MikroRNA`larin Kanserde Onemi
advertisement
mikroRNA’ların Kanserde Önemi Dr. Uğur DELİGEZER İstanbul Üniversitesi Onkoloji Enstitüsü Protein/RNA Genleri • • • Gen arama çalışmaları geleneksel olarak protein-kodlayan dizilere yönelik olduğundan bir çok gen gözden kaçmış olabilir Bilinmeyen tümör baskılayıcı genler veya onkogenler ? Genomun sadece %3’ü protein kodlarken, sıralamalı (“tiling”) genomik mikroarray çalışmaları genomun önemli bir bölümünün (~ %50) RNA’ya dönüştürüldüğünü olduğunu ortaya koymuştur Kodlamayan RNA’lar Kodlamayan RNA’lar • Protein kodlamayan RNA’ların bir kısmı işlevleri bilinen RNA’lar: - • • tRNA, ribozomal RNA’lar, spliceozomal RNA’lar (snRNA U1,U2,U4,U5,U6) snoRNA’lar, telomeraz RNA, sinyal tanıma partikül RNA’sı Poli-A içermediklerinden saptanmaları daha zordur Kodlamayan RNA’ların bir tipi de biyokimyasal düzeyde iyi tanımlanmış mikroRNA’lardır mikroRNA’lar • • • • Genom tarafından kodlanan, proteine dönüştürülmeyen küçük (20-25 nükleotid uzunluğunda) RNA molekülleri RNA müdahalesi yoluyla, gen ifadesinin transkripsiyon sonrası negatif olarak düzenlenmesi Hücre çoğalması, apoptozis, hücre farklılaşması ve metabolizma gibi farklı yolaklarda görev alırlar Kanser: belli miRNA genlerinin değişmiş ekspresyonu RNA Müdahalesi Nedir? • Küçük RNA moleküllerinin, dizi benzerliği taşıdıkları mRNA’larla eşleşerek, onların yıkımına yol açarak veya translasyonu önleyerek gen ifadesini baskılamaları olayına RNA müdahalesi (“RNA interference”) denilmektedir - Yeni bir gen ekspresyon düzenleyici sistem • Amerikalı bilim adamları Andrew Fire ve Craig C. Mello, RNA müdahalesi çalışmaları ile 2006 yılı Nobel Tıp Ödülü’nü paylaştılar RNA Müdahalesi Uzun çift zincirli endojen (transpozonlar) veya ekzojen (virüsler) RNA’lar Dicer miRNA genleri Öncül miRNA transkriptleri Kısa RNA’lar Dicer siRNA miRNA Baskılayıcı RISC kompleksinin oluşması Homoloji taşıyan mRNA’ların yıkımı veya translasyonun baskılanması RNA Müdahalesi miRNA Çalışmalarının Önemli Aşamaları • • • • • • • • • • 1993 – 1995 – 2000 – 2001 – 2001 – 2001 – 2002 – 2003 – 2004 – 2006 – C. elegans’da küçük düzenleyici RNA (let-4) RNA müdahalesinin keşfi Evrimsel korunmuş düzenleyici RNA let-7 saptandı RNA müdahalesi küçük RNA’larca (21-22 nk) gerçekleştiriliyor “mikroRNA” kavramı bilim diline girdi (Science yayınları) miRNA-kanser ilişkisi ortaya kondu miRNA databank http://www.sanger.ac.uk/ bazı miRNA hedef genleri saptandı miRNA databank: 719 miRNA insanda 460 civarında miRNA PubMed’de miRNA’lar 600 Yayın Sayısı 500 400 300 200 100 0 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Yıl miRNA’lar Nasıl Keşfedildi ? • • Ekspresyonlarının belli dokulara ve şartlara özgü olması geç keşfedilmelerine yol açmıştır İlk miRNA’lar deneysel yöntemlerle bulunmuştur Küçük RNA’ların izolasyonu ve saflaştırılması 5’ ve 3’ adaptör dizilere ligasyon, klonlama RT-PCR Sekanslama Yeni miRNA’ların Bulunması • • Düşük kopya sayısı nedeniyle miRNA’ların deneysel olarak bulunma ve izolasyonları zordur Günümüzde, bioinformatik yaklaşımlar + deneysel yöntemler Bilgisayar programları: a) Bilinen miRNA’lardan yola çıkarak homoloji taranması ve miRNA’ların yakınında “stem-loop” oluşturabilecek dizilerin araşt. b) Genomda “stem-loop” oluşturabilecek korunmuş dizilerin taranması