Tanı ve Tedavide mikroRNA`ların Potansiyel Değeri ve Araştırma

Türk Farmakoloji Derneği
XXI. Eğitim Sempozyumu
Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı işbirliğiyle
Farmakolojide Yeni Hedefler:
Tanı ve Tedavide mikroRNA'ların Potansiyel
Değeri ve Araştırma Yöntemleri
30 Mayıs 2014
Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, 20 Mayıs Amfisi, Bornova İzmir
Program
30 Mayıs 2014
08:45-09:30
Kayıt ve kahvaltı
09:30-10:20
miRNA ve Diğer “NonCoding” RNA’ların Tanı
ve Tedavi Stratejileri
Geliştirilmesindeki Yeri
10:20-10:30
Soru/katkı
10:30-11:10
Prostat Kanserinin
İlerleme Sürecinde
miRNA’lar
11:10-11:20
Soru/katkı
11:20-11:30
Kahve arası
11:30-12:20
Klinik Genetik Tanıda
Yeni Nesil Dizi Analizi
Uygulamaları
12:20-12:30
Soru/katkı
12:30-14:30
Öğle yemeği arası
E.Ü. Öğretim Üyeleri Lokali
14:30-15:10
İnsan Primer Aort
Hücrelerinde miRNA’ların
Yeni Nesil Dizi Analizi ile
belirlenmesi
Yrd. Doç. Dr. Yasemin ERAÇ, Ege
Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi,
Farmakoloji AbD
15:10-15:20
Soru/katkı
15:20-16:00
İnsan Hepatoselüler
Karsinoma Hücre
Hattında Transkriptom
Analizi
16:00-16:10
Soru/katkı
16:10-16:20
Kahve arası
16:20-16:50
Laboratuvar tanıtım
gezisi
16:50-18:30
Serbest zaman
18:30
Otelden hareket
Ege Sağlık Oteli
19:30
Akşam yemeği
Levent Marina, İnciraltı Kent
Ormanı
Prof. Dr. Mehmet S. SERİN, Mersin
Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi,
Farmasötik Mikrobiyoloji AbD
Doç. Dr. Buket KOSOVA, Ege
Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi
Biyoloji AbD
Doç. Dr. Hüseyin ONAY, Ege
Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi
Genetik AbD
Dr. Çiğdem SELLİ, Ege
Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi,
Farmakoloji AbD
Farmasötik Bilimler Araştırma
Laboratuvarı
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
miRNA VE DİĞER “NON-CODING” RNA’LARIN TANI VE TEDAVİ STRATEJİLERİ
GELİŞTİRİLMESİNDEKİ YERİ
Prof. Dr. Mehmet Sami SERİN
MEÜ. Eczacılık Fakültesi Farmasötik Mikrobiyoloji AD
Yaklaşık 50 yıldan beri “gen” terimi mRNA’ları kodlayarak genetik bilgiyi protein diline
tercüme eden bölgelerle aynı anlamda kullanılmıştır. Bununla birlikte son yıllarda
yapılan tüm genom ve işlevsel analiz çalışmaları insan genomunun yaygın olarak
binlerce düzenleyici “non-coding” RNA (ncRNA)’lar transkribe ettiğini ortaya
koymuştur. Bunlar arasında mikro RNA (miRNA)’lar, small interfering RNA
(siRNA)’lar, P-element-induced Wimply Testis (PIWI) interacting RNAs (piRNA)’lar ve
çeşitli uzun “long non-coding RNA” (lncRNA)’lar bulunmaktadır (1), (Tablo-1). Ayrıca,
genom üzerinde yer alan ve hastalıklarla ilişkili olan genetik varyasyonların büyük bir
kısmının, protein kodlayan bölgelerin dışında kalan ve transkripsiyonu kontrol eden
“promoter”, “enhancer” gibi bölgelerde ve gen ekspresyonunu düzenlemede görev
yapan ncRNA’larla ilişkili olduğu da bulunmuştur (2).
Tablo-1: Non-coding RNA’lar ve karakteristik özellikleri (1)
Başlıca ncRNA Sınıfları
Karakteristik Özellikleri
Long
(regulatory)
non-coding > ∼200 nt, epigenetik kontrol, subselüler
RNAs (lncRNAs)
kompartmanların veya lokalizasyonların spesifik
olarak belirlenmesi
Small interfering RNAs (siRNAs)
∼21–22
nt.
Komplementer
dsRNA
duplekslerinden Dicer kesimi ile oluşurlar. Gen
düzenlenmesi, transpozon kontrolü ve viral
savunmada görev alırlar.
microRNAs (miRNAs)
∼22 nt. post-transkripsiyonel gen düzenlenmesi
PIWI-interacting RNAs (piRNAs)
Dicer bağımsız sRNA, ∼26–30 nt. Temel olarak
germline ve germline sınırında yer alan somatik
hücrelerde bulunur. Transpozon aktivitesi ve
kromatin durumunu düzenlerler.
Promoter-associated
RNAs Promotor bölgeleriyle ilişkili uzun ve kısa
(PARs)
RNA’lardır. Gen ekspresyonunu regüle ederler.
Small nucleolar RNAs (snoRNAs)
Geleneksel olarak rRNA metilasyonu ve yalancı
urilasyona klavuzluk yaparlar. Bununla beraber
gen düzenleyici işlevlerinin de olduğu ortaya
çıkmaktadır.
Diğer ncRNA sınıfları
X-inactivation RNAs (xiRNAs), Sno-derived RNAs (sdRNAs), microRNA-offset RNAs
(moRNAs), tRNA-derived RNAs, MSY2-associated RNAs (MSY-RNAs), Telomere
small RNAs (tel-sRNAs), Centrosome-associated RNAs (crasiRNAs)
Şimdiye kadar tanımlanan sınıflar içerisinde miRNA’lar, siRNA’lar ve piRNA’lar
effektör Argonaute proteinlerin klavuzluğunda genomik lokus veya hedef RNA’lara
dizi spesifik bir düzende bağlanarak onları kesime uğratarak susturmaktadır. Bu
özelliklerinden dolayı da üzerinde en fazla çalışma yapılan grupları oluşturmaktadırlar
(2).
Bu küçük RNA’lar tarafından yönlendirilen gen ekspresyonunun kontrolü, hücresel
işlevlerin düzenlenmesinde yer alan temel prensiplerden birisi olarak benimsenmiştir.
1
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
Bu süreçte işlev gören temel proteinler Argonaute ailesi üyeleridir. Argonaute
proteinleri, miRNA, siRNA ve piRNA gibi küçük RNA komponentlerinin yüksek
özgüllükte bağlanacak şekilde özelleşmişler ve diğer bazı proteinlerle de etkileşerek
“RNA interferans” (RNAi) olarak da bilinen “downstream” gen susturma olaylarını
koordine etmektedirler. Bu diziye özgül özelliklerinden dolayı son yıllarda birçok
siRNa-RNAi, shRNA-RNAi ve miRNA-RNAi aracılı terapötik tasarımlar
geliştirilmektedir (3).
İnsanlarda 1000’den fazla miRNA, yüzlerce siRNA ve binlerce benzersiz piRNA
dizisinin varlığı küçük RNA’ların tüm RNA’lar içerisinde önemli bir işlevsel konuma
sahip olduğunu ve bazal düzenleyici sistemde yaygın olarak görev aldıklarını ortaya
koymaktadır.
Ekzojen siRNA’lar 10 yıl önce keşfedilmiş olmakla beraber endojen siRNA’lar meyve
sineklerinde ve memelilerde son yıllarda tanımlanmışlardır. Endojen siRNA’lar antiviral savunma, transpozon susturma, kromozomal yeniden modellenme ve posttranskripsiyonel gen susturmada “PTGS” (Argonaute aracılı hedef transkript kesimi)
rol oynamaktadır (1,2).
Hastalık oluşumlarında küçük ncRNA’lar
Küçük RNA’lar kök hücre ve germline sürekliliği, gelişmesi ve farklılaşması, PTGS ve
subselüler lokalizasyon gibi hemen hemen tüm gelişim süreçlerinde rol
oynamaktadırlar. Bu nedenlerden dolayı süreçteki bir bozukluğun insan hastalıkları
ile ilişkili olması sürpriz değildir. Örneğin, karaciğer, pankreatik, özofajiyel, mide,
kolon, hematopoietik, over, meme, hipofiz, prostat, tiroid, testiküler ve beyin
kanserlerinde miRNA ekspresyonlarında anomaliler gözlenmektedir. miRNA genleri
genellikle insan genomunun kırılgan bölgelerinde bulunmakta olup bu bölgeler
onkojenik viral integrasyon bölgeleriyle de ilişkilidir. Ayrıca, spesifik küçük RNA
lokusunun kaybı, Prader-Willi Sendromu gibi hastalıklarla da ilişkilendirilmiştir.
Protein kodlayan genler gibi küçük RNA’lar da hastalıkların aktivatörleri veya
inhibitörleri olarak işlev görebilirler. Bir farklılaşma faktörü olarak rol oynayan let-7 bir
tümör baskılayıcı olup ekspresyon düzeyindeki azalma, düşük sağkalım oranına
sahip olan insan akciğer kanserleri ile ilişkilendirilmiştir. Bunun aksine mir-29b
ekspresyonu ovarian seröz karsinomada hastalıksız bir sağkalım ile ilişkilendirilmiştir.
miRNA’ların değişen ekspresyon düzeylerinin önemi, hedeflerine bağlı olarak
değişmekte olup, ya tümör baskılayıcı veya onkojenik işlev gösterirler ve bu
değişimler, üzerinde çalışılan tüm kanser tiplerinde gösterilmiştir. Benzer ilişki,
kardiyovasküler hastalıklarda ve diğer birçok hastalıkta da belirlenmiştir (1,2).
Küçük ncRNA’ların Tanı Stratejileri geliştirilmesindeki yeri
Yukarıda özetlenen işlevsel özelliklerinden dolayı, kısa ncRNA’lar, özellikle miRNA’lar
ekspresyon düzeylerindeki anomaliler veya kendilerini kodlayan genlerdeki
varyasyonlardan dolayı ilişkili oldukları protein sentez düzenlenmesini yeterince
yapamazlar ve ilişkili oldukları proteinlerin kritik işlevleri ile ilişkili olarak çeşitli
hastalıklar ortaya çıkmaktadır. İşte bu anomalilerin belirlenmesi ilişkili oldukları
hastalıkların da özgül tanısını sağlayabilmektedir.
Çeşitli çalışmalarda yapılan gözlemler, parafine gömülü klinik örneklerde ve insan
plazmasında bulunan miRNA’ların yüksek bir stabiliteye sahip olduğunu ve bu
örneklerde yapılan miRNA ekspresyon kalıbı analizinin çeşitli hastalıkların durumları
hakkında yararlı bilgiler sunabileceğini ortaya koymuştur. Yayınlanan ilk raporlardan
birinde 217 memeli miRNA’sı klinik örnekler, yaygın olarak kullanılan kanser hücre
2
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
kültürleri ve fare tümörlerini de içeren yüzlerce örnekte çalışılmış ve miRNA
ekspresyon kalıbının tümör gelişimi orijinini belirleyebildiği ve 217 miRNA’nın
129’unun ekspresyonunun kanserlerde genellikle baskılandığı gösterilmiştir. Daha
ileri çalışmalarda, miRNA ekspresyon kalıpları kanser alttiplerinin belirlenmesinde
kullanılmıştır.
