T.C. SAĞLIK BAKANLIĞI OKMEYDANI EĞİTİM ve ARAŞTIRMA
advertisement
T.C. SAĞLIK BAKANLIĞI OKMEYDANI EĞİTİM ve ARAŞTIRMA HASTANESİ 2.GENEL CERRAHİ KLİNİĞİ Klinik Şefi: Prof. Dr. Servet Rüştü KARAHAN İSKEMİK KOLON ANASTOMOZUNDA PLASMİDLERE KLONLANMIŞ VASKÜLER ENDOTELYAL GROWTH FAKTÖR VE FİBROBLASTİK GROWTH FAKTÖR’ ÜN ANASTOMOZ YARA İYİLEŞMESİ ÜZERİNE ETKİSİ (UZMANLIK TEZİ) Dr. Aşkın Kadir PERÇEM İstanbul – 2009 TEŞEKKÜR Genel cerrahi uzmanlık eğitimim süresince, eğitimimde büyük katkı ve emekleri olan, her konuda destek ve yardımlarını eksik etmeyen sayın hocam Prof. Dr. Servet Rüştü Karahan ’a saygı ve teşekkürlerimi, Eğitimimde katkıları olan, bilgi ve deneyimlerinden yarar gördüğüm Op. Dr. Ayhan Özsoy, Op. Dr. Selahattin Karaca, Op. Dr. Emin Gürbüz, Op. Dr. Yaşar Doğan, Op. Dr. Yücel Polat ’a Tezimi hazırlamamda ilgi, destek ve yardımlarını esirgemeyen, ayrıca eğitimim sırasında kendisinden çok şey öğrendiğim Op. Dr. Gökhan Tolga Adaş ’a Tezimin histopatolojik incelemelerini yapan Uzm. Dr. Gülçin Kamalı ’ya, biyokimyasal parametreleri değerlendiren Cerrahpaşa Tıp Fak. Biyokimya ABD Uzmanı Dr. Ahu Kemik ’e, istatistiksel hesapların yapılmasında yardım eden Op. Dr. Sedat Kamalı ’ya, plazmid hazırlanmasını sağlayan İstanbul Tıp Fak. Genetik ABD Doç Dr. Duran ÜSTEK ve İstanbul Üniversitesi Deneysel Araştırma ve Hayvan Laboratuarı Personeline ayrıca Hemşire Bahar Eryaşar, Doç. Dr. Soykan Arıkan ve Dr. İdris Kurtuluş ‘a Eğitimimde katkıları olan diğer genel cerrahi klinik şefleri ve uzman doktorlarına, rotasyonlarım sırasında deneyimlerinden istifade ettiğim klinik şefleri, uzman doktorları ve asistan arkadaşlarıma, birlikte severek çalıştığım tüm asistan arkadaşlarım, 2. Genel Cerrahi Kliniği hemşire ve tüm personeline, Hastanemiz Başhekimi Doç. Dr. Adem Akçakaya ’ya ve tüm hastane çalışanlarına, Eğitimim için hiçbir fedakarlıktan kaçınmayan ve bugünlere gelmemde çok büyük emekleri olan anneme ve babama, bana hep destek olan kardeşime, eğitimim sırasında hep yanımda olan ve tezimin hazırlanmasında yardımını esirgemeyen eşim Uzm. Dr. Banu Biçerol Perçem‘e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Dr. Aşkın Kadir PERÇEM ii ÖNSÖZ 1. GİRİŞ VE AMAÇ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. YARA İYİLEŞMESİ 3 2.1.1. Hemoztasis 4 2.1.2. İnflamasyon 6 2.1.3. Proliferatif Faz 10 2.1.4. Olgunlaşma ve Yapılanma Fazı 13 2.2. GASTROİNTESTİNAL SİSTEMDE YARA İYİLEŞMESİ 14 2.3.CİLT VE GASTROİNTESTİNAL SİSTEMDEKİ YARA İYİLEŞMESİ ARASINDAKİ FARKLAR 17 2.4.GASTROİNTESTİNAL SİSTEM ANASTAMOZLARINDA YARA İYİLEŞMESİNİ ETKİLEYEN FAKTÖRLER 18 2.4.1.Lokal Faktörler 18 2.4.2.Sistemik Faktörler 20 2.5.KOLON ANASTOMOZU VE İSKEMİ 23 2.6.BÜYÜME FAKTÖRLERİNİN YARA İYİLEŞMESİ ÜZERİNDEKİ 23 ETKİLERİ 2.6.1.Trombosit Kaynaklı Büyüme Faktörü (PDGF) 23 2.6.2. Fibroblastik Büyüme Faktörü (FGF) 23 2.6.3. Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü (VEGF) 24 2.7. GEN TERAPİSİ 24 2.7.1. Gen Terapisi Tipleri 25 2.7.2. Terapi metodları 26 2.7.3. Gen Transferi Yöntemleri 26 2.8. GEN TERAPİSİNDE VEKTÖRLER 2.8.1. Virüsler 26 26 iii 2.8.2. Non-Viral Metodlar 30 2.8.3. Plazmidler 32 3. MATERYAL VE METOD 35 3.1. DENEY HAYVANLARI 35 3.2. PLAZMİD KONSRÜKSİYONU VE ENJEKSİYONU 35 3.3. CERRAHİ PROSEDÜR VE TEDAVİ 36 3.4. ANASTOMOZ PATLAMA BASINCI ÖLÇÜMÜ 36 3.5. HİSTOPATOLOJİK İNCELEME 37 3.6 BİYOKİMYASAL İNCELEME 37 4. İSTATİSTİKSEL DEĞERLENDİRME 38 5. BULGULAR 39 6. TARTIŞMA 51 7. ÖZET 57 8. SUMMARY 59 9. SONUÇ 61 iv 1. GİRİŞ VE AMAÇ Gastrointestinal operasyonlar sonrasında gelişen anastomoz kaçağı ve ayrılmaları günümüzde sıkça karşılaşılan mortalite ve morbidite nedenleridir. (1,2). Genel olarak anastomoz kaçağının görülme sıklığı % 3-8 olup bu oranlar değişik merkezlere göre farklı bildirilmektedir. (3,4). Anastomoz kaçağı nedeniyle mortalite halen % 30’un üzerindedir (5). Gastrointestinal anastomozlarda yara iyileşmesini bozan birçok faktör mevcuttur. Bunlar başlıca kan akımının yetersizliği, kötü cerrahi teknik, lokal enfeksiyon (peritonit), hematom, iyonize radyasyon, ileri yaş, malnutrisyon, metabolik bozukluklar (obezite, diabetes mellitus, üremi) gibi nedenlerdir (2). Anastomoz kaçağının oluşmasında en önemli nedenlerden biri devaskülarizasyon ve buna bağlı olarak görülen hipoperfüzyondur. Oluşan hipoksi yara iyileşmesinde bir risk faktörü olup oluşan nekroz sonucu anastomozda kaçak ve ayrışma görülmektedir (6). Günümüzde her türlü cerrahi, teknik ve medikal gelişmeye rağmen anastomoz kaçağının yüksek mortalite ve morbidite oranları cerrahları iyileşmeyi pozitif yönde etkileyecek ajanlar üzerinde çalışmaya yönlendirmiştir (7,8). Yara iyileşmesinin düzgün ve eksiksiz ilerleyebilmesi için iyileşmede görev alan hücrelerin fonksiyonlarını tam olarak yerine getirmeleri gerekmektedir. Yara dokusunun merkezinde gelişen hipoksi, laktik asit ve yüksek miktarda oksidan madde birikimi anjiyogenetik faktörlerin salınımını tetikler. Yara onarımı için gerekli olan O2, besin ve inflamatuar hücrelerin ulaştırılması için yeni damarların oluşumuna anjiyogenez denmektedir. (9-12). Anjiyogenezi en fazla miktarda uyaran büyüme faktörleri Vasküler endotelyal growth faktör (VEGF) ve Fibroblastik Growth (FGF) Faktördür. Yaralanmayla birlikte FGF seviyeleri artmaya başlar ve 48. saatte normal değerlerine düşer. VEGF değerleri ise yaralanmadan birkaç gün sonra pik yapar.(9,13) Klonlanmış büyüme faktör genlerinin çeşitli gen tedavi teknikleri kullanılarak hedef doku ve organlara verilmesi anjiyogenezisin oluşturulması amaçlı yeni bir yaklaşımdır. Vasküler Endotelyal Growth Faktör (VEGF) geni ve proteini oldukça iyi çalışılmış bir anjiyogenetik faktörüdür. Çeşitli hayvan modellerinde, büyüme faktörlerinin dışarıdan verilmesi ile oluşturulan anjiyogenez çalışmaları oldukça umut vericidir. Gen tedavi çalışmaları henüz emekleme aşamasında olduğundan uygulanabilir standart protokol ve araçlar yoktur (14). Ökaryotik bir hücrede çalışacak bir plazmide hedef genin klonlanması ile DNA’nın hedef hücre, doku ve organa verilmesi gen tedavisinde kullanılan protokollerden 1 biridir. Ancak, gen tedavisinde aşılması gereken alanlardan biri terapötik genin hedef doku ve organa verilme şeklidir. Biz bu çalışmada insan VEGF 165 ve FGF genini, insan Ubiquitin C promoterunun alt kısmına klonlayarak ve insana B2-mikroglobulin geni poly A sekanslarını ekleyerek stabilitesini sağladık. Plazmidler gen transfer ve tedavi çalışmalarında kullanılan en basit araçlardır, toksisitelerinin düşük olması, geçici ekspresyon sağlamaları ve kromozomal integrasyon özelliklerinin olmaması ile tıbbi çalışmalar için tercih edilirler (15,16). Amacımız bir risk faktörü olan iskeminin kolon anastomozunda yara iyileşmesi üzerine olan etkilerini araştırmak ve bu olumsuzluğu gidermektir. Bu amaçla büyüme faktörleri olan VEGF ve FGF genleri plazmide bağlanarak iskemik kolon anastomoz bölgesine lokal olarak verilmiştir. Sonuç olarak amacımız yapmış olduğumuz tedavinin olumlu veya olumsuz etkilerini iskemik kolon anastomoz yara iyileşmesi üzerinde görmek ve elde edilen bulguları literatür eşliğinde irdelemektir. 2 2. GENEL BİLGİLER 2.1. YARA İYİLEŞMESİ Yara onarımı, yaralanmadan sonra dokuların normal fonksiyon ve yapısal bütünlüklerini eski haline getirmek için yapılan düzenli ve sıralı fizyolojik, biyokimyasal süreçtir (17,18). Bu esnada meydana gelen sıvı kaybı ve enfeksiyonlara karşı vücut; iç ve dış bariyerleri onarmaya, normal kan ve lenf akımı ile yaralanan sistemin mekanik bütünlüğü sağlanmaya çalışılır. Dokunun normal fonksiyonlarının yerine gelmesi için genellikle kusursuz onarımdan fedakârlık edilmesi gerekir. Rejenerasyon ise bir önceki dokunun mimarisinin aynı şekilde skar dokusu oluşmadan yerine konmasıdır. Rejenerasyon yara iyileşmesinin ana hedefi ise de, insanda sadece embriyojenik dönemde, kaya yengeci ve semender gibi aşağı organizmalarda ve organ olarak karaciğer ve kemik gibi dokularda görülür. Yara iyileşmesindeki anahtar nokta bütün dokuların aynı süreç serisinde ilerlemesidir. Bu amaçla yara iyileşmesinin anlaşılmasını kolaylaştırmak için süreç belirli bölümler ayrılmıştır (17). Yara İyileşmesi Bölümleri: a) Hemoztaz ve inflamasyon b) Proliferasyon c) Olgunlaşma ve yapılanma (19) 3 2.1.1. Hemoztasis Organizmanın yaralanmaya karşı anlık reaksiyonu hemoztaz şeklinde olur (20). Yaralanmadan sonra yaralanan bölgede kan kaybını yavaşlatmak veya durdurmak için vazokonstrüksiyon gelişir. Kan damarlarından salgılanan norepinefrin ve trombosit ile mast hücrelerinden salınan serotonin damarların vazokonstrüksiyonundan sorumludur (21-23). Hemoztasis inflamasyondan hemen önce gerçekleşmektedir (3). Yaralanma bölgesindeki trombositler açığa çıkan kollajen ve ekstraselüler matriks elemanlarıyla temas ederler (21,24). Akut doku yaralanması sırasında kan damarlarının hasar görmesiyle trombositler subendotelyal kollajenle ( tip IV ve tip V ) karşılaşırlar. Bu durum trombositlerin agregasyonu ve koagulasyonun aktivasyonuna neden olur (3). İlk zamanlarda görülen lokal arteriol ve kapillerlerin vazokonstruksiyonundan sonra vazodilatasyon ve vasküler geçirgenlikte artış başlar (17). Vazokonstrüksiyon yaklaşık olarak 5-10 dakika sürer (25). Kanamanın durması yaralanmış kapiller endoteline yapışan eritrosit ve trombosit tıkaçlarının gelişmesiyle olur. Kollajenle trombositlerin ilk teması sırasında megakaryositler ve endotel hücreleri tarafından sentezlenen heterodimerik bir protein olan von Willebrand faktörü (vWF) VIII gerekir. Trombositlerin endotele adhezyonu glikoprotein reseptörleriyle integrin reseptörlerinin etkileşmesi sonucunda meydana gelir (17). Fibrinojenden pıhtılaşma sırasında üretilen fibrin, trombosit tıkacına bağlanır ve geçici matriksi oluşturur. Trombositlerden α granüllerinden sitokin ve büyüme faktörleri salınır (22,26). Doku türüne göre ekstrinsik ya da intrinsik pıhtılaşma yolları aktive olur. Beyin, akciğer, plasenta, kalp ve uterusta doku faktörüyle-faktör VIIa arasında doku kompleksi oluşur. İskelet kası ve eklem dokusunda oluşan doku kompleksinde faktör VIIIa ve faktör IXa mevcuttur (21,24). Trombositlerin bu kompleks oluşumlarla teması sonucunda; trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) , transforming growth faktör (TGF-β) gibi büyüme faktörleri ve sitokinler içeren α granülleri trombositlerden salınır.(22,27). Bu faktörler sadece hemoztazı tetiklemekle kalmaz, aynı zamanda iyileşmenin diğer fazlarında da önemli rolleri vardır. Yara iyileşmesinin başlatılması için trombositler ve pıhtılaşma mekanizması önemlidir. Yaralanma oluşunca trombositler ve pıhtılaşma ürünleri birleşir ve artan hızla pıhtı oluşumu başlar (21,26) 4 Tablo 1. Yara iyileşmesiyle ilişkili hemostatik ve trombosit kaynaklı faktörler (20). Fonksiyon Hemostatik Faktör Fibrin, fibronektin Koagülasyon, kemotaksis, hücre göçü F XIII Kemotaksis, yapışma Kompleman Antimikrobiyal aktivite, kemotaksis Trombosit Kaynaklı Faktörler Sitokin, Büyüme Faktörleri Kemotaksis, mitogenez, fibroplazi Fibronektin Matriks oluşumu, trombosit agregasyonu Trombosit aktive edici faktör (PAF) Trombosit agregasyonu Tromboksan A2 Vazokonstriksiyon, trombosit agregasyonu, kemotaksi Serotonin Vasküler geçirgenlik, nötrofil, kemotaksisi 5 2.1.2. İnflamasyon İnflamasyon fazında yara yüzeyinin kapatılması, nekrotik doku, yabancı madde veya bakterilerin uzaklaştırılması ile yaralanmış bölge sınırlandırılmaya çalışılır (17). İnflamatuar faz yara iyileşmesinin gerekli bölümlerinden olup, vasküler geçirgenliğin artması, hücre kemotaksisi, lokal sitokinler ve büyüme faktörlerinin salınması ile karakterizedir (19). Trombosit kaynaklı sitokinler interlökin-1 (IL-1) ve tümör nekrotize edici faktör-α ( TNF- α ) dür. Endotelden salınan histamin, prostoglandin E2 ( PGE2 ) , prostasiklin, endotel kaynaklı büyüme faktörü (EDGF) damar geçirgenliğini artırır (20,28,29). İnflamasyon fazında yaralanma bölgesine ilk gelen hücreler nötrofillerdir. Nötrofil göçünü uyaran faktörler; damar geçirgenliğinin artması, kompleman faktörler, IL–1, TNF-α, TNF-β, PF–4 ve bakteriyel yıkım ürünlerdir (20,30-33). Nötrofiller (polimorfonükleer lökositler) yaraya hemen ulaşır, 24 saat içinde büyük sayılara ulaşır.(33,34). Nötrofillerin ana görevi, yara yüzeyindeki yabancı cisim ve bakterilerin fagositozu ve proteaz salınımıyla zarar gören hücre kalıntılarının temizlenmesidir. Nötrofiller görevlerini yaptıktan sonra dolaşım sisteminden gelen makrofajlar tarafından fagosite edilirler. Maksimum sayıya 1–2. günde ulaşırlar ve yara temizlendikten sonra 2–3. günlerde sayıları azalır (28). Monositler nötrofilleri izler ve yaralanmadan 48–72 saat sonra yarada gözlenir (25,26,33,35). Yaralanmadan sonra 3.günde baskın hücre tipini makrofajlar oluşturur (17,20). Yara iyileşmesinde görev alan hücrelerin etkin olabilmesi için aktif halde olması gerekir. Büyüme faktörlerinin hücre üzerindeki etkileri sonucunda hücrede fenotipik, biyokimyasal ve fonksiyonel değişiklikler meydana gelir. Bu aktivasyon sonucunda yeni hücre yüzeyi antijenleri görülür ve sitokin salınımı artar (20). Monosit kemoatraktan protein 1’in (MCP–1) sunumuyla monositler iyileşmekte olan yaraya ilerler. Doku makrofajları sistemik dolaşımdan kaynaklanır ve monosit olarak isimlendirilir, dolaşımdan dokuya geçtiklerinde ise fenotiplerini değiştirirler (25). Aktive olan makrofajlar hücresel kalıntıları ve bakterileri fagosite ederler. Makrofajların bir diğer görevi ise sitokin üreterek diğer hücrelerin aktivasyonu sağlayarak, fibroplazi ve anjiyogenesis üzerinde etkili olmalarıdır.(20,26). 6 Yara iyileşmesinde rol oynayan birçok hücre endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) veya uyarılabilen nitrik oksit sentaz (iNOS) izoenzimlerini kullanarak nitrik oksit (NO) sentezleme yetisine sahiptir (10,27). Makrofajlarda iNOS keratinositlerde eNOS ve iNOS endotelyal hücrelerde eNOS ve fibroblastlarda eNOS ve iNOS formları bulunur (26,36-38). iNOS cilt yaralanmalarında ilk 24 saat içerisinde yükselir ve 1-5 gün arasında maksimum değere ulaşır (39,40). Gastrik ülserde iNOS ve eNOS beraber yükselir ve 3-6 gün arasında pik yapar (26). Nitrik oksidin vazodilatasyon, antimikrobiyal aktivite antitrombosit aktivitesi ve vasküler geçirgenliğin artırılması gibi özellikle inflamasyonda görülen birçok primer görevi vardır (26,41,42). Lenfositler yaraya en son giren hücrelerdir ve yaralanmanın 5 ve 7. günlerinde yarada gözlenir. İyileşmede ki rolü tam olarak bilinmemekle birlikte CD4 stimulan ve CD8 inhibitör hücre popülasyonları ve mast hücreleri de inflamatuar fazın son bölümünde görülür (25). Şekil 1.Yaralanmadan 3 gün sonra cilt yarası. Yaraya göçü sağlayabilmek için gerekli hücreler ve büyüme faktörleri şekilde gösterilmiştir. ( Sabiston Textbook of Surgery. The Biological Basis of Modern Surgical Practice. 18 th edition. Elsevier Saunders; 2008). 7 Şekil 2. Yara iyileşmesi sırasında hücrelerin yaralanma bölgesinde görülme zamanları. Makrofajlar ve nötrofiller inflamatuar dönemde, fibroblastlar ise proliferatif fazda baskın olarak görülmekte. (Sabiston Textbook of Surgery. The Biological Basis of Modern Surgical Practice. 18 th edition. Elsevier Saunders; 2008.) 