preeklampsili ve normal gebelerde anjiyotensin ıı tip 2 reseptör geni
advertisement
T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI PREEKLAMPSİLİ VE NORMAL GEBELERDE ANJİYOTENSİN II TİP 2 RESEPTÖR GENİ A1675G İLE İNTERLÖKİN 4 GENİ -590 (C>T) POLİMORFİZMLERİNİN VE GENOTİP DAĞILIMLARININ ARAŞTIRILMASI Lütfiye ÖZPAK YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMANI Doç. Dr. Ayfer PAZARBAŞI ADANA-2012 T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI PREEKLAMPSİLİ VE NORMAL GEBELERDE ANJİYOTENSİN II TİP 2 RESEPTÖR GENİ A1675G İLE İNTERLÖKİN 4 GENİ -590 (C>T) POLİMORFİZMLERİNİN VE GENOTİP DAĞILIMLARININ ARAŞTIRILMASI Lütfiye ÖZPAK YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMANI Doç. Dr. Ayfer PAZARBAŞI Bu tez, Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından TF2011YL3 nolu proje olarak desteklenmiştir. Tez No: ……….. ADANA-2012 Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Programı Çerçevesinde yürütülmüş olan “Preeklampsili ve Normal Gebelerde Anjiyotensin II Tip 2 Reseptör Geni A1675G ile İnterlökin 4 Geni -590 (C>T) Polimorfizmlerinin ve Genotip Dağılımlarının Araştırılması” adlı çalışma, aşağıdaki jüri tarafından Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Tez savunma tarihi: 14.12.2012 Doç. Dr. Ayfer PAZARBAŞI Çukurova Üniversitesi Tıp Fak. Tıbbi Biyoloji ABD Öğretim Üyesi Jüri Başkanı Prof. Dr. Fatma Tuncay ÖZGÜNEN Çukurova Üniversitesi Tıp Fak. Kadın Hastalıkları ve Doğum ABD Öğretim Üyesi Üye Prof. Dr. Mülkiye KASAP Çukurova Üniversitesi Tıp Fak. Tıbbi Biyoloji ABD Öğretim Üyesi Üye Yukarıdaki tez, Yönetim kurulunun …………...……. tarih ve ………….sayılı kararı ile kabul edilmiştir. Prof.Dr. Şeref ERDOĞAN Enstitü Müdürü ii TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim boyunca ve çalışmamızın her aşamasında beni destekleyen, yönlendiren ve motive eden, sorunların çözümüne hoşgörülü, sabırlı yaklaşımını ve etik anlayışını örnek aldığım danışmanım sayın Doç. Dr. Ayfer PAZARBAŞI’ na en derin saygı ve teşekkürlerimi sunuyorum. Bu tez çalışmasının yürütülmesinde yardım ve desteklerini esirgemeyen, Dr. Sabriye KOCATÜRK SEL’e, Öğr. Gör. Dr. Mehmet BertanYILMAZ’a ve yüksek lisans eğitimime katkıda bulunan Anabilim Dalımız değerli Öğretim Üyelerinden Prof.Dr. Mülkiye KASAP’a, Prof. Dr. Halil KASAP’a, Prof. Dr. Davut ALPTEKİN’ e, Prof.Dr. Osman DEMİRHAN’a, Anabilim Dalı Başkanımız Prof. Dr. Ümit LÜLEYAP’ a ve çalışma arkadaşlarıma tüm içtenliğimle teşekkür ederim. Çalışmamızda, tez örneklerimizin sağlanmasında katkıda bulunan Ç.Ü. Tıp Fakültesi Balcalı Eğitim ve Araştırma Hastanesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim dalı öğretim üyesi Prof. Dr. Fatma Tuncay ÖZGÜNEN’e ve Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim dalı asistanlarına ve çalışanlarına teşekkür ederim. İstatistik uygulamalarında yardımcı olan Uz. Bio. Nurşen KESER’ e teşekkür ederim. Bu tez çalışması TF.2011.YL3 numaralı proje ile Ç.Ü. Rektörlüğü Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. Bugünlere gelmemde büyük pay sahibi olan ve manevi desteklerini esirgemeyen sevgili annem, babam, abim, yengem ve yeğenlerime sonsuz sevgilerimi ve teşekkürlerimi iletiyorum. iii İÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY ii TEŞEKKÜR iii İÇİNDEKİLER iv ŞEKİLLER DİZİNİ vii ÇİZELGELER DİZİNİ ix SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ xi ÖZET xv ABSTRACT xvi 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİ 5 2.1. Plasental Orjinli Maternal Hastalıklar 5 2.2. PIH (Gebeliğe Bağlı Hipertansiyon) 7 2.3. Helpp 7 2.4. Preeklampsi 7 2.4.1. Preeklampsinin Tanımı ve Sınıflandırılması 7 2.4.2. Preeklampsinin Tarihçesi 9 2.4.3. Preeklampside Risk Faktörleri 9 2.4.4. Preeklampsinin Etiyolojisi 11 2.4.5. Preekalmpsinin Patofizyolojisi 12 2.4.6. İnsidans, Prevalans, Mortalite ve Morbidite 15 2.4.7. Preeklampsinin Tedavisi 15 2.5. Sitokinler 16 2.5.1. Sitokinlerin Genel Özellikleri 16 2.5.2. Sitokin Ailesi ve İşlevleri 17 2.5.3. İnterlökin-4 (IL-4) 18 2.6. Renin Anjiyotensin Aldosteron Sistemi (RAAS) ve Anjiyotensin II 19 2.6.1. Anjiyotensin II Tip 2 Reseptör (AT2-R) Geni Yapısal Özellikleri 20 2.6.2. AT2-R Geni Transkripsiyonu ve Ekspresyonu 20 2.7. Preeklampsinin Genetiği 22 2.7.1. Aile Çalışmaları 23 iv 2.7.2. İkiz Çalışmaları 25 2.7.3. Segregasyon Analizi 25 2.7.4. Linkaj Analizi 26 2.7.5. Asosiyasyon Çalışmaları ve Aday Genler 27 2.7.6. Çalışmalarda En Sık Rastlanan Aday Genler 28 2.7.7. Fetal Genotipin Katkısı 29 2.7.8. Paternal Genotipin Katkısı 30 2.7.9. Epigenetik Mekanizmalar 31 2.7.10. AT2-R Geni Polimorfizmleri 32 2.7.11. IL-4 Geni Polimorfizmleri 33 3. GEREÇ VE YÖNTEM 34 3.1. Araç ve Gereçler 34 3.1.1. Kimyasal Malzemeler 34 3.1.2. Cihazlar ve Teknik Malzemeler 35 3.2. Kan Örneklerinin Sağlanması 35 3.2.1. Hasta Rızası 36 3.3.Yöntem 36 3.3.1. Periferik Kandan DNA Eldesi 36 3.3.2. Agaroz Jelin Hazırlanması 37 3.3.3. Örneklerin Agaroz Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi 38 3.3.4. Örneklerin Poliakrilamid Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi 38 3.3.5. PZR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) Yönteminin Uygulanması 40 3.3.5.1. AT2-R A1675G Polimorfizmi İçin PZR Yönteminin Uygulanması 41 3.3.5.2. IL-4 Geni -590 C>T Polimorfizmi İçin PZR Yönteminin Uygulanması 42 3.3.6. Restriksiyon Parça Uuznluk Polimorfizmi (RFLP) Yönteminin Uygulanması 44 3.3.7. İstatistiksel Analiz 45 46 4. BULGULAR 4.1. Klinik Bulgular 46 v 4.2. Moleküler Bulgular 47 4.2.1. AT2-R Geni A1675G Polimorfizmi için Moleküler Genetik Bulgular 47 4.2.2. IL-4 Geni -590 C>T Polimorfizmi için Moleküler Genetik Bulgular 53 5. TARTIŞMA 58 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 64 KAYNAKLAR 66 EKLER 73 ÖZGEÇMİŞ 78 vi ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1: Plasenta Kökenli, Maternal Kaynaklı Hipertansiyon Ve Proteinuri Gibi Klinik Bulguların Eşlik Etmesi İle Meydana Gelen Hastalıklar Şekil 2: Preeklampsi Tanı Kriterleri. 6 8 Şekil 3: Preeklampside Maternal Ve Fetal Risk Faktörleri 11 Şekil 4: Preeklampsinin Genetik, Çevresel Nedenleri Ve Patofizyolojisinde Rol Oynayan Temel Mekanizmalar 13 Şekil 5: Renin Anjiyotensin Sisteminde ANG II Reseptörleri Ve Fonksiyonları 20 Şekil 6: AT2R Geni PZR İle Çoğaltılan 310 Baz Çiftlik Bölge 41 Şekil 7: IL-4 Geni 196 Baz Çiftlik PZR Çoğaltılan Bölge 43 Şekil 8: Kontrol Grubuna Ait Bazı Örneklerin, AT2R Geni İntron 1 Ve Ekson 2 Arasındaki 310 Bç. Uzunluğundaki Bölgenin PZR Yöntemi İle Çoğaltılıp Agaroz Jelde Yürütüldükten Sonra Oluşturdukları Bant Görüntüleri 47 Şekil 9: Hasta Gruba Ait Bazı Örneklerin, AT2R Geni Geni İntron 1 Ve Ekson 2 Arasındaki 310 Bç. Uzunluğundaki Bölgenin PZR Yöntemi İle Çoğaltılıp Agaroz Jelde Yürütüldükten Sonra Oluşturdukları Bant Görüntüleri 48 Şekil 10: Hasta Ve Kontrol Gruplarına Ait Bazı Örneklerin RFLP Yöntemi İle (HYP 188 III Enzimi İle) Kesilip, Agaroz Jelde Yürütüldükten Sonra Oluşturdukları Bant Görüntüleri 48 Şekil 11: Hasta Ve Kontrol Gruplarına Ait Bazı Örneklerin RFLP Yöntemi İle (HYP 188 III Enzimi İle) Kesilip, Agaroz Jelde Yürütüldükten Sonra Oluşturdukları Bant Görüntüleri 49 Şekil 12: Hasta Gruba Ait Bazı Örneklerin, IL4 Geni -590 Bölgesini İçeren 196 Baz Çifti Uzunluğundaki Bölgenin PZR Yöntemi İle Çoğaltılıp Agaroz Jelde Yürütüldükten Sonra Oluşturdukları Bant Görüntüleri 53 Şekil 13: Hasta Ve Kontrol Gruplarına Ait Bazı Örneklerin RFLP Yöntemi İle (Ava II Enzimi İle) Kesilip, Poliakrilamid Jelde Yürütüldükten Sonra Oluşturdukları Bant Görüntüleri vii 54 Şekil 14: Hasta Ve Kontrol Gruplarına Ait Bazı Örneklerin RFLP Yöntemi İle (Ava II Enzimi İle) Kesilip, Poliakrilamid Jelde Yürütüldükten Sonra Oluşturdukları Bant Görüntüleri viii 54 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1: Sitokinler ve işlevleri 17 Çizelge 2: AT2-R geni yeri, yapısı, düzenlenmesi ve fonksiyonu 23 Çizelge 3: Preeklampsi ile ilgili yapılan aile çalışmaları, yapıldıkları yıllar, çalışmacılar, çalışmaya ait sonuçlar ve yorumlar 24 Çizelge 4: Pereeklampsi ile ilgili yapılan linkaj çalışmaları 27 Çizelge 5: Preeklampsi ile ilgili aday genler 29 Çizelge 6: AT2R geni intron 1 ve exon 2 arasındaki bölgenin amplifikasyonu için gerekli primer çiftleri 41 Çizelge 7: AT2R geni intron 1 ve exon 2 arasındaki bölgenin optimal amplifikasyonlarının gerçekleşmesinde kullanılan maddeler ve miktarları42 Çizelge 8: AT2R geni intron1 ve exon 2 arasındaki bölgenin optimal amplifikasyonlarının gerçekleştiği PCR programı ısı döngüleri Çizelge 9: IL4 geni 5’ UTR bölgesinin amplifikasyonu için gerekli primer çiftleri 42 43 Çizelge 10: IL4 geni -590 C>T polimorfizmi için optimal amplifikasyonlarının gerçekleşmesinde kullanılan PCR reaksiyon koşulları 44 Çizelge 11: IL4 geni -590 C>T polimorfizmi için optimal amplifikasyonlarının gerçekleştiği PZR programı ısı döngüleri 44 Çizelge 12: AT2R geni G1675A ve IL4 geni -590 C>T polimorfizmleri için RFLP reaksiyon koşulları 45 Çizelge 13: AT2R geni G1675A ve IL4 geni -590 C>T polimorfizmleri için RFLP reaksiyonu ısı döngüleri. 45 Çizelge 14: Preeklampsili ve sağlıklı kontrol gruplarına ait klinik özelliklerin ortalamaları ve p değerleri 47 Çizelge 15: Preeklamptik grubun AT2R geni 1675 bölgesi için Hyp 188 III enzimi ile kesimi sonucunda elde edilen genotipleri 50 Çizelge 16: Kontrol grubunun AT2R geni 1675 bölgesi için Hyp 188 III enzimi ile kesimi sonucunda elde edilen genotipleri 51 Çizelge 17: AT2R geni 1675 bölgesi için hasta ve kontrol gruplarına ait genotip frekansları 52 ix Çizelge 18: AT2R geni 1675 bölgesi için hasta ve kontrol gruplarına ait allel frekansları 52 Çizelge 19: Preeklamptik grubun IL-4 geni -590 bölgesi için Ava II enzimi ile kesimi sonucunda elde edilen genotip kodları 55 Çizelge 20: Kontrol grubunun IL-4 geni -590 bölgesi için Ava II enzimi ile kesimi sonucunda elde edilen genotip kodları 56 Çizelge 21: IL-4 geni -590 bölgesi için hasta ve kontrol gruplarına ait genotip frekansları 57 Çizelge 22: IL-4 geni -590 bölgesi için hasta ve kontrol gruplarına ait allel frekansları 57 Çizelge 23: Afro-Karayip, Asya, Kafkas ve Türk populasyonlarına ait AT2R geni 1675 bölgesi için preeklampsi ve kontrol grubu genotip dağılımları 60 Çizelge 24: Afro-Karayip, Asya, Kafkas ve Türk populasyonlarına ait AT2R geni 1675 bölgesi için preeklampsi ve kontrol grubu allel frekansları 60 Çizelge 25: Çalışmamız ve R.Fraser ve arkadaşlarının yaptığı çalışmaya ait IL-4 geni -590 bölgesi C>T polimorfizmi için preeklampsi ve kontrol grubu genotip ve allel frekansları 62 Çizelge 26: Çalışmamız ve R. Fraser ve arkadaşlarının yaptığı çalışmanın sonuçlarının toplamına ait IL-4 geni -590 bölgesi C>T polimorfizmi için preeklampsi ve kontrol grubu genotip ve allel frekansları x 63 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ADE Anjiyotensin Dönüştürücü Enzim AGT Anjiyotensinojen ANG II Anjiyotensin II Arg Arginin Asp Aspargin AT1-R Anjiyotensin II Tip 1 Reseptör Geni AT2-R Anjiyotensin II Tip 2 Reseptör Geni APS Amonyum Persülfat Bç/bp Baz Çifti ºC Santigrat Derece Ca Kalsiyum cAMP Siklik Adenozin Monofosfat cDNA Komplementer Deoksiribonükleik Asit CpG Sitozin-fosfat-Guanin CaCO3 Kalsiyum Karbonat CaF Kalsiyum Florür cm Santimetre del Delesyon dk Dakika DNA Deoksiribonükleik Asit dNTP Deoksi Nükleotit Tri Fosfat EDTA Etilen Diamin Tetra Asetik Asit EtBr Etidiyum Bromür F2 Faktör 2 F5 Faktör 5 Leiden g Gram G-CSF