Çeşitli kanser türlerinde yapılan araştırmalar, miRNA ekspresyon kalıplarının klinik
progresyonun öngörülmesine olanak sağladığını ortaya koymuştur. miR-15a/16-1
kronik lemfositik lösemi (CLL)’de let-7a akciğer kanserlerinde tanısal biyomarkerler
olarak değerlendirilmektedir. Kanserlere ek olarak miRNA ekspresyon kalıpları kalp
hastalığı, kas rahatsızlıkları ve nörodejeneratif bozuklukların farklı formlarının
ayrımında kullanılabilmektedir (4).
miRNA ekspresyon düzensizliklerinin belirlenmesinde yaygın olarak kullanılan 2
temel yaklaşım vardır:
1. Gen ekspresyon kalıplarının belirlenmesi
2. Genetik varyasyonların belirlenmesi
Gen ekspreyon kalıplarının belirlenmesi kullanılan teknikler:
 Northern Blotting
 In situ Hibridizasyon
 Mikrodizin platformları
 Yeni Nesil Dizileme (Next Generation Sequencing, NGS)
 Nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR)
Yukarıdaki teknikler kullanılmakla birlikte özellikle miRNA’lar için günümüzde en
yaygın olarak kullanılan yöntem: miRNA ekspresyon kalıplarının High throughput
Stem-loop RT-qPCR ile belirlenmesidir.
“High throughput Stem-loop” RT-qPCR miRNA ekspresyon kalıplarının
belirlenmesi
2005 yılında Chen ve arkadaşları tarafından yeni bir miRNA nicel belirleme yöntemi
geliştirilmiştir. Bu yöntemde önce miRNA bir “stem-loop” primeri ile reverse
transkripsiyona (RT) uğratılıp daha sonra elde edilen cDNA’nın kalıp DNA olarak
kullanıldığı TaqMan PCR analizi uygulanmaktadır. Bu şekilde zaten 19-21 nt.lik olan
miRNA’lara primerlerin bağlanma oranı ve fidelite önemli ölçüde arttırılıp geleneksel
oligo-dt RT tepkimesine göre çok daha özgül cDNA’ların elde edilmesine de olanak
sağlanmıştır. Bu şekilde genomik DNA kontaminasyonu da engellenmektedir. Rutin
analizlerde birçok miRNA için 25 pg total RNA bu yöntem için yeterlidir. Diğer yandan
akışkan entegre devrelerin geliştirilmesiyle de bir örnek ile aynı anda 300’ün üzerinde
qRT-PCR yapma olanağı doğmuştur. Günümüzde geliştirilen daha yüksek kapasiteli
akışkan diziler (fluidic arrays) ile tepkime sayısı da gittikçe artmaktadır.
Bu yöntem aynı zamanda doku ve çeşitli hastalıklara özgül, hızlı ve duyarlı miRNA
ekspresyon kalıplarının belirlenmesine de olanak vermektedir. Stem-loop qRT-PCR
ile aynı zamanda siRNA gibi diğer küçük ncRNA’ların miktarları da
belirlenebilmektedir (5).
Alternatif olarak mikrodizin tabanlı sistemler de bu amaçla kullanılmaktadır.
Az sayıdaki miRNA analizleri için müşteriye özel “custom design” çalışma yapmak da
olasıdır. Ekspresyon değişimlerini gösteren miRNA’ların belirlenmesi, ilişkili oldukları
protein ekspresyonu ile birlikte hangi hastalıklarla sonuçlanıyor ise ona göre bir
3
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
biyomarker özelliğine sahip olup olmadıkları belirlenir ve bu özelliğe sahip olan
değişimler ilişkili hastalığın tanısında kullanılır. Günümüzde çeşitli hastalıkların erken
tanısına önemli ölçüde destek veren miRNA biyomarkerleri belirlenmiş ve tanı amaçlı
olarak yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır.
miRNA’ların solid dokulardan elde edilen örneklere ek olarak hasta
serum/plazmasında da belirlenebilmesi, kanser gibi tanısında mutlaka girişimsel
tekniklerin (biyopsi) kullanılmasını gerektiren hastalıklarda oldukça kolay bir örnek
eldesine (kan alma gibi non-invasive işlemlerle) gereksinim duyulması tanısal
değerini daha da arttırmaktadır (4).
Çalışma grubumuzca yapılan bazı araştırmalarda da gastrik kanserin erken tanısında
kullanılabilecek bir biyomarker olarak miR-195-5p, HBV infeksiyonu ile ilişkili olarak
gelişen kronik hepatit B, siroz ve hepatosellüler karsinoma’da miR-125b-5p ve
miR223-3p, benzer şekilde HCV ile ilişkili olarak gelişen kronik hepatit C, siroz ve
hepatosellüler karsinoma’da miR-223-3p, miR-17-5p ve miR-24-3p ekspresyon
değişimleri, ayrıca kolorektal kanserlerde miR-150-5p, miR-30a-5p, miR-34a-5p, ve
miR-195-5p ekspresyon değişimleri biyomarker olarak kullanılabilecek potansiyelde
bulunmuştur (6,7,8,9).
Genetik varyasyonların belirlenmesinde özellikle son yıllarda çok daha yaygın olarak
kullanım olanağı bulan yeni nesil DNA dizi analizi yöntemleri teknolojide sağlanan
önemli gelişmelerle birlikte başarıyla uygulanmaktadır.
Küçük ncRNA’ların Tedavi Stratejileri geliştirilmesindeki yeri
Yukarıda da belirtildiği gibi miRNA’lar, siRNA’lar ve piRNA’lar gibi sncRNA’lar diziye
özgü bir düzende mRNA transkripsiyonunun post transkripsiyonel olarak
durdurulmasıyla sonuçlanan bir gen ekspresyonunudüzenlemektedir. Bu
özelliklerinden dolayı dizi spesifik gen susturma hedefli ilaç tasarımlarında sıklıkla
kullanılmaktadırlar.
Gen susturmanın yanı sıra, ekspresyondaki düzensizlik bir hastalıkla ilişkili ise
mevcut miRNA’nın veya miRNA biyogenezinin kritik bir yolağının bloke edilmesi ile
elde edilen terapötik yarar da ilaç tasarımlarının temelini oluşturmaktadır.
Son yıllarda tasarlanan ve üzerinde klinik çalışmaların yapıldığı küçük ncRNA’lar
özellikle miRNA-RNAi ve siRNA-RNAi tabanlı olup henüz etkili bir aşısı veya tedavisi
olmayan çeşitli viral infeksiyonlar ve bir çok kanser türü üzerine yoğunlaşmış
durumdadır.
Potansiyonel olarak gen veya protein sentez bozukluğu aracılı her hastalık, hücre tipi
veya doku tipi; miRNA, miRNA-RNAi veya siRNA-RNAi tabanlı hedefleri
oluşturabilirler. Bu önemli avantajdan dolayı günümüzde sadece kanser tedavisinde
kullanılmak üzere 56 şirket 127 kanser araştırma projesi kapsamında 96 sncRNA
(miRNA, RNAi & siRNA) tabanlı ilaç geliştirme çalışması yapmaktadır. Onkolojik
tedavi amaçlı bu ilaçlar temel 24 hücresel fonksiyon içerisinde yer alan 63 potansiyel
molekülü hedeflemektedir (10). Bu hücresel işlevler aşağıda sunulmuştur:
- Hücre adezyon molekül aktivitesi
- Kofaktör bağlanması
- Sitokin aktivitesi
- Büyüme faktörü aktivitesi
- GTPaz aktivitesi
- Kinaz aktivitesi
- Liganda-bağımlı nükleer reseptör aktivitesi
4
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
- Metallopeptidaz aktivitesi
- Moleküler işlevi bilinmeyenMotor aktivite
- Oksidoredüktaz aktivitesi
- Peroksidaz aktivitesi
- Proteaz inhibitor aktivitesi
- Protein serin/treonin kinaz aktivitesi
- Protein treonin/tirozin kinaz aktivitesi
- Reseptör aktivitesi
- Reseptör sinyal kompleks bağlantı aktivitesi
- RNA bindingbağlanması
- Serine-tip peptidaz aktivitesi
- Yapısal molekül aktivitesi
- T hücre reseptör aktivitesi
- Transkripsiyon faktör aktivitesi
- Translasyonel düzenleyici aktivitesi
- Transmembran reseptor protein tirozin kinaz aktivitesi (10).
Küçük Oligonükleotidlerin Gen Susturmasında Kullanılması
1998’de Fire ve arkadaşları RNA interferans (RNAi) olarak tanımlanan ve küçük tek
zincirli ncRNA’lar ile gen ekspresyonunu kontrol eden bir mekanizma keşfetmişlerdir
(11). Bu mekanizmanın en önemli kısmının dizi özgüllüğünü sağlayan Argonaute
proteinlerinin klavuzluğunda gerçekleşmesi RNAi mekanizmasının araştırmacılar
tarafından çeşitli genetik hastalıklar ve kanser tedavisinde kullanılabilecek önemli bir
araç haline gelmesine neden olmuştur. RNAi uygulamaları, potansiyel olarak hedefi
protein sentezinin inhibisyonu olan her durum için uygulanabilir olmasından dolayı,
oldukça büyük bir potansiyel değer oluşturmuştur. Zira günümüzde kullanılan
konvansiyonel farmasötik ilaçlar sadece 500 civarındaki farklı protein ve bunlarla
ilişkili yolakları hedeflerken, post genomik çağda insan genomunun 20,330 farklı
proteini kodladığının belirlenmesi ve her protein hedefe yönelik antisens oligo
nülkleotid (ASO) tasarımının mümkün olması, bu alanın önemini vurgulamaktadır
(12).
RNAi teknolojisinde kullanılan küçük ncRNA’lar 4 temel sınıfa ayrılmışlardır:
 small interfering RNA (siRNA)
 short hairpin RNA (shRNA)
 microRNAs (miRNAs)
 P-element-induced wimpy testis (PIWI) interacting RNAs (piRNA)
Yeni keşfedilen bazıları da benzer amaçlarla tasarlanmaktadırlar.
siRNA
RNAi teknolojisinde ilk kullanılan sentetik RNA’lardır. Bu süreçte uzun dsRNA
molekülleri Dicer adı verilen bir RNAaz III enzimi ile her 2 ucunda 2’şer nüklotidlik tek
zincirli uç oluşturacak şekilde 19-23 nükleotidlik siRNA’lara kesilirler. Oluşan
siRNA’lar komplementeri olan hedef mRNA’lara bağlanarak onları klevaja uğratarak
post transkripsiyonel olarak gen ekspresyonunu durdururlar. Bu siRNA’lar daha
sonra, bir multiprotein-RNA nükleaz kompleksi olan, RNA-aracılı ile indüklenen
susturma kompleksi (RISC)’ne bağlanır. siRNA, RISC’in klavuzluğunda hedef
komplementer mRNA’ya dizi spesifik olarak bağlanır ve kompleks içerisinde yer alan
endonükleazlar ile onu sonrasında küçük fragmanlara böler. Kesime uğrayan mRNA
daha sonra house-keeping endonükleazlarla sindirilerek hücreden temizlenir.
5
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
Sonuçta ilgili protein
(susturulmuş) olur (12).
sentezi
post
transkripsiyon
aşamasında
baskılanmış
shRNA
shRNA’lar genellikle uzun sureli gen susturma proseslerinde kullanılmak üzere
geliştirilmiştir. shRNA’lar nükleusta kısa dsDNA’lardan bir saç tokası şekli oluşturacak
şekilde transkribe olurlar. shRNA transkripti sentezlendikten sonra siRNA aracılı
RNAi sürecinde olduğu gibi dicer enzimi ile kesilir, RISC’e bağlanır ve hedef
komplementer mRNA’ya dizi spesifik olarak bağlanarak süreç siRNA aracılı RNAi ile
aynı şekilde sonlanır (12).
miRNA
miRNA’lar ncRNA’ların bir başka grubu olup gen düzenlenmesinde oldukça büyük bir
öneme sahiptir. Hücrelerde yüksek düzeyde korunmuş diziler olarak bulunurlar.
miRNA ilk olarak intergenik dizilerde veya intronlarda yerleşmiş olan öncüllerden
primer transcript (pri-miRNA) olarak transkribe olurlar. Daha sonra, Drosha olarak
bilinen RNaz III endonükleaz ile sindirilerek pre-miRNA formuna dönüşür ve
sitoplazmaya transfer edilir. Sitoplazmada pre-miRNA aynı siRNA ve shRNA’da
olduğu gibi Dicer enzimi ile kesilerek 20-23 bp’lık olgun miRNA molekülüne dönüşür.