8 Tablo 2. Makrofajların yara iyileşmesindeki rolü ve etki mekanizması Etki Fagositoz ve antimikrobiyal etki Mekanizma Oksijen radikalleri; H2O2, O2, 0H Nitrik oksit Yara debritmanı Fagositoz Enzimler Kollejenaz, elastaz Matris sentezi Growth faktör TGF-β, EGF, PDGF Sitokinler TNFα, IL-1, INF Prostoglandinler PGE2 Hücre aktivasyonu Growth faktör PDGF, TGF-β, EGF, IGF Sitokinler TNF-α, IL-1, IL-6 Fibrinonektin Angiogenez Growth faktör bFGF, VEGF Sitokinler TNF-α 9 2.1.3. Proliferatif Faz Hemoztasis ve inflamasyonun etkileri azalmaya başladığında, yaranın anjiogenez, fibroplazi ve epitelizasyon ile onarımı için iskelet oluşturulur. Bu bölüm; kapiller yatak, fibroblastlar, makrofajlar ve gevşek düzenlemiş kollajen, fibronektin ile hiyaluronik asitten oluşan bağ dokusu oluşumuyla karakterizedir (17). Yara iyileşmesinin proliferatif fazının genel olarak yaralanmadan sonra 4 ile 21. günler arasında meydana geldiği kabul edilir (25). Fibroblastlar ve endotelyal hücreler bu fazda primer prolifere olan hücrelerdir. Fibroblastlar yara bölgesine çevre dokulardan gelir, endotelyal hücreler ise yara kenarındaki sağlam venüllerden veya anjiogenez sonucu oluşan yeni kapillerden ortaya çıkar (20). Anjiyogenesis yeni kan damarı oluşumu olup iyileşen yara ortamına destek sağlar (9). Sitokinler ve büyüme faktörleri; trombosit ve aktive makrofajlardan kaynaklanıp fibroblast ve endotelyal hücrelerin proliferasyonundan sorumludur. Yeni kan damarı oluşması yara iyileşmesinin en önemli bölümlerinden biridir. Nitrik oksidin iskemik fare dokusunda anjiyogenezi artırdığı gözlenmiştir. Gastrik ülser iyileşmesinde eNOS inhibitörlerinin granülasyon dokusundaki anjiyogenezi bozduğu gözlenmiştir (26,43,44). Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) yara iyileşmesinde en potent anjiyogenik faktördür (45,46). VEGF nitrik oksit üretimini eNOS üretimini artırarak sağlar. VEGF’nin anjiyogenik etkisinin NO üzerinden olduğu görülmektedir (26,38). NO’nun blokajı VEGF tarafından uyarılan endotel hücre proliferasyonunu ve mitozunu engeller (26,47). PDGF ve EGF fibroblastların kemotaksisinden ve proliferasyonundan sorumlu başlıca büyüme faktörleridir (26,28,48). Doku kaybı olan yaralarda sıvı kaybını engelleme ve enfeksiyon oluşumuna karşı koymada epitelyal hücre artışı önemlidir. Yaralanmadan birkaç gün sonra yara kenarındaki sağlam bölgedeki epitel, yara içine doğru prolifere olur (20). Yaralanmadan sonra aktive olan endotelyal hücreler venüllerin bazal membranını zayıflatarak meydana gelen aralıklardan hücre göçüne izin verir. Göç eden endotelyal hücreler tübül veya lümen oluşturur. Bazal membranın tekrar oluşturulmasıyla kapiller damar olgunlaşır (17). Yeni kapillerlerin oluşumu ile yara bölgesi pembe veya kırmızı-mor renkte görülür. Kapiller vaskülarizasyon, fibroblastların yara matrisinde kalıcı destek doku oluşturmasına yardımcı olur. Kalıcı yara matrisindeki temel yapı molekülü kollajendir (20). Kollajen molekülü hidroksiprolin ve hidroksilizinin hidroksilasyonundan meydana gelir. Bu aminoasitlerin hidroksilasyonu ve 10 kollajen arası bağların sağlamlaştırılması için C vitamini gereklidir (20,49). Kollajen fibrinleri arasındaki moleküller içi ve arası bağlar, yaranın gerilim kuvvetine ve sağlamlığına etki eder. En az 20 çeşit kollajen bulunmaktadır ve bağ dokusunda bulunan ana kollajen tipleri I, II, III, V ve XI dir. Tip I en fazla bulunan kollajen olup deri ve kemik dokusunun ana kollajenidir. Erişkinde deri yaklaşık % 80 tip I ve % 20 tip III kollajenden oluşur (20,50). Çocuklarda tip III kollajen miktarı daha fazladır. Yara iyileşmesinin erken döneminde (granülasyon dokusu) tip III kollajen miktarı fazladır. Olgunlaşmış skar dokusunda nispeten (%10) azdır. Tip I kollajenler fibriller veya fibril-oluşturan kollajenlerdir (20,51). İn-vitro hayvan deneylerinde NO ve kollajen birikimi arasındaki ilişki tanımlanmıştır. Deneysel çalışmalarda diyette arginin, NO tedavisi veya gen terapisi ile iNOS aktivasyonunun yarada kollajen miktarını artırdığı gözlenmiştir (26,52,53). Şekil 3. Yara matriksi oluşumunun zaman içindeki süreci. Wound matrix deposition over time. Fibronektin ve tip III kollajen erken matriksi oluşturmakta. Tip I kollajen daha sonra birikmekte ve yaranın ayrılma kuvvetiyle orantılı olarak artmaktadır ( Sabiston Textbook of Surgery. The Biological Basis of Modern Surgical Practice. 18 th edition. Elsevier Saunders; 2008). 11 Şekil 4. Yaralanmadan 5 gün sonra cilt yarası. Kan damarları fibrin pıhtı içerisine uzanmakta olup aynı zamanda epidermal hücreler tekrar yüzey oluşturmaktadır. Hücre ilerlemesinde görevli olan proteinazların hareket ettikleri yön oklarla gösterilmiştir. Matriks metaloproteinazlar(MMP) -1,2,3 ve 13 (kollajenaz 1, jelatinaz A, stromelisin 1, ve kollajenaz 3, sırayla); doku plasminojen aktivatörü (t-PA) ; ürokinaz-tipi plasminojen aktivatörü (u-PA) (Sabiston Textbook of Surgery. The Biological Basis of Modern Surgical Practice. 18 th edition. Elsevier Saunders; 2008). 12 2.1.4. Olgunlaşma ve Yapılanma Fazı Proliferasyon ve neovaskülarizasyonun sona ermesiyle yeniden yapılanma fazı başlar. Olgunlaşma bölümünün ana özelliği yarada kollajen birikmesidir. Klinik bakış açısıyla matriks oluşumunun kalite ve miktarı skar dokusunun gücünü belirleyeceği için olgunlaşma fazı yara iyileşmesinin en önemli fazıdır (20). Yara iyileşmesinde inflamatuar ve proliferatif fazların iç içe oluşup geliştiği gibi yeniden yapılanma ve proliferasyon fazında da birçok olay iç içe oluşur. Proliferatif fazdan yeniden yapılanma fazına geçiş kollajenin dengeye ulaştığı süreç olarak tanımlanır. Bu faz sırasında yoğun hücresel ve yüksek vaskülaritesi olan daha az hücre ve damardan oluşan skar dokusu ile replase olur. Fibroblast ve makrofajlar kaybolur. Kollajen birikimi yaralanmadan 2–3 hafta sonra en yüksek değere ulaşır. Yeniden yapılanma döneminde kollajen sentezi ve yıkımı devam eder, ama kollajen miktarı değişmez (22,54). Kollajen sentezi ile birlikte kollajen yıkımı yara matrisinin maturasyonu süresince devam eder. Kapillerlerin yoğunluğu ve fibroblastların sayısı azalır. Pembe mor görünümlü yaranın rengi soluklaşır. Gerilme kuvveti kollajen fibrillerinin yerini daha fazla moleküller arası bantlar içeren organize fibrillerin alması ile yavaş yavaş artar. Gerilme kuvveti ile kollajen fibrillerinin kalınlığı arasında doğru orantı vardır fakat epiderm hiçbir zaman eski şeklini tam alamaz. Skar dokusu gerilme kuvveti yaralanmadan bir haftadan sonra normalin %3’üne, 3 hafta sonra %20’sine, 3 ay sonra ise %80’ine ulaşır ve daha fazla artmaz. Yara iyileşmesinde bütün bu bölümlerin sonunda yaralarda morfolojik olarak üç ana özellik olan yara kontraksiyonu, epitelizasyon ve bağ dokusu birikimi sağlanarak yara iyileşmesi tamamlanmış olur. Yaralanmayla dokuda meydana gelen doku hasarının durumuna bağlı olarak iyileşme mekanizmasında değişiklik olmaksızın bu üç olayın karakterlerinde bir tanesi ön plana geçebilir; Parmak ampütasyonunda kontraksiyonun, yüzeyel doku kaybında epitelizasyonun, primer sütürle kapatılan cerrahi yaralarda bağ dokusu birikiminin daha fazla olması buna örnek olarak gösterilebilir (55,56). 13 2.2. GASTROİNTESTİNAL SİSTEMDE YARA İYİLEŞMESİ Yara iyileşmesi temel olarak tüm dokularda birbirine benzer ancak GİS’de farklı bazı özellikler taşır. Normal şartlarda gerilme kuvveti barsakta cilt yaralarına göre çok daha hızlı oluşmaktadır (57). Barsak yaralarında cilt yaralarından farklı olarak fibroblastlara ek olarak düz kas hücreleri de kollajen sentezler (58). Barsak ve cilt yarasındaki fibroblastlar kollajen sentezi farklı mekanizmalarla düzenlenir (59). Barsak lümeninin içerdiği geniş mikroorganizma havuzu (özellikle kalın barsak), sütür hattının kapatılmasında serozanın etkisi, hipovolemi durumunda perfüzyonun azalması gibi özellikleriyle gastrointestinal kanal iyileşmesi deriden farklılıklar gösterir. Mukoza, submukoza, muskularis propria ve seroza gastrointestinal kanalı oluşturan tabakalardır. Her tabaka farklı görevleri olan hücre tiplerini içermektedir. Mukozal ayrılmalar epitel hücrelerinin migrasyonu ve hiperplazisi ile onarılır. Bu durum oluşan defekti kapatır ve lümen içerisindeki bakterinin geçişi için bariyer oluşturur. Mukozanın direkt karşı karşıya getirilmesi onarımın 3 güne kadar inmesine olanak sağlar (3,18). Tüm dokularda hasar sonrası hemostaz ve inflamasyon, proliferasyon, olgunlaşma ve yeniden yapılanma fazları ortak olmasına karşın, her doku aynı şekilde iyileşmemektedir. Mukoza glandler, villuslar ve kriptler oluşturan epitel hücrelerinden oluşur (60). Özofagus dışında tüm barsak mukozası kolumnar epitelden oluşur (18). Epitelin altında gevşek bağ dokusu olan lamina propria bulunur. Kan damarları ve lenfatik kanallara ek olarak lamina propriada; fibroblastlar, myofibroblastlar ve düz kas hücreleri gibi mezenkimal hücreler bulunur. Submukoza, damarlardan ve konnektif dokudan oluşan bir tabakadır. Barsak duvarının bütünlüğünü ve mekanik gücünü bu tabaka sağlar. GİS’deki kollajenin büyük kısmı buradadır ve bunun %68’i tip I, %20’si tip III, %12’si tipV kollajendir. Ayrıca elastin içeren submukoza yara iyileşmesindeki en önemli tabakadır (18,20,61). Submukozanın üzerinde muskularis propria vardır. Muskulasis propria sirküler ve longitüdinal kas tabakasını içerir. En dış tabakayı bağ dokusu ve mezotel hücrelerinden meydana gelen seroza oluşturur (3,18). Gastrointestinal sistemde yara iyileşmesi temel olarak inflamasyon, proliferasyon ve olgunlaşma evrelerini içerir. Yaralanmayı takiben yara dudaklarında vazokontrüksiyon gelişir, ardından vazodilatasyon, vazoaktif maddelerin salınımı ve permeabilite artışı ile inflamasyon başlar ve yaralanmadan 3 saat sonra bölgeye nötrofiller gelir ve 12–24 saatte maksimum düzeye ulaşır, daha sonra makrofajlar ve bunu takiben fibroblastlar yara bölgesine gelir. Makrofajlar salgıladıkları sitokinlerle inflamasyonu kontrol ederler ve düz kas hücreleri ile fibroblastların proliferasyonunu, kollajen sentezini ve ayrıca neovaskülarizasyonu uyarırlar. 14 GİS’de yara iyileşmeside kollajen sentezinden fibroblastların yanı sıra düz kas hücreleri de sorumludur (3,58). Kollajen sentezi ve granülasyon dokusunun anastomozda görülmesi proliferatif fazın başlangıcını belirler (18). Anastomozun gücü submokozal tabakada bulunan kollajen fibrillerinden kaynaklanır. Operasyon sonrası ilk birkaç gün kollajenaz aktivitesi nedeniyle kollajenin yıkılmasıyla anastomozun gücünde azalma meydana gelir. Bu nedenle erken anastomoz gücü sütür veya staplere dayalıdır. Fibroblastlar ve düz kas hücreleri tarafından 1-2 gün sonra yeni kollajen sentezi olur. Bu döneme kadar anastomoz zayıftır (3,18,58,59). Submukoza sağlam barsaktaki gerilim kuvvetinin en önemli kaynağı ve anastomotik uçları bir araya getiren sütürlerin tutunduğu başlıca katmandır. Bu tabakadaki kollajen birikimi yaranın mekanik direncini ve sütürleri taşıma kapasitesini belirler (3). İyileşen sütür hattının gerilim kuvveti, nitelik ve niceliksel olarak tamir olayının düzeyini yansıtır. İlk 3–4 gün içinde barsak anastomoz kuvvetinde belirgin bir azalma olduğu gösterilmiştir. Yara bölgesine geçici olarak gelen nötrofillerden salınan proteazlar ve serbest oksijen radikallerinin, hücre dışı matriksde değişiklik meydana getirerek gerilim kuvvetinde azalmaya neden olabilir. Dördüncü günden itibaren yara bölgesinde kollajen yapımı ve birikimi belirginleşmeye başlar ve kollajen miktarındaki artışla birlikte anastomoz kuvvetinde de artış meydana gelir (61). Proliferasyon evresinde kollajen sentezi ile birlikte yeni kapiller damarlar oluşur ve yarada biriken laktik asidin anjiogenezi uyardığı düşünülmektedir. Anjiogenez ilerledikçe yaradaki oksijen kullanımı artmaya başlar ve enerji metabolizması değişir (62,63). Submukozada sentezlenen kollajen fibrilleri yaranın iki dudağı arasında köprüler oluşturur. Erken dönemde yara dudaklarını bir arada tutan kuvvet sütürler ise de kollajen köprülerinin artmasıyla 7–14. günlerde sütürlerin önemi kalmaz. Olgunlaşma ve yeniden yapılanma evresiyle birlikte kollajen fibrillerindeki çapraz bağlar artar. Bu evrede yara daha az hücresel bir hale gelir ve fazla sayıdaki kapillerlerin bir kısmı kapanır, granülasyon dokusu yerini skar dokusuna bırakır. Kolon anastomozlarının mekanik dayanıklılığı 14. günde normal dokunun %45’i kadardır, 4. ayda ise %75’i düzeyine ulaşır (64). Mide ve ince barsakların kanlanması çok iyi olup ayrıca bakteri kolonizasyonu da azdır. Bu organların rezeksiyon ve anastomozları sonucu anastomoz sızdırması çok az görülmekte ve bir hafta sonra anastomoz yeterli sağlamlığa ulaşmaktadır. Özafagus ve kolonun kanlanması ise mide ve ince barsaklara göre daha azdır. Distal kolondaki yüksek bakteri kontaminasyonu bir yandan kollajen sentezini geciktirirken diğer yandan da kollajenaz etkisini artırarak kollajenin aşırı lizisine neden olmaktadır (65). 15 Şekil 5. Gastrointestinal yara iyileşmesinde kollajen sentezi ve kollajenoliz arasındaki dengeyi gösteren grafik. Zayıf dönemde kollajenoliz, kollajen sentezini geçmektedir. 16 2.3.CİLT VE GASTROİNTESTİNAL SİSTEMDEKİ YARA İYİLEŞMESİ ARASINDAKİ FARKLAR Yara iyileşmesinin üç klasik fazı cilt için tarif edilmesine karşın bütün dokularda benzerdir. Cilt ve gastrointestinal iyileşme arasında önemli farklar bulunmaktadır. Bu farklar tablo 3 de gösterilmiştir (18,58,59). Tablo 3. Cilt ve Gastrointestinal Sistemdeki Yara İyileşmesi Arasındaki Farklar Gastrointestinal Traktus Cilt Alt tipleri 1,3,5 1,3 Üretimi Düz kas hücreleri ve fibroblastlar Sadece fibroblastlar TGF-β TGF-β, İnterlökin 1β Makaslama Direnci Peristalsizm ve intralüminal madde iletimiyle, artar Minimal Bakteri Aerobik ve anaerobik, anastomoz iyileşmesini etkileyebilir. Aerobik, nadiren probleme neden olur. Vasküler Perfüzyon Hipovolemik şokta azalır Sabit İyileşme hızı Hızlı (Haftalar) Uzun (Aylar) Ek unsurlar Seroza ek kuvvet sağlar Serozası Yok İlk 3 gün artar, anastomoz gücünde geçici azalmaya neden olur Belirgin değil Kollajen Regülasyon Yara ortamı Yara kuvveti Kollajenaz aktivitesi 17 2.4.GASTROİNTESTİNAL SİSTEM ANASTAMOZLARINDA YARA İYİLEŞMESİNİ ETKİLEYEN FAKTÖRLER 2.4.1.Lokal Faktörler Dokunun Kanlanması Anastomoz bölgesinin perfüzyonu ve oksijenizasyonu anastomozun iyileşmesini etkileyen en önemli faktörlerdir (3,66). Fibroblastların fonksiyonları ve proliferasyonu için oksijenizasyon gereklidir. Ayrıca oksijen kollajen molekülündeki çapraz bağların oluşumu için gereklidir. Perianastomotik dokuda oksijen basıncı (pO2) 20-25 mmHg altına düşerse yaradaki enerji metabolizması bozulur ve fibroblast proliferasyonu durur. Oksijen basıncı 40 mmHg’nin altına düşmesi durumunda matür kollajen oluşumu bozulmasıyla anastomoz kaçağı olasılığı artar. Oksijen basıncı 10 mmHg altında olursa büyüme faktörleri üretimi, anjiogenez ve epitelizasyon durur (18,67,68). Anastomoz sırasındaki doku oksijen basıncının rezeksiyondan önceki basıncın %50’sinden az olması durumunda kaçak oranını %100’e yaklaşır. Güvenli bir anastomoz için intestinal kan akımı %30’unun üzerinde olması gerekir (3). Anemi, perfüzyon yeterli olduğu sürece yara iyileşmesine zarar vermez. Hastalarda kardiyak output yeterli oldukça ve periferik vazokonstrüksiyon olmadıkça, normal değerlerin %15 aşağısına kadar hematokrit değerleri tolere edilebilir (18,69). Cerrahi Teknik Cerrahi teknik her türlü ameliyatta başarı için vazgeçilmez bir faktördür. Deneyimli cerrahların yara komplikasyonlarının daha az olduğu gözlenmiştir. Dokunun kuruması ıslak petler kullanılarak önlenmelidir. Sütürler kenarlara uygun uzaklıkta atılmalıdır (3). Kullanılan dikiş materyalleri incelendiğinde, tüm dikişlerin inflamatuar bir cevap oluşturduğu görülmüştür. En az inflamatuar cevap ve bakteri kolonizasyonuna neden olan dikiş materyalinin, yara iyileşmesi açısından en avantajlısı olduğu sonucuna varılmıştır. En uygun dikişlerin monoflaman sentetik absorbe olmayan dikişler olduğu savunulmaktadır. Metal zımbalar kullanılan staplerlerin de oldukça avantajlı olduğu ve inflamatuar reaksiyonun az olması nedeniyle yara iyileşmesini hızlandırdığı saptanmıştır (3). Stapler kullanılarak yapılan anastomozlarda anastomoz kaçağının daha az olduğu savunulmaktadır (70). 