Granülosit Koloni Uyarıcı Faktör Gm-CSF Granülosit-Makrofaj Koloni Uyarıcı Faktör HIF 1α Hipoksi Uyarıcı Faktör 1 Alfa HLA İnsan Lökosit Antijeni xi IFN γ İnterferon Gama IgE İmmünoglobulin E IL-1 İnterlökin 1 IL-1 β İnterlökin 1 Beta IL-2 İnterlökin 2 IL-3 İnterlökin 3 IL-4 İnterlökin 4 IL-5 İnterlökin 5 IL-6 İnterlökin 6 IL-7 İnterlökin 7 IL-8 İnterlökin 8 IL-9 İnterlökin 9 IL-10 İnterlökin 10 IL-11 İnterlökin 11 IL-12 İnterlökin 12 K Potasyum kDa Kilodalton kg Kilogram L Litre LDL Düşük Yoğunluklu Lipoprotein LT Lenfotoksin M-CSF Monosit-Makrofaj Koloni Uyaran Faktör MCP Monosit Kemotatktik Protein mg Miligram MgCl2 Magnezyum Klorür MgPO4 Magnezum Fosfat mmHg Milimetre Civa ml Mililitre μl Mikrolitre mM Milimolar M Markır mRNA Mesajcı Ribonükleik Asit xii MTHFR Metilentetrahidrofolat Redüktaz M Molar n Birey Sayısı NaCl Sodyum Klorür ng Nanogram NK Natural Killer NHBPEP National High Blood Presure Education Program NOS3 Nitrik Oksit Sentetaz 3 P Fosfat PAGE Poliakrilamid Jel Elektroforezi PC12 Sıçan Feokromositom Hücre Hattı PE Preeklampsi PIH Gebeliğe Bağlı Hipertansiyon pmol Pikomol PKC Protein Kinaz C PZR Polimeraz Zincir Reaksiyonu RAS Renin Anjiyotensin Sistem RAAS Renin Anjiyotensin Aldosteron Sistem RFLP Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi Rh Rhesus Faktör rpm Dakikadaki Devir Sayısı R3T3 Fare Fibroblast Hücre Hattı SDS Sodyum Dodesil Sülfat SNP Tek Nükleotid Polimorfizm SERPIN B5 Serpin Peptidaz İnhibitörü B5 Grubu TBE Tris Borat EDTA TE Tris EDTA TEMED Tetrametilendiamin TGF β Transforming Büyüme Faktörü Beta TNF α Tümör Nekroz Faktör Alfa TH2 T yardımcı Hücreleri VCAM Damar Hücresi Adezyon Molekülü xiii VLDL Çok Düşük Dansiteli Lipoprotein VSMC Vasküler Düz Kas Hücreleri xiv ÖZET Preeklampsili ve Normal Gebelerde Anjiyotensin II Tip 2 Reseptör Geni A1675G ile İnterlökin 4 Geni -590 (C>T) Polimorfizmlerinin ve Genotip Dağılımlarının Araştırılması Gebeliklerin yaklaşık %3-5’ inde görülen, oluşumunda maternal, plasental, immün ve genetik faktörlerinrol oynadığı, hipertansiyon ve proteinuri ile tanısı konulan insan gebeliğine özgü ciddi bir rahatsızlıktır. Gebeliğin fizyolojisinde yer alan birçok biyolojik yolakta etkili pek çok genin preeklampsinin kalıtımında çeşitli rollere sahip olduğu düşünülmektedir. Yapılan farklı tipte çok sayıda genetik çalışma, preeklampsinin genetik kökeni ile ilgili bilmeceyi çözmek için yeterli değildir. Bu çalışmada 131 preeklampsili gebe ve 86 sağlıklı gebe, preeklampsi ile anjiyotensin 2 tip II reseptör geni (AT2-R) A1675G ve interlökin 4 (IL-4) geni -590 C>T polimorfizmleri arasındaki ilişki bakımından araştırılmıştır. Ayrıca çalışmamızda bu polimorfizmlere ait genotip ve allel frekanslarının normal ve preeklamptik olgulardaki dağılımı incelenmiştir. Çalışma sonuçlarımıza göre preeklamptik ve normal gebe kadınlar genotip frekansları bakımından karşılaştırıldığında anlamlı bir fark belirlenmemiştir. AT2-R geni 1675 polimorfizmi bakımından preeklamptik kadınlarda A alleline sahip olguların, normal gebe kadınlardan daha yüksek olduğu belirlenmiştir. (p=0.033). AG+AA genotipleri frekansı, GG genotipi frekansı ile karşılaştırıldığında GG genotipi preeklamptik grupta %78.5 iken, kontrol grubunda %89.5 olarak bulunmuştur. Bu genotipler bakımından hasta ve kontrol grubu arasında anlamlı bir farklılık saptanmıştır (p=0.034). IL-4 geni -590 polimorfizminde genotip (p=0.456) ve allel (p=0.310) frekansları açısından istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık saptanmamıştır Sonuç olarak, gelecekteki çalışmalarda preeklampsi ile ilişkili olabileceği düşünülen genler ile polimorfizmler daha geniş çalışma gruplarında değerlendirilmelidir. Anahtar Sözcükler: Preeklampsi, Anjiyotensin II Tip 2 Reseptör Geni, İnterlökin 4 Geni, Polimorfizm xv ABSTRACT Investigation of Angiotensin II Type 2 Receptor Gene A1675G and Interleukin 4 Gene -590 (C>T) Polymorphisms and Genotype Distribution in Preeclampsia and Normal Pregnancies Preeclampsia, specific to human pregnancies, is a serious disorder which occurs approximately in 3-5% of all pregnancies. It is a complex disorder, in which immune and genetic factors also take part. Preeclampsia is particularly diagnosed with hypertension and proteinuria. The genes, which function in the biological pathways in the physiology of pregnancy, are thought to have several roles in the genetics of preeclampsia. Although there have been a great deal of genetic studies, there is not sufficient data available to solve the riddle of the genetic origins of preeclampsia. In this study, 131 preeclamptic and 86 normotensive pregnant women were investigated in terms of the relationship between preeclampsia and angiotensin II type 2 receptor gene (AT2-R) A1675G / interleukin 4 (IL-4) Gene -590 (C>T) polymorphisms. Furthermore, the distribution of genotype and allele frequencies related to these polymorphisms in normal and preeclamptic women were also evaluated. According to our results, there was not significant difference with respect to genotype and allel frequencies between preeclamptic and normotensive pregnant women. As for AT2-R gene 1675 polymorphism A allel was found significantly higher in preeclamptic women than normotensive pregnant women (p=0.033). When AA+AG genotype frequencies were compared to GG genotype frequency; GG genotype was found to be 78.5% in the preeclamptic group and, 89.5% in normotensive group. There was a significant difference in terms of these genotypes between preeclamptic and normotensive pregnant women (p=0.034). As for IL-4 gene -590 polymorphism, there was not significant difference in terms of genotype (p=0.456) and allele (p=0.310) frequencies. In conclusion, broader sample size, different genes and their polymorphisms that could be related to preeclampsia should also be investigated in future studies. Key Words: Preeclampsia, Angiotensin II Type 2 Receptor Gene, Interleukin 4 Gene, Polymorphism xvi 1. GİRİŞ Plasental kökenli maternal hastalıklardan birisi olan preeklampsi; gebeliğin ikinci yarısından itibaren ortaya çıkan, gebeliklerin yaklaşık % 7-10’ nunda görülen maternal ve perinatal mortaliteye sebep olan ciddi bir gebelik dönemi hastalığıdır1-10. Preeklampsinin fetal yansıması, intrauterin gelişme geriliği ve amniyotik sıvıda azalmadır1. Klinik belirtiler açısından preeklampsinin maternal yansıması ise, gebeliğin 20. haftasından sonra ortaya çıkan hipertansiyon, bunu takip eden proteinuri ve ödemdir1-10. Preeklampsi için NHBPEP (National High Blood Pressure Education Program)’ ın 2000 yılında yaptıkları çalışma raporlarına göre, tanımlama ve sınıflandırma kriterleri kullanılmaktadır. Bu rapora göre, hastalık normotensif kadınlarda 20. gebelik haftasından sonra, kan basıncının ≥ 140/90 mm-Hg ölçülmesi ve 24 saatlik idrarda protein atımının ≥ 300 mg olması ve eşlik eden ödem gibi klinik bulgulara sahiptir11. Gebeliğe bağlı hipertansif hastalıklar tanı kriterlerine göre 5 alt grupta toplanmıştır. Bunlar gestasyonel hipertansiyon, kronik hipertansiyon, süperempoze preeklampsi, preeklampsi ve eklampsidir11-17. Preeklampsi kendi içinde hafif ve ağır grup olarak ikiye ayrılır. Ağır preeklampside, kan basıncı ölçümlerinin ≥ 160mmHg/110mmHg olması, 24 saatlik idrarda ≥ +3 proteinuri saptanması, oligüri, görme bozuklukları, pulmoner ödem, epigastrik ağrı, karaciğer fonksiyonlarının bozulması, trombositopeni, fetal büyüme geriliği gözlenir. Bu bulguların dışında kalan hastalar hafif preeklamptik olarak adlandırılır. Eski çağlarda preeklampsi ve eklampsinin gebelik dönemine ait bir hastalık olduğu bilinmiyordu. Vaquez ve Nobecart’ ın preeklampside hipertansiyonu keşfetmesi ile preeklampsi semptomları belirlenmeye başladı12,18. Preeklampsi için tanımlanan yüksek risk faktörleri; ilk gebelik, ileri anne yaşı, önceki gebeliklerde preeklampsi öyküsü, obezite, hipertansiyon, diabet gibi hastalıklara sahip olmak, Afrikan- Amerikan ırkından olmak şeklinde belirlenmiştir19-22. Yapılan çalışmalara rağmen preeklampsinin etiyolojisi hala bilinmemektedir. Ancak trofoblastik dokunun varlığında ortaya çıktığı için maternal ve fetal/plasental kökenli olduğu bilinmektedir. Myometriumdaki arterlerin trofoblast invazyonunda 1 problem olan gebeliklerde azalmış plasental akım, bunun sonucunda da preeklampsi ve intrauterin gelişme geriliği gözlenmektedir23. Preeklampsinin tanı kriterleri belirlenmiş ve sınıflandırılmış olmasına rağmen etiyolojisi ve patofizyolojisi hala açık değildir. Preeklampsi patofizyolojisinde rol oynayan 2 temel mekanizma belirlenmiştir. Bunlar spiral arterlerdeki yetersiz endovasküler sitotrofoblast invazyonu ve endotel hücre hasarıdır24,25. Preeklampsinin etiyopatogenezinde, plasentasyonda maternal vasküler cevapta yetersizlik 26 düşünülmektedir . Normal gebelikte, büyüyen fetüsün ihtiyaçlarını karşılamak için elastik müsküler arterler çaplarını arttırıp yüksek akımlı düşük rezistans sistemine geçerler, preeklampside ise bu durum gerçekleşmez27. Preeklampsideki endotel hücre hasarını hangi faktörün başlattığı henüz netlik kazanmamıştır. Ancak endotel hücre hasarına neden olan faktörler arasında oksidatif stres ve inflamatuvar cevap suçlanmaktadır. İnflamatuvar sitokinlerin uyarısı ile endotel hücrelerdeki çeşitli moleküllerin gen ekspresyonu artar5. Oksidatif stres, lipid peroksidasyonunu, protein ve DNA hasarını indüklemektedir28-31. Son yapılan çalışmalarda preeklampsinin altında yatan sebepler arasında genetik ve immün faktörler önemli bir yer tutmaktadır5,6. Preeklampsi insidansı ırk, bölge ve ülkelere göre değişmekle beraber tüm gebeliklerin yaklaşık %7-10’u civarındadır32-37. Etnik kökene bağlı olarak farklılık göstermekte olan preeklampsi insidansı, siyahi kadınlarda %5.2, İspanyol asıllı kadınlarda %4, yerli Amerikan kadınlarda %3.9, beyaz kadınlarda %3.8, Asyalı kadınlarda ise %3.5‘ tur38. Preeklampsi tanısı konur konmaz en kesin tedavi yöntemi doğumdur. Doğuma karar verirken hastalığın ağırlık derecesi, maternal/fetal durum, gebelik yaşı, doğum eyleminin varlığı göz önünde bulundurulur39-43. Preeklampsi ailesel yatkınlık ile genetiğin de desteklediği multifaktoriyel bir sendromdur. Sağlıklı bir gebelik, annenin normal savunma mekanizmasına sahip olmasına bağlıdır44-47. Renin anjiyotensin sistemi (RAS); su-tuz dengesinin ayarlanmasında, preeklampsinin patofizyolojisinin belirlenmesinde çok önemlidir. Ayrıca normal gebelikte damar direnci, kan basıncı, plazma volümü azaldığından dolayı RAS’ ın uyarısı sonucu plazma renin aktivitesi, anjiyotensin II (AngII) ve aldosteron seviyesinde artışa neden olur. Fakat preeklampsili gebeliklerde plazmada anjiyotensinojenin yüksek 2 molekül ağırlıklı formu artarken, AngII ve renin seviyesi azalır. RAS’ ın vazoaktif elementlerindeki bu değişiklikler PE’ nin patofizyolojisinde önemli bir rol oynar. Kan basıncı düştüğünde böbrekteki jukstaglomerüler hücreler renin salgılarlar. Renin anjiyotensinojenden, anjiyotensin I oluşumunu uyarır. Anjiyotensin I ise anjiyotensin dönüştürücü enzim ile anjiyotensin II’ ye dönüştürülür48-63. Preeklampsi genetiğinin şekillenmesinde 2 temel durum vardır. Birincisi preeklampsi esnasında genlerin eksprese oldukları yer, zaman ve ekspresyon profilleri. İkincisi ise preeklampsili ve kontrol grubuna ait ekspresyon profilleri arasındaki farklar64. Preeklampsi gibi multifaktoriyel hastalıklarda tek nükleotid