Olgun miRNA’lar da siRNA ve shRNA’lar gibi RISC kompleksine bağlanarak ilişkili
oldukları komplementer mRNA’yı klevaja uğratırlar (12,13).
siRNA, shRNA ve miRNA arasındaki bir önemli fark; siRNA ve shRNA’nın hedef
mRNA ile tam bir dizi özgüllüğüne gereksinim duymalarına karşın miRNA’da durum
farklıdır. miRNA’ların bir kısmı mRNA’lar ile birebir eşleşmezler (12).
Bir tek miRNA’nın ekspresyon düzeyindeki değişiklik 100’den fazla farklı geni
etkileyebilir. miRNA’ların gen düzenlenmesindeki işlevi farklı şekillerde olabilir.
miRNA’lar, hedef mRNA’nın 3’ UTR (untranslated region) bölgesine bağlanarak
translasyonu baskılar. Bununla birlikte bazı çalışmalar 3’ UTR’den daha az miktarda
olmakla beraber miRNA’ların protein kodlayan bölgeleri ve mRNA’nın 5’ UTR
bölgelerine de bağlanabildiğini göstermiştir. Diğer bazı çalışmalarda da mRNA’ların 5’
UTR bölgesine veya DNA’ya bağlanarak gen ekspresyonunu indükleyebildiği de
gösterilmiştir (12,13).
piRNA
piRNA’lar PIWI proteinleri ile etkileşen küçük ncRNA’lardır. PIWI proteinleri,
Argonaute protein ailesinde yer alan bir grup proteindir ve Drosophila ve memeliler
gibi çeşitli organizmaların germinasyon hatlarında predominant olarak eksprese
edilirler. piRNA’lar susturma kompleksi tekrar elementlerinin sürekliliğine, genomun
bütünlüğünü korumaya ve gametlerin oluşumuna yardımcı olurlar. Bunlara ek olarak,
Drosophila’da piRNA’ların bir alt grubu susturma proteinlerini kodlayan genlerin
düzenlenmesinde işlev görmektedirler. piRNA-PIWI komplekslerinin doğrudan
transpozon aktivitesini kontrol ettikleri kabul edilmektedir. piRNA’ların PIWI
proteinlerine bağlanarak homolojik bir hedef kesimi gerçekleştirdikleri in vitro olarak
gösterilmiştir. Bu nedenle, transpozonların olasılıkla post-transkripsiyonel yıkıma
uğratılarak susturuldukları düşünülmektedir.
piRNA’lar, siRNA ve miRNA’lardan aşağıdaki özellikleri bakımından farklılıklar
gösterirler:
1. piRNA’lar genellikle 24-31 nt.lik diziler içerirler. Diğer ncRNA’lar yaklaşık 21
nt.dir.
6
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
2. miRNA’ların yüzlerce türüne karşın piRNA’lar yaklaşık 50,000 türe sahiptir.
3. Bazı piRNA’lar epigenetik düzenlemelere katılmaktadırlar. siRNA ve
miRNA’lar genellikle mRNA’ları hedeflemektedirler (12).
İlaç geliştirme süreçleri devam eden bazı spesifik miRNA’lar:
Viral Hepatit C hastalığında miR-122
Hepatit C Virüs (HCV)’ünün replikasyonunda, karaciğere özgü bir miRNA olan mir122’nin kritik bir önemi olduğu gösterilmiştir. miR-122’ye komplementer dizi-özgüllüğü
olan bir ASO dizi tasarımının operasyonel olarak kullanılması HCV RNA replikasyon
düzeyini önemli ölçüde azaltmaktadır. Bu deneysel gözlem miR-122’yi antiviral bir
hedef olarak şiddetle önermektedir. Bildirilen ilk raporlardan sadece birkaç ay sonra
kimyasal olarak tasarlanmış ve “antagomirler” olarak isimlendirilen yeni bir
oligonükleotidler sınıfı ortaya çıkmıştır. İntravenöz olarak uygulanan bu
oligonükleotidler olgun miRNA’lara komplementer dizilerden oluşmakta ve hücresel
internalizasyonun sağlanması için kolesterol ile konjuge edilmiştir. Yapılan ilk
çalışmalarla antagomirlerin intravenöz sistemik teslimatı önemli ölçüde valide edilmiş
ve zaman içerisinde birçok dokuda hedef miRNA düzeylerinde önemli azalmalar
gözlenmiştir. Daha sonraları sistemik uygulamalarda “Locked Nucleic Acid” (LNA)
içeren anti-miR’ler kullanılmış ve fare ve “non-human” primatlarda miR-122
potansiyel olarak antagonize edilmiştir. HCV ile kronik infekte şempanzelerde LNAanti-miR-122 ile yapılan çalışmalarda HCV viremisinin etkili ve güvenli bir şekilde
baskılandığı ve HCV infeksiyonu ile indüklenen karaciğer patolojisinin de önemli
ölçüde iyi bir prognoz sergilediği bildirilmiştir. Anti-miR-122 ile yapılan klinik
çalışmalar halen devam etmektedir (14), (www.clinicaltrials.gov).
Patolojik kardiyak yeniden modellenmede miR-208
Genetik bir delesyonun oluşumu ilk defa miR-208a’da bildirilmiştir. Ayrıca miR-208a
şimdiye kadar bildirilen tek kardiyo-spesifik miRNA’dır. Kardiyak stres süresince miR208a’nın ekspresyon düzeyi görece stabil kalmakla beraber bu miRNA’nın kardiyak
strese yanıt sürecinde βMHC ekspresyonunda, kardiyak hipertrofide ve kardiyak
yeniden modellenmede temel işlevi olduğu görülmektedir. miR-208a-null fare torasik
aortik kasılma veya bir Ca+2/Kalmodulin bağımlı fosfataz olan “calcineurin” ile oluşan
sinyal sonucu gelişen aşırı basınca yanıtta kardiyomiyosit veya fibrötik hipertrofi
göstermemiş ve βMHC upregülasyonu yapamamıştır. Streste miR-208a
ekspresyonunun önemli değişiklikler göstermediği ancak strese bağlı patolojik
kardiyak yeniden modellenmede varlığına gereksinim duyulduğundan LNA-modifiye
bir anti-miR’in sistemik olarak kullanımının gelişen bu patolojik yeniden modellenmeyi
terapötik olarak baskıladığı gösterilmiştir. LNA-anti-miR208a’nın subkutan
uygulanması, diyastolik kalp hastalığında patolojik kardiyak yeniden modellenme,
işlevsel bozulma ve letaliteyi önlemektedir(13,14).
İnflamatuvar hastalıklarda miR-155
miR-155 immün sistemde görev alan önemli bir regülatördür. miR-155’te görülen
genetik delesyonların yardımcı T hücre farklılaşmasında ve en azından sitokin üretimi
düzenlenmesinde önemli aksamalara neden olduğunu göstermiştir. Yapılan çeşitli
çalışmalarda, makrofaj kültürleri ve fareler LPS (lipopolisakkarid) ile etkileştiklerinde
miR-155 ekspreyon düzeylerinde artış meydana geldiğini göstermektedir (14).
Gerçekleştirdiğimiz diğer bir çalışmada da LPS verilerek deneysel septik şok modeli
oluşturulan farelerde miR-150, miR-223 ve miR-297 ekspresyonunun ciddi şekilde
7
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
arttığı, 5,14-HEDGE verildiğinde ise bu miRNA’ların hızlı bir şekilde azaldığı
gösterilmiştir (15).
Transkripsiyon faktörü c/ebp β miR-155’in direkt hedefidir. Fare makrofajlarında ve
insan monosit hücrelerinde LPS ile stimüle edilen makrofajlarda LNA-modifiye antimiR-155’in sistemik olarak uygulanması ile c/ebp izoformlarının derepresyon ve
granulosit koloni stimüle edici faktör (GCSF) ekspresyonunda downregülasyon
meydana gelmektedir. Bu bulgular, miR-155 antagonistlerinin kronik inflamatuvar
hastalıkların tedavisinde kullanılabilme potansiyelinde olduğunu göstermektedir.
Fibroz’da miR-21
miR-21, kanserden kalp hastalıklarına kadar çeşitli patolojik durumlarda oldukça
dinamik olarak regüle edilen miRNA’lardan birisidir. Antagomirlerle miR-21’in in vivo
şartlarda bloke edilmesi ile kardiyak hipertrofinin baskılandığı, interstisyal fibrozun
inhibe edildiği, kardiyak disfonksiyonun azaldığı bildirilmiştir. Henüz açıklanamayan
bazı çelişkilere rağmen miR-21’in inhibisyonu hem kanser hem de fibrotik hastalıklara
yönelik terapötik uygulamalar için üzerinde aktif olarak çalışmaların yapıldığı bir
araştırma alanıdır.
Neo-anjiyogenez’de miR92a
İntravenöz antagomir uygulaması ile miR-92a’nın inhibisyonu hem yeni kan damarları
oluşumunu (anjiyogenez) hem de iskemi ve myokardial infarksiyon modellerindeki
hasara uğramış dokularda işlevsel bir iyileşme oluşturmaktadır. Bu özelliğinden
dolayı miR-92a inhibisyonu iskemik kalp hastalığı ve periferik arter hastalıkların
tedavisi için yeni bir araştırma alanı oluşturmuştur.
Metabolik Hastalıklarda miR-33
miR-33a ve miR-33b sterol regulator element-bağlayıcı proteinleri (SREBPs)’nin
intronlarında yer almaktadır. SREBP2 miR-33a regülasyonu ile eksprese olurken
SREBP1 ekspresyonu miR-33b’den etkilenmektedir. Bu konak genler, kolesterol
biyosentezinde anahtar işlev gören transkripsiyonel regülatörlerdir. Çeşitli çalışmalar
miR-33a/b’nin, “high density lipoprotein” (HDL) sentezinde ve zıt kolesterol
transportunun önemli regülatörlerinden olan “ATP-binding cassette transporter A1”
(ABCA1) proteinini hedeflediğini göstermiştir. Farelerde LNA-modifiye anti-miR-33 ile
miR-33’ün inhibisyonunun ABCA1 ekspresyonunu ve kolesterol akışını arttırdığını,
ayrıca batı tipi beslenme ve LNA-modifiye ASO uygulamalarının, kan HDL
seviyelerini yükselttiği gösterilmiştir. Bu veriler, miR-33 inhibisyonunun aterom plak
oluşumunu engelleyerek terapötik tasarıma uygun olduğunu vurgulamaktadır (14).
Birçok işlevsel genin ekspresyonunun siRNA aracılı baskılanarak terapötik bir yararın
sağlandığı çeşitli hastalıklar bulunmaktadır.
siRNA tasarım stratejileri
siRNA aracılı susturma süreci terapötik yöntem bakımından 3 önemli özelliğe
sahiptir:
i) Post-transkripsiyonel etkinlik göstermesi
ii) Susturma özgüllüğünün yüksekliği
iii) Birçok farklı siRNA dizisi aynı hedef mRNA’yı inhibe edebilmektedir. Bu
nedenle en doğru hedefin susturulmasına yönelik tasarım ile non-spesifik etkinin
minimalize edilmesi önemlidir.