miRscan, miRseeker miRNA’ların Genomik Organizasyonu • İnsanda 1000 kadar miRNA geni olabilir; protein kodlayan genlerin yaklaşık %30’sunun miRNA’larca düzenlendiği tahmin edilmektedir Bir miRNA çok sayıda farklı genin düzenlenmesinde rol alabilir • • Bilinen miRNA genlerinin çoğunluğu birbirinden bağımsız eksprese edilir, %15 kadarı gen kümelerinde yer alır miRNA genlerinin yaklaşık %50’si protein kodlayan genlerin intronlarında veya kodlamayan RNA transkriptleri içinde yer alır miRNA’ların önemli bir bölümünün ekspresyonu, konak genin transkripsiyonu ile bağlantılıdır miRNA’ların Biogenezi miRNA’ların Biogenezi pre-miRNA (~ 70 baz) Negatif Gen Düzenlenmesinin Mekanizmaları • Çevirinin başlamasının engellenmesi - eIF4E2 inhibisyonu • mRNA yıkımı - poli(A) kuyruğu ve şapkanın uzaklaştırılmasının yol açtığı mRNA decay Hangi miRNA’lar ? İzolasyon, klonlama, sekanslama miRNA’lar nerde ve ne zaman eksprese ediliyor ? miRNA ekspresyon analizi Hangi hücresel yolaklar miRNA’larca düzenleniyor ? miRNA kütüphane taraması miRNA’lar hangi genleri düzenliyor ? miRNA hücre assayleri Hastalık Modeli miRNA profilleme Aşırı ekspresyon veya inhibisyon yoluyla belli miRNA profillerinin yeniden oluşturulması Bioinformatik Hastalık fenotipi Gen ekspresyonu üzerine etkisi miRNA Ekspresyon Analizi Kullanılan Yöntemler • • • • Northern blot Kantitatif RT-PCR Mikroarray miRNA ekspresyon profillemesi Bead-based flow sitometrik miRNA ekspresyon profillemesi 5’ Total RNA izolasyonu 5’ 5’ 5’ AAAAAAA 3’ 3’ 5’ Olgun miRNA’ların Pürifikasyonu miRNA işaretlemesi Hibridizasyon Analiz 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ AAAAAAA 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ miRNA’ların Fizyolojik Görevleri • Embryonal gelişim • Hücre çoğalması • Apoptozis • Farklılaşma miRNA-Kanser İlişkisi • • • miRNA’lar tarafından kontrol edilen gen düzenleyici ağ karmaşıktır Bunun nedenlerinden biri, miRNA’ların hedefleri üzerindeki alternatif etkileri: 3’ UTR bölgelerinde miRNA bağlanma bölgeleri içeren mRNA’ların yıkımı veya translasyon baskılanması miRNA’ların etkilerinin değerlendirilmesi için transkriptomik ve proteomik stratejilerin her ikisinin de kullanılması gerekmekte miRNA-Kanser İlişkisi • • Düzenleyici RNA molekülleri, geleneksel olarak tümör baskılayıcı gen veya onkogen olarak görülmemişlerdir miRNA’ların gen ekspresyonun düzenlenmesindeki önemi anlaşılmaya başlandıkça bu görüş değişmeye başlamıştır miRNA’lar Aday Tümör Baskılayıcı Gen veya Onkogen ? • • Farklı kanser tiplerinde geniş bir anlatım bozukluğu var mı ? Delesyon, amplifikasyon veya mutasyon taşıyan tümörlerde kazanılmış veya kayıp miRNA işlevi var mı ? • Hayvan modellerinde tümör-baskılayıcı veya onkogen etki ? • Onkogenezde önemli hedef genler veya yolaklar saptandı mı ? Aday Tümör Baskılayıcı Gen/ Onkogen Olarak miRNA’lar • • • Kanserde miRNA ekspresyonunda geniş bir anlatım bozukluğu vardır miRNA’ların sıklıkla, daha önce çeşitli kanser tiplerinin gelişimi ile ilişkili olarak bildirilmiş frajil bölgelerde, heterozigotluk kaybının olduğu bölgelerde, amplifiye olan bölgelerde veya sık kromozom kırıklarının yakınlarında yerleşik olduğu gösterilmiştir Bir çok miRNA geninin kanserogenezde önemli olabilecek hedef genleri saptanmıştır miRNA Etki Kanser tipi Hedef Genler miR15a, miR16-1 