polimorfizmlerine (SNP) daha sık rastlanmaktadır. Çalışmalarda yer alan, bir genin promotor, enhansır, represör, regülatör, intron, ekson ve kodon gibi belirli bir bölgesinde bulunan SNP’ deki bir fark, direk bir biyokimyasal sonuç doğurabilir. Bu durum preeklampsinin patofizyolojisi ve etkileri konusunda bilgi sahibi olunmasını sağlar65,66. Preeklampsi genetiği ile ilgili aile çalışmaları, ikiz çalışmaları, segregasyon analizi, linkaj analizi, asosiyasyon çalışmaları ve aday genlerin belirlenmesi, fetal genotipin katkısı, paternal genotipin katkısı, epigenetik mekanizmalar gibi çalışmalar üzerine yoğunlaşmıştır64-100. Preeklampsi ile ilgili yapılan asosiyasyon çalışmalarında 70’ ten fazla gen incelenmiş ancak araştırmalar biyolojik hipotezlere dayanarak ve preeklampsiye olan katkıları değerlendirilerek yaklaşık 7 gen belirlemişlerdir. Bu genler; MTHFR (Metilenhidrofolat Redüktaz), F5 (Faktör 5 Leiden), AGT (Anjiyotensinojen), HLA (İnsan Lökosit Antijeni), NOS3 (Nitrik Oksit sentetaz 3) , F2 (Faktör 2) ve ACE (Anjiyotensin Dönüştürücü Enzim)’ dir64. AT2-R geni; anjiyotensin II’ nin alt tipi olup, büyümeyi inhibe edici, damar çapını arttırıcı, antihipertrofik ve proapoptotik etkileri mevcuttur. Normal feto-plasental gelişim, AT2-R ve anjiyotensin II’nin diğer alt tipi olan AT1-R genlerinin düzenli eksprese olmasını ve taşınmasını gerektirir101-105. Savunma sisteminde yer alan sitokinlerden birisi olan interlökin 4 (IL-4), plasental dönemde meydana gelir. IL-4 seviyesi preeklampsiye hassasiyeti etkileyebilir106-110. Bu tez çalışmasında preeklampsi ile AT2-R ve IL-4 genleri arasındaki ilişkinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada preeklampsili ve normal gebelerden alınan kanlardan izole edilen DNA örnekleri, AT2-R geni A1675G polimorfizmi ve IL-4 geni - 3 590 C>T değişimi açısından PCR-RFLP yöntemi kullanılarak analiz edilmiştir. Bu çalışma ile Türk toplumunda preeklampsi hastalığı ile bu polimorfizmler arasındaki ilişki ve genotip dağılımları belirlenmiştir. Bu sayede IL-4 geninin -590 ve AT2-R geninin 1675 bölgesindeki polimorfizmlerin Türk toplumundaki preeklamptik kadınlar daki insidansı ortaya çıkarılmıştır. 4 2. GENEL BİLGİ 2.1. Plasental Orjinli Maternal Hastalıklar Plasenta anneyle bebek arasındaki besin, oksijen ve diğer maddelerin alışverişini sağlayan yapıdır. Plasenta, yeni hücre gruplarının yani dokuların oluşması için gerekli olan besinleri ve oksijeni fötüse taşırken, atık maddeleri ayırarak annenin vücuduna gönderir. Normal gebelikte plasentaya maternal kan akımını sağlayan spiral arterlerde hayati önem taşıyan değişiklikler olur. Bunlara ‘’gebeliğin fizyolojik değişiklikleri’’ denir1,2. Plasenta oluşurken ekstravillöz trofoblastlar interstisiyel ve intravasküler invazyon yaparlar, bu invaze trofoblast hücrelerinin damara gömülmüş endotel hücrelerine dönüşmesinin (damardaki trofoblast duvara dahil olarak vasküler endotele penetre olur) etkisiyle damar duvar değişiklikleri ortaya çıkar. Desiduayı besleyen spiral arterlerin damar duvarındaki düz kas ve elastik lifleri fibrinoid bir materyalle yer değiştirirler. Bu vasküler değişikliklerle çok sayıda spiral arteriol intervillöz mesafede, genişlemiş, birbirleriyle irtibatlı olan, çeperleri kavisli, huni şekilli damarlar haline gelir. Vasküler düz kasın yokluğunda bu damarlar vazoaktif ajanlara kontraksiyonla cevap veremez ve kan akımı artar1-6. Bu endovasküler invazyon myometriumda da devam eder ve myometriumun iç 1/3 tabakasındaki spiral arterler de benzer değişikliğe uğrayarak artmış uteroplasental akıma katkıda bulunur. Preeklampside desiduadaki damarlar orijinal yapılarını kısmen korur, düz kas ve elastik lifler kaybolmaz, bu nedenle gereken bu değişiklikleri gösteremediği için dolaşım yetersiz olur, plasentasyon yüzeysel ve yetersizdir. Bu histopatolojik değişiklikler plasenta yatak biyopsilerinde gösterilmiştir7. Bu değişmemiş damarların bazısı akut aterosis gösterir, damar obstruksiyonları ve infarktüsler görülebilir8. Normal gebelikte olması gereken myometriumdaki spiral arterlerdeki müsküler ve elastik yapı kaybı görülmez, bu damarlar düz kaslarını koruyarak hormonal etkiye yanıtsız kalır, gereken değişiklikleri göstermezler. Sonuç olarak uteroplasental dolaşım yetersizliği ortaya çıkar. Plasenta kökenli maternal hastalıklar, plasentada meydana gelen bozukluğun yanı sıra, eşlik eden klinik bulgulara göre farklı gruplara ayrılırlar. Maternal kaynaklı 5 olan hipertansiyon ve proteinuri gibi klinik bulguların eşlik etmesi ile şekillenen hastalıklar 4 alt grupta toplanır1 (Şekil 1). Şekil 1: Plasenta kökenli, maternal kaynaklı hipertansiyon ve proteinuri gibi klinik bulguların eşlik etmesi ile meydana gelen hastalıklar1 (PIH: Gebeliğe bağlı hipertansiyon). Gebeliğe bağlı hipertansiyon bir multiorgan hastalığıdır ve semptomlar bu tutulumlara bağlı oluşur. Preeklampside böbrek tutulumu (proteinüri); eklampside 6 santral sinir sistemi tutulumu (nöbetler); HELLP sendromunda hemoliz, karaciğer enzimlerinde yükseklik ve trombosit sayısında azalma ön plandadır9. 2.2. PIH (Gebeliğe Bağlı Hipertansiyon) Gebelikte görülen hipertansiyondur. Önceden hipertansiyonu olmayan ve ilk 20 haftalık takiplerde tansiyon değerleri normal seyreden anne adaylarında saptanan tansiyon yüksekliğinde, gebeliğin neden olduğu hipertansiyon tanısı konur10. 2.3. Hellp Pre-eklamsi ile beraber veya proteinüri ve hipertansiyon olmadan da %20 oranında izlenir. Hastalığın teşhis kriterleri hemoliz, karaciğer enzimlerinde artış, trombositopeni olarak belirlenmiştir9,11. 2.4. PREEKLAMPSİ 2.4.1. Preeklampsinin Tanımı ve Sınıflandırılması Preeklampsiye ait evrensel bir tanım bulunmamakla birlikte gebelikte görülen hipertansiyonla ilgili değişik terminoloji ve sınıflandırmalar kullanılmıştır. 2000 yılında NHBPEP (National High Blood Pressure Education Program)’ ın çalışma raporlarına göre yaptıkları tanımlama ve sınıflandırma kriterleri kullanılmaktadır12. Bu rapora göre, gebelikten önce normotensif olan bir kadının gebeliğinin 20. haftasından sonra hipertansiyon ve eşlik eden proteinuri gibi klinik bulguları taşıması ile görülen gebeliğe özgü bir hastalıktır12. Gebeliğe bağlı hipertansif hastalıklar tanı kriterlerine göre 5 alt grupta toplanmıştır. 1. Gestasyonel Hipertansiyon: Geçici veya gebeliğin indüklediği hipertansiyondur (PIH). Normal kan basıncına sahip bir kadında gebeliğin 20. haftasından sonra ortaya çıkan hipertansiyon (sistolik kan basıncı ≥140mm-Hg ve diastolik kan basıncı ≥90mmHg) , proteinurisi olmayan olgulardır13. 7 2. Kronik Hipertansiyon: Gebelikten önce kan basıncının 140/90 mm-Hg’nın üzerinde olduğu, gebeliğin 20. haftasından sonra tansiyonun bu değerlerin de üzerine çıkması ve doğumdan 6 hafta sonrasına kadar bu şekilde seyretmesidir13. 3. Kronik hipertansiyon zemininde gelişen preeklampsi (Süperempoze preeklampsi): Kronik hipertansiyon tanısı konmuş bir gebede 20. gebelik haftasından sonra kan basıncının yükselmesi ve buna proteinüri durumunun eklenmesidir. Kronik hipertansif bir gebede preeklampsi gelişmesi, gebe için önemli bir tehlikedir. Kronik hipertansif gebelerin %25 ve fazlasında kronik hipertansiyon zemininde gelişen preeklampsi görülür14. Kronik hipertansiyonu olan gebeler, tipik olarak 24. gebelik haftasından sonra daha da kötüleşir ve kronik hipertansiyon olmadan preeklampsi gelişen gebelere göre daha ağır bir tablo sergileyebilirler15. 4. Preeklampsi: Preeklampsi gebeliğe özgü olarak, çoğunlukla ilk gebeliği olan kadınlarda ve 20. haftadan sonra ortaya çıkmaktadır. Genel olarak preeklampsi tanı kriterleri aşağıdaki Şekil 2’ de verilmiştir16. 20. gebelik haftasından sonra daha önce normal kan basıncına sahip kadınlarda, sistolik kan basıncının 140 mm-Hg ve üzeri ve/veya diastolik kan basıncının 90 mm-Hg ve üzerinde ölçülmesi. 24 saatlik idrarda protein atımının 300 mg ve üzerinde olması. Tek başına bir tanı kriteri olmamakla birlikte diğer klinik bulgulara eşlik eden ödem. Şekil 2: Preeklampsi tanı kriterleri16. Preeklampside hipertansiyon, olguların erken ve kesin bulgusudur17. Proteinüri glomerüler hasarın göstergesi olup 24 saatlik idrarda 300 mg ve üstü protein saptanması, 6 saatlik ara ile alınan en az 2 idrar örneğinde +1 fazla protein olması patolojik proteinüri tanısı için yeterli bulunmaktadır16. Ödem; serum kolloid onkotik basıncının düşmesi ve kapiller permeabilitenin artmasıyla oluşmaktadır. Ödem normal gebe kadınlarda da görüldüğü için günümüzde tanı kriteri olmaktan çıkmıştır15. Preeklampsi kendi içinde hafif ve ağır grup olarak ikiye ayrılır. Ağır preeklampside, kan basıncı ölçümlerinin 160mmHg/110mmHg veya üzerinde olması, 8 24 saatlik idrarda 5gr veya üzerinde (+3 veya üzerinde) proteinuri saptanması, oligüri, görme bozuklukları, pulmoner ödem, epigastrik ağrı, karaciğer fonksiyonlarının bozulması, trombositopeni, fetal büyüme geriliği gözlenir. Bu bulguların dışında kalan hastalar hafif preeklamptik olarak adlandırılır16. 5. Eklampsi: Gebelik ya da lohusalık sırasında preeklampsi kriterlerini taşıyan hastalarda nörolojik hasar olmadan gelişen havale veya koma durumu eklampsidir. Preeklampsinin klasik üçlüsü olan hipertansiyon, proteinuri ve ödem, hastaların % 50’sinde görülmektedir. Baş ağrısı, görme bozukluğu eklamptik nöbetlerin gelişmesi açısından alarm semptomlarıdır17. 2.4.2. Preeklampsinin Tarihçesi Eski çağlarda preeklampsi ve eklampsinin gebelik dönemine ait bir hastalık olduğu bilinmiyordu. 18. yüzyılın sonlarından 19. yüzyılın başlarına doğru preeklampsi ve eklampsi semptomları belirlenmeye başlandı. Eklampsi ve epilepsi konvülziyon (nöbet) durumundan dolayı karıştırılıyordu. Ancak 1739’da Bossier de Sauvages epilepsinin kronik bir hastalık olduğunu, eklampsinin ise sadece hamilelikte meydana gelen akut nöbetlere sahip olduğunu belirlemiştir12,18. 1843’te Robert Johns bu hastalıkta baş ağrısı, geçici görme kaybı, midede şiddetli ağrı ve vücutta ödem olduğunu tesbit etti12. Vaquez ve Nobecart preeklampside hipertansiyonu keşfetti18. 20. yüzyılda preeklampsi, gebeliğin 20. haftasından sonra ortaya çıkan hipertansiyon, proteinuri ve ödem gibi klinik bulgulara sahip bir hastalık olarak sınıflandırıldı. 2000 yılında NHBPEP (National High Blood Pressure Education Program)’ nin çalışmaları sonucunda elde edilen preeklampsi tanı kriterleri ve sınıflandırma kabul edildi. Preeklampsinin etiyolojisi hala tam olarak açık olmamakla birlikte tarih boyunca hastalığın etiyolojisi, tanı kriterleri ile ilgili elde edilen bilimsel gerçekler preeklampsinin anlaşılmasına geniş bir perspektif sunmuştur12. 2.4.3. Preeklampside Risk Faktörleri Preeklampsi hamilelikte görülen, maternal ve fetal komplikasyonların artışı ile bağlantılı bir sendromdur19. İleri anne yaşı, düşük sosyo-ekonomik düzey ve Afrikalı Amerikalı ırktan olmak preeklampside risk faktörleri arasında yer almaktadır20. 