8
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
Bu özellikler temel olarak 2 sınıfa ayrılabilir; siRNA etkinliği ve siRNA özgüllüğü.
siRNA etkinliği, dizi seçimi, mRNA hedef bölgesinin yapısı ve ortalama G/C oranı ile
ilişkilidir. siRNA özgüllüğü ise karşılaştırmalı olarak dizi seçimi, seçilen dizinin
immünojenisitesi, ve seçilen hedefin benzersizliği ile ilişkilidir.
5’ Nükleotid seçimi
siRNA aktivitesi, siRNA içerisinde bulunan bir dizi konuma özgü baz seçimi ile
ilişkilidir. Etkinlik ile ilişkili olan baz dizileri genellikle siRNA’nın 5’-ucunda veya bu uca
en yakın olanları ile ilişkilidir. Bununla birlikte şu ana kadar özgül baz seçimi
konusunda tam bir fikir birliğine varılamamıştır.
mRNA hedef bölge
mRNA’nın sekonder yapısı RISC bağlanmasını ve kesimini engellemektedir. Ancak
bu engellemenin ne ölçüde olacağı ve en uygun bağlanma biyoinformatik veri
tabanlanan sağlanan dizilerin in-silico ortamda çeşitli olasılık-öngörü programları ile
yapılan analiz ile kolaylıkla belirlenebilmektedir.
Özgül olmayan etkiler
Bir siRNA’nın özgüllüğü hedef hücrelerin transkriptomu içerisindeki benzersiz dizilerin
seçilmesi ile başlar. Bununla birlikte kısmen komplamenter ve miRNA benzeri
hedeflerin olası varlığının araştırılması da hedef dışı (off-target) etkilerini azaltabilir.
Aynı zamanda, nükleotid tekrarlarından da kaçınmak gerekir. Özellikle GGGG
motiflerinin G-quartet sekonder yapı oluşturduğu bilinmektedir. miRNA benzeri
hedefler, siRNA’ların tohum (seed) bölgeye sahip olduğu durumlarda hedeflenmemiş
transkriptlerin translasyonal represyonuna neden olabilirler. miRNA benzeri dizilerin
çoğu tanımlanmış ve “http://www.mirbase.org” biyoinformatik veri tabanında
sunulmaktadır. Benzer şekilde diğer birçok veri tabanı ve “on-line” program bir
siRNA’nın hedef dışı etki olasılıklarını öngörebilmektedir. Basit bir BLAST (Basic
Local Alignment Search Tool) analizi (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ile
kolaylıkla olası hedef dışı etkiler algoritmik olarak belirlenebilmektedir. Bununla
birlikte, yine de hedef dışı etkiler çeşitli nedenlerle sorun oluşturmaya devam
etmektedir. Bu nedenlerden bazıları; eşleşme hatalarının dupleks içerisinde tolere
edilmesine karşın hangi eşleşme hatalarının tolere edildiğinin bilinmemesi öngörülen
miRNA benzeri hedeflerin her zaman belirlenememesidir.
Genetik varyasyonların da özellikle tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNPs) de dikkate
alınması gerekmektedir. Bir nükleotidlik farka sahip bir hedef bölgede, hedef
susturma etkinliği önemli ölçüde değişebilir. Bu nedenle sıklıkla SNP’lerin belirlenen
hedef bölgelerden kaçınmak gerekir. Yakın gelecekte daha da ucuzlayan DNA dizi
analizi ve sentez teknolojileri ile doğrudan hastanın kendi genotipine uygun özgül
siRNA terapötikler tasarlanabilecektir(16).
siRNA’ların hedef doku veya hücrelere ulaştırılması (delivery)
siRNA terapötiklerinin etkinliğini en çok zorlayan bariyer, hedeflenen hücre tipi, doku
veya organa siRNA’ların ulaştırılmasıdır. siRNA’lar büyüklükleri ve fosfodiester yapılı
omurgasının negatif elektrik yükünden dolayı hücre membranından doğrudan
geçemezler. Bu nedenle, kimyasal olarak sentezlenmiş veya in vitro olarak transkribe
edilmiş siRNA’ların uygulanmasında taşıyıcı olarak genellikle katyonik lipozomtabanlı stratejiler kullanılmaktadır. Bununla beraber, lipid-tabanlı taşıyıcı
9
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
sistemlerinde de karaciğerde hızlı yıkım ve hedef özgüllüğü gibi birçok sorun
yaşanmaktadır.
Uygulama yöntemleri ve taşıyıcı sistemler;
i) fiziksel yöntemler
ii) konjugasyon yöntemleri
iii) doğal taşıyıcılar (virüsler ve bakteriler)
iv) non-viral taşıyıcılar
olarak sınıflandırılabilir.
DNA-tabanlı ekspresyon kasetleri genellikle virüsler ve bakteriler tarafından hücrelere
aktarılırlar ve hücreye girdiğinde küçük firkete (small hairpin, sh) RNA (shRNA)
eksprese ederler. Bu amaçla geliştirilmiş en tanınmış taşıyıcılar adenovirüs ve
adeno-ilişkili virüs türevi vektörlerdir. Bununla beraber viral vektör kullanımında da
insertsiyonel mutajenez ve immünojenisite gibi sorunlar yaşanmaktadır (17,18).
Non-viral gen taşıyıcı sistemleri daha güvenli olmaları ve viral vektörlere göre daha
kolay tasarlanabilmeleri avantajları vardır. Günümüzde kullanılan non-viral taşıyıcılar
organik ve inorganik sistemler olarak sınıflandırılırlar. Organik kompleksler lipid
kompleksleri, konjuge polimerler ve katyonik polimerleri içermektedir. İnorganik
nanopartiküller ise manyetik nanopartiküller, “quantum dot”lar, karbon nanotüpleri ve
altın nanopartikülleridir (17).
İletişim Adresi:
Prof. Dr. Mehmet Sami SERİN
1. MEÜ. Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Mikrobiyoloji A.Dalı 33169, Yenisehir, Mersin
2. Mersin Üniversitesi İleri Teknoloji Araştırma Uygulama ve Eğitim Merkezi
(MEİTAM), Çiftlikköy, Mersin
[email protected]; [email protected]
KAYNAKLAR
1. Taft RJ, Pang KC, Mercer TR, Dinger M, Mattick JS. “Non-coding RNAs:
regulators of disease.” J Pathol 2010; 220: 126–139.
2. Hrdlickova B, de Almeida RC, Borek Z, Withoff S. “Genetic variation in the noncoding genome: Involvement of micro-RNAs and long non-coding RNAs in
disease”. Biochim Biophys Acta. 2014 Mar 22. pii: S0925-4439(14)00071-4. doi:
10.1016/j.bbadis.2014.03.011.
3. Meister G. “Argonaute proteins: functional insights and emerging roles”. Nat Rev
Genet. 2013 Jul;14(7):447-59.
4. Hydbring P, Badalian-Very G. “Clinical applications of microRNAs”.Version 3.
F1000Res. 2013 Jun 6 [revised 2013 Oct 8];2:136. eCollection 2013.
5. Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu
NL, Mahuvakar VR, Andersen MR, Lao KQ, Livak KJ, Guegler KJ. “Real-time
quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR”. Nucleic Acids Res. 2005 Nov
27;33(20):e179.
6. Gorur A, Balci Fidanci S, Dogruer Unal N, Ayaz L, Akbayir S, Yildirim Yaroglu H,
Dirlik M, Serin MS, Tamer L. “Determination of plasma microRNA for early
detection of gastric cancer”. Mol Biol Rep. 2013 Mar;40(3):2091-6.
7. Giray BG, Emekdas G, Tezcan S, Ulger M, Serin MS, Sezgin O, Altintas E, Tiftik
EN. “Profiles of serum microRNAs; miR-125b-5p and miR223-3p serve as novel
10
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
biomarkers for HBV-positive hepatocellular carcinoma”. Mol Biol Rep. 2014 Mar
5.DOI 10.1007/s11033-014-3322-3 [Epub ahead of print].
8. Öksüz Z, Serin MS, Döğen A, Kaplan E, Tezcan S, Aslan G, Emekdaş G, Sezgin
O, Altintaş E, Tiftik EN”. Serum/Plazma miR-223-3p, miR-17-5p ve miR-24-3p
ekspresyon profilleri Kronik Hepatit C (KHC), Siroz ve Hepatosellüler Karsinoma
(HSK)’lı
hastalarda
HSK’nın
non-invasive
biyomarkırları
olabilecek
potansiyeldedir” 9. Ulusal Hepatoloji Kongresi, 28 Mayıs-1 Haziran 2013, Bildiri
Kitabı.
9. Akbayir S, Unal ND, Fidanci SB, Gorur A, Yaroglu Hy, Ayaz L, Gundogdu R, Dirlik
M, Serin MS, Tamer L. “Evaluation of Plasma microRNA Expression Levels in
Early Diagnosis of Colorectal Cancer” Journal of Clinical & Experimental
Oncology, in Press.
10. Research
and
markets
2014,
erişim:
http://www.researchandmarkets.com/reports/2191815/.
11. Fire, A, Xu, S, Montgomery, M. K, Kostas, S. A, Driver, S. E, & Mello, C. C. Potent
and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis
elegans. Nature. (1998) 391, 806-11.
12. Sakiragaoglu O, Good D, Wei MQ. “Cancer Gene Therapy with Small
Oligonucleotides” Novel Gene Therapy Approaches; 2013, erişim:
“http://dx.doi.org/10.5772/54782”.
13. Broderick JA and Zamore PD. “MicroRNA therapeutics”. Gene Therapy (2011) 18,
1104–1110.
14. Rooij EV, Purcell AL, Levin AA. “Developing MicroRNA Therapeutics”. Circulation
Research 2012; 110: 496-507.
15. Sarı AN, Korkmaz B, Serin MS, Kaçan M, Ünsal D, Buharalıoğlu K, Fırat SŞ,
Falck JR, Malik KU, Tunçtan B. “ Sıçanlarda oluşturulan deneysel septik şok
modelinde
20-HETE
analoğu
5.14-HEDGE’nin
yararlı
etkilerine
MyD88/TAK1/IKKβ/NF-кB yolu etkinliği ile birlikte sistemik miR-150, miR-223 ve
miR-297 ekspresyon düzeylerindeki azalmanın katkısı. 22.ci Ulusal Farmakoloji
Kongresi, 4-7 Kasım 2013, Antalya, Bildiri Kitabı, s64, ss102.
16. Angart P, Vocelle D, Chan C, Walton SP. “Design of siRNA Therapeutics from the
Molecular Scale”. Pharmaceuticals 2013, 6, 440-468.
17. Lee JM, Yoon TJ, Cho YS. “Recent Developments in Nanoparticle-Based siRNA
Delivery for Cancer Therapy”. BioMed Research International Volume 2013,
Article ID 782041, 10 pages http://dx.doi.org/10.1155/2013/782041.
18. Serin MS. “Viral Hepatitlerle ilişkili Olarak Gelişen Hepatosellüler Karsinomanın
Tedavisinde Gen Tedavisi”. Viral Hepatit Dergisi, 2004; 9(3), 113-122.