TS KLL, mantle cell lenfoma multiple myelom, prostat Bcl-2 Let-7 TS meme, serviks, akciğer kolon, over,üretelyal Ras, Hmga2 miR143, miR145 TS meme, kolon, MDS ? miR-17-92 ailesi (7 miRNA) OG B-hücreli lenfoma, meme, kolon akciğer, pankreas, prostat E2F1 TGFbeta2 miR21 OG meme, kolon, glioblastoma akciğer, pankreas, prostat Bcl-2, PTEN Tropomyozin 1 Tümör Baskılayıcı miRNA’lar Model I: Apoptozisin düzenlenmesi • • • • Model: KLL. Batıda en sık görülen yetişkin lösemisi; genetik temeli az biliniyor; malign hücreler Bcl-2’yi aşırı eksprese ederler 13q14 delesyonu (30 kb) KLL ve bir çok solid tümörde sık. Bu bölgede mir-15a–16 miRNA gen kümesi saptanmıştır miR-15a ve miR-16, anti-apoptotik gen Bcl-2’yi hedef alır miR-15a–16 delesyonu gösteren lenfoma hücrelerinde yeniden ekspresyon apoptozise yol açar Tümör Baskılayıcı miRNA’lar Model II: Onkogenlerin hedeflenmesi • • • • • Let-7 ailesi: 12 miRNA geni Bunların en az dördü farklı malignitelerde delesyonlara uğrayan bölgelerde yer almaktadır Let-7 ailesi üyeleri, K-ras ve N-ras ekspresyonunu düzenler Let-7 kaybı olan akciğer kanser dokularında Ras aşırı ekspresyonu görülür Ayrıca, daha önce bir çok tümörde meydana gelen translokasyonların “High mobility group A2” nin let-7 tarafından baskılanmasını ortadan kaldırdığı saptanmıştır tümör büyümesi Onkogenik miRNA’lar Model I: Apoptozisin baskılanması • • Büyük B-hücreli lenfoma, foliküler B hücreli lenfoma, diğer bazı lenfomalar, akciğer, meme, baş-boyun, prostat kanserlerinde amplifikasyon görülen 13q31 bölgesinde miR-17-92 miRNA gen kümesi (miR-17, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20 ve miR-92 genleri) saptanmıştır Bu miRNA’ların aşırı ekspresyonu, primer lenfoma, kolon, akciğer, meme, pankreas, prostatta doğrulanmıştır • miR-17-92 üyeleri c-Myc tarafından aktive edilir • miR-17 ve miR-20, apoptozisin baskılanması ile ilişkili bulunmuştur - miR-20, E2F ailesi üyelerini düzenlemektedir Onkogenik miRNA’lar Model I: Apoptozisin baskılanması • • • miR-21: glioblastoma, meme, akciğer, pankreas, mide ve prostatta aşırı ekspresyon Hedef genlerden ikisi, Bcl-2 ve PTEN Primer tümör hücre kültürü gen ‘knock-down’ çalışmaları kaspazların artışına ve apoptozise yol açmıştır Onkogenik miRNA’lar Model II: Tümör baskılayıcı genlerin hedeflenmesi • • mir-17-92 hedef genleri: TGF-Beta reseptör II (miR-20a) E2F (miR17-5p ve miR-20a) Trombospondin-1 miR-21: in vitro ve ksenograft fare modelinde tümör büyümesi. Antisens yaklaşımı ile miR-21 baskılanması tümör büyümesini durdurmuştur. Hedef genlerden biri tropomyozin 1 Onkogenik miRNA’lar Model III: Onkogen aşırı ekspresyonunun yol açtığı hücresel duraklamanın (“senescence”) baskılanması • • • Ras aşırı ekspresyonu anormal hücre çoğalması için yeterli değildir; ilave olarak örneğin p53 kaybı gereklidir Retroviral miRNA ekspresyon kütüphanesi ile p53 kaybının yerine geçecek ve Ras aktivasyonu sonucu hücrelerin çoğalmasını devam ettirecek miRNA’lar saptandı: miR-372 ve miR-373 Bu miRNA’ların, hücreleri, normal p53 etkisine karşı hücreleri duyarsız hale getirerek onkogenik etkilerini gösterdikleri tahmin ediliyor miRNA Ekspresyon Profili ile Diagnostik ve Prognostik Analiz • • • Genom çapında miRNA ekspresyon analizi: doku spesifik profil Tümörde genel olarak miRNA ekspresyon