HCV-TS
advertisement
KULLANICI KILAVUZU HCV-TS REF. 03-07R Striplerde reverse hibridizasyon ile Hepatit C virus tiplendirme kiti 03-07R-20_8033622780359_TR.doc 1 ÜRÜN BİLGİSİ 2 2 KİT İÇERİĞİ 3 3 REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI 4 4 KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER 4 5 GÜVENLİK KURALLARI 5 5.1 Genel Güvenlik Kuralları 5 5.2 Kit Hakkında Güvenlik Kuralları 6 6 KİT İÇERİĞİNDE OLMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 8 7 GİRİŞ 9 8 TEST PRENSİBİ 10 9 ÜRÜN TANIMI 12 10 ÖRNEK MUAMELESİ VE SAKLAMA 13 11 PROSEDÜR 13 11.1 Ön hazırlık 13 11.2 Denatürasyon 13 11.3 Hibridizasyon 13 11.4 Sıkı yıkama 14 11.5 Kolorimetrik belirleme 15 12 SONUÇ YORUMLAMA 16 13 SORUN GİDERME 19 14 TEST PERFORMANSI 21 14.1 21 Özgünlük 15 REFERANSLAR 21 16 İLGİLİ ÜRÜNLER 22 pag.1 03-07R-20_8033622780359_TR.doc 1 ÜRÜN BİLGİSİ HCV-TS (kod 03-07R-20) Striplerde reverse hibridizasyon ile Hepatit C virus tiplendirmesi için kit Bu ürün in vitro diagnostik direktifin (IVDD) 98/79/EC (CE markası) gerekliliklerine uygundur. Kod 03-07R-20 Ürün HCV-TS Pkg 20 test AB ANALITICA srl Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: [email protected] 2 KİT İÇERİĞİ KUTU R +2 / +8 DE SAKLANIR AÇIKLAMA ETİKET TÜP YA DA KAPAK RENGİ 20 test Spesifik problar bağlı Nitroselüloz stripler HCV STRIP 20 SOLUSYON 1 BUFFER 1 2 X 100 mL Pre-BUFFER 2 1 X 100 mL SOLUSYON 3 BUFFER 3 1 X 100 mL Skim Milk toz SKIM MILK 6g Skim Milk çözülme Solusyonu Streptavidin-Alkaline phosphatase konjugat Substrat: Tablette NBT/BCIP Konjugat Sarı 1 X 30 μL NBT/BCIP Karanlık Şişe 5 tablet Hibridizasyon ve boyama için 8 tek kullanımlık inkübasyon tray ile pleytler Hibridizasyon Solusyonu Sıkı Yıkama Solusyonu 3 Hibridizasyon Solusyonu Sıkı Yıkama Solusyonu Sonuç yorumlama için Referans şebeke 1 X 50 mL 2 X 100 mL 1 pag.3 03-07R-20_8033622780359_TR.doc 3 REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore saklanmalıdır. Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır. 4 KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER • Bu ürün sadece IN VITRO kullanım içindir; • Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır; • Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; • • Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun; • Son kullanım tarihi geçmiş kitparçalarını kullanmayın; • Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: [email protected] • Tüm prosedür sırasında oda ısısı 15°C ve 28°C arasında olmalıdır ve nem %20-80 arasında olmalıdır. Yukarıdaki aralıkların altında ya da üstünde olan sıcaklık ve nem değerleri test performansını etkileyebilir. • IFO tarafından önerilen her bir deneysel negatif ve pozitif kontrollerin kit içeriğinde bulunması önemlidir. AB ANALITICA srl Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: [email protected] • İyi bir kit performansı için her bir aşamada yeterli miktarda reaktif dozu kullanmak kesinlikle gereklidir. • Nükleik asitler, çevrede ve kullanıcının derisinde bulunan nukleazlar tarafından kolayca yıkılır; kullanıcıdan DNase ve RNase tarafından örneklerin kontaminasyonunu önlemek için daima tek kullanımlık eldiven ve laboratuar giysisi kullanılmalıdır. • Filtreli uç kullanın; • Farklı lot numarasındaki reaktifleri kullanmayın ya da karıştırmayın. • PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. • Reaktifleri, ekstrakte edilmiş DNA örneklerinden uzakta saklayın. • Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin. 5 