11
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
12
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
Klinik Genetik Tanıda Yeni Nesil Dizi Analizi Uygulamaları
Doç. Dr. Hüseyin Onay
Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Genetik Anabilim Dalı
İnsanlık tarihinin en büyük bilim projesi olan İnsan Genom Projesi, normal insan
DNA’sının şifresini çözmeye çalışırken aynı zamanda DNA dizi analizi teknolojilerinin
gelişmesine de ön ayak oldu. Başlarda gözle görülebilir esas gelişme Sanger
dizileme temelli kapiler elektorforez sistemlerinde yaşandı. Tek kapilerli sistemlerden
96-384 kapilerli sistemlere geçiş yapılırken okuma uzunluğu 1000 baz çiftine, ham
veri doğruluğu da %99,999’a çıktı. Buna rağmen dizilenmesi gereken DNA’nın
uzunluğu göz önünde bulundurulduğunda alternatif yöntemlere olan ihtiyaç her geçen
gün arttı. İnsan Genom Projesi kapsamında ilk insan konsensus DNA dizisi 2001
yılında yayımlandı. İkinci Nesil Dizi Analizi (Yeni Nesil Dizi Analizi-Next Generation
Sequencing, NGS) teknolojisi konusundaki ilk yayınlar 2005 yılında bilim dünyasında
yerini almaya bşladı ve 2008 yılında da ilk defa NGS teknolojisi kullanılarak diploid
insan genomunun dizisi çıkartıldı. DNA’nın keşfiyle Nobel ödülü kazanan James D.
Watson’a ait olan bu DNA’nın dizilenmesi için yaklaşık 1,5 milyon dolar harcandı ve
ilk konsesnsus DNA’nın dizilenmesi için harcanan 3 milyar doların yanında son
derece mütevazı bir rakamdı. O günden itibaren NGS teknolojileri hızla genetiğin
çehresini değiştirmeye başladı. NGS teknolojilerindeki baş döndürücü ilerleme bu
teknolojilerin de kendi içinde 2., 3. ve 4. nesil olarak sınıflandırılmasına neden oldu.
Sanger sekanslama teknolojisinde esas olarak tek bir fragmanın dizilenmesi söz
konusu iken NGS teknolojilerinde aynı anda milyonlarca fragmanın dizilenmesi
olasıdır. Bu nedenle birçok farklı isimlendirmesi olan NGS teknolojilerini en iyi anlatan
tanımlardan bir tanesi “Massively Parallel Sequencing”tir. Bu tanım milyonlarca
amplifiye edilmiş DNA fragmanının katı bir yüzey üzerine sabitlenerek aynı anda
dizilenmesini anlatmaktadır ve özetle ikinci nesil NGS’nin temelini oluşturmaktadır.
İkinci nesil NGS’de milyonlarca fragmandan gelen veriler birleştirilerek DNA dizisi
ortaya çıkartılmaktadır. Dünyada ikinci nesil NGS teknolojileri her geçen daha fazla
laboratuvarda yer almaktadır. Burada başta Illumina olmak üzere Roche ve Life
Technologies’e ait sistemler bulunmaktadır. Üçüncü nesil NGS teknolojilerinde ise tek
molekül sekanslama kullanılmaktadır. Şu anda rutin kullanıma girmemiş olsa da
üçüncü nesil teknolojiler kanser gibi klonal değişikliklerin önemli olduğu çalışmalarda
büyük bir avantaj sağlayacaktır. Dördüncü nesil NGS ise şu aşamada son derece
deneyseldir ve hücre bazında DNA analizi denebilecek bir temelde ilerlemektedir.
Özellikle somatik mutasyonların değerlendirilmesinde son derece faydalı olacak bir
teknoloji olarak düşünülmektedir.
NGS teknolojilerinde meydana gelen bu olağanüstü gelişmelerin kliniğe yansıması
yaklaşık 5 yıl içinde gerçekleşmiştir. Bu gelişmenin ilk yanısıması hastalık genlerinin
keşfi olmuştur. NGS teknolojilerinin hayatımıza girmesinden itibaren tüm genom
sekanslama (Whole Genome Sequencing-WGS) ve tüm ekzom sekanslama (Whole
Exome Sequencing-WES) yaklaşık 300’e yakın hastalık geni tanımlanmıştır. Sadece
2012 yılında tanımlanan gen sayısı 130’dur. Teknolojinin bu kadar kolay kullanılabilir
olması özellikle gen tanımlama algortimalarında NGS temelli yaklaşımları ilk sıraya
oturtmuştur.
NGS’nin rutin tanıya girmesi ise “benchtop sequencer” denilen grubun piyasaya
sürülmesi ile gerçekleşmiştir. Illumina Miseq, Roche 454 GS Junior ve Life
Technologies Ion Torrent sistemleri bu grubun öncüleridir. Bu sistemler kullanım
13
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
kolaylığı son derece yüksek, düşük kapasiteli, düşük maliyetli NGS sistemleridir.
Sistem maliyetlerinin kapiler dizileme cihazları maliyetine düşmesi, bu sistemlerin
rutin laboratuvarlarda geçen iki yıl içinde yoğun olarak kullanılmasını sağlamıştır. Bu
sistemlerde DNA etiketlemesi denilebilecek olan indeksleme yöntemiyle birlikte
yüzlerce hastaya ait DNA tek seferde analiz edilebilmektedir. Sistemin rutine bu
kadar rahat girmiş olmasının nedeni, hiçbir optimizasyona gerek kalmadan amplikon
sekanslama yapabilmesidir. Sanger sekanslama için hazırlanan PCR amplikonları
ekstra bir işleme gerek kalmadan örnek hazırlama basamağından sonra sisteme
yüklenebilmektedir. Örneğin rutin bir MiSeq çalışmasında 500’e yakın hastanın tek
seferde sonucunun alınması mümkün olmaktadır. Bu sistemler sayesinde kistik
fibroz, FMF, talasemi gibi yaygın görülen hastalıklara ait genler çok daha düşük
maliyetle çalışılır hale gelmiştir. Buna ek olarak BRCA1 ve BRCA2 gibi büyüklüğü
nedeniyle çalışılması zor olan genler rutinde daha yaygın bir şekilde bakılır hale
gelmiştir. Ayrıca sağırlık, MODY, Bardet Biedel Sendromu gibi genetik heterojenite
gösteren hastalıklarda, o hastalığa neden olan genlerin tamamının tek seferde bir
panel şeklinde çalışılabiliyor olması da sistemin avantajları arasındadır. Şu anda
laboratuvarımızda kullanılan MiSeq sistemi ile rutinde 3 hastaya ait 4800 gen tek
seferde analiz edilebilmektedir.
Kanser araştırmaları ve tanısı NGS teknolojilerinden en fazla faydalanılan alanlardan
bir tanesi olmuştur. Kanser, tek bir hücreden köken alan genetik bir hastalıktır. Tek
hücreden köken alan bozukluğun yıllar içinde klinik bir kanser olarak ortaya
çıkabilmesi için, birçok moleküler mekanizmadaki bozukluğun tabloya eşlik etmesi
gerekmektedir. Bu nedenle kanser aynı zamanda birçok genin etkilendiği kompleks
bir hastalıktır. Hemen her kanserde farklı yolaklar ve genler etkilenmektedir. Tüm bu
faktörler nedeniyle kanser genetiği ile ilgili çalışmalar uzun yıllar istenilen düzeyde
olmamıştır. NGS teknolojileri kanser genomu araştırmalarına bütüncül bir yaklaşım
getirmiştir. Örneğin kanserin ortaya çıkmasına neden olan genler, yatkınlık yaratan
genler ve farmakogenetik açıdan önemli olan genler tek seferde incelenebilir hale
gelmiştir. Bundan sonraki süreçte kansere neden olan moleküler mekanizmaların çok
hızlı bir şekilde aydınlatılacağı düşünülmektedir.
Özetle, NGS teknolojileri genetik anazlilerin süresinde ve maliyetinde çok kısa bir
süre içinde dramatik düşüşlere neden olmuştur. İnsan genomunun dizilenmesinin bu
yıl 1000 doların altına düşmesi beklenmektedir. Bunun yarattığı olumlu etki hem
genetik tanıda hem de araştırmalarda kendisini çok kısa sürede gösterecektir.
14
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
PROSTAT KANSERİNİN İLERLEME SÜRECİNDE miRNA’ LAR
Doç. Dr. Buket KOSOVA
Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, İzmir
Prostat kanseri erkeklerde en sık görülen kanser türü olup, kansere bağlı ölüm
nedenleri arasında da akciğer kanserinden sonra ikinci sırada yer almaktadır. Normal
prostat dokusunun gelişimi, farklılaşması ve devamlılığının sürdürülmesinden
androjen hormonları sorumludurlar. Androjenler prostat hücreleri üzerindeki
proliferatif ve farklılaştırıcı etkilerini androjen reseptörü (AR) aracılığıyla
gerçekleştirirler. Ancak, AR prostat kanseri hücrelerinin yaşamı, canlılığı, apoptoz,
hücresel çoğalma ve anjiyogenezin uyarılması gibi tedaviyi olumsuz yönde
etkileyebilecek değişimler üzerinde de işlevseldir. Androjen-baskılama tedavilerine,
yani kastrasyona, dirençli prostat kanseri hücre seri modellerinde AR
ekspresyonunun baskılanmasının hücre proliferasyonunu inhibe ettiğinin
gözlenmesiyle AR’nin kastrasyona-dirençli prostat kanseri hücrelerinin büyümesinden
de sorumlu olduğu anlaşılmıştır. Bu nedenle AR, androjene duyarlı ve dirençli prostat
kanseri tedavilerinde artık önemli bir terapötik hedef olmuştur. Günümüzde
araştırmalar prostat kanserinde AR düzenleme mekanizmasına odaklanarak AR
ekspresyonunu etkin bir şekilde baskılayan yeni tedavi stratejileri üzerinde
yoğunlaşmıştır.
Endojen olarak kodlanan ve insanda sayıları bini geçen ~17–23 nükleotid
uzunluğundaki tek zincirli mikroRNA (miRNA)’lar hedef mRNA’ larına özgül olarak
bağlanarak translasyonlarını inhibe edebilmektedirler. Genellikle bir miRNA birden
fazla farklı mRNA’yı hedefleyebildiğinden ilgili mRNA’ları kodlayan genlerin
ekspresyonları da tek bir miRNA tarafından düzenlenebilmektedir. Bu nedenle,
miRNA’ların anormal ekspresyon kalıpları başta kanser olmak üzere çeşitli
hastalıklara da yol açabilmektedirler. Gerçekten de miRNA’ların ekspresyonlarındaki
değişimler prostat, böbrek ve mesane başta olmak üzere birçok ürolojik kanserin
patofizyolojisinde işlev görmektedir. Bu nedenle, özellikle kastrasyona-dirençli prostat
kanseri modelinden yola çıkarak androjene karşı gelişen dirençte önemli olan ve aynı
zamanda AR’yi de hedefleyen miRNA’ları araştırmaktayız. Çalışmamızda ilgili
miRNA’ların etkiledikleri ve direnç gelişiminde önemli hücresel yolaklarda yer alan
diğer hedef genlerin bozulan işlevlerini belirlemek amaçlanmıştır. Direnç gelişim
mekanizmasının alt basamaklarının aydınlatılması prostat kanserinde özgül terapötik
hedeflerin tanımlanmasına yardımcı olacaktır.