18 Devamlı dikişlerin tek tek dikişlere göre yara kenarında daha fazla iskemi ve inflamasyona neden olduğu ve yara iyileşmesini geciktirdiği saptanmıştır. Aynı zamanda devamlı dikişlerle yapılan anastomozlarda erken dönemde anastomoz darlığı daha sık görülmektedir. İnverte edilerek yapılan anastomozların everte edilerek yapılan anastomozlara göre sağlam olduğu gösterilmiştir. Everte edilerek yapılan anastomozların daha çok adezyona ve lokal komplikasyona sebep olduğu ve normal histolojik yapının daha geç oluştuğu bilinmektedir. Everte edilen anastomozların tek avantajı lümenin daha geniş olmasıdır. Çift tabaka anastomozlarda, tek tabakaya göre yarada iskemi ve inflamasyon daha fazla olduğu ve iyileşmenin geciktiği gösterilmiştir (66). Lokal Enfeksiyon Lokal enfeksiyon inflamatuar fazı uzatarak ve doku proteazlarının salgılanmasının artışını uyararak yara iyileşmesini olumsuz yönde etkiler. Doku proteazlarındaki artış büyüme faktörlerinin yıkılmasına neden olur ve böylece epitelizasyonda ve kollajen birikiminde gecikme ortaya çıkar (18,67). Lokal enfeksiyon buna bağlı olarak görülen anastomoz kaçaklarının en önemli nedenlerinden biri bakteriyel kontaminasyondur (71). Kolondaki bakteri sayısında yüksekliğe rağmen yabancı cisim bulunmadığı durumlarda anastomoz etrafında enfeksiyon oluşması nadiren görülür. Bunun nedeni peritonun koruyucu özelliğidir. Periton bakterileri seyrelterek fagosite edilmelerini hızlandırır (72). Enfeksiyon yara dokusunda kollejenaz aktivitesini artırarak kollojen miktarında azalmaya neden olur (73). Enfeksiyon varlığında anastomoz çevresinde ve komşuluğundaki kolon duvarında kollojen aktivitesinde azalma görülmüştür (74) Hematom ve Dren Hematom ve yabancı cisimler özellikle ekstraperitoneal anastomozlarda enfeksiyon riskini artırarak iyileşmeyi olumsuz etkiler. Ekstraperitoneal anastomozlarda özellikle drenaj uygulanması, anastomoz çevresinde hematom oluşmasının önlenmesi açısından önerilmektedir. Bu gibi anastomozlarda anastomoz çevresinde periton bulunmadığı için ölü mesafeye yayılan bakteriler fagosite edilemezler. Anastomoz çevresinde oluşan hematom kolaylıkla enfekte olabilir (66). Anastomozların çevresine yerleştirilen drenlerin anastomotik yara iyileşmesine etkisi net olarak açıklanamamaktadır. Fakat anastomoz çevresine dren konulmasının morbiditeyi arttırdığı gösterilmiştir. Drenlerin, anastomoza komşu dokuların ve 19 omentumun dikiş hattına yapışmasını engelleyerek veya enfeksiyona neden olarak anastomoz kaçak riskini arttırdığı düşünülmektedir. Drenlerin anastomozu korumadığı, çok gerekmedikçe konulmaması ve fazla yerinde bırakılmaması gerekir (3). Mekanik Barsak Temizliği Barsak hazırlığının kolorektal cerrahide komplikasyon gelişmesini önleyen faktörler arasında olduğuna uzun zamandır inanılmaktadır. Feçesin anastomoz bütünlüğünü bozabileceği düşünülmüş fakat barsak temizliği yapılmayan hastalarda anastomozun mekanik ayrılması nadiren görülmüştür (3). Bir meta-analizde Slim ve ark. kolorektal cerrahi öncesi yapılan barsak temizliğinin postoperatif anastomoz kaçağı üzerinde etkili olmadığını bildirmiştir (18,75). Radyasyon Terapisi Gastrointestinal ve jinekolojik maligniteler için perioperatif radyasyon tedavisinin kullanımı, dokunun canlılığını kaybetmesi ve iyileşme kapasitesinin azalması sorularını ortaya çıkarmıştır. Radyoterapi tümör hücrelerini ortadan kaldırsa da yakındaki sağlıklı doku üzerinde akut ve kronik istenmeyen etkileri oluşmaktadır. GI kanalda uzun dönem etkileri fibrosis, darlık ve endarteritis obliteransa bağlı iskemiye neden olur. Hayvan deneylerinde yüksek doz radyasyon sonrası seromusküler kan akımının erken dönemde 4 hafta içerisinde azaldığı ve bunun 4 ay devam ettiği gözlenmiştir (3). 2.4.2.Sistemik Faktörler Yaş Yaşla birlikte anastomoza bağlı komplikasyonların sıklığı da artmaktadır. Bu artış ileri yaşlarda daha sık görülen malnutrisyon, kardiyak ve respiratuar yetersizlik gibi durumlara bağlı olabilir. Ancak deneysel olarak yaşın yara iyileşmesine direkt etkisi saptanmamıştır (3). Stoop ve ark. deneysel bir çalışmada ilerlemiş yaşın ratlardaki kolon anastomozlarında kollajen miktarını veya anastomoz kuvvetini etkilemediğini göstermiştir (18,76). 20 Nutrisyonel Durum Yara iyileşmesi için enerji ve hastanın beslenmesinin yeterli olması gerekmektedir. Beslenme yetersizliği olan hastalarda, onarım için gerekli vitamin ve mineraller eksik olduğu için yara ayrılması görülür. Bunlar kollajen sentezi ve çapraz bağlanması için gerekli olan vitamin A, B6, C ve çinko ile demir mineralleridir. Çinko ve demir DNA sentezi, protein sentezi ve hücre proliferasyonunda gerekli olan birçok reaksiyonda ko-faktör olarak görev alır. Çinko ve demir eksikliği suboptimal fibroblast proliferasyonuna ve kollajen sentezinin bozulmasına neden olur. Azalmış demir seviyeleri anemide oksijen taşımasının azalmasına neden olarak anastomoz iyileşmesini indirekt olarak bozar (18,67,77). Özellikle uzun süreli protein malnütrüsyonunda GİS’de yara iyileşmesi olumsuz etkilenebilmektedir. Vücut ağırlığının %30’unun kaybı anastomozlarda ciddi komplikasyonlara neden olabilmektedir. Deneysel çalışmalarda erken postoperatif enteral beslenmenin kolonik anastomoz yara iyileşmesini artırdığı gösterilmiştir. C vitamini kollajen sentezinde önemli olan prolinin hidroksiproline çevrilmesinde rol oynar, eksikliği yara iyileşmesini etkileyebilir (3). Çinko eksikliğinde yara iyileşmesi gecikir ve çinko verilmesi ile yara iyileşmesinde hızlanma görülür. Bu etki proliferatif fazda görülür ve epitel hücrelerini kapsar (71). Transfüzyon Kan transfüzyonu immun yanıtı baskılamakta, tümör büyümesine ve rekürense neden olmaktadır. Yara iyileşmesini olumsuz yönde etkilenmekte ve anastomoz kaçak oranını artırmaktadır (3). Buna yara iyileşmesinin inflamatuar fazındaki özellikle makrofaj fonksiyonlarında ve migrasyonundaki azalma gibi değişikliklerin neden olduğu düşünülmektedir (18,68). Transfüzyon sonrası lokal enfeksiyon riski artmaktadır. Ayrıca lenfositlerin süpresyonu yara iyileşmesinin inflamasyon evresindeki olayları olumsuz etkilemektedir (3). Hipovolemi Hipovolemi yara iyileşmesini olumsuz yönde etkiler ameliyat sırasında kan volümünün %10’luk kaybı, postoperatif 3. günde kolonik ve ileokolik anastomozda anlamlı derecede kollojen azalmasına neden olur (56-57). Hipovolemiyle birlikte olmadığı sürece anemi yara iyileşmesini etkilemez. Dokuların oksijenizasyonu için kanın oksijen içeriği değil, parsiyel oksijen basıncı önemlidir. Bu nedenle anemi çok şiddetli değilse doku oksijenizasyonu ve yara iyileşmesi bozulmamaktadır (18,69). 21 İlaçlar Non-steroid Anti-inflamatuar İlaçlar NSAİ ilaçların ilk 3 gün kollajenolizi azaltarak anastomoz iyileşmesinde etkili oldukları görülmüştür. Aynı zamanda prostoglandin sentezini azaltarak kollajen sentezini artırır ve anastomotik yara iyileşmesine olumlu etki gösterir (3). Kortikosteroidler Kortikosteroidler kollajen sentezini ve fibroblast proliferasyonunu baskılar. Kortikosteroidlerin antienflamatuar etkileri ile hücre fonksiyonları baskılar ve yara iyileşmesini geciktirirler (77). Kemoterapi (5-Fluorourasil) 5-Fluorourasil (5-FU) kollajen sentezini azaltır, bu etki cerrahiden sonra 3 gün beklenerek azaltılır. Hastanın nütrisyonel durumu ve ilacın konsantrasyonu 5-FU’ya bağlı bozulmuş yara iyileşmesini etkilemez. 5-FU kandaki lökosit sayını azaltır. (3). Metabolik Hastalıklar Diyabetin yara iyileşmesini azatlığını ve geciktirdiğini gösteren birçok kanıt bulunmaktadır (78). Diyabetik hastalarda nötrofil, makrofaj ve lenfositlerin fonksiyonları bozulur ve fibroblast proliferasyonunun bozulması sonucunda, kollajen depolanması azalır. Lökositlerin kemotaksis, fagositoz ve hücre içi bakteri öldürme fonksiyonları diyabette azalır, bu durum enfeksiyona ve tıkayıcı periferik vasküler hastalıklara yatkınlığı arttırır (67). Ayrıca diyabet mikrovasküler dolaşım bozukluklarına da neden olarak kan akımının azalmasına yol açar. Malign hastalıklar, katabolik etkileri nedeniyle yara iyileşmesini geciktirirler (3). Üremi ile birlikte renal asidozlu hastalarda, yara komplikasyonlarında ve yara iyileşmesinin gecikmesi artar. Karaciğer fonksiyonlarında bozulma protein sentezi üzerinde olumsuz etkiler yapar ve yara iyileşmesinin bozulması ve yara enfeksiyonu gibi komplikasyonlarda artma olur (3). 22 2.5.KOLON ANASTOMOZU VE İSKEMİ GİS’in iskemiye en duyarlı bölümlerinden biri kolondur. Yaşlı, malnütrisyonlu ve dehidrate hastalarda sık olarak karşılaşılan hipovolemi nedeniyle kolon iskemiye maruz kalmaktadır. Damar içi hacmin %10’luk azalması ile kolon perfüzyonunun 1/3 oranında azaldığı bildirilmiştir (79). İskemik segmentte uygulanan anastomoz her zaman komplikasyonlara açıktır. İskemi sonrası yara gerilim kuvvetinin ve kollajen sentezinin azaldığı gösterilmiştir. Azalan kan akımı sonrasında nötrofillerden reaktif oksijen türevleri açığa çıkmaktadır. Doku hipoksisi ile dokudaki ATP deposu azalır ve hücre membranında fonksiyonel bozukluk meydana gelir. Sonrasında gelişen protein sentezinin bozulması gibi zincirleme reaksiyonlar sonucunda membran stabilitesi bozulur ve hücre ölümü gerçekleşir. Anastomoz hattında kollajen yıkımı kaçak gelişmesinin en önemli sebeplerinden biridir. Hidroksiprolin düzeyi kollajen düzeyini yansıtır. Hidroksiprolin seviyesinde ki azalma ameliyattan üç saat sonra baslar ve 48. saatte en yüksek düzeyine ulaşır (1). 2.6.BÜYÜME FAKTÖRLERİNİN YARA İYİLEŞMESİ ÜZERİNDEKİ ETKİLERİ 2.6.1.Trombosit Kaynaklı Büyüme Faktörü (PDGF) PDGF yara iyileşmesinin her safhasında rol oynar. Yaralanmayı takiben PDGF trombositlerden salınır ve yara sıvısında bulunur (80,81). Bu mitogenisiteyi ve nötrofillerin, makrofajların, fibroblastların ve düz kas hücrelerinin yara bölgesine kemotaksisini uyarır (82). Aynı zamanda makrofajlarda büyüme faktörlerinin üretimini sağlar. TGF-β ve PDGF makrofajlar tarafından dokunun debritmanını ve granülasyon dokusu oluşmasını artırır (83). PDGF’nin anjiogenez yapma etkisi organa bağlıdır. Kardiyak mikrovasküler hücrelerde Vasküler endotelyal büyüme Faktörü (VEGF) ve VEGF-reseptör-2 üretimini artırarak kardiyak anjiogenezde önemli rol oynar. İskemik dokuda hipoksiyle sinerjik olarak VEGF yapımını artırır. Kan damarlarının maturasyonunda özellikle önemlidir. 2.6.2. Fibroblastik Büyüme Faktörü (FGF) FGF ailesi 23 üyeden oluşmaktadır. Bunlardan kutanöz yara iyileşmesinde rol oynayan en önemli olanları FGF-2, FGF-7 ve FGF-10 dir. Bunlar keratinositler, fibroblastlar, endotelyal hücreler, düz kas hücreleri, kondrositler ve mast hücreleri tarafından üretilir (84,85). 23 FGF-2 ve temel (basic) FGF (bFGF) akut yaralanmada artar, granülasyon dokusu oluşumunda, reepitelizasyonda ve dokunun tekrar yapılandırılmasında rol oynar . In vitro çalışmalar FGF-2’ nin ekstraselüler matrix elemanlarının sentezlenmesi, reepitelizasyon sırasında keratinosit motilitesini kontrol eder. FGF-2 fibroblastların migrasyonunu ve kollajenaz üretimini artırır. FGF-7 ve FGF-10 keratinositlerin proliferasyonunu ve migrasyonunu sağlayarak reepitelizasyonda önemli rol oynar (86). 2.6.3. Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü (VEGF) VEGF ailesi VEGF-A,VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E ve plasental büyüme faktörünü içerir. VEGF-A endotelyal hücreler, keratinositler, fibroblastlar, düz kas hücreleri, trombositler, nötrofiller ve makrofajlar tarafından sentezlenir (87). VEGF-A anjiogenezin erken döneminde ki endotelyal hücre migrasyonu ve proliferasyonunu düzenler (88). Akut yaralanmada VEGF-A üretimini tetikleyen ana etken yara ortamındaki metabolik düzensizliğe bağlı hipoksidir. Sonuçta oluşan anjiogenez doku perfüzyonunu sağlar, mikrosirkülasyonu tekrar kurar ve yara bölgesinde oksijen basıncını artırır (89). Hipoksi özellikle monositler, fibroblastlar, keratinositler, düz kas hücreleri ve endotelyal hücrelerden VEGF-A üretimini sağlar. Anjiyogenik etkilerine ek olarak VEGF-A lenfanjiyogenezde de etkilidir. Yeni lenf damarı oluşumu VEGF-reseptör-2 (VEGFR2) aktivasyonuyla sağlanır (90). Yaralanma sırasında aynı zamanda VEGF-C’ nin üretimi de artar. Bu büyüme faktörü primer olarak makrofajlardan salınır ve yaralanmanın inflamatuar fazında önemlidir. Proteoliz sonrası işlenen VEGF-C, damar endotelindeki VEGFR2’yi aktive edebilir. İn vitro çalışmalar bu faktörün direkt etkisiyle yara bölgesine inflamatuar hücre göçünde ve indirekt olarak VEGFR2 etkisi ile vasküler geçirgenliğin artmasında rol oynar (91). 2.7. GEN TERAPİSİ Genler kromozomlarda taşınır ve kalıtımı sağlayan temel fiziksel ve fonksiyonel birimlerdir. Protein üretiminin yöntemini kodlayan spesifik baz sıralarından oluşurlar. Genlerin tanımlanması ve genetik mühendisliğinde kaydedilen önemli gelişmeler sonucunda hastalıklarla mücadele edebilmek ve korunmak için hatalı genetik yapıyı değiştirme ön plana çıkmıştır (92). Gen terapisi terapötik fayda sağlama amacıyla bireyin hücrelerine veya dokusuna genetik materyal (hastalıklı mutant allel yerine fonksiyonel allelin) transferine 24 denmektedir. Bu transfer ilgili genin (transgen) hedef hücreye ilgilenilen bölgenin gerekli gen sunumu ortaya çıkarılarak bir araçla (vektör) verilmesidir (93-95). Çeşitli gen terapisi stratejileri geliştirilmiştir, başarılı bir gen terapisi için gereken ortak temel elemanlar vardır. Bunların en önemlisi hastalığa neden olan genin belirlenmesi ve klonlanmasıdır. Genin tanımlanmasından sonraki aşamada, genin hedeflenen hücrelere nakledilmesi ve orada ekspresyonu, yani kodladığı proteinin üretimi gelir. Gen terapisinin öteki önemli elemanlarıysa tedavi edilmek istenilen hastalığı ve gen nakli yapılacak hücreleri iyi tanımak ve gen naklinin olası yan etkilerini anlamaktır (92). Yabancı bir DNA’nın konakçı hücreye tanıtımı için iki strateji geliştirilmiştir. 1-DNA’nın kalıcı yerleştirilmesi 2-Geçici transformasyon ve kısa süreli üretim için kullanılması (96,97). Genler in vivo veya ex vivo şeklinde sunulabilir. İn vivo tekniğinde genler hedef dokuya direkt ulaştırılır. Ex vivo tekniğinde in vitro transfeksiyon yapılan seçilmiş hücreler izole edilir ve kültür yapıldıktan sonra konakçıya transplante edilir (96,98). 