9 Afrikalı-Amerikan ırkta kronik hipertansiyon prevalansı da yüksektir. Bu yüzden preeklampsi meydana gelme olasılığı etnik köken ile de ilişkilidir şeklinde yorumlanabilir20. Nullipar (hiç sağlıklı doğum yapmamış) kadınların preeklampsi açısından yüksek riske sahip oldukları belirlenmişlerdir21. Sibai ve arkadaşları çalışmalarında 4314 doğum yapmış kadından 326’sında (%7,6) preeklampsi geliştiğini gözlemlediler ve buna gore risk faktörlerini belirlediler. İnceledikleri preeklampsi populasyonunun %5-7’sini nullipar kadınlar oluşturmuştur. Buna göre sağlıklı nullipar kadınlarda preeklampsi gelişimini etkileyen faktörleri; ileri anne yaşı (>35), ırk, sosyo-ekonomik düzey, eş değişimi, kan grubu, Rh faktörü, önceki düşük öyküleri, hamilelik esnasında sigara ve alkol kullanımı, vücut kitle indeksi, ilk gebeliklerindeki sistolik ve diastolik kan basıncı, gebelik sırasında özellikle de 3. trimestırdaki kilo kazancı ve gestasyonel diabet varlığı olarak belirlediler19. Birden fazla çocuğu olan kadın, eş değiştirdiğinde preeklampsiye yakalanma riski artar. Paternal antijenlere karşı immünolojik reaksiyon gelişmesi bu risk artışının sebebi olabilir. Preeklampsi için maternal ve fetal risk faktörleri şekil 3’ de özetlenmiştir19, 22. 10 Şekil 3. Preeklampside maternal ve fetal risk faktörleri19,22. 2.4.4. Preeklampsinin Etyolojisi Bu alanda yapılan pek çok çalışmaya rağmen preeklampsinin etiyolojisi hala bilinmemektedir. Ancak trofoblastik dokunun varlığında ortaya çıktığı için maternal ve fetal/plasental kökenli olduğu bilinmektedir. Myometriumdaki arterlerin trofoblast tarafından invazyonunda problem olan gebeliklerde azalmış plasental akım, bunun sonucunda da preeklampsi ve intrauterin gelişme geriliği gözlenmektedir23. Preeklampsinin etiyolojisinde kabul gören 4 hipotez mevcuttur. 1. Plasental iskemi: Artmış trofoblast göçü ve sınırın dışına çıkışı endotelyal hücre disfonksiyonuna sebep olmaktadır. Bu hipoteze göre preeklampsideki zayıf 11 plasentasyon, fetal genlerin aktivitesi sonucu ortaya çıkan inflamatuvar sinyallere maternal gen ürünlerinin doğal yollarla immün cevap geliştirmesi sonucu ortaya çıkar24. 2. Çok düşük dansiteli lipoprotein (VLDL) ve albuminin toksisite önleyici aktivitesi: Preeklampside hastalık başlamadan önce serbest yağ asitlerinin dolaşımdaki seviyesi gebelikte artan enerji ihtiyacını karşılayabilmek için 15-20 haftalıkken artar. Plazma albumin seviyesi, preeklamptik kadınlarda normal gebelere göre daha düşük seviyededir. Adipoz dokudan fazladan yağ asitlerinin karaciğere taşınması sonucu albuminin antitoksik aktivitesi azalır ve bu durumda endotelyal hasara sebep olur24. 3. İmmün uyumsuzluk: Gebeliğin oluşması ve güvenle sürmesi maternal bir immün tepkinin doğmasını gerekli kılmaktadır. İmmünolojik maladaptasyon sonucu desidual lökositler ve sitotrofoblast hücreleri arasındaki etkileşim yetersizleşir, bunun sonucunda da normal trofoblast invazyonu ve gelişimi tehlikeye girer24. 4. Genetik Yatkınlık: Maternal ve fetal genom gelişimde farklı roller üstlenir. Paternal kalıtımda normal trofoblastik gelişim için gereklidir24. Bu konu preeklampsinin genetiği kısmında geniş bir şekilde ele alınacaktır. 2.4.5. Preeklampsinin Patofizyolojisi Preeklampsinin gelişimini engellemek için etiyolojisinin ve patofizyolojisinin çok iyi bilinmesi gerekmektedir. Ancak yıllardır yapılan araştırmalara rağmen preeklampsinin patofizyolojisi tam olarak aydınlatılamamıştır. Bunun nedenleri arasında, hiçbir hayvan modelinin insandaki preeklampsiyi tam olarak karşılayamaması yetersiz trofoblast invazyonuna kanıt olarak ilk trimester doku materyalinin elde edilememesi, altta yatan temel patolojiye annenin vermiş olduğu reaksiyonun her vakada farklı ortaya çıkması sayılabilir. Bununla birlikte gelişiminde maternal, plasental ve paternal triadın hepsinin birden rol aldığı ve multifaktoriyel bir hastalık olduğu bulunmuştur. Önceden mevcut olan hipertansiyon, mikrovasküler hastalıklar, endokrinolojik ve koagülatif bozukluklar preeklampsi gelişimine zemin hazırlasa da, preeklampsinin açık bir tanı testi olmaması başlangıcının ve gelişiminin tahmin edilememesi bu alanda yapılan çalışmaları 12 zorlaştırmıştır. Preeklampsi patofizyolojisinde rol oynayan 2 temel mekanizma belirlenmiştir. Bunlar spiral arterlerdeki yetersiz endovasküler sitotrofoblast hasarıdır 24,25 invazyonu ve endotel hücre . Şekil 4. Preeklampsinin genetik, çevresel nedenleri ve patofizyolojisinde rol oynayan temel mekanizmalar25. Preeklampsinin etiyopatogenezinde, plasentasyonda maternal vasküler cevapta yetersizlik düşünülmektedir. Plasentasyonda maternal vasküler cevap spiral arterlerin trofoblastik dokular tarafından endovasküler invazyonu ile oluşur. Böylece spiral arterler uteroplasental arterlere dönüşür. Bu dönüşüm iki evrede gerçekleşir. Birinci evre ilk trimesterda görülür ve spiral arterlerin desidual segmentinde trofoblastik invazyon oluşur. İkinci evre ise 14. gebelik haftasında başlar ve 16-18. gebelik haftasında sonlanır. Bu durum vasküler basıncın düşmesine ve yüksek kan akımına sebep olur26. Vasküler değişiklikler intervillöz aralıktan myometriumun üçte birlik iç kısmına kadar uzanır. Büyüyen fetüsün ihtiyaçlarını karşılamak için elastik müsküler arterler çaplarını arttırıp, yüksek akımlı düşük resistans sistemine geçerler. Preeklampside bu olaylar gerçekleşmez, meydana gelen durum ‘’akut ateroz’’ olarak adlandırılır27. 13 Vazoaktif peptidlerin anormal yıkımına bağlı olarak, dolaşımdaki prostasiklin azalır ve tromboksan, endotelin-1, fibronektin ve trombomodulinin seviyeleri artar27. Pek çok vasküler hastalıkta olduğu gibi preeklampside de nötrofil ve trombosit aktivasyonu artmıştır. Tüm bu bulgular preeklampside artmış inflamatuvar yanıta bağlı endotel hücre hasarının olduğunu göstermektedir. Yapılan son çalışmalarda preeklampside endotelin dilatasyon fonksiyonunun azaldığı gösterilmiştir. Endotel hücre aktivasyonuna bağlı vasküler permeabilite artmakta ve preeklampsi bulgularından birisi olan ödem oluşmaktadır. Endotelyal hasarı hangi faktörün başlattığı henüz netlik kazanmamıştır. Ancak ilk olarak plasental faktörlere bağlı olarak plasental kan dolaşımının azaldığı ve bunu takiben salınan biyokimyasal moleküllerin endotel hücre hasarına neden olduğu görüşü yaygındır28. Preeklamptik gebelerin kanında normalden fazla sitotrofoblast hücrelerine rastlanmıştır. Yapılan in vitro çalışmalarda bunların nötrofilleri aktive ederek inflamatuvar yanıta ve endotel hücre hasarına neden olduğu gösterilmiştir29. Endotel hücre hasarına neden olan faktörler arasında oksidatif stres de suçlanmaktadır. Plasental hipoksi ve reoksijenizasyon nedeniyle oluşan oksidatif stres plasental sitokin sentezini, nötrofil aktivasyonunu, lipid peroksidasyonunu, protein ve DNA hasarını indüklemektedir29,30. Serbest radikaller trofoblastlarda apoptozisde artışa yol açar. Preeklamptik gebelerin plasentalarında da apoptozisde artış olduğu gösterilmiştir30. Preeklampsi gelişiminde rol alan başlıca olaylardan birisi de hipertansiyondur. Kalp debisi (kalbin bir dakikada aorta pompaladığı kan miktarıdır) ve periferik damar direnci kan basıncını etkileyen faktörlerdir. Normal gebelerde kalp debisi 1. trimesterde gebe olmayan kadınlara göre %30-50 oranında artar sonra artış durur ve gebeliğin sonuna kadar aynı seviyede kalır. Normal gebelerde periferal damar direnci %25 azalırken, preeklamptiklerde artar. Periferal damar direncindeki bu artış yüksek tansiyonun ana nedeni olarak gösterilmektedir. Artmış damar direncine; angiotensin II, katekolaminler, vasopressin gibi endojen hormonlara karşı damar seviyesindeki değişikliklerin neden olabileceği düşünülmektedir31. 14 2.4.6. İnsidans, Prevelans, Mortalite ve Morbidite Gebelikte hipertansiyon sıklığı %7-10 oranında görülmekte olup halen maternal ve fetal önemli morbidite ve mortalite nedenidir32,33. Son yıllarda hipertansif gebeliklerdeki perinatal mortalite oranının %10’ un altında olduğu bildirilmektedir34. Maternal mortalite gelişmiş ülkelerde de sorun olmaya devam etmekte, ABD de maternal mortalitenin %17’si gebeliğin hipertansif hastalıklarından kaynaklanmaktadır33,35. Preeklampsi insidansı ırk, bölge ve ülkelere göre değişmekle beraber gebeliklerin yaklaşık %7-10’u civarındadır36. Eklampsi insidansı gelişmiş ülkelerde 1:2000, gelişmekte olan ülkelerde ise 1:100-1:1700 olarak bildirilmiştir37. Preeklampsi insidansı etnik kökene bağlı olarak farklılık gösterir. Preeklampsi insidansı AfrikalıAmerikalı kadınlarda %5,2, İspanyol asıllı kadınlarda %4, yerli Amerikan kadınlarda %3,9, beyaz kadınlarda %3,8, Asyalı kadınlarda ise %3,5‘ dir38. Gebeliğin indüklediği hipertansif hastalıkların oranı yaşanılan coğrafyaya göre değişiklik göstermektedir. Yapılan bir çalışmada nem oranında artış ve hava sıcaklığında düşüş ile eklampsi oranının arttığı, ayrıca eklampsiden dolayı da ölü doğum oranının relatif nem oranı ile korelasyon gösterdiği bildirilmiştir33. Fetal mortalite oranı, gelişmekte olan ülkelerde, gelişmiş ülkelerle karşılaştırıldığında preeklampside 3 kat, eklampside ise 4,5 kat yüksektir39. İlk gebeliğinde hafif preeklampsi geçiren kadının ikinci gebeliğinde preeklampsi riski %5-7, hiç doğum yapmamış bir kadında ise %2’ dir. İlk gebeliğini ağır geçiren bir kadının ikinci gebeliğinde ki risk %60-80’ dir40. Preeklampsi insidansı son yıllarda artış göstermiştir. Nedenleri arasında dünya genelinde artan obezitede, ileri yaştaki anne sayısında ve çoğul gebelik sıklığındaki artış nedenler arasında sayılabilir. Kalp krizi, felç, trombofili, böbrek ve karaciğer yetmezliği gibi hastalıkların hepsi preeklampsi ve eklampsi ile ilişkili olup bu hastalıklardan etkilenmiş kadınlar mutlaka yoğun bakıma gereksinim duyarlar39. 2.4.7. Preeklampsinin Tedavisi Gebeliğin 20. haftasından sonra meydana gelen preeklampsi anne ve çocukta hayatı tehdit eden komplikasyonlara neden olur. Etiyolojisi ve patofizyolojisi net olarak belli olmadığı için etkin bir tedavi yöntemi geliştirilememiştir41. Preeklampsi tanısı 15 konur konmaz kesin tadavi doğumdur. Tedavide amaç öncelikle annenin güvenliğinin sağlanmasıdır. Doğuma karar verirken hastalığın ağırlık derecesi, maternal ve fetal durum, gebelik yaşı, doğum eyleminin varlığı göz önünde bulundurulur41. Düşük doz aspirin ve kalsiyum uygulamasının preeklampsinin önlenmesinde rol oynadığı bulunmuştur. Preeklampside gebelik ilerlemiş ise (33-34 hafta) doğum yaptırılmalıdır41. Son yapılan metaanaliz çalışmaları, sigara içmenin preeklampsi gelişimini engellemede önemli rolü olduğunu göstermiştir. Nikotin, nitrik oksit üretimini arttırarak serbest radikalleri etkisiz hale getirir. Pek çok yan etkisinden dolayı klinik çalışmalar yapılamamaktadır42. Magnezyum eklampsi tedavisinda kullanılan primer bir ilaçtır. Lipid peroksidasyonunu önleyerek, endotel hücreleri üzerinde koruyucu etki yapar43. 2.5. Sitokinler Sitokinler, fonksiyonlarını doğal sağlayan ve adaptif polipeptid immünitede yapıdaki görevli, biyolojik hücrelerin yanıt immün değiştiricilerdir. Enflamasyon, hücre büyümesi ve iyileşmesi, antijenlerin eliminasyonu, lenfositlerin büyüme ve farklılaşmasında rol oynarlar44. Kökenlerine göre farklı isimler alırlar. Mononükleer fagositler (monokin), lenfositler (lenfokin), lökositler (interlökin) şeklindedirler45. 2.5.1. Sitokinlerin Genel Özellikleri Sitokinler, doğal ve spesifik bağışıklığın effektör fazında üretilirler ve bağışıklıktaki inflamatuvar yanıtların oluşmasını ve düzenlenmesini sağlarlar46. Sitokin sekresyonu kısa ve kendini sınırlayıcı özelliktedir. Genellikle öncül moleküller olarak depolanmazlar ve sentezleri yeni gen transkripsiyonu ile başlatılır44,46. Birçok farklı hücre tipine aynı sitokinler etki edebilir, bu özelliklerinden dolayı pleiotropiktirler. Aynı biyolojik fonksiyon farklı sitokinler tarafından yürütülebilir47. Sitokinler polimorfiktir. Bir aktivasyon sonucunda üretilen sitokin seviyesi bireyler arasında çok çeşitlidir ve genetik olarak kontrol edilir. Sitokin seviyesi hastalıklara karşı hassasiyet ve direncin belirlenmesinde önem kazanmaktadır47. 