15
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
16
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
İnsan Primer Aort Hücrelerinde miRNA’ların Yeni Nesil Dizi Analizi Yöntemi ile
belirlenmesi
Yrd.Doç.Dr. Yasemin Eraç
E.Ü. Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji AD, 35100 İzmir
Sıçan aortunda TRPC ekspresyonlarındaki yaşa bağlı değişimleri incelediğimiz
çalışmalarımızda (TÜBİTAK 103S176) hücrenin birçok yaşamsal sürecinde işlev
gören depo-kontrollü kalsiyum kanallarının (Store-operated Ca+2 Channels, SOCC)
temel bileşenini kodlayan TRPC1 (transient receptor potential canonical 1) geninin
ekspresyonu azalırken TRPC6 düzeylerinin artması (ERAC, 2010) yaşlanma
sürecinde bu iyon kanallarının işlevsel önemine dikkat çekmiştir. Alfa-adrenerjik
reseptörler (α AR) ile aktive olan Ca+2 kanallarının bir bileşeni olduğu önerilen
TRPC6 protein düzeylerindeki artışla beraber α AR yanıtlarının yaşlanma sürecinde
potansiyelize olması aynı zamanda proliferasyonla ilişkili TRPC6 artışlarının yaşa
bağlı gelişen vazospastik olgularla ilişkili olduğunu düşündürmüştür.
Yaşlanma sürecinde görülen TRPC1 düzeylerindeki azalmayı embriyonik sıçan aort
hücre kültürlerinde (A7r5) post-transkripsiyonel gen susturma (post-transcriptional
gene silencing, PTGS veya RNA interferans, RNAi) yöntemi kullanılarak taklit
ettiğimizde TRPC6 artışının (TÜBİTAK 104S568) yanı sıra SOC girişi (store-operated
Ca2+ entry, SOCE) de anlamlı olarak artmıştır (SELLI, 2009). Normal deneysel
koşullarda gözlemlediğimiz bu sonuçların patolojik koşullarda da incelenmesi
amacıyla
karaciğer kanseri hücre serisinde (Huh-7)
TRPC1’in baskılandığı
koşullarda SOCE’nin artması (TÜBİTAK 108S072), TRPC1 proteininin SOCC’lerin
hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda temel düzenleyicisi olduğu yönündeki
hipotezimizi desteklemektedir. Kanal bileşimine katılan proteinleri hedefleyen spesifik
blokörlerinin olmaması in vivo koşullarda TRPC kanallarının damar düz kas
sistemindeki işlevinin belirlenmesini zorlaştırmaktadır. Bu nedenle TRPC kanallarının
işlevine yönelik yapılan çalışmalar “knock-out” fare modelleri, hücre kültürlerinde
PTGS ile yapılan “knock-down” ya da aşırı ekspresyon (over expression, OE)
modellerinde gerçekleştirilmektedir. Damar dokusundaki mekanizmayı algılamak
amacıyla insan primer aortik düz kas (Human Aortic Primary Smooth Muscle, HASM)
hücrelerinde plazmid vektör aracılı PTGS ve OE yöntemi ile TRPC1 geninin
ekspresyonu sırasıyla azaltılmış ve artırılmıştır.
TRPC proteinleri damar düz kasında başlıca damar bariyerinin sürdürülmesi,
oksidatif stres aktivasyonu, vazokonstriksiyon/dilatasyon, proliferasyon, anjiyojenez,
“remodeling” gibi süreçlerde işlev görmektedir. TRPC proteinlerinin birçok
nörodejeneratif hastalık ve kanser olguları ile ilişkilendirilmesinin yanı sıra kalp damar
sistemi ile ilgili birçok hastalıkta da ekspresyonel değişimleri bu proteinlerin terapötik
hedef olabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, TRPC genlerinin ekspresyonlarının
düzenlenmesine yönelik mekanizmaların aydınlatılması Ca +2 homeostazı ile ilişkili
hastalıkların ayrımsal tanı ve tedavisinde kolaylık sağlayacaktır. Dokuya spesifik
miRNA ekspresyon kalıplarının bilinmesinin hastalıkların ayrımsal tanısında ve yeni
terapötik hedeflerin belirlenmesinde yaşamsal değeri vardır. Bu amaçla, TRPC1
“knock-down” ve OE edildiği HASM hücrelerinde miRNA ifade kalıplarının
belirlenmesi amacıyla FLX 454 Genome Sequencer GS (Roche) sisteminde yeni
nesil dizileme (Next Generation Sequencing, NGS) çalışmaları gerçekleştirilmiştir.
Pirodizileme (Pyrosequencing, PS) sistemi geleneksel Sanger dizileme sistemine
alternatif ilk otomatize yüksek kazançlı tüm genom dizileme sistemidir. Jonathan
17
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
Rothberg tarafından kurulan 454 Life Sciences’ın düşük-maliyetli gen dizileme
metodu 2005 yılında Biotech-Medical kategorisinde “Wall Street Journal’s Gold
Medal for Innovation” ödülünü kazanmıştır. Kasım, 2006’da Rothber, M. Egholm ve
arkadaşları, Svante Paabo ile birlikte Nature’da bir makale yayınlamışlardır. 454
platformunda gerçekleştirilen bu çalışmada Neandertal genomunun ilk bir milyon baz
çifti dizilenmiştir. Aynı grup tarafından Neandertal genomunun tümünün dizilenmesi
amacıyla 2006 yılında “Neandertal Genom Projesi” başlatılmış ve bu projenin
sonuçları 2010 yılında Science dergisinde yayınlanmıştır (Green RE, Krause J,
Briggs AW, et al. (May 2010). "A draft sequence of the Neandertal genome". Science
328 (5979): 710–22). İlk bireysel dizinin belirlenmesi amacıyla Rothberg ve 454 Life
Sciences tarafından başlatılan “Jim” projesi Mayıs, 2007’de James Watson’ın
genomunun dizilenmesinin ardından tamamlanmıştır.
Genomik DNA dizilendiği durumda DNA’nın sistem için uygun 300-800 baz
büyüklüğündeki fragmanlara ayrılma aşaması sRNA’ların boyutlarının zaten küçük
olması nedeniyle gerçekleştirilmesine gerek yoktur. GS FLX sistemine uygun cDNA
kütüphanesinin hazırlanması için iki alternatif yöntem bulunmaktadır. Birinci metoda
göre, standart GS FLX DNA kütüphane hazırlama protokolü (Rapid Library
Preperation Kit, Roche) ile cDNA’lar dizilemeye hazır hale getirilmektedir. GS
sürecine spesifik A ve B adaptörleri (44mer adaptörler) sRNA’ların çift-sarmal
(double-strand, ds) cDNA kopyalarını “blunt-end” oluşturacak şekilde eklenir. Bu
şekilde oluşturulan ds kütüphane ile klonal amplifikasyon için emülsiyon PCR
(emPCR) basamağı tamamlanır. Amplifikasyon sonrası her sRNA molekülünün
dizileme aşaması gerçekleştirilir.
İkinci yönteme göre ise GS-spesifik A ve B adaptörleri sRNA’nın ds cDNA
kopyalarına PCR ile eklenir. Bu yöntemde, PCR amplifikasyon primerleri füzyon
primer çiftidir ve her biri ~20 bç’lik sRNA adaptörleri (3’ ya da 5’ adaptör) ve 19-bç
sabit diziyi (Primer A ya da Primer B) içermektedir. Füzyon primerlerinin primer A ve
primer B bölgeleri klonal amplifikasyon (emPCR aşaması) ve dizileme için bağlanma
bölgesi olarak görev yapmaktadır. Çalışmamızda GS FLX sistemine uygun cDNA
kütüphanelerinin hazırlanmasına yönelik olarak ikinci yöntem uygulanmıştır. Her iki
yöntem ile hazırlanan sRNA’ların ds cDNA kopyaları GS FLX sisteminin ortak
süreçleri olan sırasıyla emPCR ve PS aşamalarına transfer edildiler. GS FLX NGS
sistemi ile yapılacak olan PS için örneklerin hazırlanması amacıyla öncelikle küçük
RNA’lardan (small RNA, sRNA) çift-sarmal cDNA oluşturulur. sRNA’lar (~15-30 baz)
ile çalışmayı kolaylaştırmak ve ters transkriptaz reaksiyon primerleri ile eşleşme
amacıyla bu moleküllerin 5’ ve 3’ uçlarına uygun adaptörler (~20 bç) eklenir ve
ardından cDNA’ya dönüştürülürler. Bir sonraki aşama elde edilen cDNA’ların PCR ile
çoğaltılmasıdır. miRNA’ların kalıp olarak kullanılması ile oluşturulan cDNA’lar GS
FLX sistemi ile dizilemeye uygun hale getirilmek amacıyla 454 sekans primerleri ile
PCR reaksiyonu gerçekleştirilir. Bu PCR sonucunda elde ettiğimiz DNA
kütüphanesine ait her bir kalıp dizinin 5’ ve 3’ uçlarında emülsiyon PCR ve PS için
gerekli diziler eklenmiş olur.
TRPC1 geninin baskılandığı ve aşırı düzeyde ifade edildiği HASM hücrelerinde
miRNA ifade kalıplarının belirlenmesi amacıyla FLX 454 GS (Roche) sisteminde yeni
nesil dizileme (Next Generation Sequencing, NGS) çalışmaları gerçekleştirilmiştir.
miRNA ifade kalıplarının belirleneceği GS FLX Sistemi NGS çalışmalarına ait
süreçler aşağıda özetlenmiştir.
I. cDNA kütüphanesinin hazırlanması:
18
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
1. Total RNA izolasyonu: Trizol (Invitrogen) ile total RNA izolasyonu
gerçekleştirilir.
2. sRNA’ların ayrılması: Kullanıma hazır %15’lik poliakrilamid (PAA) üre jele
(Biorad) yüklenen total RNA elektroforez ile farklı molekül ağırlıklarına göre
ayrılır. 15-30 nükleotid büyüklüğündeki sRNA’lar jelden ayrıştırılır.
3. 3’ ligasyon: sRNA’ların 3’ ucuna, 3’ Modban adaptörün eklenmesi amacıyla
mutant T4 RNA ligaz varlığında (ATP bulunmayan tampon çözelti ile) 2 saat
oda sıcaklığında bekletilerek ligasyon işlemi gerçekleştirilir. 3’ ucuna başarı ile
adaptör eklenen sRNA’ları ayırmak amacıyla ligasyon ürünü %15 PAA üre jele
yüklenir ve yaklaşık 40 bç RNA’lar jelden ayrıştırılır.
4. 5’ ligasyon: 3' ucuna adaptör eklenen sRNA’ların jelden saflaştırılması
sonrasında bu RNA’ların 5' ucuna Nelson adaptörünün eklenmesi amacıyla T4
RNA ligaz enzimi varlığında ligasyon reaksiyonu gerçekleştirilir.
5. Ters transkripsiyon reaksiyonu: 5'-fosfat (PO4) ve 3’-OH uçlarına adaptör
eklenen sRNA fragmanları kalıp olarak kullanılarak ters transkriptaz enzimi ile
cDNA’ların sentezi gerçekleştirilir. Bu amaçla öncelikle Modban adaptörüne
komplementer diziye sahip BanOne primeri ile bağlanma (annealing)
reaksiyonu gerçekleştirilir. Bağlanma reaksiyonunu takiben birinci tek sarmal
cDNA sentezi için “SuperScript III First Strand Synthesis System for RT-PCR”
(Invitrogen) kiti kullanılmıştır.
6. Birinci sarmal cDNA’nın PCR ile çoğaltılması: Çalışmanın bu aşamasında
RNA örneklerinde bulunan tüm miRNA’ların kalıp olarak kullanılması ile elde
edilen cDNA’lar çift iplikli cDNA’lara dönüştrülerek PCR ile çoğaltılmışlardır. Bu
yöntemle miRNA’lara ait cDNA kütüphanesi oluşturulmuştur. Bu amaçla Taq
DNA Polymerase, dNTPPack (Roche) kiti kullanılarak PCR reaksiyon
gerçekleştirilmiştir.