2.7.1. Gen Terapisi Tipleri Germ hücre gen terapisi Germ hücre gen terapisinde sperm veya yumurta gibi kök hücrelerin genomlarına fonksiyonel genler yerleştirilerek modifiye edilir. Bu nedenle terapiye bağlı yapılan değişiklik kalıtsal olur ve sonraki jenerasyonlara aktarılır. Bu yeni yaklaşım teorik olarak genetik hastalıkları önleyerek yüksek oranda efektif olacağı düşünülmektedir (99). Somatik gen terapisi Somatik gen terapisinde terapötik genler hastanın vücut hücrelerine yerleştirilir. Yapılan herhangi bir değişiklik kişiyi etkiler fakat kişi genetik olarak etkilenmediği için kalıtsal değildir (99). 25 2.7.2. Terapi metodları Gen terapisinde hedef genleri değiştirmek veya onarmak için birçok yöntem mevcuttur (99). • Normal bir gen genomda spesifik olmayan lokalizasyona yerleştirilerek fonksiyon görmeyen gen değiştirilir (en sık kullanılan). • Homolog rekombinasyonla normal gen anormal genle değiştirilir. • Selektif revers mutasyonla anormal gen onarılır ve gen normal fonksiyonuna kavuşur. • Özel bir genin düzenlenmesi değiştirilir( gen açılır ya da kapanır) (99). 2.7.3. Gen Transferi Yöntemleri Hücrelere gen eklemenin birkaç yöntemi bulunmaktadır. 1. Transfeksiyon; çıplak DNA molekülleri veya lipozomlarda lipid ile karıştırılmış DNA 2. Enfeksiyon veya transdüksiyonla; virüsler gibi istenilen geni taşıyacak ajanlar kullanarak. Vektör terimi eklenen gen ve onu içeren DNA’ yı ve lipozom/virüsü tanımlamak için kullanılan terimdir (100). 2.8. GEN TERAPİSİNDE VEKTÖRLER 2.8.1. Virüsler Viral vektörleri kullanarak yapılan gen transferi virüslerin kendi genlerini konakçı hücreye taşıyabilme ve orda kullanabilme esasına dayanır. Gen terapisi vektörlerinin üretimi virüsün genetik modifikasyonuyla başlar. Bütün virüsler konakçılarına bağlanır ve genetik materyalini konakçı hücrenin replikasyon siklusunun bir parçası olacak şekilde yerleştirir. Bu genetik materyalde virüsün daha fazla kopya üretmesi için basit bilgiler bulunur. Bu şekilde vücudun normal üretim mekanizmasını kendisi için kullanmış olur. Virüs üretimi devam ettikçe konakçı daha fazla enfekte olur. Replikasyon veya kurulum için gerekli orijinal viral genin silinmesi sonrasında istenilen terapötik genin yerleştirilmesi izler. Rekombinant virüs 26 üretebilme yeteneği paketleme hücreleri adı verilen silinmiş viral genin fonksiyonunu alan özel hücrelerle yerine konur (96,98,101). Gen terapisi vektörleri değişik tip virüslerin modifikasyonuyla geliştirilir. Retrovirüsler ve lentivirüsler enfekte olan hücrenin hücre membranından üretilir, non-litik replikatörlerdir ve hücreyi sağlam bırakırlar. Litik replikasyon metodunda enfeksiyondan sonra virionların salınmasıyla birlikte hücre çöker. İnsan adenovirüsleri, adeno ilişkili virüsler ve herpes simpleks litik replikatörlerin örnekleridir (96). Retrovirüsler (HIV) fiziksel olarak kendi genomlarını konakçının genomunun içine yerleştirir. Virüs revers transkriptaz enziminide konakçıya yerleştirir; böylelikle kendi RNA'sını ana bilgi kaynağı olarak kullanır. Böylelikle konakçı hücrenin yaşam siklusu boyunca virüs genlerini taşırlar (96). Retrovirüsler Retroviral vektörler gen transfer teknolojisininde standart olarak kullanılmaktadır (116,117). Diğer gen transfer sistemleriyle karşılaştırıldığı zaman çok çeşitli hücre tipine girebilme, konakçının genomik DNA’sına etkin olarak entegre olabilme ve yüksek miktarda geni çevirebilme yeteneğini içeren birçok avantaja sahiptir (103). Retrovirüsün genetik materyalinin konakçıya yerleşebilmesi için kendi RNA molekülünün DNA kopyasını yapması gereklidir. RNA’dan DNA üretilmesine revers transkripsiyon denir. Revers transkriptaz (RT) tek zincirli RNA genomunu çift zincirli lineer DNA’ya kopyalar. RT RNA ve DNA bağımlı DNA polimeraz ve RNA-DNA dublekslerinin RNA zincirleri degrade eden RNaz H aktivitesi olan multifonksiyonlu bir enzimdir (104). Nükleusda DNA sentezlendikten sonra büyük konakçı DNA sına yerleştirilmesi işlemi integraz enzimi tarafından gerçekleştirilir. Böylelikle konakçı yeni bir gene sahip olur. Konakçı çoğaldıkça ortaya çıkan hücrelerde aynı gene sahip olur (103,105). Retrovirüslerle yapılan gen terapisinin problemlerinden biri integraz enziminin geni konakçı genomunda rastgele bir yere yerleştirmesidir. Genetik materyal orijinal genin ortasında bir yere yerleşirse; bu gen bozulur (insersiyonel mutagenez). Eğer bu gen hücre bölünmesini denetleyen bir gen ise ortaya kanser gibi kontrolsüz büyüme durumları çıkar. 27 Şekil 6.Retrovirüs hayat siklusu (117). Şekil 7. Viral gag, pro, pol ve env (paketleme) genlerini ayrı moleküler yapı olan içerisinde tutulmakta ve sadece vektör paketlenebilmektedir (103). 28 Lentiviral Vektörler Lentiviral vektörler kazanılmış immun yetersizlik sendromunun etiyolojik ajanı olan insan immun yetmezlik virüsünden (HIV-1) kaynaklanır. Bu vektörlerin diğer gen dağıtım sistemlerine göre avantajları mevcuttur. Belirgin klonlama kapasitesi olan (8-9 kb) ve entegre olan bir retrovirüstür. Mevcut çalışmalar doğru regülatuar dizilerin özellikle kontrol bölgesi (locus control region- LCR) kullanıldığında stabil veya hücreye spesifik ekspresyonları olduğunu göstermektedir (106). Adenovirüsler Adenoviral (Ad) virüsleri, 70–90 nm boyutlarında zarfsız dış protein kabuğunun iç nükleer kor yapıyı sardığı icosahedral yapıda partiküllerdir. Adenovirüs lineer 30-38 Kbp non-segmente çifte zincirli (ds)DNA genomuna sahiptir. Teorik olarak 30-40 gen taşıyabilir. Memeli hücrelerinde konakçının çoğalma mekanizmasını kullanarak replikasyon yapar (107). Adenovirüsler genetik materyallerini çift sarmallı DNA formunda taşırlar. Adenovirüslerin genetik materyali konakçının genomuyla birleşmez; geçicidir. DNA molekülü konakçı nükleusunda serbest dolaşır ve bu moleküldeki bilgiler diğer genler gibi RNA’ ya ve sonrasında proteine çevrilir. Farklı olarak hücre bölünmesi sırasında bu genler çoğalmaz. Viral gen terapisinde en çok kullanılan vektörlerdir (108). İn vivo büyük çoğunlukla stabillerdir ve adenoviral vektörler hücreleri in situ enfekte etmek için kullanılabilir. Adenovirüslerin yüksek miktarda üretilebilir olması ve yüksek seviyede heterolog gen sunulabilmesi, gen terapisinin popular vektörleri haline getirmiştir (109). Adenovirüsler reseptör aracılı endositoz mekanizmasıyla hüre içine alınır. Genomları nükleusa taşınır ve konakçı genine entegre olmadan (epizomal) replike olurlar. Bunun sonucu olarak insersiyonel mutagenez görülmez (110). Diğer bir kısıtlama birçok adeno virüs vektörünün immunojenik olması ve çevrilen hücreye karşı immun yanıt gelişmesidir. Çevrilen hücreler immun yanıtla parçalanınca, gen ürünlerinin seviyesinde ani bir düşüş görülür. Sekonder immun yanıt nedeniyle adenoviral vektörlerle tekrarlayan gen transferi başarısız olmaktadır (111). 29 Adeno-İlişkili Virüsler Parvovirus ailesinden tek sarmallı DNA'lı küçük virüslerdir. Rekombinant AİV viral gen taşımaz ve genoma integre olmaz; terminal sonlarından birleşir ve sirküler; epizomal form oluşturur. Bunun sonucu olarak uzun dönem gen ekspresyonu görülür. Az miktarda DNA içerdiği için gen taşıma kapasitesi azdır ve üretilmesi zordur. Adenovirüslere göre konakçıda immun yanıt gelişimi azdır. AİV’lerin çoğalamayan hücreleri enfekte edebilmesi önemli bir avantajdır (85) . Protein Zarflı Viral Vektörlerin Psödotiplendirilmesi Virüslerin etkin olarak enfekte edebildikleri doğal konakçı hücreler bulunmaktadır. Retrovirüslerin Adenovirüslere göre enfekte edebildikleri konakçı çeşidi daha sınırlıdır. Bazı hücreler ise viral enfeksiyonlara dirençlidir. Duyarlı hücreye tutunma ve giriş virüsün yüzeyinde ki protein zarf sayesinde gerçekleştirilir. Spesifik protein reseptörü sayesinde viral proteinde yapısal değişiklik meydana gelir ve hücreye giriş sağlanır. Konakçı enfeksiyonun meydana gelmesi için virüs yüzey proteini ile hücre yüzey proteinin uygun etkileşimi gerekmektedir. Gen terapisi için vektörün hedef çeşitliliği artırıp azaltılmak istenebilir; bu vektörün zarf proteininin başka virüslere ait zarf proteinleriyle ya da şimerik proteinlerle değiştirilmesiyle gerçekleştirilebilir. Protein kılıfları değiştirilen virüslere psödotip virüs denir. 2.8.2. Non-Viral Metodlar DNA dağıtımının en basit yöntemi plazmid DNA ekspresyon vektörlerinin ökaryotik promotorlar tarafından alınmasıdır. Viral olmayan DNA dağıtım vektörleri iki ana tipe sınıflanabilir. 1. Polimerik dağıtım sistemleri (DNA polimer kompleksleri) Polimerik dağıtım sistemleri, pozitif yüklü kompleksin anyonik DNA ile elektrostatik etkileşmesi sonucu hücresel uptake’ine dayanır. Bu kompleksin negatif yüklü hücre yüzeyiyle etkileşmesi manipüle edilerek DNA uptake artırılabilir. 2. Lipozomal dağıtım sistemleri (DNA lipozomal kompleksleri) 30 Lipozomlar fosfolipid çift katman ile sarılmış sıvı kompartmanından oluşan veziküllerdir. DNA sıvı kompartmanın içinde veya fosfolipid lamelle kompleks halde tutulur. Lipozom dağıtım sistemleri istenilen büyüklük, yüzey yükü, bileşim ve morfolojiye ulaştırılabilir. Non-viral transfeksiyon etkinliği viral vektörlere oranla önemli oranda azdır. Diğer bir dezavantajı serum varlığında hızlı inaktivasyonudur. Non-viral vektörlerin ana avantajı immun yanıt oluşturmadığı için güvenli uygulanabilmesidir (109). 2.8.2.1. Çıplak DNA Non-viral transfeksiyonun en basit metodudur. İntramusküler plazmide bağlı çıplak DNA enjeksiyonları denenmekte ve başarılı sonuçlar bildirilmektedir. Fakat diğer metodlara göre gen ekspresyonu çok az olmaktadır (94,112). 2.8.2.2. Oligonükleotidler Oligonükleotidler kısa zincirli DNA segmentleridir. Sentetik oligonükleotidler gen terapisinde hastalıktan sorumlu genleri inaktive etmek için kullanılmaktadır. Hücresel internalizasyonla selektif olarak tek bir proteinin üretilmesini engelleye bilirler. Bunun için çeşitli metodlar kullanılmaktadır. Hatalı genin transkripsiyonunu bozmak için hedef gene spesifik antisens kullanmak bir stratejidir. Antisens uygulamalarında oligonükleotidler mRNA veya pre-mRNA ile etkileşerek dupleks yapar ve protein translasyonu engellenir. Diğer bir yöntem siRNA adı verilen küçük RNA molekülleri kullanarak hücrenin, hatalı genin mRNA transkriptinde yer alan özel dizinlerini ayırmasıdır. Bu sayede hatalı genin translasyonu ve böylelikle genin ekspresyonu durur (112). 2.8.2.3. Lipopleksler ve polipleksler Yeni DNA nın hücre içine ulaşmasını sağlamak için, DNA nın hasar görmesi önlenmeli ve hücre içerisine girmesi kolaylaştırılmalıdır. Bu aşamada DNA nın indirgenmesini önlemek için yeni moleküller lipopleksler ve polipleksler üretilmiştir. Plazmid DNA’sı lipidlerle kaplanarak miçel veya lipozomlar gibi organize bir yapı oluşabilir. Bu organize yapı DNA ile kompleks oluşturursa lipopleks adı verilir. DNA‘lı polimer kompleksleri polipleks olarak adlandırılır (113). 31 2.8.3. Plazmidler Plazmidler spesifik proteinleri kodlayan transgenleri içeren yüksek molekül ağırlıklı çift sarmallı DNA’lardır. Moleküler düzeyde plazmidler ön-ilaç olarak kabul edilebilir; hücre içerisine alınmasıyla DNA transkripsiyon ve translasyon aletlerini terapötik proteinin sentezlenmesinde kullanır. Gen terapisinde plazmid DNA’sını kullanılarak, kalıtımsal olarak belirli bir bir proteini üretemeyen hücre, programlanmış transgenler aracılığıyla bu proteini sentezleyebilir. Plazmidler genetik hataları düzeltmek için kullanılabilir. Plazmid molekülünün etkin olabilmesi için sitoplazmaya girdikten sonra nükleusa girmesi gerekir. Nükleusa giriş nükleer porlardan sağlanır ve oldukça zor işlemdir. Hastalık tedavisi yanında plazmidler genetik immunizasyon için aşı olarak kullanılabilir. Enhancer’lar plazmid DNA’sında ilgili genin üretimini 100 kata kadar artırabilen bölgelerdir. Transkripsiyon etkinliği uygun enhancer ile artırılabilir (112). 32 2.9. ANASTOMOZ İYİLEŞMESİNİ İNCELEME YÖNTEMLERİ Anastomoz üzerindeki radiyal kuvvetler direnç kuvvetlerini aşınca gastrointestinal yara iyileşmesi bozulur. Kollajen miktarını ve anastomoz gücünü ölçmek için kullanılan birkaç yöntem bulunmaktadır. Anastomoz kuvveti patlama basıncı ve kırılma gücüyle ölçülür. Kollajen miktarı hidroksiprolin ve kollajen birikme hızıyla ölçülür (18,114). 2.9.1. Mekanik İnceleme Yöntemleri 2.9.1.1. Anastomoz Patlama Basıncı Anastomoz yapılan barsak segmentlerinin hava ile şişirildikten sonra ayrıldığı maksimum intrakolonik basınca patlama basıncı denir (18). Patlama basıncı su banyosu içerisine konan barsak segmenti şişirilirken, intralüminal basıncın manometre ile ölçülmesi yöntemiyle tespit edilir (115,116). Gastrointestinal anastomozlar kuvvetlerinin büyük bir bölümünü 2-3. günlerde kaybeder. Patlama basıncı bu nedenle ilk 3 gün en düşük düzeydedir, bundan sonra hızla artar (18). 2.9.1.2. Anastomoz Ayrılma Kuvveti Ayrılma kuvveti bir anastomozun bozulması için gereken maksimum çekme kuvvetidir (18). Barsak segmentinin uzun eksenine paralel çıkartılan barsak şeridinin iki ucuna zıt yönlerde kuvvet uygulanmasıyla ölçülür. Bu işlem için geliştirilen tansiyometre (gerilim ölçer) cihazı ile yapılmaktadır (63). Erken ayrılma kuvveti iki barsak ucunun sütür tutma kapasitesini yansıtır. Kollajen senteziyle orantılı olarak postoperatif 4.günden sonra artar. Ayrılma kuvveti daha yavaş bir hızla artar. Yaralanmadan sonra 10.günde normal kolonun %50 si kadardır (117). 33 2.9.2. Biyokimyasal Yöntemler Kollajen miktarı (konsantrasyon) anastomoz iyileşmesini en iyi gösteren biyokimyasal parametredir. Submukozal tabaka en fazla kollajen içeren tabakadır ve barsağın mekanik kuvvetini oluşturur. Hidroksiprolin yalnızca kollajende (kollajende % 14 ve elastinde % 2 ) bulunur, diğer hayvan proteinlerinde çok fazla miktarda yoktur. Hidroksiprolin dokunun iyileşmesini ve kollajen metabolizmasını göstermekte çok faydalıdır (71). Hidroksiprolin düzeyi birim yaş dokuda ağırlık olarak (μg/mg yaş doku) verilmektedir. Bu değer nonkollajenöz matriks materyallerini de içermektedir. Ancak bu ihmal edilebilir bir değerdir ve hidroksiprolin düzeyinin bire bir kollajen içeriğini yansıttığı kabul edilmiştir. Kollajen miktarı kadar kollajenin kalitesi ve çaprazlaşması da anastomoz iyileşmesinde önemlidir; ancak bunu direkt ölçen bir yöntem yoktur (116). İntramural pH ölçümü gastrointestinal sistemde iyileşmeyi gösteren başka bir kimyasal yöntemdir. Anastomoz bölgesinin kanlanması ve yara iyileşmesi açısından kantitatif veriler elde edilebilir (118). 2.9.3 Histopatolojik İnceleme Histopatolojik olarak anastomoz iyileşmesi incelenirken ışık ve elektron mikroskobu kullanılabilir. Işık mikroskobu ile inflamatuar hücre infiltrasyonuna göre inflamasyon derecesi, nekroz derecesi, kapiller gelişimi, fibroblast proliferasyonu, yarada kollajen birikmesi ve epitelizasyon durumu incelenebilir. Bu veriler semi kantitatif olarak belirlenmektedir ve çeşitli skorlama sistemleri doğrultusunda değerlendirilerek istatistiki karşılaştırmalar uygulanabilir. Nekrozun ve inflamatuar göçün fazla olması granülosit kökenli kollajenaz aktivitesinin artması sonucu daha zayıf iyileşme meydana gelmektedir. Elektron mikroskobu ile kollajenin lif diziliş şekilleri ve normale göre oluşan farklılaşmalar ile hücrenin organel düzeyindeki yapısal değişiklikleri incelenebilir (119). 