16 Sitokinler, birbirlerinin sentezini etkiler. Antagonistik, additif ve sinerjik etki gösterebilirler. Diğer polipeptid hormonlarda olduğu gibi hedef hücrenin yüzeyindeki özel membran reseptörlerine bağlanarak etkilerini başlatırlar. Bu reseptörler transmembran proteinlerdir. Ekstraselüler domainleri vardır, sitokinleri ve büyüme faktörlerini tanır ve bağlarlar46. Sitokinler ile çok geniş çeşitlilik gösteren hücre tipleri arasındaki etkileşim, genellikle düzenlidir. Ancak hastalık durumunda sitokinlerin üretimindeki düzensizlikler, hastalığın patogenezinin belirlenmesine yardımcı olabilir. Bu şartlar altında dokularda ya da vücut sıvılarında hiç sitokin tesbit edilemez ya da düşük miktarda sitokin tesbit edilir. Bu yüzden sitokinlerin sekresyon seviyelerinde yükselme, hastalığın seyri veya enflamasyonla bağlantılı sitokin yolaklarındaki aktivasyonu ifade eder47. Sitokinlerin etki mekanizmaları, otokrin (sitokin kendisini salgılayan hücreyi etkiler), parakrin (sitokin çevresinde bulunan komşu hücreleri etkiler) ve endokrin (gerçek hormonlarda olduğu gibi dolaşım ile uzak mesafedeki hücreleri etkiler) olmak üzere 3 farklı şekilde gruplandırılır. 2.5.2. Sitokin Ailesi ve İşlevleri Sitokinler işlevlerine göre 4 gruba ayrılır. Çizelge 1’ de özetlenmiştir. 17 Çizelge 1. Sitokinler ve işlevleri46. İŞLEVLERİ SİTOKİNLER Tümör nekroz faktör (TNF) İnterlökin-1 (IL-1) İnterlökin-6 (IL-6) Kemokinler Doğal immüniteye aracılık eden sitokinler. İnterlökin-2 (IL-2) İnterlökin-4 (IL-4) Transforming büyüme faktörü-β (TGF- β) Lenfosit aktivasyonu, büyüme, farklılaşma düzenleyicileri olarak T lenfositlerin özel antijenleri tanımaları ile yanıt oluşturan sitokinler. İnterferon γ(IFNγ) (Mononükleer lenfositlerin birincil aktivatörü) Lenfotoksin (LT) (Nötrofil aktivatörü) İnterlökin-10(IL-10) (Mononükleer fagositlerin negatif regülatörü) İnterlökin-5(IL-5) (Eosinofil aktivatörü) İnterlökin-12(IL-12) (Natural Killer (NK) ve T hücre stimülatörü) c-kit ligand İnterlökin-3 (Koloni stimüle eden faktör Granulosit-makrofaj koloni stimülatör faktör (GM-CSF) Monosit- makrofaj koloni uyaran faktör (M-CSF) Granülosit koloni stimülatör faktör (G-CSF) İnterlökin-7 (IL-7) İnterlökin-9 (IL-9) İnterlökin-11 (IL-11) Bağışıklık sistemi aracılığı ile enflamasyonu düzenleyen sitokin grubudur. Antijenle uyarılmış CD4+ ve CD8+ T lenfositler tarafından uyarılırlar ve enflamatuar lökositleri aktive ederler. Bu hücrelerin T hücre düzenlemesine girmesini sağlarlar. Primer lökositlerin büyüme ve farklılaşmasına aracılık eden sitokinler. 2.5.3. İnterlökin-4 (IL-4) İnterlökin-4, 20 kD ağırlığında bir glikoproteindir. Temel fizyolojik etkisi allerjik olayları düzenlemektir. Antijenle stimüle olmuş CD4+ T lenfositlerinden özellikle TH2 alt grubundan meydana gelirler ve B ve T lenfositlerinin büyüme, etkinlik ve farklılaşmasından sorumludurlar. Reseptörü 130 kD ağırlığındadır46. Aktive mast hücreleri, bazofil hücreleri ve bazı CD8+ T hücreleri de IL-4 üretir. IL-4’ ün çeşitli hücre tipleri üzerine önemli etkileri vardır46. IgE üretimi için IL-4 gereklidir. B hücrelerinin ağır zincir değişim hipotezine uyan temel sitokinlerdir. IgE, allerjik reaksiyonların aracısıdır ve IL-4 üretim artışının 18 allerji gelişimininde merkezi bir rol oynadığı düşünülmektedir. IgE, helmintik hastalıklara karşı da savunmada rol oynar46. IL-4, T hücrelerinin büyüme ve farklılaşmasında rol oynar46. Endotel hücreleri üzerine etki ederek, lenfosit, monosit ve özellikle eosinofillerin bağlanmasında artışa neden olan Damar Hücresi Adezyon Molekülü-1 (VCAM)’nin ekspresyonunu uyarır. IL-4’ e maruz kalan endotel hücreleri bir kemokin olan Monosit Kemotaktik Protein-1 (MCP-1)’ i ve eosinofillere etkili eotoksini salgılarlar. Yani yüksek lokal konsantrasyonlarda IL-4, monosit ve eosinofilden zengin inflamatuvar reaksiyonları başlatır46. IL-4, mast hücrelerinin büyüme faktörüdür. IL-3 ile birlikte mast hücre proliferasyonunu arttırır46. IL-4, IgE ve eosinofil aracılığı ile gelişen inflamatuvar reaksiyonlarda kritik rol oynar46. 2.6. Renin Anjiyotensin Aldosteron Sistemi (RAAS) ve Anjiyotensin II Renin anjiyotensin aldosteron sistemi hipovolemi ve renal iskemide aktive olarak kan volümü, kan basıncı, kan sodyum değerleri ve intraglomerular basıncın yükselmesini sağlayan önemli bir homeostatik mekanizmadır48. RAAS’ın biyolojik etkinliğinden birinci derecede sorumlu olan hormon, oldukça aktif bir oktapeptid olan anjiyotensin II’ dir. Ang II; sekiz amino asitten oluşan bir oligopeptid olup anjiyotensinojenden iki enzimatik ayrılma ile ortaya çıkmaktadır. Anjiyotensinojen dolaşıma karaciğer tarafından verilmektedir. Renin, böbreklerde jukstaglomerüler aparatus tarafından glomerüler hipoperfüzyon sonucu üretilmektedir. Renin, anjiyotensinojenin anjiyotensin I’ e dönüşümünü katalizlemektedir. Anjiyotensin I, aktif olmayan bir dekapeptidtir. Anjiyotensin I, anjiyotensin dönüştürücü enzim (ADE) tarafından anjiyotensin II (Ang II)’ ye dönüştürülmektedir. AngII’ nin de reseptörüne bağlanması ile aldosteron salınımı gerçekleşir. Anjiyotensin II’ nin temel olarak iki reseptörü vardır. Anjiyotensin II, Anjiyotensin II tip 1 reseptörü (AT1-R) tarafından düzenlenen çeşitli sinyal yolaklarının aktivasyonu ile kan basıncını ve su-elektrolit dengesini düzenler. Anjiyotensin II tip 2 reseptörü (AT2-R) ise, fetüs gelişiminde yüksek seviyede eksprese olan bir reseptör proteindir49. Şekil 5’de renin anjiyotensin sisteminde anjiyotensin II reseptörleri ve fonksiyonları özetlenmiştir50. 19 Şekil 5. Renin anjiyotensin sisteminde ANG II reseptörleri ve fonksiyonları50. 2.6.1. Anjiyotensin II Tip 2 Reseptör Geni (AT2-R) Yapısal Özellikleri Ang II’ nin ikinci izoformu, AT2 reseptörüdür. Fetüs gelişimindeki mezenşimal dokularda örneğin, uterus, adrenal bezler, feokromositom (böbrek üstü bezlerinde görülen tümör) ve beynin bazı bölgelerinde bol miktarda bulunur49. Nöronal ve gelişimsel roller üstlenir. AT2-R için, PC12 hücrelerinden ve rat fetüsünden izole edilen cDNA 363 amino asitlik bir protein kodlamaktadır. Bu proteinin molekül ağırlığı 41303 kDa’dur. İkinci sitozolik lobun N-terminal bölgesinde oldukça korunmuş Asp141-Arg142-Tyr143 sekansını içermektedir. Bu sekans diğer G protein bağlı reseptörlerinin de bağlanması için oldukça önemlidir49. 2.6.2. AT2-R Geni Transkripsiyonu ve Ekspresyonu AT2-R geni ekspresyonu çoklu faktörler tarafından düzenlenir. PC12 hücrelerindeki AT2-R ekspresyonu; Ca+2 iyonoforları tarafından hücreler arası Ca+2 seviyesindeki artış ile, forbol esterleri tarafından da protein kinaz C (PKC) aktivasyonu ile düzenlenir51. Büyüme faktörleri de (epidermal, nöral, trombosit kökenli büyüme faktörleri) R3T3 (fare fibroblast hücre hattı), PC12 (sıçan feokromositom hücre hattı) ve vasküler düz kas hücrelerinde (VSMC) AT2-R ekspresyonunu downregüle eder52-56. Büyüme faktörü reseptörlerinin uyarılması, Fos ve Jun transkripsiyon faktörlerini içeren 20 Ap1 aktivatör protein kompleksinin formasyonu ile sonuçlanır. Ap1; pek çok genin promotor bölgesinde yer alan bağlanma bölgesidir. Aynı etki forbol esterleri ile aktive edilmiş PKC tarafından da sağlanır. Hem büyüme faktörlerinin hem de forbol esterlerinin AT2-R mRNA ekspresyonunu baskıladığı düşünülür53. AT2-R geni promotor bölgesinde glukokortikoid elementlere, CAAT/enhansır bağlayan proteinlere, nükleer faktör IL-6, AP-1 ve cAMP’ ye cevap oluşturan elementlere sahiptir57. Transkripsiyonel düzenlemeyi glukokortikoidler, sitokinler, forbol esterleri ve cAMP’ nin başlattığı düşünülmektedir. Bu yüzden AT2-R geni ekspresyonunu multiple faktörler downregüle eder denilebilir. R3T3 (AT2-R geninin eksprese olduğu fare fibroblast hücre hattı) ve VSMC(vasküler düz kas hücrelerinde)’ de AT2-R geninin upregülasyonu ise, IL-1β, insülin, insülin benzeri büyüme faktörleri ile olur58,59. Fetal mezenşimal fibroblastlarda fazla miktarda insülin benzeri büyüme faktörü-1 ve reseptörlerinin bulunması ile AT2-R geni yüksek seviyede eksprese olur60. PC12, R3T3 ve mezenşimal hücreler konfluent sessiz faza ulaştığında AT2-R geni ekspresyonu önemli derecede artar52,61,62,63. Dolayısı ile bu genin ekspresyonu büyüme durumuna bağlıdır, düzenlenmesi de ekspresyon seviyesi ile olur. Çizelge 2’ de; AT2-R geni yeri, yapısı, düzenlenmesi ve fonksiyonu özetlenmiştir49. 21 Çizelge 2. AT2-R geni yeri, yapısı, düzenlenmesi ve fonksiyonu49. AT2-R Eksprese olduğu yerler Fetüs, beyin(nöron), myometrium, böbrek, akciğer, kalp Bağlandığı bileşenler PD123319, CGP42112A Kodladığı proteinin a.asit 363 sayısı Bulunduğu kromozom ve X kromozomu ekson (insan ve fare) Fonksiyonu Düzenlenmesi Voltaj bağımlı K+ kanalı aktivasyonu, Ca+ kanalı ve büyüme inhibisyonu, apoptoz indüksiyonu, vazodilatasyon Downregülasyonu; glukokortikoidler, büyüme faktörleri, forbol esterleri Upregülasyonu; insülin, insülin benzeri büyüme faktörleri, sitokinler 2.7. Preeklampsinin Genetiği Preeklampsi genetiğinde 2 temel soru vardır. Birincisi preeklampsi esnasında belirli genler nerede, ne zaman ve nasıl eksprese olur ? İkincisi ise hasta ve kontrol gruplarının ekspresyon profilleri arasında nasıl bir fark vardır ? Yapılan çalışmalar bu iki soruya cevap bulmak amaçlı şekillenmiştir64. Bu bağlamda preeklampsi ile ilgili tüm genom tarandığında çalışılacak aday genler çok hızlı bir şekilde tesbit edilebilmiştir. İnsan genom çalışmalarından elde edilen bilgilere göre özellikle preeklampsi gibi kompleks hastalıklarda diğer polimorfizmlerden ziyade tek gen polimorfizmlerine (SNP) daha sık rastlanmaktadır65. SNP’ ler genomun kodlanan ve kodlanmayan bölgelerinde bulunabildiği için fonksiyonelliği değişkendir. Genomda yer alan pek çok SNP’ nin belirli biyolojik etkileri konusundaki bilgiler hala açık değildir. Çalışmalarda yer alan bir gendeki promotor, enhansır, repressör, regülatör, intron, ekson ve kodonlarda belirli bir bölgede bulunan belirli bir SNP direk bir biyokimyasal sonuç doğurabilir. Bu durum çalışılan hastalığın patofizyolojisi ve etkileri konusunda bilgi sahibi olunmasını sağlar66. Hastalık riskini arttıran fonksiyonel SNP’ lerin önemli 22 protein domainlerinin kodlayıcı gen bölgelerinde yer aldığı ve protein yapılarını değiştirebildiği gözlenmiştir67. Fakat preeklampsi gibi kompleks hastalıklarda bilinen ya da bilinmeyen pek çok SNP’ nin farklı roller oynadığı ve muhtemel kombinasyonları sonucunda bir fenotip değişikliği ortaya çıkabildiği düşünülmektedir. Fonksiyonel olmayan SNP’ ler, fonksiyonel SNP’ lere göre genom boyunca daha yaygındır. Fonksiyonel olmayan bu SNP’ ler hastalığa sebebiyet veren olaylar için asosiyasyon ve linkaj analizi çalışmalarında genetik marker olarak kullanılabilmektedir64. 2.7.1. Aile Çalışmaları Preeklampsi ile ilgili yapılan ilk çalışmalar, aile çalışmalarıdır. Preeklampsiye ait ilk ipuçları bu çalışmalarla tesbit edimiştir5. Preeklampsili bir gebelik sonucu doğan kız çocuğunun, normal bir gebelikten dünyaya gelen kız çocuğuna göre preeklampsiye yakalanma olasılığı 3 kat daha fazladır8. Yapılan aile çalışmaları çizelge 3’te özetlenmiştir64. 23 Çizelge 3. Preeklampsi ile ilgili yapılan aile çalışmaları, yapıldıkları yıllar, çalışmacılar, çalışmaya ait sonuçlar ve yorumlar. Çalışmanın Yapıldığı Yıl Yazar Sonuç ve Yorum 1873 Elliot64 Eklampsili anne ve 4 kızını incelemiş, kızlardan 3’nün eklampsiden öldüğünü tesbit etmiş. 