GÜVENLİK KURALLARI 5.1 Genel Güvenlik Kuralları Moleküler biyolojide HCV belirlemesi için başlangıç biyolojik örnekleri serum ve plazmadır. Her bir tekli örneği aşağıdaki kuralları içeren uygun güvenlik kuralları ile çalışmak gerekir: • Serum ve plazma gibi biyolojik örnekler ile çalışırken biyozararlı laminar flow kabini kullanın; • Tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlükler kullanın; • RNA ekstraksiyonu için tahsis edilmiş pipet ve sarf malzemeleri kullanın; • Ağızla pipetleme yapmayın. • Her bir giysideğişiminden sonra ellerinizi yıkayın; pag.5 03-07R-20_8033622780359_TR.doc • Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. • Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: • 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna batırılmalı YA DA en az 2 saat 121°C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solusyonları otoklavlamayın !!) 5.2 Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu ürün kullanımı ile ilgili risk yoktur. AB ANALITICA srl Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: [email protected] pag.7 03-07R-20_8033622780359_TR.doc 6 KİT İÇERİĞİNDE MATERYALLER • • • • • • • • BULUNMAYAN GEREKLİ Mikropipetler (aralık: 0,5-10 µL; 2-20 µL; 20-100 µL) ve filtreli uçlar; Otomatik pipetör ve dereceli steril pipetler; Thermalcycler; Hibridizasyon kuyucuklarından sıvı aspirasyonu için sistem; Orbital karıştırıcı; 65°C ye kadar ısıya programlanabilen su banyosy (Dubnoff); Tek kullanımlık eldivenler; Bazı reaktifleri hazırlamak için Falcon ® tipi test-tüpleri. AB ANALITICA srl Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: [email protected] 7 GİRİŞ İnsan Hepatit C Virusu (HCV); Kronik Hepatit, hepatik siroz ve hepatokarsinomaya neden olan en genel virustur. HCV, non-A ve non-B hepatitlerin (NANBH) %70-90 ında etiyolojik ajandır ve post-transfuzyonel Hepatitlerin en büyük nedenidir. İnsan Hepatit C enfeksiyonu parenteral geçiş ile aktarılabilir ve kronik lezyonda belirlenen hepatik hücrelerde kalmaya eğilimlidir. Viremi, bulaşmadan 1-3 hafta içinde belirlenebilir ve akut enfeksiyonlu hastalarda 4-6 ay, kalıcı enfeksiyonlu hastalarda 10 yıldan fazla kalabilir. HCV nin etiyolojik tanısı; viral antijenlere karşı antikor için araştırma olan immunoenzimatik testler ve her bir tekli antijene karşı antikorun tanımlanması için immunoblot gibi başarılı ilave testler ile konulabilir. Böyle testler, enfeksiyonun birinci fazında ya da antiviral tedavi sırasında viral aktivite ya da viral replikasyon durumu hakkında bilgi vermezler. Glycoprotein of envelope 1 Protein/s of capsid (Core) RNA+ genome Glycoprotein of envelope 2 HCV virus Section HCV virus Surface HCV mükletidik dizi oldukça çeşitlidir; ilk dizilenen HCV genomu genotip 1 dir (Choo ve arkadaşları, 1991). 5’ ve 3’ ucunda translasyon olmamış bölge, Core 21 bölgesi (p21 ya da capsid, Core protein, nukleocapsid, C protein), zarf (E1, E2/NS1) ve yapısal olmayan proteinler (NS2, NS3, NS4,NS5) içerir. HCV, yaklaşık 9,6 kb pozitif polarite RNA molekülü ile karakterizedir: Bu molekül, 3011 aminoasitleri polipeptidi için kodlayan tekli ORF (Açık Okuma Çerçevesi) içerir. 