34 3. MATERYAL VE METOD 3.1. DENEY HAYVANLARI Bu deneysel çalışma, İstanbul Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu onayı alınarak, İstanbul Üniversitesi Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü, İstanbul Tıp Fakültesi Biyokimya Ana Bilim Dalı ve Okmeydanı Eğitim ve Araştırma Hastanesi Patoloji laboratuarlarında gerçekleştirildi. Çalışmamızda, İstanbul Üniversitesi Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü’nden temin edilen 200-250 gram ağırlığında, sağlıklı, 40 adet erkek Wistar-Albino sıçan kullanıldı. Bütün hayvanlar 22°C oda sıcaklığında ikili kafeslerde tutuldu. Günde 2 kez kafes bakımları yapıldı. Hayvanlara normal sıçan yemi ve çeşme suyu verildi. Sıçanlar her grupta 8 sıçan olacak şekilde 5 gruba randomize edildi. Grup 1: (Kontrol) : İskemik kolon anastomozu Grup 2: (Kontrol) : İskemik kolon anastomozu + lokal plazmid verilmesi Grup 3: İskemik kolon anastomozu + plazmide bağlı lokal VEGF geni verilmesi Grup 4: İskemik kolon anastomozu + plazmide bağlı lokal FGF geni verilmesi Grup 5: İskemik kolon anastomozu + plazmide bağlı lokal VEGF ve FGF genleri verilmesi. 3.2. PLAZMİD KONSRÜKSİYONU VE ENJEKSİYONU İstanbul Üniversitesi Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü’nde VEGF ve FGF gen plazmidleri, insan VEGF165 ve bFGF cDNA’ları pcDNA3 (Invitrogen)’a birleştirilerek ayrı ayrı üretildi. EndoFree® ile arındırılan insan VEGF (1 μg) ve FGF (1 μg) cDNA’sı karıştırılarak sıçan kolonuna enjekte edildi. Kültür yapılmış hücrelerden, üretici firmanın (Qiagen Co) tavsiyesiyle, total RNA purifikasyon kiti kullanarak total RNA izole edildi (108). Revers transkripsiyondan sonra 5' ve 3' uçlarında kısıtlama bölgesi içeren oligonükleotidlere PCR yapıldı. PCR fragmanları % 1’lik agarose jelden keserek ayrıldı. DNA, kesilmiş agarose jelden, jel ayrıştırma kiti ile ayrıştırıldı. 50 ng’lık DNA vektörü ve 1 μl’lik PCR ürünü, 1 ml (3u/μl) T4 DNA ligaz içeren 2x T4 DNA ligaz tamponla 4°C’de bir gece inkübe edildi. Ligasyon reaksiyonun 2 μl ‘si ve DH5 alfa uyumlu hücrelerin 100 μl’ sine ısı-şok transformasyonu uygulandı ve 100 mg/ ml ampisilin içeren agar plakalara yayıldı. 35 PCR test edildi ve ardıştırma (Refgen Co, Turkey) ile doğrulandı. Plakalar bir gece 37°C’de inkübe edildi. Plazmidler çoğalır ve Endofree Plazmid kit (Qiagen) kullanılarak saflaştırıldı. İnsan VEGF cDNA ve FGF cDNA ‘sı taşıyan plazmidler üretildi. Kontrol amaçlı boş pcDNA3.1 plazmid üretildi. 3.3. CERRAHİ PROSEDÜR VE TEDAVİ Tüm hayvanlara bir gece açlığı takiben subkutan 5mg/kg Xylazine HCL ve 50 mg/kg Ketamine HCL intramusküler verilerek genel anestezi oluşturuldu. Sırt üstü yatar pozisyonda ameliyat masasına tespit edilen sıçanların karın tüylerinin tıraş edildikten sonra, ameliyat bölgesi %10’luk povidon iyodür solüsyonu ile temizlendi. Abdominal bölge orta hatta 3-4 cm’lik insizyon yapılarak karın boşluğuna girildi. Distal kolon bulundu 2-4 cm’lik kalın barsak segmentine giden damarlar bağlanıp kesilerek iskemik kolon oluşturuldu, kolon tam ortasından transvers olarak kesilerek 6-0 propilen ile uç uca tek tek sütürlerle toplam 8 sütür konularak anastomoz yapıldı. Anastomoz sonrasında lokal olarak anastomoz bölgesine plazmid (grup 2), VEGF (grup 3), bFGF (grup 4) ve birleşik tedavi olarak VEGF ile bFGF genleri infiltasyon şeklinde verildi. Anastomoz sonrası karın içine 2 cc % 0,9 NaCl solüsyonu intraperitoneal konularak karın katları 3-0 ipekle kapatıldı. Ameliyat sonrası 12. saatte su ve 24. saatte normal sıçan yemi verildi. Ameliyat sonrası 4. gün deney hayvanları intrakardiyak Na Pentotal verilerek sakrifiye edildi. Nekropsi yapılarak oluşturulan anastomoz bölgesi mekanik, histopatolojik ve biyokimyasal olarak yara iyileşmesi yönünden incelendi. 3.4. ANASTOMOZ PATLAMA BASINCI ÖLÇÜMÜ Patlama basıncını ölçmek için sfigmomanometre kullanıldı. Denek hayvanları sakrifiye edildikten sonra karın orta hat insizyonundan açıldı. Anastomoz yapılan segment bulundu. Sfigmomanometre’ye takılan bir serum seti ve sete bağlanan ince nelaton sonda sıçanın anüsünden sokularak anastomoz hattının 2 cm yukarısına kadar ilerletildi. Kolon sondanın proksimalinden 3-0 ipekle bağlandı. Kolon sfingomanometre yardımı ile 4ml/dk basınç uygulanarak şişirildi. Anastomoz hattındaki patlama sesi duyulduğu veya hava kaçağı görüldüğü andaki basınç kaydedildi. 36 3.5. HİSTOPATOLOJİK İNCELEME Doku parçaları 24 saat %10’luk formaldehit solüsyonu içinde sabitlendikten sonra parafin bloklar hazırlandı. Parafinlenmiş doku bloklarından, 4 μm kalınlığında transvers kesitler hazırlandı. Kesitler hematoksilen-eozin ile boyanıp ışık mikroskobunda (Olympus, BX51, Japan) x20, x40 ve x100 büyütme ile değerlendirildi, ışık mikroskobuna bağlı olan Olympus marka fotoğraf makinesi ile kesitler fotoğraflandı. Dokuların histopatolojik incelemesi, örneklerin hangi gruba ait olduğunu bilmeyen (kör) deneyimli bir patolog tarafından yapıldı. Anastomoz hattındaki değişiklikler ve iyileşmenin değerlendirilmesi için kullanılan parametreler; 1. İnflamatuar yanıt 2. Fibroblast proliferasyonu 3. Neovaskülarizasyon (Anjiogenez) 4. Kollajen birikimi 5. Epitelizasyon Histolojik grade’leme skalası; • 0: Değişiklik yok • 1: Hafif derecede • 2: Orta derece • 3: Yoğun 3.6 BİYOKİMYASAL İNCELEME Bütün biyokimyasal parametreler Cerrahpaşa Biyokimya Bölümü Anabilim Dalında bu konuyla ilgili uzman tarafından bakılmıştır. Kolon segmenti anastomoz çizgisinin 0,5 cm. distal ve 0,5 cm. proksimalinden kesildi. Peritoneal duvarlar çıkarıldıktan sonra hassas terazide tartıldı ve serum fizyolojik solüsyonu içerisinde Potter tipi cam homojenizatör (Heidolphy-RZR 2021, Almanya) kullanılarak % 20 homojenizata (%20 g /ml) homojenize edildi. Homojenizatlar 1500 d /dak hızda 15 dakika santrifüje edildikten sonra süpernatanlar 10-18 saat süresince eşit oranda hidroklorik asit eklenerek hidrolize edildi. Hidroksiprolin kiti 37 ( Hipronisticon, Organon, Hollanda ) kullanarak Stegeman ve Stadler prensiplerine göre miligram ıslak dokudaki hidroksiprolin miktarı solüsyonun 560 nm’ deki spektrometrede absorbansı okunarak mikrogram türünden hesaplandı. Doku VEGF ve bFGF konsantrasyonları ELİSA yöntemi (Quantikine, R&D Systems, ABD) kullanılarak bakıldı. Doku konsantrasyonları pg/ml mg protein birimi olarak değerlendirildi. 4. İSTATİSTİKSEL DEĞERLENDİRME Ölçümlere ait tanımlayıcı istatistikler ortalama ± standart sapma olarak verildi. Non-parametrik testler değerlendirildi. Kruskal-Wallis ile gruplar arasında fark araştırıldı. Gruplar arasında farlılık olduğu görülen değerlere (p<0.05) kendi aralarında değerlendirilmek üzere Mann-Whitney U testi uygulandı. Hesaplamalarda SPSS for Windows sürüm 16 (Statistical Package for Social Sciences, inc.) kullanıldı. P<0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kullanıldı. 38 5. BULGULAR Deney hayvanları içerisinde herhangi bir mortalite ve anastomoz kaçağı görülmedi. Bütün deneklerin in vitro olarak patlama basıncı ölçüldükten sonra anastomoz hattındaki dokudan VEGF, bFGF ve hidroksiprolin düzeyleri bakıldı. Biyokimyasal örnekler alındıktan sonra Histopatolojik inceleme yapıldı. ANASTOMOZ PATLAMA BASINÇI Anastomoz sonrası postoperatif 4. gündeki anastomoz patlama basınç değerleri ve standart sapmaları Tablo 4 ve 5 ’de ve gruplara göre anastomoz patlama basınç değerlerinin dağılımı Grafik 1’de gösterilmiştir. Tablo 4. Grupların anastomoz patlama basınçlarının ortalamaları (mmHg) ve standart sapmaları. Tedavi gruplarının kontrol grubuyla (Grup I) istatistiksel olarak karşılaştırılması Grupların P Değerleri Ort. Değer ±SD Grup I-II Grup I-III Grup I-IV Grup I- V Grup I 59,37 ±20,07 Grup II 91,25 ±22,32 Grup III 106,25 ±21,33 p < 0.05 Grup IV 103,75 ±21,99 Grup V 126,25 ±26,69 39 p < 0.01 p < 0.01 p <0.001 Tablo 5. Grupların anastomoz patlama basınçlarının ortalamaları (mmHg) ve standart sapmaları. Tedavi gruplarının plazmid grubuyla (Grup II) istatistiksel olarak karşılaştırılması Ort. Değer ±SD Grup I 59,37 ±20,07 Grup II 91,25 ±22,32 Grup III 106,25 ±21,33 Grupların P Değerleri Grup II-III Grup II-IV Grup II-V p > 0.05 p > 0.05 p < 0.05 Grup IV 103,75 ±21,99 Grup V 126,25 ±26,69 Grafik 1. Anastomoz Patlama Basınçlarının gruplara göre dağılımı. 40 Grupların patlama basınçları değerlendirildiğinde ölçümlerin normal dağılım gösterdiği gözlendi ve bütün gruplar arasında istatistiksel olarak ileri derecede anlamlı fark olduğu gözlendi (p<0.001) . Grup III ve IV’ deki patlama basınçları kontrol grubuna (Grup I) göre anlamlı derecede yüksek (p<0.01) bulunurken Grup V’deki patlama basıncındaki artış kontrol grubuna göre ileri derece anlamlı (p<0.001) bulunmuştur. Grup III ve IV’ deki patlama basınç artışı plazmid kontrol grubuna göre anlamlı bulunmamıştır. Grup V deki artış ise plazmid kontrol grubuna göre anlamlı bulunmuştur. İki değişik faktörün ayrı ayrı üretimini sağlayan genlerin beraber verildiği gruptaki patlama basınçlarının artışı ise daha belirgindir ve istatistiksel olarak ileri derecede anlamlı (p <0.001) bulundu. Plazmid verilen kontrol grubundaki patlama basınçlarındaki artış ise istatistiksel olarak dikkat çekicidir (p <0.05). HİDROKSİPROLİN Operasyon sonrası 4. gündeki ortalama doku hidroksiprolin düzeyleri µg/ml yaş doku olarak standart sapmaları ile Tablo 6 ve 7’de gösterilmiştir. Karşılaştırmalı verileri Grafik 2’de gösterilmiştir. Tablo 6. Grupların doku hidroksiprolin düzeylerinin ortalamaları (μg/ml) ve standart sapmaları. Tedavi gruplarının kontrol grubuyla (Grup I) istatistiksel olarak karşılaştırılması Ort. Değer ±SD Grup I 0,42±0,065 Grup II 0,43±0,079 Grup III 0,51±0,093 Grup IV 0,8±0,047 Grup V 1,49±0,311 Grupların P Değerleri Grup I-II Grup I-III Grup I-IV Grup I-V p >0.05 p <0.05 p <0.001 p <0.001 41 Tablo 7. Grupların doku hidroksiprolin düzeylerinin ortalamaları (μg/ml) ve standart sapmaları. Tedavi gruplarının plazmid grubuyla (Grup II) istatistiksel olarak karşılaştırılması Grupların P Değerleri Ort. Değer ±SD Grup I 0,42±0,065 Grup II 0,43±0,079 Grup III 0,51±0,093 Grup IV 0,8±0,047 Grup V 1,49±0,311 Grup II-III Grup II-IV Grup II-V p <0.05 p <0.001 p <0.001 Grafik 2. Doku hidroksiprolin düzeylerinin gruplara göre dağılımı 42 Grupların doku hidroksiprolin miktarları değerlendirildiğinde ölçümlerin normal dağılım gösterdiği gözlendi ve bütün gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark olduğu gözlendi (p<0.001). Grup II, grup I ile karşılaştırıldığında doku hidroksiprolin düzeyinde anlamlı ( p >0.05 ) bir artış gözlenmemiştir. Tedavi grupları (grup III, grup IV, grup V) kontrol grubu (Grup I) ile karşılaştırıldığında hidroksiprolin düzeylerinde anlamlı bir artış (sırasıyla p<0.05, p<0,001, p<0,001) olmuştur. Grup III, Grup IV ve V’ de doku hidroksiprolin düzeyinde kontrol plazmid grubuna (Grup II) oranla anlamlı artış (sırasıyla p<0,05, p<0,001, p<0,001) gözlenmiştir. VEGF ve bFGF faktör genlerinin beraber uygulanması iskemik kolon anastomozunda iyileşme sırasında oluşan doku hidroksiprolin düzeyini ileri derecede anlamlı olarak arttırmaktadır (p<0.001) . DOKU VEGF Postoperatif 4.gün dokuda bakılan ortalama VEGF düzeyleri pg /ml olarak standart sapmaları ile tablo 8 ve 9’ da gösterilmiştir. Grupların istatistiksel karşılaştırmaları aynı şekilde tabloda verilmiştir. Tablo 8. Grupların doku VEGF düzeylerinin ortalamaları (pg/ml) ve standart sapmaları. Tedavi gruplarının kontrol grubuyla (Grup I) istatistiksel olarak karşılaştırılması Grupların P Değerleri Ort. Değer±SD Grup I 200,50±15,62 Grup II 358,62±38,81 Grup III 434,87±17,65 Grup IV 279,75±52,08 Grup V 431,25±14,35 Grup I-II Grup I-III Grup I-IV Grup I-V p <0.001 p <0.001 p <0.001 p <0.001 43 Tablo 9. Grupların doku VEGF düzeylerinin ortalamaları (pg/ml) ve standart sapmaları. Tedavi gruplarının plazmid grubuyla (Grup II) istatistiksel olarak karşılaştırılması Grupların P Değerleri Ort. Değer ±SD Grup I 200,50±15,62 Grup II 358,62±38,81 Grup III 434,87±17,65 Grup IV 279,75±52,08 Grup V 431,25±14,35 Grup II-III Grup II-IV Grup II-V p <0.01 p <0.05 p <0.01 Grafik 3. Doku VEGF düzeylerinin gruplara göre dağılımı 44 Grupların doku VEGF miktarları değerlendirildiğinde ölçümlerin normal dağılım gösterdiği gözlendi ve bütün gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark olduğu gözlendi (p<0.01). Doku VEGF düzeylerin artışı bütün gruplarda (Grup I-V) kontrol grubuna (Grup I) göre ileri derece anlamlıdır (p<0.001). Kontrol plazmid grubu ile karşılaştırıldığında Grup IV’ deki doku VEGF’ inin artışı anlamlı (p<0.05) görülürken Grup III ve Grup V’deki doku VEGF’ inin artış ileri derece anlamlı olarak (p<0.01) bulunmuştur DOKU bFGF Postoperatif 4.gün dokuda bakılan ortalama VEGF düzeyleri pg / ml olarak standart sapmaları ile tablo 10 ve 11' de gösterilmiştir. Grupların p değerleri de tablolara eklenmiştir. Tablo 10. Grupların doku bFGF düzeylerinin ortalamaları (pg/ml) ve standart sapmaları. Tedavi gruplarının kontrol grubuyla (Grup I) istatistiksel olarak karşılaştırılması Grupların P Değerleri Ort.Değer ± SD Grup I 0,91±0,16 Grup II 1,63±0,22 Grup III 1,58±0,2 Grup IV 2,57±0,19 Grup V 2,73±0,15 Grup I-II Grup I-III Grup I-IV Grup I-V p <0.001 p <0.001 p <0.001 p <0.001 45 Tablo 11. Grupların doku bFGF düzeylerinin ortalamaları (pg/ml) ve standart sapmaları. Tedavi gruplarının plazmid grubuyla (Grup II) istatistiksel olarak karşılaştırılması Ort. Değer ±SD Grup I 0,91±0,16 Grup II 1,63±0,22 Grup III 1,58±0,2 Grup IV 2,57±0,19 Grup V 2,73±0,15 Grupların P Değerleri Grup II-III Grup II-IV Grup II-V p >0.05 p <0.001 p <0.001 Grafik 4. Doku bFGF düzeylerinin gruplara göre dağılımı 46 Grupların doku bFGF miktarları değerlendirildiğinde ölçümlerin normal dağılım gösterdiği gözlendi ve bütün gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark olduğu gözlendi (p<0.001). Doku bFGF düzeylerin artışı bütün gruplarda (Grup I-V) kontrol grubuna (Grup I) göre ileri derece anlamlıdır (p<0.001). Grup III’ de kontrol plazmid grubuna (Grup II) oranla anlamlı bir yükselme görülmemiştir (p>0.05). Grup IV ve V’deki doku bFGF oranları belirgin olarak artmış ve istatistiksel olarak ileri derecede anlamlı bulunmuştur. HİSTOPATOLOJİ Doku Histopatolojik incelemesinde anastomoz hattındaki epitelizasyon artışı ve inflamasyon yoğunluğu açısından gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark gözlenmedi (p> 0.05). Kollajen birikimindeki artış Grup IV ve V’ de kontrol grubuna (Grup I) göre ileri derece anlamlı (p< 0.01) olurken plazmid kontrol grubu ile istatistiksel olarak anlamlı fark (p> 0.05) gözlenmemiştir. Fibroblast göçünde plazmid grubunda (Grup II) kontrol grubuna göre (Grup I) anlamlı bir artış gözlenirken bu artış diğer gruplarda (Grup III, IV ve V) ileri derecede anlamlı (p<0.001) bulunmuştur. Anjiyogenesis artışı bütün tedavi gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı (p< 0.01) bulunurken sadece büyüme faktörü genlerinin beraber verildiği grupta (Grup V) artış plazmid kontrol grubuna göre anlamlı (p< 0.05) görülmektedir Tablo 12. Histolojik parametrelerin ışık mikroskobunda bakılan ortalama değerleri Histolojik Bulguları Grup 1 (Kontrol) Grup2 (Plazmid ) Grup 3 (VEGF) Grup 4 (bFGF) Grup 5 (VEGF+bFGF) Epitelizasyon 1,4 1,3 1,4 1,9 2,0 Kollajen birikimi 1,1 1,8 2,0 2,4 2,3 Fibroblast 1,0 2,0 2,5 