düzeyleri düşük miRNA profillemesi tümör kökeni ve diferansiyasyon derecesinin saptanmasında informatif miRNA profili, mRNA profiline göre daha yararlı • Az diferansiye olan tümörlerde en düşük miRNA düzeyleri Farklılaşmanın kanserdeki genel kaybı ile uyumlu • Her bir kanser tipi için özgül profiller söz konusu olabilir Örnek: akciğer, pankreas ca, nöroblastom ve KLL’de özgül profiller saptandı miRNA Ekspresyon Profili ile Diagnostik ve Prognostik Analiz • 8’i aile hikayesine veya başka tümörlere sahip 11 KLL hastasında 5 farklı miRNA geninde mutasyon saptanmıştır miRNA genlerindeki mutasyonlar kanserin ailesel birikiminde etkili olabilir • • • • Pek çok kanser tipinde (ör. meme ve akciğer) miRNA ekspresyon düzeyleri ile klinik ve patolojik parametreler arasında korelasyon Azalmış let-7 miRNA düzeyleri akciğer Ca.’da kısa sağkalımla ilişkili Dicer enziminin azalması yetersiz diferansiyasyon ve kötü prognozla ilişkili bulundu miRNA’lar kanser diagnostiği, sınıflaması ve prognoz tahmininde potansiyel öneme sahip Kök Hücreler, miRNA’lar ve Kanser • • • Kanser kök hücre modeli: tümör kitlesinin küçük bir oranı kök hücre özellikleri taşıyor. Bu hücreler, tümör inisiyasyonu ve metastazdan sorumlu, diferansiyasyon az Bu modelin miRNA’larla bağlantısı nedir? Tümör hücrelerinin gösterdiği miRNA profili, kök hücre miRNA profilini hatırlatır Tümörler, bir çok miRNA’yı düşük oranda eksprese ederken, kök hücre miRNA moleküllerini koruyor (örnek miR-17-92) Tedavide Hedef Olarak miRNA’lar • • • • • miRNA’lar, kanserin başlaması ve ilerlemesindeki muhtemel rolleri nedeniyle potansiyel terapötik hedef Pek çok miRNA’nın kanserde değişmiş ekspresyon gösterdiği düşünülürse, çok sayıda aday hedef söz konusu Onkogenik miRNA’larda hedef, ekspresyonu baskılamak; tümör baskılayıcı olanlarda arttırmak Tedavi amaçlı molekül, serumda stabil, hücrelerce alınabilme özelliği taşımalıdır miRNA’lar gen terapisi için uygun: in vivo ekspresyon viral vektörlerle veya kimyasal modifikasyonlarla sağlanabilir Tedavide Hedef Olarak miRNA’lar • • • • miRNA’lar antisense teknolojisi ile baskılanabilmekte Örneğin, antisens 2’-O-metil-modifiye RNA’ların kültür hücrelerinde miRNA işlevini inhibe ettiği gösterilmiştir. Bu tip moleküller, miR-17– 92 gibi onkogenik miRNA’ları hedeflemek için kullanılabilir miR-17-5p ve miR-20a’nın antisense oligonukleotidlerle inhibisyonu miR-17–92 gen kümesini aşırı eksprese eden akciğer kanser hücrelerinde özgül olarak apoptozisi indüklemiştir Olgun miRNA’ya komplementer tek zincirli, kimyasal olarak modifiye edilmiş, kolesterol-bağlı RNA’nın farelere intravenöz verilmesi CNS dışındaki tüm dokularda miRNA ekspresyonunu inhibe etmiştir Perspektifler • • • • • mikroRNA-kanser ilişkisinin ortaya konulması, kanser araştırmasında yeni bir dönemi başlatmıştır miRNA ekspresyon düzeylerindeki değişimler kanser gelişimi ile ilişkili miRNA’lar tarafından negatif olarak düzenlenen hedef mRNA’ların büyük çoğunluğu bilinmemektedir Bioinformatik yaklaşımlarla tek bir miRNA’nın yüzlerce hedef geni saptanabilir, ancak bunun biyolojik olarak teyitini sağlayacak detaylı yöntemler eksiktir miRNA işlevlerinin biyolojik ve fonksiyonel mekanizmalarının aydınlatılması ve kanserdeki oynadığı rolün daha iyi anlaşılması için hedef genlerin saptanması gerekmektedir