1940 Tillman64 66 eklamptik vaka incelemiş. Bu vakalardan 2’sinin annesinin ve 3’nün de kız kardeşlerinin eklampsiye sahip olduğunu bulmuş. Preeklampsili 100 kadın incelemiş. Bu kadınlardan 28’nin 1960 Humphries64 kızlarının da preeklampsiye yakalandığını bulmuş. 1961 Adams ve Finlaysan64 1986 Chesley69 et. al. 1979 Cooper and Liston70 1981 2004 2007 Sutherland71 et. al. Nilsson68 Alexander72 İncelediği eklamptik vakaların %48’nin kız kardeşlerinin de ilk gebeliklerinde eklempsiye sahip olduklarını bulmuş. 147 kız kardeş, 248 kız çocuğu, 74 kız torun, 131 gelin gebelerle ilgili bilgi toplanmış. Çalışmaya ait verilerin 0.25 olarak varsayılan gen sıklığına sahip tek gen modeli ile neredeyse uyuştuğu tesbit edilmiş. Preeklamptik vakaları şiddetine göre sınıflandırmıştır. İncelediği preeklampsili annelerin %33’ünün normal, %40’ının orta şiddette, %27’sinin ise şiddetli preeklampsiye sahip olduğunu bulmuş. Bu vakaların kız kardeşlerinin ise %25’nin normal, %36’sının orta şiddette %34’nün ise şiddetli preeklampsiye sahip olduğunu bulmuş. Preeklampsili anne ve kızlarını, yakın akrabaları ile kıyaslayarak incelemiş. Şiddetli preeklampsiye sahip 158 anne ve 160 preeklampsili yakın akrabasını incelemiş. Bu 160 yakın akrabanın %14’ünde şiddetli preeklampsi gözlenmiş. 1987-1997 yılları arasında meyadana gelen 1.188.207 doğumdan 32.824 (%2,8) ‘nin preeklampsili olduğunu bulmuş. Preeklampsili bu vakaların 418’inin öz kız kardeş, 23’nün anne aynı baba farklı üvey kız kardeş, 18’nin de baba aynı anne farklı üvey kız kardeş olduğunu, 17’sinin ise anne-kız olduğunu tesbit etmiş. Preeklampside anne fetüs ilişkisi ve babanın rolünü incelemiş. Preeklampsili bir kadından dünyaya gelen erkek ve kız çocukların yüksek risk grubunda olduğunu belirlemiş. Preeklampside maternel geçişe göre az da olsa paternal geçişinde önemli olduğunu tesbit etmiş. Not: Yukarıda ki tabloda yer alan ilk 4 çalışma 64 nolu kaynakta yer alan ve ulaşılamayan kaynaklar olduğu için, 64 nolu kaynak refere edilmiştir. 24 2.7.2. İkiz Çalışmaları Kalıtımın incelenen hastalığa katkısı İkiz çalışmaları ile belirlenmeye çalışılmıştır. O’Shaugnessy ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada 4 çift tek yumurta ikizi anneler bir grupta, bir adet de tek yumurta üçüzü anneler diğer grupta yer aldı. Ancak bu çalışmada tek yumurta ikizi veya üçüzü olma durumunun, preeklampsinin kalıtımına olan katkısı belirlenemedi73. Avusturalya’da yapılan bir çalışmada daha geniş bir ikiz topluluğu incelenmiştir. Çalışma ile uyumlu çeşitli derecelerden akraba olan tek ve çift yumurta ikizi kadınlar, eşleri tek yumurta ikizi olan kadınlar, kendileri ve eşleri dizigotik ikiz olan kadınların bu topluluğun incelenmesi ile preeklampsinin maternal kaynaklı olduğu tesbit edilmiştir74. Thornton ve Onwude, Lachmeijer ve arkadaşları, Salone Ros ve arkadaşlarının yürüttükleri preeklampsili ikiz çalışmalarından elde ettikleri bilgilerden yola çıkarak genel olarak preeklampsi sıklığının % 50’den daha az olduğunu belirlemişlerdir75. Monozigotik ikizlerde, ikizlerin her ikisinde de preeklampsi gelişme oranı dizigotik ikizlere kıyasla daha yüksektir 76,77. Yapılan tüm bu çalışmalarla preeklampsinin kalıtım modelinin çok farklılık gösterdiği tesbit edilmiştir. Preeklampsinin fenotipi mendeliyan, tek genli dominant kalıtım ve multifaktoriyel kalıtıma sahip olabileceği ortaya konmuştur64. 2.7.3. Segregasyon Analizi Segregasyon analizi çalışmaları hastalıklara yatkınlığı oluşturan olası monogenik veya mendeliyan mekanizmaların doğasını araştırmaktadır78. Chesley eklampsi ile ilgili yaptığı segregasyon çalışmalarında, öncelikle eklampsi tarihini değerlendirerek geçen birkaç jenerasyona kadar eklasmpsiden ölenlerin sayısının yüksek olduğunu belirlemiştir. Populasyonda yaygın olarak bulunan preekalmpsiye ait genin nasıl lethal hale geldiği bilinmemekteydi. Preeklampsili bir goril pedigrisi haricinde, preeklampsinin primatların atasında meydana geldiğine dair bir kanıt bulunamamıştır69. Lethal bir genin populasyonda yaygın olarak bulunması, doğal seleksiyona uğramamış olması veya sık sık yeni mutasyonlar meydana gelmesine ya da diğer genlere göre pozitif seçilimine bağlıdır64. 25 Yapılan yeni çalışmalarda preeklampsiye sahip olan ve olmayan kadınlar incelenerek populasyonda yaygın olarak bulunan ve pereeklampsiye sebep olan alleller ve bu allelerdeki mutasyon sıklığı belirlenmeye çalışılmıştır64. Oudejans ve arkadaşları daha önce yapılan segregasyon analizi çalışmalarını da değerlendirerek Hollandalı kadınlarda plasental preeklampsi ile bağlantılı olan hassas bölgeleri tesbit etmişlerdir. Bu bölgeleri epigenetik açıdan değerlendirerek, preeklampsinin tarihteki yüksek mortalite durumuna rağmen nasıl varlığını sürdürdüğü konusunda yeni bilgiler elde edilmiştir. Ancak bu çalışmada belirlenen hassas bölgelerin diğer populasyonlarla uyumlu olmaması nedeniyle diğer populasyonlarca doğrulanmamıştır79. Yapılan segregasyon çalışmaları preeklampsinin anneden fetüse resesif bir gen ile geçtiğini desteklemektedir. Preeklampsi epigenetik açıdan değerlendirildiğinde de poligenik bir kalıtım şekline sahip olduğu bulunmuştur64. Kompleks hastalıklarda genetik ilişkiyi kurabilmek ve haritalama yapabilmek için linkaj (pozisyonel yaklaşım) ve asosiyasyon (fonksiyonel yaklaşım) çalışmaları kullanılır. Asosiyasyon çalışmalarının üstünlüğü ve tercih edilme nedeni, finansal ve lojistik açıdan kısmen daha kolay olması ve linkaj çalışmalarında ki gibi çok fazla hasta ve kontrol grubuna, geniş aile pedigrilerine ihtiyaç duyulmamasıdır64. 2.7.4. Linkaj Analizi Kompleks hastalıkların genetik nedenlerini araştırmaya yönelik diğer bir yaklaşım da linkaj çalışmalarıdır. Mendel ilkelerine bağlı davranış özelliği gösteren genetik geçiş materyali farklı kromozomlar üzerinde oturmuş genler ile olurken aynı kromozomda bulunan genler ile geçiş gösteren nitelikler Mendel yasalarına uymaz. İşte aynı kromozom üzerinde bulunan genlere bağlı (linked) genler ve bu olguya da bağlantı (linkaj) denir. Gen sıklığı ve penetransı gibi genetik parametrelerin belirlenmesi için linkaj çalışmalarında lod skorlamalarına gereksinim vardır78. Linkaj analizi öncelikle Lod skor analizinde de kullanılacak uygun bir model belirlemeyi gerektirir. Son yıllardaki teknolojik gelişmeler ile birlikte linkaj çalışmaları ile geniş bir genom taranmıştır. Kompleks hastalıklar için muhtemel kromozomlar ve kromozom bölgeleri belirlenmiş ve uygun modellere karar verilmiştir. Preeklampsi ile ilgili pek çok linkaj çalışması yapılmıştır. Bu çalışmalar çizelge 4’te özetlenmiştir64. 26 Çizelge 4. Pereeklampsi ile ilgili yapılan linkaj çalışmaları64. Çalışmanın Yapıldığı Yazar Kalıtım Modeli Sonuç Yıl Harrison et.al. 80 1997 1999 Arngrimson et. al. 2000 Moses et.al. 82 81 Lachmeijer et.al. 83 2001 4 farklı model 4q’ da linkaj Dominant 2p13’de linkaj Pek çok noktada Kromozom 2 ve parametreler dışında 11q23-24’de linkaj Çeşitli noktalarda Kromozom 12,10q ve 22q 2003 Laivuori et.al. 84 Çeşitli noktalarda 2p25 ve 9p13 2006 Kalmyrzaevet.al. 85 Parametreler Kromozom 2’de linkaj dahilinde 2 noktada Johnson et.al. 86 2007 Çeşitli noktalarda 5q ve 13q’da linkaj 2.7.5. Asosiyasyon Çalışmaları ve Aday Genler Genetik asosiyasyon çalışmaları bir grup hasta ve sağlıklı kontrol bireylerde genlerin allelik sıklıklarının karşılaştırılması esasına dayanmaktadır. Diğer bir deyişle asosiyasyon çalışmaları küçük etkili genleri kuvvetli bir şekilde tanımlamaya verilen addır87. Genetik asosiyasyon çalışmaları bir hastalığın fenotipindeki spesifik bir genin veya ilişkili pek çok genin fonksiyonuna bakılarak hipoteze katılımına karar verilmesi ile başlar. Bu aday genler, protein ürünlerinin biyokimyasal olaylardaki etkisi değerlendirilerek tipik olarak belirlenir. Hasta ve kontrol gruplarından DNA örnekleri toplanır. Her bir populasyondan toplanan örnekler, fonksiyonel gen varyantları açısından genotiplendirilir ve ki-kare testi yapılır. Spesifik gen varyantları ve preeklampsi arasındaki ilişki ile ilgili sonuçlar kaydedilir. Kaydedilen bu bilgiler ışığında preeklampsideki hasta-kontrol asosiyasyon çalışmaları yürütülür. Bu çalışmalar ile araştırılan genin bir marker ya da hastalık nedeni bir gen ya da hastalığa yatkınlık oluşturan bir gen olup olmadığı belirlenebilir64. 27 2.7.6. Çalışmalarda En Sık Rastlanan Aday Genler Sitokin ailesi, anjiyotensinojen ve trombofili genlerini içeren pek çok çalışma yapılmış ve preeklampsi patofizyolojisi ile ilgili aday genler belirlenmeye çalışılmıştır6. Asosiyasyon çalışmalarında 70’ den fazla gen incelenmiştir. Bu genlerden biride TNF-α (Tümör Nekrozis Faktör α)’ dır. Preeklampside endotel hücre fonksiyonunu etkilemesinden dolayı hastalığın patofizyolojisinin anlaşılmasına destek olacağı düşünülen sitokin ailesinden TNF-α pek çok populasyonda çalışılmıştır. Türk populasyonunda yapılan bir çalışmada TNF-α genine ait iki polimorfik bölge açısından, preeklamptik grup ile kontrol grubu arasında önemli bir farklılık elde edilmiştir. Ancak diğer populasyonlarda yapılan çalışmalarda preeklampsi ile ilişkisi bulunamaması nedeniyle aday genler arasında yer almamaktadır5. Ancak araştırmacılar biyolojik hipotezlere dayanarak ve preeklampsiye olan katkılarını değerlendirerek yaklaşık 7 gen belirlemişlerdir. Bu genler ve preeklampsi ile ilişkileri çizelge 5’ te özetlenmiştir64. 28 Çizelge 5. Preeklampsi ile ilgili aday genler64. Aday gen ve yeri Temel polimorfizm çalışması Çalışma Sayısı C677T 27 Preeklampsi ile biyolojik ilişkisi Vasküler hastalıklar Leiden 21 Trombofili M235T 17 Kan basıncının düzenlenmesi Çeşitli çalışmalar 14 Bağışıklık sistemi Glu298Asp 16 Vasküler endotelyum fonksiyonu G20210A 12 MTHFR (Metilentetrahidrofolat redüktaz) 1p36.3 F5 (Faktör 5) 1q23 AGT (Anjiyotensinojen) 1q42-q43 HLA ( İnsan lökosit antijeni) 6p21.3 NOS3 (Nitrik Oksit sentetaz 3) 7q36 F2 (Faktör 2) 11p11-q12 ACE (Anjiyotensin dönüştürücü enzim) 17q23 İntron 16’da insersiyon ve delesyon 13 Çalışmalardan elde edilen önemli veriler Yanlızca 6 çalışmada önemli bir ilişki elde edilmiş. Kan koagülasyonu Yalnızca 5 çalışmada önemli bir ilişki bulunmuş. Hipertansiyona yatkınlık sağlayan en önemli gen AGT ve moleküler varyantları olarak belirlenmiş. Yapılan çalışmaların yarısında anne-fetüs ve anne-baba-fetüs arasında genotiplendirme bakımından önemli ilişkiler elde edilmiş. Yalnızca 6 çalışmada haplotipler ve diğer polimorfizmler açısından ilişki bulunmuş. Yalnızca 2 çalışmada önemli bir ilişki elde edilmiş. Kan basıncının düzenlenmesi Yalnızca 5 çalışmada önemli bir ilişki elde edilmiş ve 2 büyük meta-analiz yapılmış. 