5’ ucunda 324-340 bp translasyon olmamış bölge (5’ NCR ya da 5’ NTR, 5’ UR, 5’ UTR, 5’ NC) ve 3’ ucunda çeşitli boyutlarda başka bir translasyon olmamış bölge (3’ NCR ya da 3’ NTR, 3’ UR, 3’ UTR, 3’ NC)(poli U dizisi içeren; Choo ve arkadaşları, 1991) içerir. ORF translasyon, ORF nin başlama kodonunun yakınında bulunan ribozomun bağlanmasına izin veren 5' UTR nin 324-340 nukleotidleri ile tetiklenir. pag.9 03-07R-20_8033622780359_TR.doc Polipeptid, translasyon ilerleyişisırasında ya da sonrasında on farklı protein (C, E1, E2 yapısal protein olarak; NS1, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A ve NS5B yapısal olmayan protein olarak) azaltır. Region codifying for the polypeptidic precursor 5’ NTR Nucleocapsid (core) Structural Proteins C E1 Glycoprotein of envelope 1 NON Structural Proteins 3’ NTR E2 Glycoprotein of envelope 2 Diğer genotipler, HCV genotip1areferansı ile tanımlanır. Onların sınıflandırılması, viral genomun farklı bölgelerinde nukleotidik dizilerin karşılaştırılması temeline dayanır. Viral genotipler, peg-IFN-α ve Ribavirin ile tedaviye farklı yollarla cevap verir: HC—2 ya da HCV-3 ile enfekte hastalar tedaviye cevap verirken, HCV-1b ile enfekte hastalar direnç gösterirler. Dahası, 1b genotip sık sık, bu hastaların serumunda yüksek viral yük veren yüksek replikatif kapasite gösterir. 1b genotip, siroz ve hepatokarsinomada hastalık gelişimi ile ilişkilidir. Farklı genotipler karakteristik coğrafik dağılım gösterir: Avrupa’da en çok görülenler: 1a, 1b, 2a, 2b, ve 3a. HCV1, her İtalyan bölgesinde en büyük Hepatit C nedenidir. Prevalans aralığı %50den %90a kadar değişir. HCV2 yaklaşık %34 prevalansa sahiptir, daha nadir görülür. HCV3 %3 ila %10 arasında görülür. Bu nedenle, HCV tipi terapi ve prognoz ilişkisi açısından çok önemlidir. AB ANALITICA srl Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: [email protected] 8 TEST PRENSİBİ PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürlerde ilk DNA amplifikasyonu metodudur. (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda nükleik asitin üç segmenti yer alır: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid “primerler” kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solusyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dNTPler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Eğer RNAnın DNAya retrotranskripsiyonunun ilk aşaması (RT-PCR, Reverse Traskriptaz PCR) bu teknik ile ilişkili ise, çalışmak ve bir RNA genomu ile belirlenen diziyi ya da patojenleri tanımlamak mümkündür. Spesifik prob eklenerek (Alel Spesifik/Reverse Dot blot) desteklenen işaretli amplifikasyon ürününün izleyen hibridizasyonu farklı viral genomların diferansiyasyonunu sağlar. Amplifikasyon ürünü işaretlemek için çeşitli metodlar vardır; amplifikasyon sırasında radyoaktif, digoksinli ya da biotinli nukleotidler kullanılarak. Bu nukletoidler, reaksiyon miskine ya da basitçe primerlere eklenebilir. Alel-spesifik hibridizasyon tekniği bir katı fazda hibridizasyondur ve hibridize nukleik asitleri görüntülemek için en uygun metoddur (Meinkoth e Wahl, 1984). Nukleik asit immobilizasyonu için çeşitli tipte filtreler mevcuttur: Nitroselüloz, tek iplikli DNA yüksek bağlanma kapasitesi (non kovalent) (500 nukleotidden uzun iplikler için 80 µg cm-2 ) fakat asit ve alkalilerin varlığında kırılgan; • Naylon, tek iplikli DNA yüksek bağlanma kapasitesi (kovalent ya da değil) (400 µg cm-2), fakat çift iplikli ve oligonukletoidlere de bağlanabilen; • Pozitif yüklü naylon, dördüncül amonyum grupları ile (pozitif yüklü), alkalin durumda denatüre DNAya kovalent ve geri dönüşümsüz bağlanma avantajı olan. • Filtre hibridizasyonu aşağıdaki aşamalardan oluşur: pag.11 03-07R-20_8033622780359_TR.doc Denatürasyon: İşaretli amplifikasyon ürünlerinin 95°C de inkübasyonu. • Hibridizasyon: Membran, spesifik ısıda, çalkalamada ve pHda olan işaretli amplifikasyon ürünü içeren solusyon ile inkübe edilmiştir; • Yıkama: Hibiridizasyon “şiddeti” sağlayan işaretli ürün fazlalığının uzaklaştırılması için gereklidir. • Kullanılan probun tipine bağlı olarak hibrid formunun belirlenmesi. • 9 ÜRÜN TANIMI HCV-TS kiti, biotinli viral bölgenin amplifiye DNası ile spesifik prob bağlı olan nitroselüloz striplerin reverse hibridizasyonu temeline dayanır. Bu kit aşağıdaki HCV tipleri ve alttiplerinin tanımlanması için dizayn edilmiştir: 1, 1a, 1b, 1c, 1d, 1f, 2, 2a, 2b, 2c, 3, 4, 5a, 6a, 7. Her bir olguda, diğer genotipler evrensel HCV probları için pozitif sonuçlanır. Strip, 5’ UTR ve Core bölgesindeki probların görülmesi sayesinde virus genotiplendirilmesine izin verir. Bu nedenle, hibridizasyon, amplifikasyon bölgesine bağlı olarak stripte paterni toplar. Eğer amplifiye bölge Core bölgesinde görülmezse, bu bölge ile ilişkili stripte tüm problar genotiplendirme için yararlı hiçbir hibridizasyon sinyali vermez; tersi sadece Core bölgesi içeren amplifiye bölgelerde görülür, fakat 5'UTR bölgesinde değil. Bu nedenle, HCV-TS kiti, HCV AMPLICOR kit ile gözlenen 5’-UTR bölgesinin biotinli amplifiye ürünleri ile yarışabilir; fakat bu durumda alttip 2ave 2c arasında ayırıma izin vermez, çünkü bu alttipler HCV AMPLICOR metodu ile amplifiye olmayan Core bölgesinde farklılaşır. AB ANALITICA srl Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: [email protected] 10 ÖRNEK MUAMELESİ VE SAKLAMA Başlangıç örneği HCV genomunun 5’-UTR bölgesinde amplifikasyonun biotinişaretli ürünüdür. HCV-TS metoduna başlamadan önce, amplifiye ürünler örnek pozitivitesinin doğrulanması için agaroz jel elektroforezi ile görüntülenmelidir. Amplifiye ürünler hibridizasyondan önce kısa bir süre için + 2°/+ 8°C de ya da uzun sure için – 20°C de saklanmalıdır. 11 PROSEDÜR 11.1 Ön Hazırlık • • • Agaroz jel elektroforezi ile örneklerin pozitivitesinin doğrulanması Su banyosunu 50°C de kurun; tüm deney boyunca sıcaklığın 50°C de olduğundan emin olun (maksimum hata aralığı: +/- 0.5°C). HCV-TS kitini kullanmadan önce, reaktifleri en az 30 dakika oda ısısında bırakın. NOT: • 50°C de su banyosunda Sıkı Yıkama Solusyonuve Hibridizasyon Solusyonunu ısıtın; • Her bir stripi pozisyon çizgisinin üstünde en altta bir numara ile kalemle işaretleyin. 11.2 Denatürasyon • • Amplifiye ürünler thermocyclerda 95°C de 5 dakika denature edin. Onları hemen buza koyun ve hibridizasyon ile devam edin (Roche HCV AMPLICOR amplifikasyon ürünleri aynı yolla yapılır, mavi denaturasyon solusyonu eklenmeden; alternatif olarak 100 μL Roche amplifikasyon ürünü yukarıdaki solusyon ile dentaüre edilir. Roche amplifikasyon ürünlerini Amperase ile denatürasyondan korumak için amplifikasyondan hemen sonra dondurmak gerekir). NOT: Daha iyi hibridizasyon etkisi görmek için denatüre edilmiş örnekleri hemen buz üzerine koymak önemlidir. • Trayi tutabilmek için ağırlık kullanın. pag.13 03-07R-20_8033622780359_TR.doc 11.3 Hibridizasyon: • • • • • • Denatürasyon aşaması sırasında, stripin içinde bulunduğu her bir kuyucuğa 2 mL önceden hazırlanmış Hibridizasyon Solusyonu ekleyin. 20 μL denatüre edilmiş örnek ekleyin (ya da mavisolusyon ile denatüre edilmiş 100 μL Roche amplifikasyon ürünü). Nitroselüloz stripin pozisyon çizgisinin üst tarafa baktığından ve tamamen solusyon içine batmış olduğundan emin olun. Trayi su banyosuna koyun, su seviyesi tray yüksekliğinin 1/3 olmalıdır: Suyun kuyucuklara sıçramadığından emin olun. (çapraz kontaminasyon ya da aspesifik sinyalden kaçının). 