2,8 2,8 İnflamasyon 2,4 2,9 2,6 2,8 2,5 Anjiyogenezis 1,3 1,9 2,5 2,6 2,6 47 Tablo 13. Histolojik parametrelerin değerlendirilmesi, 1. ve 2. grup kontrol 3, 4 ve 5. gruplar tedavi grubu olup kontrol ve tedavi grupları birbirleri ile istatistiksel olarak karşılaştırılmıştır. p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7 I-II I-III I-IV I-V II-III II-IV II-V p> 0.05 p> 0.05 p> 0.05 p> 0.05 p> 0.05 p> 0.05 p> 0.05 p> 0.05 p> 0.05 p<0.01 p< 0.01 p> 0.05 p> 0.05 p> 0.05 Fibroblast p< 0.01 p<0.001 p<0.001 p<0.001 p> 0.05 p< 0.05 p< 0.05 İnflamasyon p> 0.05 p> 0.05 p> 0.05 p> 0.05 p> 0.05 p>0.05 p> 0.05 p< 0.01 p> 0.05 p< 0.05 Histolojik Bulguları Epitelizasyon Kollajen birikimi Anjiyogenezis p< 0.05 p< 0.01 p<0.01 P< 0.05 Resim 1. Hematoksilen-eozin boyama ile x 20 büyütmede anastomoz hattında yoğun iltihabi hücre ve fibroblast infiltrasyonu 48 Resim 2. Hematoksilen-eozin boyama ile x 100 büyütmede anastomoz hattında yoğun iltihabi hücre ve fibroblast proliferasyonu. Resim 3.Hematoksilen-eozin boyama ile x 100 büyütmede anastomoz hattında yoğun damar gelişimi 49 Resim 4. Hematoksilen-eozin boyama ile x 40 büyütmede anastomoz hattında orta derece iltihabi hücre ve az miktarda damar gelişimi. Resim 5. Hematoksilen-eozin boyama ile x 100 büyütmede anastomoz hattında orta derece iltihabi hücre ve az miktarda damar gelişimi 50 6. TARTIŞMA Kolon ameliyatları ve anastomozları birçok sebebe bağlı olarak genel cerrahide en çok uygulanan operasyonlar arasındadır. Cerrahi teknik ve kullanılan araçların geliştirilmesine rağmen kolon anastomozları sonrasında görülen kaçaklara bağlı morbidite ve mortalite oranları hala yüksektir (120). Kolorektal cerrahi sonrası görülen mortalitenin 1/3’ü anastomoz kaçaklarından olmaktadır (119). Literatürde anastomoz kaçaklarının oranı % 4-30 olarak bildirilmektedir (119,120). Deneyimli kliniklerde anastomoz kaçağı görülme sıklığı %3-8’dir. Anastomoz kaçağı sonrasında mortalite oranları ise % 30’un üzerindedir (121). Gastrointestinal sistemde yara iyileşmesi kollajen sentezi ve kollajenoliz arasındaki ince bir dengeye bağlıdır. Postoperatif 3-5. günlerde bu denge daha fazla önem kazanır. Bağırsaktaki gerilim kuvvetinde etkili olan en önemli tabaka submukozadır. Submukozadaki kollajen sentezi yaranın mekanik düzenini sağlar (122). Anastomoz iyileşmesinde en önemli faktör yeterli doku oksijenizasyonu olup bu durum kan hacmi, doku perfüzyonu ve arteriyel O2 satürasyonu ile sağlanır. Yara iyileşmesinin düzgün ilerleyebilmesi için görev alan hücrelerin fonksiyonlarını eksiksiz yerine getirmeleri gereklidir. Yeterli bir yara iyileşmesi için iyileşmede görevli olan hücrelerin ihtiyacı olan besin ve O2 sağlanmalıdır. Bu aşamada yeni damar oluşumu önemli olmaktadır (120). Doku hipoksisi büyüme faktörlerinin artmasına neden olarak yaralı dokuya giden yeni damarların gelişiminde etkili olmaktadır. Anjiyogenez ile dokunun ihtiyacı olan besinler ve O2 ‘nin yanı sıra inflamatuar hücrelerin ve fibroblastların da yaraya ulaşımı sağlanır. Anjiyogenezin en kuvvetli uyaranları vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve fibroblastik büyüme faktörü ( bFGF ) dür. Bu faktörler insan yarasındaki sıvıda saptanmıştır. Matsui ve ark. tavşan modelinde lokal VEGF verilmesinin kolon anastomozlarında anjiyogenezi artırarak anastomoz kuvvetini ve iyileşmesini artırdığını bildirmiştir. Enestvedt ve ark.nın özofago-gastrik anastomoz uyguladıkları deneklere, plazmide bağladıkları VEGF genini anastomoz bölgesine lokal olarak uygulamışlar ve sonuç olarak anjiyogenezin arttığını tespit etmişlerdir (3, 94, 120). Çalışmamızda iskemik kolon anastomozu oluşturduğumuz deney hayvanlarında yara iyileşmesi üzerine olumsuz etki yapan bu faktörü ortadan kaldırmayı amaçladık. Bunun için plazmidlere bağlanan insan VEGF 165 geni ve bFGF genini kullanarak bağırsak submukozasında FGF ve VEGF üretimini arttırmayı planladık. Artan FGF ve VEGF üretimini görmek için doku konsantrasyonları her grup için ölçüldü. Ayrıca yara iyileşme 51 parametrelerine mekanik (patlama basıncı), biyokimyasal ( hidroksiprolin düzeyi ) ve histolojik (ışık mikroskobu) olarak bakıldı. Klinik çalışmalarda miyokard enfarktüsü, ciddi extremite iskemisi ve serebrovasküler hastalığı olan hastalarda FGF nin belirli perfüzyon ve anjiyogenez sağladığı gösterilmiştir. Temel fibroblastik büyüme faktörü ( bFGF ) nün etkili bir mutajen ve kemoatraktan olduğu bilinmektedir. Etkin anjiyogenik özelliği ise yeni oluşan kapillerlerin bazal membranındaki sıralı düz kas hücrelerini ve endotelyal hücrelerin proliferasyonunu ve kemotaksisini uyarmasına bağlanmaktadır. FGF aynı zamanda fibroblastik etkileri ile kollajen sentezini arttırarak yara iyileşmesinde önemli bir role sahiptir. Şenyücel ve ark. özofagus anastomozu yaptıkları hayvan deneklerde lokal FGF nin yara iyileşmesine olumlu etkilerini bildirmektedir (123). Yara iyileşmesinde gen terapisi kullanmanın ana hedefi hızlı iyileşmenin sağlanması, doku fonksiyonlarının yerine getirilmesi ve aşırı skar dokusu oluşmasının engellenmesidir.(96). Viral vektörler bağlanmış büyüme faktör genleri çok sık çalışılan konulardır. Liecthly ve ark. trombosit kaynaklı büyüme faktörü B ( PDGF-B) genini adenoviral vektör ile iskemik tavşan kulağı modelindeki kronik yaralara transfer etmişlerdir. İskemik yaraların tek uygulamada tedavi edildiğini ve epitelizasyonun iskemik olmayan kontrol grubuna göre daha hızlı olduğunu görmüştür. Fakat adenovirüs kapsid proteinlerine bağlı akut inflamatuar yanıt gelişmiştir (124). Dodato ve Galeano iki ayrı çalışmada VEGF A genini adeno ilişkili virüs ile transferi için bir model geliştirmiştir. Çalışmalarında cerrahiden 6 -10 gün sonra yara iyileşmesinin belirgin olarak hızlandığını, 18 gün sonra iyi yapılanmış granülasyon dokusunun geliştiğini ve vaskülarizyonun arttığını bildirmişlerdir (125,126). Viral vektörler akut inflamatuar yanıt oluşturabilirler. Birçok alıcının dolaşımında viral vektör uygulaması sonrası antikor oluşumu ve T hücre yanıtı gözlenmiştir. Akut inflamatuar yanıt hayatı tehdit edebilecek bir duruma kadar ilerleyebilmektedir. İmmünojenik hale gelen hücrelerin yıkılması sonucunda üretilen protein miktarında ani azalma gözlenmektedir. İmmün yanıta bağlı transdüksiyon engellenebilir ya da enfekte hücreler elimine edilebilir. Bu da vektörün tekrarlayan uygulamalarda kullanımını engeller. Aynı zamanda viral vektörlerin üretilmesi pahalı ve zaman alıcı bir yöntemdir (96). Non viral yöntemler değişik araçlarla DNA’ nın hücrelere veya dokulara sunulması ile gerçekleştirilir. DNA nın direkt enjeksiyonu tanımlandıktan sonra Erickson ve ark. özel 52 geliştirilmiş solid enjektörlerle DNA enjeksiyonu yöntemine ‘microseeding’ ismini vermişlerdir (127). Enjeksiyon ile gen transferi sonrasında genin kodladığı proteinlerin üretilmeleri geçicidir ve ilk 3 gün en yüksek düzeyde görülür. Çalışmamızda kolay üretilebilmesi ve kolay olması yanında uzun süreli gen ekspresyonuna ihtiyacımız olmadığı için plazmid aracılıyla gen transferini tercih ettik. Lokal plazmid infiltrasyonunun kullanmamızın diğer bir avantajıda verilen büyüme faktör genlerinin lokal etki gösterip sistemik etkilerinin olmamasıdır. Lord ve ark. özofagus ve mide adeno kanserlerinde FGF ve VEGF düzeylerinin artmakta olduğunu bildirmiş ve büyüme faktörlerinin gastrointestinal kanserli vakalarda kullanımının hematolojik va lenfatik metaztazları artırabileceğini düşünmektedirler. Lokal kısa süreli ekpresyonu olan büyüme faktörleri ile bu sorunun çözülebileceğini düşünmekteyiz (96,128). Gen uygulamalarında aracıya bağlanan genin dokudaki katmanları aşıp doğru hücrelere ulaşması önemli bir problemdir. Ayrıca verilen yabancı materyalin hücre içine alınmaması, lizisi ve ya aktif olarak transkripsiyonunun yapılamaması da sık görülür. Transfer yönteminin etkinliği dokuda üretilen gen ürünlerinin ölçülmesiyle tespit edilebilir. Çalışmamızda doku büyüme faktör düzeylerini incelediğimizde, kullandığımız plazmid aracılı non-viral gen transfer metodunun başarılı olabileceğini düşünmekteyiz. FGF ve VEGF geni verildikten 4 gün sonra dokuda bakılan bFGF faktör düzeyleri yaklaşık üç kat ve VEGF düzeyleri yaklaşık 2 kat artmaktadır. Her iki faktör düzeyindeki artış ise istatistiksel olarak ileri dercede anlamlı bulunmuştur. Enestvedt ve ark. çalışmalarında VEGF165 genini plazmide bağlayıp lokal enjeksiyon şeklinde kullanmışlardır. Çalışmalarında doku VEGF düzeyleri artmış olmasına rağmen istatistiksel olarak anlamlı bulunamamıştır. Genler birlikte uygulandığı zaman faktörlerde tespit edilen artışın ise daha da fazla olduğu görülmektedir. Bu artışın sebebi olarak genlerin birbirlerini sinerjik olarak etkileyebileceğini düşünmekteyiz. İnflamatuar yanıt artışının yara iyileşmesini geciktirmektedir. Özellikle virüslerle gen transferinden sonra inflamatuar yanıt artışı görülebilmektedir. Chuang ve ark. inflamasyonun fazla olduğu alerjik hastalıkların tedavisinde plazmide bağlanmış genleri başarıyla kullanmıştır. Çalışmamızda kullandığımız plazmid ve plazmide bağlı genlerin inflamasyonu artırmadığı görülmektedir (p> 0.05). Buna dayanarak kullandığımız non-viral gen transferi metodunun intestinal yara iyileşmesi açısından düşünmekteyiz. 53 uygun bir yöntem olabileceğini Kolorektal cerrahi sonrası anastomoz kaçaklarının en sık nedeni doku perfüzyon bozukluğudur. Doku P02‘sindeki düşüş büyüme faktörlerinin üretiminde azalmaya neden olmaktadır. İskemik dokularda aynı zamanda O2 azlığı nedeniyle fibroblast proliferasyonu ve kollajen molekülünün çapraz bağ oluşumu azalır. Anjiyogenez ile dokuya sunulan pO2 ve gerekli besinler artmaktadır. VEGF üretimini arttırarak anjiyogenezi ve dolayısıyla anastomozun iyileşmesini düşündük. FGF üretiminin artmasıyla fibroblast proliferasyonunu ve kollajen sentezini arttırmayı hedefledik. Tek büyüme faktörü ile yapılan gen terapisinin potansiyel bir problemi de yara iyileşmesinin bütün fazlarına hitap etmemesidir. Ludwik ve ark. yaptığı bir çalışmada keratinosit büyüme faktörü ( KGF) cDNA ve insülin benzeri büyüme faktörü 1 ( IGF1) cDNA yı beraber kullanmış ve yarada epitelizasyon ve proliferasyonun hızlandığını gözlemlemiştir (129). Çalışmamızda FGF cDNA ve VEGF cDNA ‘yı beraber kullandığımız grupta epitelizasyonda artış görülmezken fibroblast proliferasyonunda belirgin artış gözledik. Anastomoz kaçağı açısından en kritik dönem ilk 4 gündür. Operasyondan sonra ilk üç gün kollajenolize bağlı olarak anastomoz hattının gücünün giderek azaldığı bildirilmektedir. Bu düşüşle birlikte erken dönemde dokunun dikiş tutma kapasitesinde de bir azalma meydana gelir. VEGF ile tedavi edilen hayvanların anatomoz patlama basıncları yüksek bulunmuştur. te Velde ve ark. VEGF etkilerini engelleyen angiostatinin neovaskülarizasyonu azaltarak anastomoz patlama basıncını ve iyileşmesini azatlığını tespit etmişlerdir. Çalışmamızda bu dönemin iskemik kolon anastomozları açısından da özellikle önemli olabileceğini düşündüğümüz için 4. gündeki anastomoz patlama basınçlarının ölçümünü yaptık. Patlama basıncı ayrışmanın görüldüğü maksimum intralüminal basıncı göstermesi nedeniyle anastomoz kaçağını ve ayrışmasını göstermesi açısından anastomoz ayrılma kuvvetinden daha anlamlı gösterilmektedir. Patlama basınç değerleri kollajen sentezine paralel olarak ilk 4 gün düştükten sonra hızlı bir artış gösterir. Anastomoz basınçları açısından bFGF ve VEGF genleri uygulanan gruplarda tespit edilen artış belirgin olmakta ve büyüme faktörlerinin etkili olabileceğini göstermektedir. Büyüme faktör genlerinin beraber uygulandığı durumda etki daha belirgin olarak anastomoz patlama basınçlarında ki artışlar daha fazla görülmektedir. Plazmid grubunda beklenmedik bir etki görülerek anastomoz basınçlarında artış tespit edilmiştir. Bu artış bir neden bağlanamamıştır. 54 Anastomoz dokusundaki kollajen sentezi ve depolanması anastomozun gücünü belirler. Ameliyat sonrası ilk dört gün en az düzeyde iken hızlanarak 7. günde normal düzeylere yaklaşır. Kollajen miktarı anastomoz iyileşmesini en iyi gösteren parametredir. Submukoza barsağın en fazla kollajen içeren ve en kuvvetli tabakasıdır. Hidroksiprolin ise en fazla kollajende bulunan ve kollajen metabolizmasını gösterir. Deneklerde operasyon sonrası 4. günde hidroksiprolin düzeylerine bakarak anastomoz iyileşmesi hakkında fikir sahibi olmak istedik. Kollajen sentezi üzerinde en etkili faktör bFGF olarak bilinmektedir. Fibroblastik büyüme faktör geninin uygulanması hidroksiprolin sentezini belirgin olarak artırmıştır. VEGF geninin de kollajen sentezlenmesi açısından olumlu etkileri olduğu görülmektedir. Çalışmamızda amaçladığımız gibi elde ettiğimiz bulgular bize faktör genlerinin beraber uygulanmasının kollajen sentezini daha fazla artığını düşündürmektedir. Histopatolojik olarak dokudaki kollajen miktarının aynı grupta daha fazla olması savımızı kuvvetlendirmektedir. Fibroblast artışı ve proliferasyonu ekstraselüler matriks sentezi ve kuvvetli yara dokusu oluşumunda önemlidir. Çalışmamızda FGF geni ve genlerin kombinasyon halinde kullanılması sonucunda fibroblast proliferasyonunu daha fazla görmeyi amaçladık. Fibroblast proliferasyonun plazmid gurubu dahil bütün gruplarda arttığını gözledik. Artışın bFGF ve kombine gen terapisi uyguladığımız gruplarda daha fazla olması terapinin faydalı olduğunu görebilir. Aynı zamanda gen kombinasyonu uygulanan grubun sonuçlarının bFGF grubuna göre daha anlamlı olması sinerjik etkinin burada ortaya çıktığını düşündürmektedir. Anjiyogenez hem dokuya hücrelerin hem de gerekli O2 ve besinlerin oluşumunda gereklidir. VEGF ve bFGF genlerinin uygulanmasının anjiyogenez üzerine olumlu etkileri sonuçlarımıza yansımaktadır. Daha belirgin olarak VEGF ve bFGF genlerinin beraber uygulanması dokuda yeni damar oluşumunu ileri derece artırmıştır. Yara iyileşmesi kompleks bir olay olarak tanımlanmaktadır. İyileşmenin aksamaması için kollajen sentezi, fibroblast göçü, anjiyogenez ve epitelizasyonun rolleri ön plana çıkmaktadır. Yine bunları tetikleyen büyüme faktörlerinin rolleride unutulmamalıdır. İskemik dokularda ise bu faktörlerin birçoğu etkilendiği için yara iyileşmesi sekteye uğramaktadır. Çalışmamızda özellikle büyüme faktör genlerinin beraber uygulandığı grupta kollajen sentezi, fibroblast proliferasyonu ve anjiyogenezin ileri derece anlamlı olarak artığını gözlemledik bu artış genlerin sinerjik etkilerinden kaynaklanabilir. VEGF ve bFGF genlerinin epitelizasyon üzerine etkili görünmemesi yara iyileşmesinde bir eksiklik olarak görülebilir. 55 Çalışmamız literatürde kolon anastomozları üzerinde FGF ve VEGF’ ün kullanıldığı ilk çalışmalardandır. İskemik kolon anastomozlarında yara iyileşmesini attırmak için plazmide klonlanmış VEGF ve bFGF beraber kullanılabilir. Daha başka genlerinde birleşime eklenmesi düşünülebilir. Böylelikle epitelizasyonun artması ve yara iyileşmesinin proliferatif faza geçmesini geciktiren aşırı inflamasyonun optimum düzeye gelmesi sağlanabilir. 