4. cDNA’nın jelden ekstraksiyonu: Bu amaçla yüksek çözünürlüğe sahip ve
küçük DNA fragmanlarının ayrılmasını sağlayan MetaPhor Agarose (Cambrex)
kullanılmıştır. MetaPhor agaroz ile 20 bç- 800 bç DNA fragmanları yüksek
çözünürlükle ayrılabilmektedir. PCR ürünü cDNA’lar %4 MetaPhor Agaroz jele
yüklenir. Yaklaşık 70mer DNA fragmanı jelden ayrıştırılır.
5. cDNA’lara 454 sekans primerlerinin eklenmesi: cDNA’ların GS FLX
sistemine uygun hale getirilmesi ve çoğaltılması amacıyla F ve R 454 füzyon
primerleri ile Taq polimeraz enzimi varlığında PCR işlemi gerçekleştirilir. PCR
ürünü Qiaex II Gel Extraction Kiti (Qiagen) ile %2 MetaPhor agaroz jelden
ayrıştırılır. Elde edilen cDNA’lar GS FLX sekanslama sistemine hazır hale
gelir.
II. emPCR:
Bu kapsamda öncelikle cDNA kütüphanesinin miktar tayini ve gerekli seyreltmeler
gerçekleştirilmiştir. cDNA kütüphanesinin konsantrasyon değerleri (ng/μl) Quant-iT
PicoGreen dsDNA Reagent (Invitrogen) kiti kullanılarak Varioskan Flash Multimode
Reader (Thermo) çoklu plak okuyucuda fluorometrik olarak belirlenmiştir.
cDNA ng/μl konsantrasyon değerlerinin molekül/μl olarak hesaplanabilmesi için
aşağıdaki formül kullanılmıştır.
emPCR gerçekleştirilmeden önce yakalama boncuklarına eklenecek uygun DNA
miktarının belirlenmesi amacıyla titrasyon yapılmıştır. Emülsiyon titrasyonu ile
19
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
dizileme kalitesinin bir göstergesi olan boncuk zenginleştirme yüzdesinin (% bead
enrichment, % BE) belirlenmesi sağlanmaktadır. Emülsiyon titrasyon aşamasında,
sabit DNA yakalama boncuk sayısına karşılık farklı miktardaki DNA miktarları ile
gerçekleştirilen emPCR amplifikasyonu sonrasında, DNA taşıyan boncuklar
zenginleştirilmiş ve % BE değerleri hesaplanmıştır. En iyi dizileme sonuçları yaklaşık
%8 EB ile elde edilirken, % 5-20 EB değerleri de kabul edilebilir değerler olarak
bildirilmiştir.
Kütüphane oluşturulduktan sonra cDNA fragmanları boncuklara sabitlenir. Bu
aşamada her DNA bağlayıcı boncuğa “DNA Capture beads” sadece bir DNA
fragmanının bağlanması önem taşımaktadır. Bu nedenle 1:1 oranını sağlamak
amacıyla farklı cDNA ve DNA Capture oranları denenerek optimum miktarlar bulunur.
DNA’nın boncuk üzerine bağlanması kütüphane hazırlanması aşamasında DNA’nın
her iki ucuna PCR ile eklenen 454 F ve R füzyon primerleri ile sağlanmaktadır.
Boncuklar üzerinde bu dizilere karşılık gelen oligonükleotidler bulunmaktadır. Her bir
mikroküre içerisindeki PCR ajanlarının varlığında DNA Capture boncuğunun üzerinde
bulunan 454 füzyon primerlerine karşılık gelen diziler ile PCR’ın her döngüsünde
boncuğa bağlı DNA fragmanları çoğaltılmaktadır. Emülsiyon PCR (emPCR), GS FLX
Titanium SV emPCR (Lib-A) kiti (Roche, Tablo 5.2) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
III. PS:
Pirodizileme aşaması için GS FLX Titanim Sequencing XLR70 (Roche) ve GS FLX
Titanium PicoTiterPlate 70x75 (Roche) kitleri kullanılmıştır. PS aşaması 29 ya da 44
μm çapında kuyucuklar içeren “PicoTiterPlate, PTP” üzerinde gerçekleşmektedir.
PTP (70x75 mm) yaklaşık 1,6-3,4 milyon kuyucuktan oluşmaktadır. Her bir kuyucuk
tek bir DNA boncuğunun girmesine izin verecek büyüklüktedir. Ortalama DNA
boncuğu: kuyucuk çapı 28:44 ve 20:29 μm’dir. “Sentez ile dizileme” mantığına
dayanan PS aşamasında boncuk üzerindeki tek sarmal DNA dizisine komplementer
primerler bağlanır. Ardından ardışık olarak gönderilen T, C, A ve G bazlarının
(deoxynucleoside triphosphate, dNTP) kalıp DNA’ya komplementer olması
durumunda oluşan ışıma CCD kamera ile belirlenir. Nükleotid akışı sırasında
komplementer bazın DNA polimeraz aracılığı ile bağlanması dNTP’den pirofosfat
(pyrophosphate, PPi) açığa çıkmasına neden olur. Ortamda bulunan ATP sülfürilazın
PPi’yi ATP’ye dönüştürmesi sonrasında lüsiferaz enzimi lüsiferini oksilüsiferine
dönüştürür. Oluşan oksilüsiferin ise ışık yayılmasına neden olur. Işığın şiddeti bazın
bağlanması ile açığa çıkan ATP ile doğru orantılıdır ve o anda sisteme gönderilen
bazdan kaç tane bağlandığı belirlenebilir.
PTP aşağıdaki sıraya göre yüklenir:
1. Enzim boncukları (ön-tabaka),
2. DNA ve dolgu boncukları
3. Enzim boncukları (üst-tabaka)
4. PPiaz boncukları
Enzim boncukları üzerine, kemilüminesans sistem enzimleri sülfirilaz ve lüsiferaz
sabitlenmiştir. PPiaz boncukları, herbir nükleotid akışı süresince kuyucuklar arası
sinyal girişimini azaltmak ve arka plan gürültüyü azaltmak amacıyla inorganik
pirofosfatı (PPi) uzaklaştırır. Dolgu boncukları, dizileme süresince kuyucuklardaki
sabitlenmiş tüm bileşenlerin stabil halde kalmasını sağlar.
PS sistemi geleneksel Sanger dizileme sistemine alternatif ilk otomatize yüksek
kazançlı tüm genom dizileme sistemidir. Jonathan Rothberg tarafından kurulan 454
Life Sciences’ın düşük-maliyetli gen dizileme metodu 2005 yılında Biotech-Medical
20
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
kategorisinde “Wall Street Journal’s Gold Medal for Innovation” ödülünü kazanmıştır.
Kasım, 2006’da Rothber, M. Egholm ve arkadaşları, Svante Paabo ile birlikte
Nature’da bir makale yayınlamışlardır. 454 platformunda gerçekleştirilen bu
çalışmada Neandertal genomunun ilk bir milyon baz çifti dizilenmiştir. Aynı grup
tarafından Neandertal genomunun tümünün dizilenmesi amacıyla 2006 yılında
“Neandertal Genom Projesi” başlatılmış ve bu projenin sonuçları 2010 yılında
Science dergisinde yayınlanmıştır (Green RE, Krause J, Briggs AW, et al. (May
2010). "A draft sequence of the Neandertal genome". Science 328 (5979): 710–22).
İlk bireysel dizinin belirlenmesi amacıyla Rothberg ve 454 Life Sciences tarafından
başlatılan “Jim” projesi Mayıs, 2007’de James Watson’ın genomunun dizilenmesinin
ardından tamamlanmıştır.
21
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
22
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
İnsan Hepatoselüler Karsinoma Hücre Hattında Transkriptom Analizi
Arş.Gör. Dr. Çiğdem Selli
E.Ü. Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı
Gelişmekte olan mikroRNA tedavileri
mikroRNA (miRNA)’lar birçok hastalığın düzenlenmesinde görev alan yeni tedavi
hedefleridir. Küçük olmaları ve korunmuş bir diziye sahip olmaları ilaç geliştirme
süreçlerinde avantaj sağlamaktadır. Belirli bir miRNA dizisini spesifik olarak inhibe
eden “anti-mir” ler yeni bir ilaç grubu olma potansiyeli taşımaktadır. Tek bir
miRNA’nın belirli bir hücresel süreçte veya yolakta görev alan çok sayıda genin
ekspresyonunu düzenler ve bu nedenle “anti-mir” tedavi belirgin bir etki oluşturur.
Günümüzde hastalık durumları ile ilişkili miRNA’lar belirlenmekte ve bu miRNA’ları
hedefleyen spesifik anti-mir ilaçlar geliştirilmektedir. Ateroskleroz, kalp yetmezliği,
HCV enfeksiyonu, inflamasyon ve anjiojenezden sorumlu miRNA’lar (sırasıyla miR33, miR-208, miR-122, miR-155, miR-92a) üzerinde çalışılan tedavi hedefleridir
(JacksonLevin, 2012) (van Rooij et al., 2012).
Transkriptom analizi, anti-mir tedavinin etkinliğini belirlemek için kullanılan bir
yöntemdir. Tedavi sonrası ilgili miRNA’nın hedeflediği genlerin ekspresyon
düzeylerinin artması beklenmektedir. Faz II klinik çalışmalarda kronik HCV
enfeksiyonunun tedavisinde test edilen ilk anti-mir ilaç miR-122’yi hedefleyen
miravirsen (SPC3949)’dir. miR-122, karaciğer spesifik bir miRNA’dır ve HCV
çoğalmasını destekleyici yönde rol oynar (Jopling, 2008). Azalmış miR-122 düzeyleri
hepatoselüler karsinoma ile ilişkilidir (Koberle et al., 2013). Kronik HCV enfeksiyonu
taşıyan şempanzelerin karaciğer dokusunda yapılan transkriptom analizi sonucunda,
miravirsen uygulaması sonrasında miR-122 hedef bölgesini (seed region) taşıyan
mRNA düzeylerinde belirgin artış belirlenmiştir (NormanSarnow, 2010).
Transkriptom analizi
Karaciğer kanseri hücrelerinde (Huh7) yaptığımız çalışmalarımızda, depo-kontrollü
kalsiyum girişine aracılık ettiği düşünülen TRPC1 geni susturulduğunda, hücre
proliferasyonunun baskılandığı belirlenmiştir (Selli C, 2012). TRPC1 düzeyleri
baskılanmış Huh7 hücrelerinde gerçekleştirdiğimiz tüm genom gen ekspresyonu
çalışmasına ilişkin bilgiler aşağıda verilmiştir.
Transkriptom analizi, Illumina HumanHT-12 BeadChip v3 gen çipi kullanılarak direkt
hibridizasyon yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. RNA örnekleri çip üzerine hibridize
edilmeden önce çoğaltılmış ve biotin ile işaretlenmiştir. Hibridizasyon sonrası Cy3streptavidin ile işaretleme yapılmış ve çip görüntülenmiştir. Kullanılan gen çipi
üzerinde 12 adet örnek haznesi ve her bir haznede, tanımlanmış 25.000 adet gene
spesifik 48.000 adet prob bulunmaktadır. 50mer uzunluğundaki problar adres dizi ile
3 mikron çapındaki küreler üzerine bağlıdır. Kullanılan gen çipi ve direkt hibridizasyon
çalışma prensibi Şekil 1’de verilmiştir. Transkriptom analizinde, vektör-aracılı geçici
PTGS uygulamasından 48 saat sonra izole edilen, gerçek zamanlı qRT-PCR analizi
ile TRPC1 düzeylerinin %50 oranında azaldığı belirlenen RNA örnekleri ile
çalışılmıştır.
a) RNA amplifikasyonu
RNA amplifikasyonu, RNA örneklerinin çoğaltıldığı ve biotin ile işaretli cRNA’lar
oluşturulduğu basamaktır. Çalışmamızda HuH-7 hücrelerinden izole edilen RNA
23
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
örnekleri (500 ng) Illumina Total Prep RNA Amplification Kit (Ambion) ile çoğaltılmış
ve işaretlenmiştir. Çalışmanın basamakları Şekil 2’de verilmiştir.