50°C de 60 dakika inkübe edin, dikkatlice karıştırın. Bu arada, analiz edilecek örnek sayısı ile Buffer 2 yi hazırlayın, aşağıdaki formülü kullanın: (2,5 mL Ön-Buffer 2 + 0,125 g Skim Milk) X N (N= örnek sayısı) NOT: Bu formül, bu protokolde kullanılacak tüm Buffer 2 miktarını içerir (2mL Buffer 2 ile inkübasyon ve konjugat hazırlama için). Ön-Buffer 2 solusyonunda çözülmüş Skim Milk her zaman taze Buffer 2 kullanmak için birine izin verir, geri dönüşümsüz presipitasyona neden olabilen tekrar tekrar soğutup-ısıtma aşamasından kaçının. 11.4 Sıkı yıkama • • • Aspirasyon ile sıvı içeriği uzaklaştırın ve 2 mL sıcak Sıkı Yıkama Solusyonu ekleyin, 50°C de 1 dakika sallayın. Bu aşamayı bir kez tekrar edin. Sıvıyı uzaklaştırın ve 2 mL sıcak Sıkı Yıkama Solusyonu ekleyin, sıcak su banyosunda 50°C de 10 dakika sallayın. AB ANALITICA srl Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: [email protected] 11.5 Kolorimetrik belirleme Boyama prosedürüoda ısısında, plate orbital shakera konularak yapılır. • • Sıkı Yıkama Solusyonunu aspire edin ve önceden hazırlanan ve iyice çalkalanan 2 mL Buffer 2 ekleyin. En az 10 dakika inkübe edin. Bu arada, konjugatı hazırlayın. N örneği için seyreltme: N x 1 μL Konjugat + N x 1.5 mL Buffer 1 ve N x 500μL Buffer 2 (önceden hazırlanan). • • Buffer 2 yi kuyucuklardan uzaklaştırın ve 2 mL konjugat ekleyin; çalkalayarak oda ısısında 30 dakika inkübe edin. Bu arada, aşağıda belirtildiği gibi Boyama Solusyonunu hazırlayın: 1 NBT/BCIP tableti 10 mL distile su içinde çözün. NOT: 1 NBT/BCIP tabletinden oluşan Boyama Solusyonu 5 strip için yeterlidir! Oluşturulan Boyama Solusyonu ışıktan uzakta tutulmalıdır. Taze hazırlanan solusyon kullanılması önerilir; eğer bu mümkün değilse, karanlıkta 3 günden uzun olmamak kaydı ile buzdolabında +2 / +8°C de saklanabilir (tüplerin aüminyum folyo ile kapatılması önerilir). Boyama Solusyonu hazırlanması aşamasında formamide kullanmaktan kaçının ( likit kromojenlerde bulunan toksik içeriktir). • • • • • • • Likiti uzaklaştırın ve 2 mL Buffer 1 ile 1 dakika yıkayın. Yukarıdaki aşamayı iki kez tekrar edin. Likiti uzaklaştırın ve 2 mL Buffer 3 ile 1 dakika yıkayın. Likiti uzaklaştırın ve önceden hazırlanan 2 mL Boyama Solusyonu ekleyin. Karanlıkta ve oda ısısında çalkalayarak, bantlar görünür olana kadar inkübe edin (yaklaşık 30 dakika). Eğer bantlar yeterince görünür olmazsa, boyama aşamasını buzdolabında bir gece bekleterek uzatın. Boyama aşamasını oda ısısında 5 dakika distile su ile inkübe ederek sona erdirin. Dikkatlice stripleri kurutun. Bir kere kuruduktan sonra, strip (karanlıkta) yıllarca saklanabilir. pag.15 03-07R-20_8033622780359_TR.doc 12 SONUÇLARIN YORUMLANMASI Sonuç yorumlama için referans tabloyu kullanın: Prob N° AÇIKLAMA 1 Boyama kontrol 2 Evrensel internal dizi 1 3 Evrensel internal dizi 2 4 Tip 1 (5’UTR) 5 Tip 1a (5’UTR) 6 Tip 1a (CORE) 7 Tip 1b (5’UTR) 8 Tip 1b (5’UTR) 9 Tip 1b (CORE) 10 Tip 1a/b (5’UTR) 11 Tip 1c (CORE) 12 Tip 1b/1f (CORE) 13 Tip 1d (CORE) 14 Tip 2 (5’UTR) ÇAPRAZ-HİBRİDİZASYON 6, 7,8,9 4, 6 4, 5, 7,9 9 4, 6 15 Tip 2a (5’UTR) 5 16 Tip 2a (5’UTR) 5 17 Tip 2a (CORE) 18 Tip 2b (5’UTR) 19 Tip 2b (5’UTR) 20 Tip 2b (CORE) 21 Tip 2c (CORE) 22 Tip 3 (5’UTR) AB ANALITICA srl Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: [email protected] 23 Tip 3 (UTR) 24 Tip 4 (UTR) 25 Tip 6a (UTR) 26 Tip 7 (CORE) PROBLAR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 1 + + + + 1 + + + + 1 1a 1a 1a 1a 1b 1b 1b 1b 1b 1b 1b 1b 1b 1b 1c 1d 1f 2 2 2a 2a 2a 2a 2b 2b 2b 2b 2c 2c 2c 2c 3 3 3 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + pag.17 03-07R-20_8033622780359_TR.doc 4 5a 6a 6a 6a 6a 7 7 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +/+ + + + + + + + +/- + + + + + + + + + + AB ANALITICA srl Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: [email protected] 13 SORUN GİDERME Boyama kontrol bandı haricinde BANT olmaması. • HCV örneği negatiftir. – Reverse hibridizasyon prosedüründen önce agaroz jel elektroforezi ile örneklerin HCV pozitivitesini doğrulayın. – Amplifikasyon sistemi, HCV-TS kitinin reverse hibridizasyon prosedürü ile uyumlu değildir. – Amplifikasyon ürünlerinin HCVnin 5’-UTR bölgesinde olduğunu teyit edin. – Amplifikasyon ürünlerinin biotinli olduğunu kontrol edin. Bazı amplifikasyon bantları boyama kontrolünün ve evrensel internaz dizi 1 ve 2 nin ötesindedir. • Sıkılık problemleri; – Su banyosu sıcaklığının 50°C de olduğundan ve sıcaklığın tüm deney boyunca sabit olduğundan emin olun (maksimum hata sınırı +/- 0.5°C); – Her bir kit komponentini belirtilen şekilde saklayın. – Kullanmadan önce Sıkı Yıkama Solusyonunu 50°C de ön-ısıtın; – Hibridizasyon kuyucuğuna su girebilir ve bu kontaminasyon ya da Sıkı kondisyonun değişmesi ile spesifik olmayan sonuçlara neden olabilir. • Bir ya da daha fazla solusyon kontamine olabilir; – – – – Reaktifleri amplifiye DNA kaynağından uzakta tutun; Rekatiflerin mikrop kontaminasyonundan sakının; Yeni bir lot numaralı reaktifler ile testi tekrar edin; Amplifikasyon sistemi, HCV-TS kitinin reverse hibridizasyon prosedürü ile uyumlu değildir. Soluk bantlar uzun süreli (tüm gece) inkübasyonlarından sonra görülebilir. pag.19 03-07R-20_8033622780359_TR.doc • Amplifiye DNA oldukça seyreltilmiştir. – Önerilen amplifikasyon sistemi nested PCR ürünleri ya da Roche amplifiye ürünlerdir. Herhangi bir şüphe ya da sorunuz olduğunda lütfen AB ANALITICA teknik destek ile bağlantıya geçin: [email protected], faks (+39) 049761698, ya da tel. (+39) 049-8709510. AB ANALITICA srl Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: [email protected] 14 TEST PERFORMANSI 14.1 Özgünlük Test özgünlüğü %99,9 dur. Genomik DNA ya dadiğer patojen mikroorganizmaların DNAları ile çapraz reaksiyonlar belirlenmemiştir. 15 REFERANSLAR Chen J-D et al., World J. Gastroenterol., 9 (5): 984-204; 2003 Choo et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Mar 15;88(6):2451-5 Jackson J. B. et al., J. Clin. Microbiol., 2387-2391a; 2002 Meinkoth, J. and Wahl, G. In Analytical Biochemistry, 138: 267, 1984 Mellor J. et al., J. Clin. Microbiol., 2525-2532 ; 1999 Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA and Arnheim N, Science 230, 1350-1354, 1985 Schoroter M. et al., J. Clin. Virol., 27 (2): 200-204; 2003 Simmonds P et al., Hepatology. 1994 May;19(5):1321-4 Simmonds P. et al., J. Gen. Virol., 82a: 693-712a; 2000 pag.21 03-07R-20_8033622780359_TR.doc 16 İLGİLİ ÜRÜNLER HCV-PM-BIO Retrotranskripsiyon için reaktifler, kullanıma hazır direk amplifikasyon tek-doz premiksler, nested PCR (biotinli nested primerler), TAq polymerase enzimi, agaroz jelde görüntüleme ve pozitif kontrol (rekombinant plazmid DNA) içerir. Kod 03-06-25 03-06-50 Ürün HCV-PM-BIO HCV-PM-BIO Pkg 25 test 50 test AB ANALITICA srl Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: [email protected]