56 7. ÖZET Gastrointestinal sistem cerrahisi sonrası görülen anastomoz kaçakları ve ayrışması günümüzde önemli mortalite ve morbidite nedenleri arasındadır. Anastomoz kaçağının görülme oranı %3-8 olup kaçak sonrası mortalite halen %30’ un üzerindedir. Anastomoz kaçağının oluşmasında en önemli nedenlerden biri devaskülarizasyon ve buna bağlı olarak görülen hipoperfüzyondur. Hipoksi sonrası gelişen nekroz anastomoz kaçağına ve ayrışmasına neden olmaktadır. Gelişen cerrahi ve medikal teknikler anastomoz kaçaklarını istenilen düzeylere getirememiş olması anastomoz iyileşmesini artıracak ajanların araştırılmasını gerekli kılmıştır. Yara onarımı için gerekli olan O2, besin ve inflamatuar hücrelerin ulaştırılması için yeni damarların oluşumuna anjiyogenez denmektedir. Anjiyogenezi en fazla miktarda uyaran büyüme faktörleri Vasküler endotelyal growth faktör (VEGF) ve Fibroblastik Growth (FGF) Faktördür. Yaralanmayla birlikte FGF seviyeleri artmaya başlar ve 48. saatte normal değerlerine düşer. VEGF değerleri ise yaralanmadan birkaç gün sonra pik yapar. Kollajen sentezi ve granülasyon dokusunun anastomozda görülmesi proliferatif fazın başlangıcını belirler. Büyüme faktörlerinin plazmidlere klonlanarak hedef dokulara verilmesiyle oluşturulan anjiyogenez yeni bir yaklaşımdır. Çeşitli çalışmalarda Vasküler Endotelyal Growth Faktör (VEGF) geniyle oluşturulan anjiyogenez oldukça umut vericidir. Gen tedavisinde terapötik genin hedef dokuya ulaştırılması önemli bir problemdir. Plazmidler gen transfer ve tedavi çalışmalarında kullanılan en basit araçlardır. Toksisitelerinin düşük olması, geçici ekspresyon sağlamaları ve kromozomal integrasyon özelliklerinin olmaması ile tıbbi çalışmalar için tercih edilirler. Çalışmamızda amacımız insan VEGF iskeminin kolon anastomozunda yara 165 ve bFGF genini plazmide klonlayarak iyileşme üzerine etkilerini araştırmak olumsuzluklarını gidermektir. Çalışmamızda 200-250 gram ağırlığında, 40 adet Wistar-Albino sıçan kullanıldı. Sıçanlar her grupta 8 sıçan olacak şekilde 5 gruba randomize edildi. Grup 1: (Kontrol) : İskemik kolon anastomozu Grup 2: (Kontrol) : İskemik kolon anastomozu +lokal plazmid verilmesi Grup 3: İskemik kolon anastomozu + lokal plazmide bağlı VEGF geni verilmesi Grup 4: İskemik kolon anastomozu + lokal plazmide bağlı FGF geni verilmesi 57 ve Grup 5: İskemik kolon anastomozu + lokal plazmide bağlı VEGF ve FGF genleri verilmesi. Ameliyat sonrası 4. gün deney hayvanları sakrifiye edildi. Anastomozun mekanik incelemesi için anastomoz patlama basıncı ölçüldü. Doku hidroksiprolin, VEGF ve FGF düzeyleri, biyokimyasal parametreleri olarak bakıldı. Işık mikroskobu ile inflamatuar hücre infiltrasyonuna göre inflamasyon derecesi, kapiller gelişimi, fibroblast proliferasyonu, yarada kollajen birikmesi ve epitelizasyon durumu incelendi. VEGF ve b FGF genlerinin plazmide bağlanarak ayrı ayrı olarak lokal uygulanması sonrasında doku VEGF ve FGF değerleri, anastomoz patlama basıncı, doku hidroksiprolin düzeyleri, fibroblast proliferasyonu ve anjiyogenezis kontrol grubuna göre anlamlı olarak artmıştır. bFGF geni uygulaması sonrasında ek olarak kollajen birikimi de anlamlı olarak atmaktadır. VEGF-bFGF gen kombinasyonu uygulanan grupta doku VEGF, FGF ve hidroksiprolin düzeyleri, fibroblast proliferasyonu, kollajen birikimi ve anjiyogenezis artışı kontrol grubuna göre ileri derecede anlamlı bulunmuştur. Epitelizasyon ve inflamasyon parametrelerinde gruplar arasında farklılık gösterilememiştir. VEGF-bFGF (kombine) gen terapisi iskemik kolon anastomozlarında, anastomoz yara iyileşmesini artırmak için kullanılabilir. 58 8. SUMMARY Anastomotic leakage and dehiscence after gastrointestinal tract surgery is still a significant cause of morbidity and mortality. The rate of anastomotic leakage is %3-8 while the mortality of leakage is over % 30. Devascularisation and consequent hypoperfusion are between the most important causes of anastomotic leakage. Necrosis following hypoxia results in anastomotic leakage and dehiscence. Despite improvements in surgical and medical techniques, the rates of anastomotic leakage remain high; this necessitates investigation of new agents. Angiogenesis is the occurrence of new vessels, in the demand of O2, nutrition and inflammatory cell for wound healing. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and fibroblastic growth factor are (FGF) the main growth factors stimulating angiogenesis. The amount of FGF begins to rise with wounding and decreases to normal levels in 48 hours. VEGF levels peak in a few days after wounding. Collagen synthesis and formation of granulation tissue in the anasmotic site are the indicators of the beginning of proliferative phase. Delivery of growth factor cloned plasmids to the target tissue for the development of angiogenesis is a new approach. Angiogenesis developing with the vascular endothelial growth factor gene is hopeful in different studies. Delivery of the therapeutic gene to the target tissue is an important problem in gene treatment. Plasmids are the simplest vehicles, used in gene transfer and treatment studies. Low toxicities, transient expression and lack of chromosomal integration, plasmids are the choices of medical studies. In this study, we cloned human VEGF165 and bFGF genes to plasmids in order to search their effects in the healing of ischemic colon anastomosis and eliminate the negative effects of ischemia. 40 male Wistar-Albino rats, weighing 200-250 grams were used in the study. Rats were randomized in 5 groups with 8 rats in each group. Group 1: (Control) Ischemic colon anastomosis Group 2: (Control) Ischemic colon anastomosis + local plasmid delivery Group 3: Ischemic colon anastomosis + local VEGF cloned plasmid delivery Group 4: Ischemic colon anastomosis + local FGF cloned plasmid delivery Group 5: Ischemic colon anastomosis + local VEGF and FGF cloned plazmid delivery 59 All of the rats were sacrificed in the postoperative 4th day. Anastomosis burst pressures were measured for mechanical examination of anastomosis. Tissue hydroxyprolin, VEGF and FGF levels were examined for biochemical parameters. Inflammatory cell infiltration, capillary formation, fibroblast proliferation, collagen deposition and epitelisation were examined with light microscope. After local separate delivery of VEGF and FGF cloned plasmids, tissue VEGF and FGF levels, anastomotic burst pressure, tissue hydroxyproline levels, fibroblast proliferation and angiogenesis were found significantly higher than the control group. Collagen deposition was significantly higher after the delivery of bFGF gene. In the VEGF-FGF combination group, the increase in tissue VEGF, FGF and hydroxyproline levels, collagen deposition, fibroblast proliferation and angiogenesis were extremely significantly than the control group. There wasn’t a significant difference in epitelisation and inflammation parameters between groups. VEGF-bFGF (combination) gen therapy can be effectively used in increasing anastomotic wound healing in ischemic colon anastomosis. 60 9. SONUÇ Çalışmamız iskemik kolon anastomozlarında VEGF ve bFGF gen terapisinin anastomoz yara iyileşmesi üzerinde ciddi klinik yararlarının görülebileceğini desteklemektedir. İskemik kolon anastomozu yapılan deneklere uygulanan plazmide bağlı VEGF ve bFGF genlerinin ürünleri anatomoz bölgesinden alınan dokuda gösterilmiştir. VEGF ve FGF genlerinin beraber kullanılması VEGF ve FGF düzeylerini istatistiksel olarak ileri derecede anlamlı olarak arttırdığı görüldü. Anastomoz patlama basıncı incelemelerinde ayrı ayrı VEGF plazmid ve bFGF plazmid uygulamaları kontrol grubuna (Grup II) oranla anastomoz patlama basıncını 2 kat arttırmıştır (p<0.01) . VEGF ve bFGF plazmidleri uygulanan hayvanlarda anastomoz patlama basıncı 2,5 kat artmaktadır. Büyüme faktörü genlerinin bu etkisi istatistiksel olarak ileri derecede anlamlı bulunmuştur. Hidroksiprolin düzeyleri VEGF cDNA uygulanan hayvanlarda kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0.05). bFGF cDNA uygulanan grupta hidroksiprolin değerleri kontrol gruplarına (Grup I, II) oranla yaklaşık 2 kat artmıştır (p<0.001). VEGF ve bFGF cDNA beraber uygulanan grupta hidroksiprolin düzeyleri kontrol gruplarına (Grup I, II) oranla yaklaşık 3,5 kat artmıştır (p<0.001). İnflamasyon ve epitelizayon skorları açısından gruplarda fark gözlenmemiştir. Kollajen birikimi açısından incelendiğinde bFGF ve gen kombinasyonu uygulan gruplarda istatistiksel fark belirgin olmuştur (p<0.01). Anjiyogenesis artışı tedavi gruplarında ileri derece anlamlı bulunmuştur (p<0.01). Bulgularımızın ışığı altında büyüme faktörlerinin gen terapisi terapisinin iskemik kolon anastomozlarının iyileşme sürecinde faydalı olabileceğini düşünmekteyiz. Büyüme faktörlerinin plazmidle birlikte verilmesi kolay uygulanabilir bir yöntemdir. Genlerin birlikte verilmesinin sinerjik etki yaparak iskemik kolonun iyileşmesini daha fazla artırabileceğini düşünmekteyiz. Kollajen artışı kısa dönemde anastomoz kuvveti için önemli iken uzun dönemde fibrozis artışına bağlı olarak striktür gelişmesine neden olabilmektedir. Kanserli hastalarda anjiyogenezin tümör yayılımına olan etkileri halen araştırılmaktadır. bFGF-VEGF gen terapisinin insan üzerinde yaygın kullanımı için uzun dönem sonuçlarının araştırılması gerekmektedir. 61 Kaynakça 1. Lisanne A. E. Posma, M.D., Robert P. Bleichrodt, M.D., Ph.D., Harry van Goor. Transient Profound Mesenteric Ischemia Strongly Affects the Strength of Intestinal Anastomoses in the Rat. Dis Colon Rectum 2007; 50: 1070–1079. 2. Mohammad U NasirKhan, Farshad Abir, Walter Longo. Anastomotic disruption after large bowel resection. World J Gastroenterol 2006; 28; 12-16. 3. FS Thorton, A Barbal. Healing in the gastrointestinal tract. Surg Clin of North Am 1997; 77: 549-573. 4. B Egger, R Inglin, J Zeek, O Dirsch, Y Huang, MW Büchler. Insulin like growth factor I and truncated keratinocyte growth factor accelerate healing of left sided colonic anastomoses. Brit J of Surg 2001;88: 90-98. 5. A Doeksen, PJ Tanis, BC Vrouenraets, JJB Lanschot van. Factors determining delay in relaparotomy for anastomotic leakage after colorectal resection. World J Gastroenterol 2007; 21: 13-27. 6. JG Garcia, G Criado. Healing of colonic ischemic anastomoses in the rats, Dis Colon Rectum 1998; 41: 829-895. 7. TZ Nursal, R Anarat, S Bircan, S Yıldirim, A Tarim, M Haberal. The effect of tissue adhesive, octylcy-cyanoacrylale on the healing of experimental high-risk and normal colonic anastomosis. Am J Surg 2004; 187:28-32. 8. AE Sakallioglu, A Yagmurlu, H Dindar, N Hasirci, N Renda, MS Deveci. Sustained local application of low dose epidermal growth factor on steroidinhibited colonic wound healing. J Pediatr Surg 2004; 39: 591-595. 9. Nıcola J. Brown, Phda; Edward A. E. Smyth. Angiogenesis induction and regression in human surgical wounds. Wound Rep Reg 2002; 10: 245–251. 10. Lısa J. Gould, Md, Phd; Mımı Leong, Md; Joseph Sonsteın, Bs. Optimization and validation of an ischemic wound model Wound Rep Reg 2005 ;13: 576-582. 11. Hopf HW, Hunt TK, West JM, Blomquist P, Goodson WH III. Wound tissue oxygen tension predicts the risk of wound infection in surgical patients. Surg 1997;132: 997–1005. 62 12. Dowd GS. Predicting stump healing following amputation for peripheral vascular disease using the transcutaneous oxygen monitor. Ann R Coll Surg Engl 1987; 69 :31–35. 13. Nissen NN, Polverini PJ, Gamelli RL, DiPietro LA. Basic fibroblastgrowth factor mediates angiogenic activity in early surgical wounds.Surgery 1996;119:457–465. 14. Rissanen TT, Rutanen J, Ylä-Herttuala S.: Gene transfer for therapeutic vascular growth in myocardial and peripheral ischemia. Adv Genet. 2004;52:117-164. 15. Lee JS, Kim JM, Kim KL, Jang HS, Shin IS, Jeon ES, Suh W, Byun J, Kim DK.: Combined administration of naked DNA vectors encoding VEGF and bFGF enhances tissue perfusion and arteriogenesis in ischemic hindlimb. Biochem Biophys Res Commun. 2007 ;7:360-364. 16. Rissanen TT, Markkanen JE, Arve K, Rutanen J, Kettunen MI, Vajanto I, Jauhiainen S, Cashion L, Gruchala M, Närvänen O, Taipale P, Kauppinen RA, Rubanyi GM, Ylä-Herttuala S.: Fibroblast growth factor 4 induces vascular permeability, angiogenesis and arteriogenesis in a rabbit hindlimb ischemia model. FASEB J. 2003;17:100-102. 17. Richard T. Ethridge, MD, PhD Mimi Leong, MD . Wound Healing In. Townsend C. M. et al editors. Sabiston Textbook of Surgery. The Biological Basis of Modern Surgical Practice. 18 th edition. Elsevier Saunders; 2008. 18. Sarah K. Thompson, M.D. , Eugene Y. Chang, M.D. Clinical Review: Healing In Gastrointestinal Anastomoses, Part I. Microsurgery 2006;26:131–136. 19. Barbul A. Wound healing. In F. Charles Brunicardi et al editors. Schwartz’s Principles of Surgery. 8 th ed. The McGraw-Hill Com. 2005. 20. Witte MB, Barbul A. General principles of wound healing. Surg Clin North Am 1997; 77: 515. 21. Margaret K. Strecker-McGraw, MD. Soft Tissue Wounds and Principles of Healing Emerg Med Clin N Am 2007;25: 1–22. 22. JoAn L. Monaco, MS, MD, W. Thomas Lawrence. Acute wound healing An overview. Clin Plastic Surg 2003; 30: 1– 12. 63 23. Gogia PP. Physiology of wound healing: clinical wound healing. Thorofare (NY): Slack, Inc. ; 1995; 3. 24. Mackman N. Role of tissue factor in hemostasis, thrombosis, and vascular development. Aterioscler Thromb Vasc Biol 2004; 24:1015–1022. 25. Charles H Thorne (Editor), Scott P Bartlett (Editor), Robert W Beasley. Grabb and Smith’s plastic surgery. Lippincott Williams & Wilkins; 6 edition, 2006. 26. Derek A. Dubay, MD.Acute wound healing: the biology of acute wound failure. Surg Clin N Am 2003; 83:463–481. 27. Deuel TF, Senior RM, Huang JS, et al. Chemotaxis of monocytes and neutrophils to platelet-derived growth factor. J Clin Invest 1982 ;69:1046–1055. 28. Stephan Barrientos, Olivera Stojadinovic, MD, Michael S. Golinko, MD, Harold Brem. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound Rep Reg 2008;16 585–601. 29. Hantash BM, Zhao L, Knowles JA, Lorenz HP. Adult and fetal wound healing. Front Biosci 2008; 13: 51–61. 30. TH Pohlman, KA Stanness, PG Beatty, HD Ochs, and JM Harlan.An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro by lipopolysaccharide, interleukin 1, and tumor necrosis factor-alpha increases neutrophil adherence by a CDw18dependent mechanism. J. Immunol. , 1986; 136: 4548 - 4553. 31. M P Bevilacqua, R R Schleef, M A Gimbrone, Jr, and D J Loskutoff. Regulation of the Fibrinolytic System of Cultured Human Vascular Endothelium By Interleukin 1. J Clin Invest. 1986 ; 78: 587–591. 32. M P Bevilacqua, J S Pober, M E Wheeler, R S Cotran, and M A Gimbrone. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. J Clin Invest. 1985 ; 76: 2003–2011. 33. Fine N.A, Thomas A.Wound healing. In Mulholland, Michael W. ; Lillemoe, Keith D. Greenfield's Surgery: Scientific Principles And Practice, Williams & Wilkins; 4th Edition, 2006. 64 34. Min-Ho Kim, Wei Liu, Dori L. Borjesson Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. J Invest Dermatol. 2008 ; 128: 1812-1820. 35. Prockop DJ, Kivirikko KI, Tuderman L, et al. The biosynthesis of collagen and its disorders. N Engl J Med 1979;301:13–23. 36. Heck DE, Laskin DL, Gardner CR, Laskin JD. Epidermal growth factor suppresses nitric oxide and hydrogen peroxide production by keratinocytes. Potential role for nitric oxide in the regulation of wound healing. J Biol Chem 1992;267 :21277–21280. 