsythus on
exogenous N-acetylmuramic acid. Infect Immun 1989; 57: 1757-9.
122. Akar N. Klinik Moleküler Patoloji’ye Giriş. 2. Baskı. Ankara: Antıp
Yayınları; 1999.
123. McPherson MJ, Moller SG. PCR (The Basics). 1st ed. Oxford: BIOS
Scientific Publishers Ltd; 2000.
124. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real-time quantitative
PCR. Genome Research 1996; 6: 986-94.
82
125. Siqueira JF, Roças IN, Souto R, Uzeda M, Colombo AP.
Checkerboard DNA-DNA hybridization analysis of endodontic infections.
Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2000; 89: 744-8.
126. Sundqvist G, Figdor D. Life as an endodontic pathogen. Endodontic
Topics 2003; 6: 3-28.
127. Ingle JI, Bakland LK. Endodontics. 4th ed. Baltimore: Williams &
Wilkins; 1994. p.439-64.
128. Hoshioka K, Yamasaki M, Nakane A, Hariva N, Nakamura H. The
relationship between clinical symptoms and anaerobic bacteria from
infected root canals. J Endod 1992; 11: 558-61.
129. Winkelhoff AJ, Von Steenbergen M, Graaff J. Porphyromonas
(Bacteroides) endodontalis: Its role in endodontal infections. J Endod
1992; 18: 431-3.
130. Bergenholtz G, Dahlen G. Advances in the study of endodontic
infections: introduction, Endodontic Topics 2004; 9: 1-4.
131. Pitt TL, Saunders NA. Molecular bacteriology: a diagnostic tool for
the millennium. J Clin Pathol 2000; 53: 71-5.
132. Whelen AC, Persing DH. The role of nucleic acid amplification and
detection in the clinical microbiology laboratory. Annual Reviews in
Microbiology 1996; 50: 349-73.
133. Herrington CS, McGee J.O’D. Diagnostic Molecular Pathology. 1st
ed. New York: Oxford University Press; 1992.
134. Ashimoto A, Chen C, Bakker I, Slots J. Polymerase chain reaction
detection of 8 putative periodontal pathogens in subgingival plaque of
gingivitis and advanced periodontitis lesions. Oral Microbiol Immunol
1996; 11: 266-73.
135. Greisen K, Loeffeholz M, Purohit A, Leang D. PCR primers and
probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria,
including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol 1994; 32:
335-51.
136. Hofstad T. Utility of newer techniques for classification and
identification of pathogenic anaerobic bacteria. Clin Infectious Diseases
1994; 18: 250-2.
83
137. Kong F, Gordon S, Gilbert GL. Rapid-cycle PCR for detection and
typing of Mycoplasma pneumoniae in clinical specimens. J Clin Microbiol
2000; 38: 4256-9.
138. Relman DA. The search for unrecognized pathogens. Science
1999; 284: 1308-10.
139. Gomes BPFA, Drucker DB, Lilley JD. Positive and negative
associations between bacterial species in dental root canals. Microbios
1994; 80: 231-43.
140. Xia T, Baumgartner JC. Occurrence of Actinomyces in infections of
endodontic origin. J Endod 2003; 29: 549-52.
141. Horz HP, Vianna ME, Gomes BPFA, Conrads G. Evaluation of
universal probes and primer sets for assessing total bacterial load in
clinical samples: General implications and practical use in endodontic
antimicrobial therapy. J Clin Microbiol 2005; 43: 5332-7.
142. Kawada M, Yoshida A, Suzuki N, Nakano Y, Saito T, Oho T, et al.
Prevalence of Porphyromonas gingivalis in relation to periodontal status
assessed by Real-time PCR. Oral Microbiol Immunol 2004; 19: 289-92.
143. Gomes BPFA, Drucker DB, Lilley JD. Association of specific
bacteria with some endodontic signs and symptoms. Int Endod J 1994; 27:
291-8.
144. Jacinto RC, Gomes BPFA, Ferraz CCR, Zaia AA, Souza-Filho FJ.
Microbiological analysis of infected root canals from a symptomatic and
asymptomatic teeth with periapical periodontitis and the antimicrobial
susceptibility of some isolated anaerobic bacteria. Oral Microbiol Immunol
2003; 18: 285-92.