A
B
Şekil 1. Transkriptom analizinde kullanılan gen çipi (A) ve direkt hibridizasyon
çalışma prensibi (B).www.illumina.com.
Şekil 2. RNA amplifikasyonunun basamakları.
cDNA, komplementer DNA; dsDNA, çift sarmal DNA; cRNA, komplementer RNA.
Özetle, RNA örneklerinden ters transkripsiyon ile birinci sarmal cDNA sentezi
gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla T7 “promoter” taşıyan oligo(dT) primerleri, dNTP
karışımı, RNaz inhibitörü ve yüksek verimli ve “full-length” cDNA oluşturan ters
transkriptaz (reverse transcriptase, RT, ArrayScript) kullanılmıştır.Daha sonra in vitro
transkripsiyonda kalıp olarak kullanılacak çift sarmal DNA (dsDNA) oluşturulmuştur.
Bu amaçla dNTP karışımı, RNaz H ve DNA polimeraz kullanılmıştır. Oluşan
dsDNA’lar kartuş filtrelerden geçirilerek saflaştırılmıştır. Transkripsiyon kalıbı
dsDNA’lardan biotin işaretli RNA’lar (cRNA) oluşturulmuştur. Bu amaçla biotin işaretli
NTP’ler ve T7 RNA polimeraz enzimi kullanılmıştır. Oluşan cRNA’lar kartuş
filtrelerden geçirilerek saflaştırılmış ve miktar tayini yapılmıştır. Kartuş filtrelerden
örnek içine karışabilecek silis kumu OD260 ölçümlerini yanıltabilmektedir. Bu nedenle
Quant-iT RNA boyası kullanılarak fluorometrik yöntemle cRNA miktar tayini
yapılmıştır (Qubit fluorometre, Invitrogen).
24
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
b) Direkt hibridizasyon ve görüntüleme
Çalışmamızda iki grup örnek (kontrol grubu: pSUPERIOR ve uygulama grubu
pSUPERIOR.shTRPC1 ile transfekte hücrelerden elde edilen cRNA örnekleri), 3
biyolojik ve 2 teknik örnekleme olacak şekilde hibridizasyon yapılmıştır (Direct
Hybridization Assay Kit, Illimuna). Her bir kuyucuğuna 750 ng cRNA yüklenen çip, 16
saat boyunca hibridizasyon fırınında (58°C) inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrası
sırasıyla yıkama, bloklama ve Cy3-Streptavidin (Amersham) ile işaretleme
yapılmıştır.
İşaretleme yapılan çip, 0,8 µm çözünürlüğe sahip lazer tarayıcılı konfokal mikroskop
içeren sistemde (Illumina BeadArray Reader) ile görüntülenmiş ve sonuçlar
GenomeStudio yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. Veri analizine geçilmeden önce
sistem kontrollerinden alınan sinyaller değerlendirilmiştir. Sistemde kullanılan kontrol
problar; hibridizasyon kontrolü, biotin kontrolü ve negatif kontroldür (Şekil 3). Sistem
kontrollerinin beklenen şekilde gözlenmesi sonrası veri analizine geçilmiştir.
Hibridizasyon kontrolleri, çip üzerinde hibridizasyon aşamasında kullanılan çözelti
içinde bulunan Cy3-işaretli oligonükleotidlerle eşleşen 6 adet hibridizasyon probu
bulunmaktadır. Bu problar, hibridizasyon doğru şekilde gerçekleştiğinde RNA
kalitesinden ve örnek hazırlama işlemlerinden bağımsız olarak sinyal oluştururlar.
Cy3-işaretli oligonükleotidler, kademeli hibridizasyon yanıtları oluşturacak şekilde 3
farklı konsantrasyonda (düşük, orta ve yüksek) bulunmaktadır. Çalışmamız
sonucunda beklendiği gibi hibridizasyon probları ile kademeli sinyal artışı
belirlenmiştir.
Biotin kontrolü (sinyal oluşumu kontrolü), hibridizasyon aşamasında kullanılan çözelti
içinde bulunan biotin-işaretli oligonükleotidlerle eşleşen 2 adet prob bulunur. Bu
problardan pozitif sinyal alınması Cy3 işaretlemesinin başarılı olduğunu
göstermektedir.
Negatif kontrol, genomdaki herhangi bir hedef ile eşleşmeyen problardan oluşur. Bu
problardan alınan sinyalin ortalaması sistemin “background” değerini oluşturur. Analiz
aşamasında gen ekspresyon limitlerinin belirlenmesinde bu sinyal ve standart
sapması kullanılmaktadır. Çalışmamızda elde edilen “background” sinyal, olması
gerektiği gibi 600 değerinin altında bulunmuştur.
Hibridizasyon probu
Biotin probu
Negatif kontrol prob
Şekil 3. Transkriptom analizinde
kullanılan kontrol probları.
25
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
d) Veri analizi
Bu amaçla GenomeStudio (Illumina) ve R yazılımı (lumi paketi) kullanılmıştır. Veri
analizi 4 basamakta özetlenebilir:
Arka plan sinyalinin çıkarılması: öncelikle sistemden alınan negatif kontrol sinyali tüm
örneklerden çıkarılır.
Normalizasyon: örnekler arasındaki sinyal şiddetindeki dağılım farklılıklarının en aza
indirilmesi için uygulanır. Farklı normalizasyon yaklaşımları bulunmaktadır.
Çalışmamızda 7 farklı normalizasyon yaklaşımı (quantile, rsn, vsn, ssn, rank
invariant, average, cubic spline) kullanılmış ve sonuçlar karşılaştırılmıştır. Şekil 4’de
quantile normalizasyon uygulanan örneklerdeki sinyal şiddeti dağılımı görülmektedir.
A
B
Şekil 4. Transkriptom örneklerinde quantile normalizasyon öncesi (A) ve
sonrası (B) sinyal şiddetinin dağılımı. X ekseni: örnekler, Y ekseni: sinyal
şiddeti (intensity).
Filtreleme: İfadesi belirgin düzeyde değişen genleri diğer genlerden ayırmak için
kullanılır. Filtreleme kriteri değişkendir. Kat değişim (1,3 kat) ve istatistiksel anlamlılık
(P<0.05) en çok kullanılan kriterlerdir. Çalışmamızda farklı filtreleme kriterleri
kullanılmış ve sonuçlar karşılaştırılmıştır.
Ekspresyon faklılıklarının belirlenmesi (differential expression, DE): Kontrol ve
uygulama grubu arasında ekspresyonu anlamlı olarak farklılık gösteren genleri
belirlemek için kullanılır. Çalışmamızda az sayıdaki veri setlerinde tercih edilen “rank
product” algoritması uygulanmıştır.
Sonuç
Çalışmamızda
TRPC1
proteinin
Huh7
karaciğer
kanseri
hücrelerinin
proliferasyonunda rol oynadığı gösterilmiştir (Selli C, 2012). Transkriptom analizi
sonucunda hücre döngüsü kontrolünde ve proliferasyonda görev alan bazı
proteinlerin mRNA düzeylerinin değiştiği belirlenmiştir. TRPC1’in bu proteinlerle ile
etkileşimi ve antiproliferatif etkinin mekanizması ileri çalışmalarda test edilecektir.
Transkriptom analizi, tüm genlerin ekspresyonunun belirlenmesini sağlayan ve
gelecekte klinik uygulamalarda kullanılma potansiyeli taşıyan bir yöntemdir.
Günümüzde belirli genlerin ekspresyon düzeyleri belirlenerek ilaçlı tedaviye yön
26
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
verilmektedir. Örneğin trastuzumab, Her-2 aşırı ekspresyonu olan meme kanserinin
tedavisinde kullanılmaktadır (Viani et al., 2007).
Gen ekspresyonun belirlenmesi direnç gelişiminin izlenmesi açısından da önemlidir.
Örneğin gefitinib, epidermal büyüme faktörü reseptörü tirozin kinaz (EGFR-TK) aktive
edici mutasyonu taşıyan küçük hücreli olmayan akciğer kanserinin tedavisinde
etkindir. EGFR mutasyonu bulunmayan hücrelerin bazı pompa proteinlerini
(BCRP/ABCG2) aşırı eksprese ederek gefitinibe karşı direnç kazandığı gösterilmiştir
(Chen et al., 2011).
Özetle, gen ekspresyon profilinin belirlenmesi, özellikle kanser gibi çok faktörlü ve
çoklu gen hastalıklarının tedavisinde önem taşımaktadır. Yakın gelecekte miRNA’lara
yönelik girişimler ile hastalık durumlarında bozulmuş olan gen ekspresyonu
düzenlenebilecektir.
Destekler
Deneysel çalışmalar, Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK)
Araştırma Projeleri (104S568, 108S072, proje yürütücüsü Prof.Dr. Metiner Tosun) ve
Yurt İçi Doktora Burs Programı (BİDEB 2211, 2005-2010, Çiğdem Selli) tarafından
desteklenmiştir.
Transkriptom veri analizi, Avrupa Moleküler Biyoloji Organizasyonu burs (EMBO
short-term fellowship) desteği ile Edinburgh Üniversitesi, Kanser Araştırma
Merkezi’nde Kanserde Uygulamalı Biyoinformatik Çalışma Grubu lideri Dr. Andrew
Sims desteği ile gerçekleştirilmiştir.
Referanslar
Chen Y J, Huang W C, Wei Y L, Hsu S C, Yuan P, Lin H Y, et al. (2011). Elevated BCRP/ABCG2
expression confers acquired resistance to gefitinib in wild-type EGFR-expressing cells. PLoS
One 6: e21428.
Jackson a L, Levin a A (2012). Developing microRNA therapeutics: approaching the unique
complexities. Nucleic Acid Ther 22: 213-225.
Jopling C L (2008). Regulation of hepatitis C virus by microRNA-122. Biochemical Society transactions
36: 1220-1223.
Koberle V, Kronenberger B, Pleli T, Trojan J, Imelmann E, Peveling-Oberhag J, et al. (2013). Serum
microRNA-1 and microRNA-122 are prognostic markers in patients with hepatocellular
carcinoma. Eur J Cancer 49: 3442-3449.
Norman K L, Sarnow P (2010). Hepatitis C virus' Achilles' heel--dependence on liver-specific
microRNA miR-122. Cell research 20: 247-249.
Selli C E Y, Kosova B, Erdal E, Tosun M (2012). TRPC1 silencing suppresses proliferation of HuH-7
human hepatoma cell line. Cell membranes and Free Radical Research 4: 57.
Van Rooij E, Purcell a L, Levin a A (2012). Developing microRNA therapeutics. Circulation research
110: 496-507.
Viani G A, Afonso S L, Stefano E J, De Fendi L I, Soares F V (2007). Adjuvant trastuzumab in the
treatment of her-2-positive early breast cancer: a meta-analysis of published randomized
trials. BMC Cancer 7: 153.
Whole-Genome Gene Expression Direct Hybridization Assay Guide
http://support.illumina.com/documents/MyIllumina/3466bf71-78bd-4842-8bfc393a45d11874/WGGEX_Direct_Hybridization_Assay_Guide_11322355_A.pdf
HumanHT-12 v3 Expression BeadChip
http://www.illumina.com/Documents/products/datasheets/datasheet_humanht_12.pdf]
Illumina® BeadStudio
http://www.illumina.com/Documents/products/datasheets/datasheet_beadstudio.pdf
27
TFD XXI.Eğitim Sempozyumu
28