2.7.7. Fetal Genotipin Katkısı Preeklamsi için önerilen birkaç mekanizmadan biri de, ‘’fetüs annenin sağlayabileceğinden daha fazla kan dolaşımına ihtiyaç duyar, bu durum da annede hipertansiyona neden olur’’ şeklindedir. Diğer potansiyel mekanizmalar ise genomik imprinting, gestasyonel süre ya da anne ve fetal genom arasında uyumsuzluğu (Rh uyuşmazlığı) içerir. Bu yüzden maternal ve fetal genetik etkileşim hamilelikte pek çok komplikasyon ve hastalık için kritik olarak değerlendirilir88. Preeklampsi fenotipinin oluşmasında hem maternal hem de fetal genotipin katkısı olduğu muhtemeldir. Fakat hastalığın fenotipinin ortaya çıkmasında farklı bileşenlerin de, farklı derecelerde katkısı vardır. Preeklampsi ile ilgili aday gen çalışmalarına bakıldığında, maternal genotipin fetal genotipten daha fazla çalışıldığı 29 görülmektedir. Hamilelik sürecinde maternal ve fetal genotipin birbirleri ile ilişkili ya da birbirlerinden bağımsız preeklampsi meydana gelmesine nasıl katkı sağladıkları ile ilgili soru işaretleri araştırmacıları bu konuda çalışma yapmaya yönlendirmiştir64. Romero ve arkadaşları maternal ve fetal genotipin birbirleri ile ilşkili olduğu ve gen ürünlerinin plasentada karıştığını bulmuşlardır. Bu durum üreme başarısı ile ilgili olduğu gibi gebelikte görülen spesifik hastalıkların hem fetüsü hem de anneyi etkileyeceğine kanıt oluşturmaktadır89. 2.7.8. Paternal Genotipin Katkısı Fetal genotip, maternal ve paternal genotipin kombinasyonundan oluşur. Bu yüzden fetüste yer alan paternal genler preeklampsinin patofizyolojisinde önemli rol oynar. Paternal genler plasentasyonda da anahtar rol oynar, fetüste meydana gelen trofoblast hareketliliğinde ve plasentasyondaki anormallikler paternal kökenlidir90,91. Takimoto ve arkadaşlarının preeklampsi durumu sergileyen transgenik farelerle yaptığı çalışmada, baba tarafından kalıtılan renin geninin yüksek seviyede ekspresyonu ile plasentasyonda fazla miktarda bulunmasının, maternal sirkülasyonda da fazla miktarda bulunmasına neden olduğu belirlenmiştir. Bu durumda annede hipertansiyon, proteinuri ve gebeliğin son dönemlerinde kasılmalara neden olduğu tesbit edilmiştir91. Utah populasyonunda yapılan bir kohort çalışmasında 1947-1957 yılları arasında preeklampsili gebelikten meydana gelmiş 298 erkek ve 237 kadın incelenmiştir. Daha sonra 1970-1992 yılları arasında 298 erkek bireyin babası olduğu 947 çocuk ve 237 bireyin annesi olduğu 830 çocuk incelenmiştir. Bu yıllar arasında sağlıklı annelerden dünyaya gelen 1973 erkek ve 1658 kadın kontrol grubunu oluşturmuştur. 947 erkek bireyin babası olduğu doğumdan 26 (%2,7) ve 1973 kontrol grubundan da 26 (%1,3) preeklampsili gebelik meydana gelmiştir. 830 kadından 39 (%4,7) ve 1658 kadından 32 (%1,9) preeklampsili doğum meydana gelmiş. Bu çalışmaya göre preeklampsili bir gebelikten dünyaya gelmiş bir babanın çocuğunun normal gebelikten doğmuş bir babanın çocuğuna göre preeklamptik bir gebelikten doğma riski iki kat daha yüksektir. Annesi preeklampsili olan bir annenin çocuğunun preeklampsili bir doğum gerçekleştirme riski annesi preeklampsili olmayan bir çocuğa göre 2,5 kat daha fazladır. Annesi preeklampsili olan bir annenin çocuğunun ise babası preeklampsili bir doğumdan meydana gelmiş bir babanın çocuğuna göre, preeklamptik bir doğuma neden 30 olma riski 2 kat daha fazladır90. Elde edilen bu bulgular Norveç’te geniş bir populasyon ile yapılan çalışmalar ile de uyum göstermektedir92. Preeklampsi kalıtımında maternal genotip kadar paternal genotipin de önemli bir role sahip olduğu pek çok çalışmayla desteklenmektedir. 2.7.9. Epigenetik Mekanizmalar Epigenetik; DNA sekansında herhangi bir değişiklik olmaksızın gen ifadesindeki kalıtsal değişiklikler sonucu farklı fenotiplerin ortaya çıkmasıdır. Damgalanma ise; DNA metilasyonu ile sürdürülen bir olay olup bazı genlerin sadece maternal genomda, bazılarının da sadece paternal genomda ifadelenmesidir93. Preeklampsinin patogenezinin anlaşılması, hastalığın gelişimindeki epigenetik mekanizmaların aydınlatılması ile mümkün olabilmektedir. Epigenetik orijinli erken gamet oluşumu plasental defektlerin meydana gelmesinde dolayısı ile preeklampsi riskinin artışında yeterli etkiye sahip olabilir94. Gebe bir fare modeli üzerinde yapılan çalışmada p57-Kip2 geninin damgalanmasının önlenmesi sonucunda hipertansiyon ve proteinuri meydana geldiği gözlenmiştir95. Fakat bu modelde preeklamptik insanlarda gözlenen semptomların tamamı gözlenmez. Farelerdeki transkripsiyon ile ilgili son analizler sonucunda preeklampsi benzeri semptomların zamanla geliştiği konusunda bulgular elde edilmiştir96. Preeklampside damgalanmayan genler için de epigenetik değişiklikler mümkündür. Yapılan son çalışmalarda Serpın B5 (Serpin peptidaz inhibitörü B5 grubu) ve Serpın A3 (Serpin peptidaz inhibitörü A3 grubu)’ ün promotor bölgelerindeki metilasyonda değişiklikler gözlenmiştir. Preeklamptik vakalarda SERPIN B5’ in promotor bölgesindeki metilasyonda azalma olduğu belirlenmiştir. SERPIN A3 ‘ün ekspresyon seviyesindeki artışın ise yetersiz trofoblastik invazyona sebep olduğu belirlenmiştir 97,98. Anormal metilasyon paneli preeklampsi patogenezinde çok yaygın bir durumdur. Aslında preeklampsi hücre proliferasyonu, farklılaşması ve invazyonunu içeren süreçlere bağlı olan bir uzun dönem hastalığıdır. Bir promotor demetilasyonu transkripsiyon faktörlerinin kromatine girişini mümkün kılar. Yapılan çalışmalarda HIF1α geninin bağlanma bölgesinde 31 CpG metilasyonu yokluğunda gen transkripsiyonuna izin verilir. Bu yüzden PE‘ nin meydana getirdiği hipoksik çevrede bu transkripsiyon faktörlerinin promotöre bağlanması daha kolay olur97. Sonuç olarak genom çapında araştırılan epigenetik değişiklikler plasental hastalıkların başında gelen PE’nin patofizyolojisinin belirlenmesinde yeni temel mekanizmadır97,99,100. 2.7.10. AT2-R Geni Polimorfizmleri Preeklampsi, etiyolojisi hala bilinmeyen heterojen sebeplere dayalı bir hastalık olmasına rağmen, hastalığın etiyolojisini yönlendirecek önemli genetik bileşenlere sahiptir101. Renin anjiyotensin sistem (RAS); su-tuz dengesinin ayarlanmasında, preeklampsinin patofizyolojisinin belirlenmesinde çok önemlidir102. RAS’ın bütün önemli bileşenleri plasenta ve uterusta mevcuttur. Ayrıca normal gebelikte damar direnci, kan basıncı, plazma volümü azaldığından dolayı RAS’ ın uyarısı sonucu plazma renin aktivitesi, anjiyotensin II ve aldosteron seviyesinde artışa neden olur. Fakat preeklampsili gebeliklerde plazmada anjiyotensinojenin yüksek molekül ağırlıklı formu artarken, AngII ve renin seviyesi azalır. RAS’ ın vazoaktif elementlerindeki bu değişiklikler PE’ nin patofizyolojisinde önemli bir rol oynar. RAS’ın son etkin maddesi anjiyotensin II’ dir103. AT2-R geni; anjiyotensin II’ nin alt tipi olup, büyümeyi inhibe edici, damar çapını arttırıcı, antihipertrofik ve proapoptotik etkileri mevcuttur. Normal feto-plasental gelişim, AT1-R ve anjiyotensin II’nin diğer alt tipi olan AT1-R genlerinin düzenli eksprese olmasını ve taşınmasını gerektirir. Pek çok çalışmada hipertansiyonlu gebeliklerde, AT1-R ve AT2-R genlerinin ekspresyonunun tetiklenebileceği düşünülmektedir104. Akbar ve arkadaşları X kromozomu üzerinde bulunan AT2-R genine ait 1675 G/A ve 1332 G/A bölgelerini içeren polimorfizm çalışması yapmışlardır. Bu bölgeleri, transkripsiyon ve translasyon başlama noktalarına yakın olmaları ve hipertansif hastalıklarla da ilişkili olmaları nedeniyle çalışmalarında tercih etmişlerdir. Bu çalışma Afrokarayipli, Kafkas ve Asyalı, preeklampsili, eklampsili ve sağlıklı kadınlar arasında yapılmıştır. Afrokarayipli PE’ li gebelerde, sağlıklı kontrol gruba göre 1675 G/A bölgesinde GG homozigot genotipe sahip olma oranı çok daha fazla bulunmuştur. Ancak Kafkas ve Asya kökenli kadınlarda bu bölgede önemli bir farklılık gözlenmemiştir102. Aynı polimorfik bölge (AT2R G/A) dört haftalık kullanımından sonra düşük tansiyon ve renal vazodilatasyon meydana getiren bir ilacın 32 etkileri araştırılırken de çalışılmıştır. Bu çalışma sonucunda AT2R 1675 G/A polimorfizminin AT1R’nin etkilerini inhibe ederek aldosteron seviyesini baskıladığı bulunmuştur105. 2.7.11. IL-4 Geni Polimorfizmleri Preeklampsi ailesel yatkınlık ve genetik geçiş sergileyen multifaktoriyel bir sendromdur. Başarılı bir gebelik, annenin genetik olarak başarılı bir savunma mekanizmasına sahip olmasına bağlıdır106. Savunma sisteminde yer alan sitokinlerden birisi olan interlökin 4 (IL-4), fetomaternal dönemde meydana gelir. Bu dönemde IL-4 seviyesinde artış söz konusudur. Düşük ile sonuçlanan gebelikler incelendiğinde, IL-4 seviyesinde azalma olduğu gözlemlenmiştir107. IL-4 seviyesi, preeklampsiye hassasiyeti etkileyebilir. Gebelik esnasında desidual hücrelerdeki IL4 ekspresyonu azaldığında, spontan düşükler meydana gelmiştir. IL4’ ün aşırı eksprese olması da fetüsün gelişimi için olumsuz koşullar yaratmaktadır. Fraser ve arkadaşları IL-4 genine ait -590 C/T bölgesini içeren bir polimorfizm çalışması yapmış ve bu bölgenin preeklampsi ile ilişkili olup olmadığını araştırmışlardır. Sağlıklı kontrol grup ile preeklamptik grubu karşılaştırdıklarında, preeklamptik grupta TT homozigot genotipe daha fazla rastlamışlardır108. Yapılan başka bir çalışmada aynı polimorfik bölgenin (IL-4, -590 C/T) atopik allerji için büyük risk faktörü teşkil ettiği bulunmuştur109. Bir grup astım hastası ile yapılan çalışmada IL-4 TC (-590), IL-4 GT (-1098) ve IL-4 GA (+1902) polimorfik bölgeler çalışılmış ve IL-4 geni promotor bölgesinde yer alan -590, -33, 1098 bölgelerinin broşial astım ile güçlü bir korelasyona sahip olduğu bulunmuştur110. IL-4 geni -590 C/T polimorfizm çalışmasının Türk toplumunda daha önce çalışılmaması bizi bu çalışmayı yapmaya yönlendirmiştir. 33 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1 Araç ve Gereçler Bu çalışmada kullanılan kimyasal maddeler, cihazlar, teknik malzemeler ve temin edildikleri firmalar aşağıda belirtilmiştir. 3.1.1. Kimyasal Malzemeler § Taq DNA polimeraz enzimi (BioLabs) § Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) tamponu (BioLabs) § Primerler § dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) (Sigma) § Restriksiyon enzimleri AvaII ve Hpy188III (BioLabs) § Etidiyum bromid (Sigma) § Agaroz (Sigma) § Akrilamid (Sigma) § N,N’-Metilen-bis-Akrilamid (Sigma) § Amonyum persülfat (APS) (Sigma) § Tris-baz (Sigma) § Borik asit (Sigma) § Etilen diamin tetra asetik asit (EDTA) (Sigma) § Sodyum klorür (NaCl) (Merck) § Tetrametil etilen diamin (TEMED) (Sigma) § Bromfenol mavisi (Merck) § Magnezyum Klorür § Tris-HCl § TritonX100 (Sigma) § Sükroz (Merck) § Proteinaz-K (Sigma) § Sodyum dodesil sülfat (SDS) (Sigma) § Etil alkol (Merck) § Distile ve bidistile su 34 3.1.2. Cihazlar ve Teknik Malzemeler § Soğutmalı santrifüj (Universal 16R) § Mikrosantrifüj (Techne force 16) § Su banyoları (Grant) § Hassas Terazi (Sartorius) § Terazi (Shimadzu 321-33557) § pH metre (İnolab) § UV jel görüntüleme sistemi (UVI tec) § Otomatik pipetler (Gilson, Biohit, Socorex) § Vorteks (Nüve NM 110) § Etüv (Dedeoğlu) § Elektroforez güç kaynağı (EC3000-90) § Yatay elektroforez sistemi (Biogen) § Dikey elektroforez sistemi (Biolab) § PZR cihazı (Thermal cycler Ependorf Mastercycler) § Nanodrop (IMPLEN) § Buzdolabı (Arçelik) § Deepfreez (Siemens, Bosch) § Otoklav (Trans) 3.2 Kan Örneklerinin Sağlanması Çalışma grupları Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Doğum Anabilim Dalı Doğum Ünitesi, Doğum Servisi ve Polikinliğinde takip edilen preeklampsi tanısı konulmuş hastalardan ve herhangi bir hastalık tanısı almamış normal gebelerden oluşturuldu. Kronik hipertansiyona sahip gebeler çalışmaya dahil edilmedi. Hasta grubu P1,P2,P3 olarak, kontrol grubu K1, K2, K3 olarak kodlandırıldı. Bu kişilerden EDTA’ lı tüplere kan alındı. Tüpler alt üst edilerek kanların pıhtılaşması önlendi ve kan örnekleri DNA izolasyonunda kullanıldı. 35 3.2.1. Hasta Rızası Bu çalışmada yer alan tüm hastaların Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulları Araştırma Projesi Bilgi ve Taahhüt Formunda belirtilen kurallara uygun olarak hazırlanmış DNA Çalışması Onam Formlarını doldurmaları sağlandı. 