145. Gomes BPFA, Pinheira ET, Gade-Neto CR, Sousa ELR, Ferraz
CCR, Zaia AA, et al. Microbiological examination of infected dental root
canals. Oral Microbiol Immunol 2004; 19: 71-6.
146. Hancock HH, Sigurdsson A, Trope M, Moiseiwitsch J. Bacteria
isolated after unsuccessful endodontic treatment in a North American
population. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2001; 91:
579-86.
147. Kaufman B, Spangberg L, Barry J, Fouad A. Enterococcus spp. in
endodontically treated teeth with and without periradicular lesions. J
Endod 2005; 31: 851-6.
84
148. Sundqvist G. Taxonomy, ecology, and pathogenicity of the root
canal flora. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1994; 78: 522-30.
149. Baumgartner JC, Siqueira JF, Xia T, Roças IN. Geographical
differences in bacteria detected in endodontic infections using polymerase
chain reaction. J Endod 2004; 3: 141-4.
150. Roças IN, Baumgartner JC, Xia T, Siqueira JF. Prevalence of
selected bacterial named species and uncultivated phylotypes in
endodontic abscess from two geographic locations. J Endod 2006; 32:
1135-8.
151. Siqueira JF, Jung IY, Roças IN, Lee CY. Differences in prevalence
of selected bacterial species in primary endodontic infections from two
distinct geographic locations. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol
Endod 2005; 99: 641-7.
152. Edwards AM, Jenkinson HF, Woodward MJ, Dymack D. Binding
properties and adhesion-mediating regions of the major sheath protein of
Treponema denticola ATCC 35405. Infect Immun 2005; 73: 2891-8.
153. Fenno JC, Wong GW, Hannam PM, McBride BC. Mutagenesis of
outer membrane virulence determinants of oral spirochete Treponema
denticola. FEMS Microbiol Lett 1998; 15: 209-15.
154. Haapasalo M, Muller KH, Uitto VJ, Leung WK, McBride BC.
Characterization, cloning and binding properties of the major 53-kilodalton
Treponema denticola surface antigen. Infect Immun 1992; 60: 2058-65.
155. Miyamoto T, Noji S, Kakeguchi S, Kato K, Kurihara H, Murayama Y,
et al. Molecular cloning and sequence analysis of antigen gene tdpA of
Treponema denticola. Infect Immun 1991; 59: 1941-7.
156. Ishihara K, Miura T, Kuramitsu HK, Okuda K. Characterization of
the Treponema denticola prtP gene encoding a prolyl-phenylalaninespecific protease (dentisilin). Infect Immun 1996; 64: 5178-86.
157. Vesey PM, Kuramitsu HK. Genetic analysis of Treponema denticola
ATCC 35405 biofilm formation. Microbiology 2004; 150: 2401-7.
158. Norris JM, Love DN. The association of two recombinant
proteinases of a feline strain of Porphyromonas gingivalis with periodontal
disease in cats. Vet Microbiol 2000; 71: 69-80.
85
159. Takahashi N, Kato T, Kuramitsu HK. Isolation and preliminary
characterization of the Porphyromonas gingivalis prtC gene expressing
collagenase activity. FEMS Microbiol Lett 1991; 84: 135-8.
160. Liv Y, Fletcher HM. The recA gene in Porphyromonas gingivalis is
expressed during infection of the murine host. Oral Microbiol Immunol
2001; 16: 218-23.
161. Yang SF, Hsieh YS, Huang FM, Yang LC, Chang YC. Effect of
black-pigmented bacteria and the plasminogen-plasmin system in human
pulp and osteoblastic cells. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol
Endod 2003; 95: 621-5.
86
10. ÖZGEÇMİŞ
Adı: Özgür İlke
Soyadı: Atasoy ULUSOY
Doğum Yeri ve Tarihi: Ordu – 09.06.1978
Eğitimi (tarih sırasına göre yeniden eskiye doğru)
2002-2007: Gazi Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Diş Hastalıkları ve
Tedavisi Anabilim Dalı
1996-2001: Gazi Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi
1990-1996: Ankara Atatürk Anadolu Lisesi
1986-1989: Ankara Mimar Kemal İlkokulu
1985-1986: Necatibey İlköğretim Okulu, Bozüyük, Bilecik
Yabancı Dili: İngilizce, Almanca
Üye Olduğu Bilimsel Kuruluşlar: Türk Endodonti Derneği, Avrupa
Endodonti Derneği
87
Download