37. Arany I, Brysk MM, Brysk H, Tyring SK. Regulation of inducible nitric oxide synthase mRNA levels by differentiation and cytokines in human keratinocytes. Biochem Biophys Res Commun 1996; 220:618–622. 38. Hood JD, Meininger CJ, Ziche M, Granger HJ. VEGF upregulates ecNOS message, protein, and NO production in human endothelial cells. Am J Physiol 1998;274 : 1054–1062. 39. Frank S, Madlener M, Pfeilschifter J, Werner S. Induction of inducible nitric oxide synthase and its corresponding tetrahydrobiopterin-cofactor-synthesizing enzyme GTPcyclohydrolaseI during cutaneous wound repair. J Invest Dermatol 1998;111 :1058–1064. 40. John N. Curan MB, Des C. Winter, MD. Biological fate and clinical implications of arginine metabolism in tissue healing. Wound Rep Reg 2006; 14: 376–386 41. Stuehr DJ, Gross SS, Sakuma I, Levi R, Nathan CF. Activated murine macrophages secrete a metabolite of arginine with the bioactivity of endothelium-derived relaxing factor and the chemical reactivity of nitric oxide. J Exp Med 1989;169:1011–1020. 42. Granger DN. Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol 1988;255::1269–1275. 43. Murohara T, Asahara T, Silver M, Bauters C, Masuda H, Kalka C, et al. Nitric oxide synthase modulates angiogenesis in response to tissue ischemia. J Clin Invest 1998; 101:2567–2578. 65 44. Konturek SJ, Brzozowski T, Majka J, Pytko-Polonczyk J, Stachura J. Inhibition of nitric oxide synthase delays healing of chronic gastric ulcers. Eur J Pharmacol 1993;239: 215–217. 45. Nissen NN, Polverini PJ, Koch AE, Volin MV, Gamelli RL, DiPietro LA. Vascular endothelial growth factor mediates angiogenic activity during the proliferative phase of wound healing. Am J Pathol 1998;152:1445–1452. 46. Harrıet W. Hopf Md, Jeffrey J. Gıbson Md, Adam P. Angeles Md. Hyperoxia and Angiogenesis. Wound Rep Reg 2005; 13:558–564. 47. Morbidelli L, Chang CH, Douglas JG, Granger HJ, Ledda F, Ziche M. Nitric oxide mediates mitogenic effect of VEGF on coronary venular endothelium. Am J Physiol 1996;270: 411–415. 48. Steed DL. The role of growth factors in wound healing. Surg Clin N Am 1997;77:575–586. 49. Kivirikko KI, Helaakoski T, Tasanen K, et al. Molecular biology of prolyl 4hydroxylase. Ann N Y Acad Sci 1990;580:132. 50. Erlich HP, Krummel TM: Regulation of wound healing from a connective tissue perspective.Wound Repeair and Regeneration 1996;4:203. 51. Veis A, Averey J. Modes of intermolecular crosslinking in mature insoluble collagen. J Biol Chem 1965; 240:3899– 3908. 52. Shi HP, Efron DT, Most D, Tantry US, Barbul A. Supplemental dietary arginine enhances wound healing in normal but not inducible nitric oxide synthase knockout mice. Surgery 2000;128:374–378. 53. Thornton FJ, Schaffer MR, Witte MB, Moldawer LL, MacKay SL, Abouhamze A, et al. Enhanced collagen accumulation following direct transfection of the inducible nitric oxide synthase gene in cutaneous wounds. Biochem Biophys Res Commun 1998;246:654–659. 54. Caterson B, Lowther DA. Changes in the metabolism of the proteoglycans from sheep articular cartilage in response to mechanical stress. Biochem Biophys Acta 1978;540:412–422. 55. Kurt N. Akut ve kronik yara bakımı. Noberl Tıp Kitapevi 2003; 17-33. 66 56. Kalaycı G. Genel cerrahi Cilt 1. Nobel tıp kitapevi 2002 : 53-60. 57. Cronin K, Jackson DS, Dunphy JE. Chaging bursting strength and collagen content of the healling colon. Surg Gynecol obstet 1968;126 : 747-753. 58. Graham MF, Drucker DE, Diegelmann RE, Elson CO. Collegen synthesis by human intestinal smooth muscle cells in culture. Gastroenterology 1987;92:400405. 59. Martens MF, Huyben CM. Hendriks T. Collegen synthesis in fibroblast from human colon: Regulatory aspects differences with skin fibroblasts. Gut 1992; 33:1664-1670. 60. Graham MF, Blomguist P, Zederfeldt B.The alimantary canal. (In) Wound healing: Biochemical and clinical Aspects (Eds) Cohen IK, Diegelmann RF, LindbladWJ. WB Sunders Company 1992, Philadelphia: 433-449. 61. Mast BA. Healing in other tissues. Surg Clin North Am 1997;77 :529–547 62. Brasken P.Healing of experimental colon anastomases. Eur J Surg 1991; 566:851. 63. Högström H, Haglund U.Postoperative decrease in suture holding capacity in laparatomy wounds and anastomoses. Acta Chir Scand 1985;151:533-535. 64. Van Winkle W Jr, Hastings JC,Barker E,et al: Role of the fibroblast in controlling rate and extent of repair in wounds of various tissues. In Kulonen E, Pikkarainen J (eds): Biology of fibroblast. New York, Academic Pres, 1973: 559-570. 65. Martens MF WC, Hendriks TH: Postoperative changes in cologens synthesis in intestinal anastomoses of the rat: differences between small and large bowel. Gut,1991:32;1482-1487. 66. Bülent Kılıçoğlu, Sibel Serin Kılıçoğlu, Veli Çağatay Eren. Gastrointestinal sistemde yara iyileşmesi . S.D.Ü. Tıp Fak. Derg. 2005;12: 67-76. 67. Robson MC, Steed DL, Franz MG. Wound healing: biologic features and approaches to maximize healing trajectories. Curr Probl Surg 2001;38: 71–140. 68. Tadros T, Wobbes T, Hendriks T. Blood transfusion impairs the healing of experimental intestinal anastomoses. Ann Surg 1992;215:276–281. 67 69. Shandall A, Lowndes R, Young HL. Colonic anastomotic healing and oxygen tension. Br J Surg 1985;72:606–609. 70. Goligher LC, Et.Al: Acontrolled comparison of one and two layer technigues of for high and low colorectal anastomoses. Bj j surg 1977; 64: 609-614. 71. Schilling JA. Wound Healing. Surg Cli North Am. 1976;56:859-874. 72. Hawley PR: Causes and prevention of anastomotic breakdown. Dis. Colon Rectum 1973 ; 16:272-277. 73. Irvin TT: Collagen metaboloism in infected colonic anastomoses. Br. J. Surg. 1975;62:659. 74. Schrock TR, Deveney CW, Dunfy JE: Factors contributing to leakage of colonic anastomosis. Ann Surg 1973;177:513-51. 75. Slim K, Vicaut E, Panis Y, Chipponi J. Meta-analysis of randomized clinical trials of colorectal surgery with or without mechanical bowel preparation. Br J Surg 2004;91:1125–1130. 76. Stoop MJ, Dirksen R, Hendriks T. Advanced age does not suppress anastomotic healing in the intestine. Surgery 1996;119:15–19. 77. Dubay DA, Franz MG. Acute wound healing: the biology of acute wound failure. Surg Clin North Am 2003;83:463–481. 78. Michiel H. J. Verhofstad, Roger M. L. M. Lome, Ben M. de Man. Intestinal Anastomoses from Diabetic Rats Contain Supranormal Levels of Gelatinase Activity. Dis Colon Rectum 2002;45:554–561. 79. Gilmour DG, Aitkenhead AR, Hothersall AP, Ledingham IM. The effect of hypovolaemia on colonic blood flow in the dog. Br J Surg. 1980 ;67:82-84. 80. Trengove NJ, Bielefeldt-Ohmann H, Stacey MC. Mitogenic activity and cytokine levels in non-healing and healing chronic leg ulcers. Wound Repair Regen 2000; 8: 13–25. 81. Vogt PM, Lehnhardt M, Wagner D, Jansen V, Krieg M, Steinau HU. Determination of endogenous growth factors in human wound fluid: temporal presence and profiles of secretion. Plast Reconstr Surg 1998; 102: 117–123. 68 82. Heldin CH, Westermark B. Mechanism of action and in vivo role of plateletderived growth factor. Physiol Rev 1999; 79: 1283–1316. 83. Uutela M, Wirzenius M, Paavonen K, Rajantie I, He Y, Karpanen T, Lohela M, Wiig H, Salven P, Pajusola K, Eriksson U, Alitalo K. PDGF-D induces macrophage recruitment, increased interstitial pressure, and blood vessel maturation during angiogenesis. Blood 2004; 104: 3198–3204 84. Wu L, Pierce GF, Galiano RD, Mustoe TA. Keratinocyte growth factor induces granulation tissue in ischemic dermal wounds. Importance of epithelialmesenchymal cell interactions. Arch Surg 1996; 131: 660–666. 85. Ceccarelli S, Cardinali G, Aspite N, Picardo M, Marchese C, Torrisi MR, Mancini P. Cortactin involvement in the keratinocyte growth factor and fibroblast growth factor 10 promotion of migration and cortical actin assembly in human keratinocytes. Exp Cell Res 2007; 313: 1758–1777. 86. Clark RAF. In: Clark RAF, editor. The molecular and cellular biology of wound repair. 2nd ed. New York: Plenum Press, 1996. 87. Saaristo A, Tammela T, Farkkila A, Karkkainen M, Suominen E, Yla-Herttuala S, Alitalo K. Vascular endothelial growth factor-C accelerates diabetic wound healing. Am J Pathol 2006; 169: 1080–1087. 88. Senger DR, Ledbetter SR, Claffey KP, Papadopoulos-Sergiou A, Peruzzi CA, Detmar M. Stimulation of endothelial cell migration by vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor through cooperative mechanisms involving the alphavbeta3 integrin, osteopontin, and thrombin. Am J Pathol 1996; 149: 293–305. 89. Silver IA. The measurement of oxygen tension in healing tissue. Prog Repair Res 1969; 3: 124–135. 90. Knighton DR, Silver IA, Hunt TK. Regulation of woundhealing angiogenesiseffect of oxygen gradients and inspired oxygen concentration. Surgery 1981; 90: 262–270. 91. Schoppmann SF, Birner P, Stockl J, Kalt R, Ullrich R, Caucig C, Kriehuber E, Nagy K, Alitalo K, Kerjaschki D. Tumor- associated macrophages express 69 lymphatic endothelial growth factors and are related to peritumoral lymphangiogenesis. Am J Pathol 2002; 161: 947–956. 92. Xin-Hua Feng. Cell, Genomics, and Molecular Surgery. In F. Charles Brunicardi et. al Schwartz’s Manual Of Surgery 8 th ed. ; 309. 93. Catherine van Montfrans, Anje A. te Velde, Sander J. H. van Deventer, Maria Sol Rodriguez Pena. Gene therapy in the treatment of intestinal inflammation. Int J Colorectal Dis 2004; 19:79–86. 94. C. Kristian Enestvedt, Luke Hosack, Shelley R. Winn. VEGF Gene Therapy Augments Localized Angiogenesis and Promotes Anastomotic Wound Healing: A Pilot Study in a Clinically Relevant Animal Model. J Gastrointest Surg 2008; 12:1762–1772. 95. Ian S. Blagbrough, Chiara Zara. Animal Models for Target Diseases in Gene Therapy — using DNA and siRNA Delivery Strategies. Pharmaceutical Research 2009;26. 96. Ludwik K. Branski, Gerd G. Gauglitz. A review of gene and stem cell therapy in cutaneous wound healing. Burns 2009; 35:171-180 97. Khavari PA, Rollman O, Vahlquist A. Cutaneous gene transfer for skin and systemic diseases. J Intern Med 2002;252:1–10. 98. Sprugel KH, McPherson JM, Clowes AW, Ross R. Effects of growth factors in vivo. I. Cell ingrowth into porous subcutaneous chambers. Am J Pathol 1987;129:601–613. 99. Kevin R. Smith. Gene Therapy: Theoretical and Bioethical Concepts. Archives of Medical Research 2003;34: 247–268. 100. Bank A. Human somatic gene therapy. Bioessays 1996;18: 999-1007. 101. Dando JS, Roncarolo MG, Bordignon C, Aiuti A. A novel human packaging cell line with hematopoietic supportive capacity increases gene transfer into early hematopoietic progenitors. Hum Gene Ther 2001;12:1979–1988. 102. Karim Ghani, Alain Garnier. Retroviral Vector Production Using SuspensionAdapted 293GPG Cells in a 3L Acoustic Filter-Based Perfusion Bioreactor. Biotechnology and Bioengineering 2006;95:653-660. 70 103. PaluÁ G, C. Parolin. Progress with retroviral gene vectors. Rev. Med. Virol. 2000; 10: 185-202. 104. Wilhelm M. Reverse transcription of retroviruses and LTR Retrotransposons. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 2001;58: 1246–1262. 105. T Roe, T C Reynolds, G Yu, and P O Brown. Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis. EMBO J. 1993 ; 12: 2099–2108. 106. Daniel Klink, Dirk Schindelhauer. Gene delivery systems—gene therapy vectors for cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis 2004;3: 203– 212. 107. Dragomira Majhen. Adenoviral vectors—How to use them in cancer gene therapy. Virus Research 2006;119:121–133. 108. Kevin J. Harrington, Christopher M. Nutting. Gene therapy for head and neck cancer. Cancer and Metastasis Reviews 2005;24: 147–164. 109. M.A. Witlox, M.L. Lamfers. Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: Review. Bone 2007;40:797–812. 110. N.C. Petrie et al. Surg Clin N Am 2003; 83: 597–616. 111. Martin Hauses, Hans K. Schackert. Gene therapy and gastrointestinal cancer: concepts and clinical facts. Langenbeck’s Arch Surg 1999; 384:479–488. 112. Siddhesh D. Patil,1 David G. Rhodes. DNA-based Therapeutics and DNA Delivery Systems: A Comprehensive Review. The AAPS Journal 2005; 7 :61-76. 113. Crispin R. Dass. Lipoplex-mediated delivery of nucleic acids:factors affecting in vivo transfection. J Mol Med 2004; 82:579–591. 114. Christensen H, Oxlund H. Growth hormone increases the collagen deposition rate and breaking strength of left colonic anastomoses in rats. Surgery 1994;116:550–556. 115. Braskén P. Healing of experimental colon anastomosis. Eur J Surg Suppl. 1991;566:1-51. 116. Koruda MJ, Rolandelli RH. Experimental studies on the healing of colonic anastomoses (review). J Surg Res. 1990; 48:504-515. 71 117. Jiborn H, Ahonen J, Zederfeldt B. Healing of experimental colonic anastomoses. I. Bursting strength of the colon after left colon resection and anastomosis. Am J Surg 1978;136:587–594. 118. Hendriks T, Mastboom WJ. Healing of experimental intestinal anastomoses: parameters for repair. Dis Colon Rectum 1990;33: 891-901. 119. Mantzoros M.D. , Ph.D. , I.Kanellos The Effect of Insulin-Like Growth Factor Ion Healing of Colonic Anastomoses in Cortisone-Treated Rats. Dis Colon Rectum 2006; 49:1431–1438. 120. Oktay Irkorucu ,Bulent Hamdi Ucan. Does sildenafil reverse the adverse effects of ischemia on ischemic colon anastomosis. International Journal of Surgery 2009;7: 39–43. 121. Ali Yarimkaya, M.D., Berat Apaydin Effects of Recombinant Human Growth Hormone and Nandrolone Phenylpropionate on the Healing of Ischemic Colon Anastomosis in Rats. Dis Colon Rectum 2003;46:1690-1697. 122. Goran Marjanovic, Eva Jüttner Ischemic preconditioning improves stability of intestinal anastomoses in rats. Int J Colorectal Dis 2009; 24:975–981. 123. Mine Fedakar-Senyucel, Meltem Bingol-Kologlu The effects of local and sustained release of fibroblast growth factor on wound healing in esophageal anastomoses. Journal of Pediatric Surgery 2008; 43, 290–295. 124. Liechty KW, Nesbit M, Herlyn M, Radu A, Adzick NS, Crombleholme TM. Adenoviral-mediated overexpression of platelet-derived growth factor-B corrects ischemic impaired wound healing. J Invest Dermatol 1999;113: 375–383. 125. Deodato B, Arsic N, Zentilin L, Galeano M, Santoro D, Torre V, et al. Recombinant AAV vector encoding human VEGF165 enhances wound healing. Gene Ther 2002;9:777–785. 126. Galeano M, Deodato B, Altavilla D, Squadrito G, Seminara P, Marini H, et al. Effect of recombinant adeno-associated virus vector-mediated vascular endothelial growth factor gene transfer on wound healing after burn injury. Crit Care Med 2003;31:1017–1025. 127. Eriksson E, Yao F, Svensjo T, Winkler T, Slama J, Macklin MD, et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res 1998;78: 85–91 72 128. Reginald V. N. Lord, MD Ji Min Park, MS Vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor expression in esophageal adenocarcinoma and Barrett esophagus J Thorac Cardiovasc Surg 2003;125:246-53. 129. Jeschke MG, Klein D. Liposomal gene transfer of multiple genes is more effective than gene transfer of a single gene. Gene Ther 2004;11:847–855. 73