3.3. Yöntem 3.3.1. Periferik Kandan DNA Eldesi Biyolojik örneklerden genomik DNA’ nın izolasyonu moleküler tanı yöntemlerinin uygulanmasında gerekli ilk adımdır. Periferik kandan DNA eldesi için Miller ve arkadaşlarının geliştirdiği salting out (tuzla çöktürme) yöntemi modifiye edilerek uygulandı. 1. 1,5 ml lik ependorf tüp içerisine iyice alt üst edilmiş kan örneğinden 700 µl, eritrosit lizis (Ek-1.1) solüsyonundan da 700µl konulup dikkatlice alt üst edilerek 3-5 dk. oda ısısında bekletildi. 4500 rpm.de 5 dk. santrifüj edildi. Santrifüj işleminden sonra süpernatant kısmı atıldı. 2. Elde edilen pellet üzerine 700µl eritrosit lizis solüsyonu eklendi. Tüp kuvvetlice çalkalanarak pellet çözdürüldü. 4500 rpm.de 5 dk. santrifüj edildi. Santrifüj işleminden sonra süpernatant kısmı atıldı. 3. Pellet üzerine 1000 µl (1ml) fizyolojik tampon (Ek-1.2) eklenerek çözdürüldü. 4500 rpm.de 5 dk. santrifüj edildi. Santrifüj işleminden sonra süpernatant kısmı atıldı. 4. Pellet üzerine 300 µl TE-9 (Ek-1.3) tamponu ilave edilerek çözdürüldü. Bunun üzerine 100 µl SDS (Ek-1.4) ile 20 µl Proteinaz-K (Ek-1.5) ilave edildi. Vorteks üzerinde tüp içeriği iyice karıştırıldı. 1-2 saat 65 ºC de benmaride tutuldu. 20 dk aralıklarla tüp alt üst edildi. 5. İnkübasyon sonunda tüp içersine 200 µl 6M NaCl (Ek-1.6) ilave edildi. Oluşan beyaz görünümlü yapıyı dağıtmak için tüp kuvvetlice çalkalanıp 13500 rpm.de 7 dk. santrifüj edildi. 6. Santrifüj sonunda süpernatant başka bir tüpe alınıp pellet atıldı. Süpernatant tekrar 13500 rpm.de 7 dk. santrifüj edildi. 36 7. Yine süpernatant başka bir tüpe alınıp pellet atıldı. Tuzdan arınmış olan süpernatantın üzerine 900 µl %100’ lük etil alkol (Ek-1.7) eklendi. Tüp iyice karıştırıldı. Bu aşamada DNA ipliksi yapıda görülebilmektedir. 8. Tüp içeriği 13500 rpm.de 7 dk. santrifüj edildi. Süpernatant atıldı. 9. Tüpün dibine yapışan DNA’ yı kaldırmak için 1000 µl %70’ lik etil alkol (Ek-1.7) eklendi. 13500 rpm.de 7 dk. santrifüj edildi. Süpernatant atıldı. Bu işlem bir kez daha tekrar edildi. 10. Süpernatant döküldükten sonra tüp ters çevrilip DNA’ nın tüpe yapışması ve alkolün uçması için 15 dk. beklendi. 11. DNA’nın büyüklüğüne göre 50-100 µl TE (Tris-EDTA) (Ek-1.8) konuldu. 12. DNaz aktivitesini ortadan kaldırmak için 70-80 ºC de benmaride 10-15 dk. inkübasyona bırakıldı. 13. DNA örnekleri kullanılıncaya kadar +4 ºC de muhafaza edildi. Uzun süreli saklamak için ise -20 ºC ye alındı. 3.3.2. Agaroz Jelin Hazırlanması PZR sonrasında elde edilen ürünlerin varlığını kontrol etmek için kolay ve hızlı hazırlanması sebebi ile agaroz jellerden yararlanıldı. Genellikle %2 oranında agaroz jel hazırlandı. 1. Çalışmaya başlamadan önce jel kabı iyice temizlenip kurutulduktan sonra jel dökme kalıbına yerleştirildi. Bu kalıp düzgün bir yüzeye kondu. Kuyucuk oluşturmak için kullanılan taraklar düzgünce yerlerine yerleştirildi. 2. Jel dökme kabının boyutları ve jelin kalınlığı dikkate alınarak hesaplama yapıldı. 8x9 cm boyutundaki jel kabına %2 konsantrasyonunda jel dökmek için erlenmayerde 1gr agaroz tartılıp, 50 ml 1 x TBE solüsyonu (Ek-2.1) mikrodalga fırın içinde agaroz iyice eriyinceye kadar ısıtıldı. 3. Jelin içine 3 µl stok EtBr (Etidiyum Bromür) solüsyonundan (Ek-2.2) ilave edildi. 4. Agaroz çözeltisi, sıcaklığı 45-50 ºC’ye (el yakmayacak sıcaklığa) gelinceye kadar soğutuldu. 37 5. Ilık agaroz çözeltesi hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edilerek jel kabına döküldü. 6. Jelin oda sıcaklığında yaklaşık 30-45 dk. polimerize olması için beklendi. 7. Jel elektroforez tankına alındı, üzerini örtecek kadar 1 x TBE tamponu ilave edildi. Taraklar dikkatlice çekilerek, yükleme yapılacak kuyuların oluşması ile jel hazır hale getirildi. 3.3.3. Örneklerin Agaroz Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi Kontrol edilmek istenen DNA örnekleri jel yükleme tamponu (Loading dye) (Ek2.3) ile birlikte yüklendi. Jel Yükleme ( veya DNA yükleme) Tamponu § Örneğin yoğunluğunu arttırarak DNA’ nın kuyucuğa düzgün olarak damlamasını sağlar. § Örneği renklendirerek kuyulara yüklenme işlemini basitleştirir. § Elektriksel alanda göç hareketinin takip edilmesini kolaylaştırır. Jelin sağındaki veya solundaki ilk kuyuya moleküler ağırlığı bilinen marker DNA’dan 5 μl yüklendi. Mikropipet ile 5 μl PZR ürünü ile 1 μl Bromfenol mavisi içeren 6X yükleme tamponu karıştırıldı. Toplamı 6 μl olan karışım kuyucuklara yüklendi. 100 voltta 60 dakika elektrik akımına maruz bırakılarak yürütüldü. § Jel UVI doc cihazında ultraviyole ışık altında görüntülendi ve jel görüntüleri diskete kaydedildi. 3.3.4. Örneklerin Poliakrilamid Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi Akrilamidin polimerizasyonu ile hazırlanan poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE), küçük ya da orta boydaki (yaklaşık 1 milyon dalton kadar) nükleik asitler ve proteinler için yüksek ayrıştırma gücüne sahiptir. 38 %8 ‘lik poliakrilamid jeli hazırlamak için gerekli ön hazırlıklar: § %40’ luk stok poliakrilamid çözeltisi (Ek3.3) hazırlandı. § %25’ lik amonyum persülfat (APS) çözeltisi (Ek3.4) hazırlandı. § 10X TBE stok tamponu (Ek3.5) hazırlanıp otoklavda steril edildikten sonra kullanıldı. § Dikey elektroforez cihazı ve cam malzemeler temizlenip saf sudan geçirildikten sonra, cam malzemeler %70 ‘lik alkolle yıkanıp, kurutuldu. § Camların arasına sızdırmayı önlemek üzere vazelinlenmiş 1mm kalınlığında ki spacerler (aralık yapıcı) aynı hizada olacak şekilde yerleştirildi. § Arasına spacer konulmuş camlar aparata yerleştirildi ve vidaları sıkıştırıldı. § 12 kuyuluk tarak %70’lik alkolle silinerek camların arasına yerleştirildi. %8’ lik poliakrilamid jeli hazırlamak üzere; Akrilamid-Bisakrilamid stok solüsyonu %40 (29:1) 1,6 ml. Bidistile su 5,6 ml. 10X TBE tamponu 0,8 ml. %25 APS 50 µl. TEMED 6-8 µl. § TEMED eklenmeden önce hazırlanan karışımın havası alındı. TEMED eklendikten sonra mümkün olduğunca hızlı bir şekilde karışım enjektöre çekilip, camların arasına hava kabarcığı kalmayacak şekilde enjekte edildi. Çünkü TEMED polimerizasyonu başlatan katalizördür. § Polimerizasyon için 15-20 dk beklendi. § Polimerizasyon gerçekleştikten sonra aparat tankın içine yerleştirildi. § Jelin alt ve üst sınırlarına temas edecek şekilde jel tankına 1x TBE tamponu eklendi. § Tarak düzgün bir şekilde çekildi ve tampon çekilmiş enjektörle kuyular jel kalıntılarından kurtulmak için yıkandı. § İlk iki kuyu hariç her kuyuya 1µl yükleme tamponu ve 5 µl kesim ürünü karıştırılarak uygulandı. İlk iki kuyudan birine 50 bp’ lık markır DNA ve 39 ikincisine ise kesim reaksiyonu gerçekleşip gerçekleşmediğini kontrol etmek amacıyla PZR ürünü yüklendi. § Tankın kapağı kapatıldı ve güç kaynağı çalıştırıldı. Akım ile örnekler istenilen miktarda yürütüldükten sonra güç kaynağı kapatıldı. 3.3.5. PZR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) Yönteminin Uygulanması PZR, herhangi bir organizmaya ait genomik DNA‘ daki dizisi bilinen herhangi bir bölgenin çoğaltılmasını (amplifikasyonunu) sağlayan basit ama çok başarılı bir invitro DNA sentez yöntemidir. PZR reaksiyonunun hazırlanmasında temel olarak sırasıyla şu basamaklar izlendi. § PZR mixinde kulanılacak çözelti ve DNA miktarları için gerekli hesaplamalar yapıldı. § Reaksiyonda kullanılacak DNA’ lar ve çözeltiler -20 ºC’ den alınıp çözdürüldü. § 200 µl’lik PCR tüpleri üzerine örnek kodu yazılarak hazırlandı. § Tüm DNA örnekleri ve çözeltiler önce vortekslendi, daha sonra tüpün duvarındaki tüm damlaları toplamak amacıyla kısa bir süre santrifüj edildi. § Reaksiyon hacmini tamamlamak için steril su kullanıldı. § PZR mixi hazırlamak için 200 µl lik PCR tüpüne hesaplanan miktarlarda PZR tamponu, forward ve reverse primerler, dNTP mix ve Taq polimeraz eklendi. § Kısa bir vorteks ve santrifüj yapıldı. § Kodlanmış her bir PZR tüpüne hesap edilen miktarlarda su ve kodunu taşıdıkları DNA eklendi. § PZR mixi tüplere eşit olarak dağıtıldı. § Tüplerin her biri önce vortekslenip sonra santrifüj edildi. § Daha sonra önceden programlanmış termal cycler’ a yerleştirildi ve cihaz çalıştırıldı. 40 3.3.5.1. AT2R Geni A1675G Polimorfizmi için PCR Yönteminin Uygulanması Çalışmamızda AT2R (Angiotensin 2 Tip II Reseptör Geni)’ nin intron1 ve exon 2 arasındaki bölgeyi çoğaltmak için Akbar ve arkadaşlarının102 çalışmalarında kullandıkları 20 ve 21 baz çifti uzunluğundaki primer dizileri seçilmiştir. Seçilen primer dizileri aşağıda gösterilmiştir (Çizelge 6 ). AT2R geni PZR ile çoğaltılan 310 baz çiftlik bölge şekil 6’ da yer almaktadır. Çizelge 6. AT2R geni intron1 ve exon 2 arasındaki bölgenin amplifikasyonu için gerekli primer çiftleri102. Primer 5’-AGAGATCTGGTGCTATTACG-3’ 20 baz çifti Forward Primer Reverse 5’-CACTTGAAGACTTACTGGTTG-3’ 21 baz çifti 206 bç. 104 bç. Şekil 6. AT2R geni PZR ile çoğaltılan 310 baz çiftlik bölge. Örneklerimizin uygun amplifikasyon koşullarını saptamak için çeşitli denemeler yapıldı. Primerlerin, Taq polimerazın, dNTP’nin farklı konsantrasyonları ile PZR programında farklı ısı döngüleri ve annealing (yapışma) ısıları denendi; her denemede sadece bir değişken dışındakiler sabit tutuldu. Optimal amplifikasyonun gerçekleştiği koşullar bütün PZR reaksiyonları için kullanıldı (Çizelge 8). PZR reaksiyonunu gerçekleştirmek için kullanılan malzemelerin tümü ticari olarak satın alınmıştır (Çizelge 7). Amplifiye olan ürünler ileriki çalışmalarda kullanılmak üzere +4 ºC de saklandı. 41 Çizelge 7: AT2R geni intron1 ve exon 2 arasındaki bölgenin optimal amplifikasyonlarının gerçekleşmesinde kullanılan maddeler ve miktarları Kullanılan Miktar Final Reaksiyon Karışımı (µl) Konsantrasyonu 10 x PZR Tamponu 2,5 µl 1x PZR Tamponu dNTP 0,25 µl 25 mM Primer F 1 µl 10 pmol Primer R 1 µl 10 pmol Taq Polimeraz Enzimi 0,25 µl 0,05 U/ µl 4 µl 100-200 ng Genomik DNA (1/10) sulandırılmış Bidistile su 16 µl Toplam hacim 25 µl Çizelge 8. AT2R geni intron1 ve exon 2 arasındaki bölgenin optimal amplifikasyonlarının gerçekleştiği PCR programı ısı döngüleri Döngüler Sıcaklık Süre 1.Ön Denatürasyon 95.0 ºC 5 dk 2.Denatürasyon 94.0 ºC 45 sn 55.0 ºC 1 dk 72.0 ºC 1 dk 3.Yapışma (Annealing) 4.Sentez (Extension) 5.Toplam Döngü Sayısı 35 (2. Döngüden itibaren) 6.Final Uzama 72 ºC 7 dk 7.Saklama 4 ºC Uzun süre Örneklerin amplifikasyonu ve elde edilen bantların kontrolü 3.3.3’ te anlatıldığı gibi %2’ lik agaroz jelde yürütülerek kontrol edildi. 3.3.5.2. IL4 Geni -590 C>T Polimorfizmi için PZR Yönteminin Uygulanması Çalışmamızda IL4 (Interlökin 4) 5’ UTR bölgesini çoğaltmak için R. Fraser ve arkadaşlarının108 çalışmalarında kullandıkları primer dizileri seçilmiştir. Seçilen primer 42 dizileri aşağıda gösterilmiştir (Çizelge 9 ). IL-4 geni 196 baz çiftlik PZR çoğaltılan bölge şekil 7’ de yer almaktadır. Çizelge 9. IL4 geni 5’ UTR bölgesinin amplifikasyonu için gerekli primer çiftleri108. Primer Forward 5’-TAAACTTGGGAGAACATGGT-3’ 20 baz çifti 5’-TGGGGAAAGATAGAGTAATA-3’ 20 baz çifti Primer Reverse 174 bç. 22 bç. Şekil 7. IL-4 geni 196 baz çiftlik PZR çoğaltılan bölge. Örneklerimizin uygun amplifikasyon koşullarını saptamak için çeşitli denemeler yapıldı. Primerlerin, Taq polimerazın, dNTP’nin farklı konsantrasyonları ile PZR programında farklı ısı döngüleri ve annealing (yapışma ısıları) denendi; her denemede sadece bir değişken dışındakiler sabit tutuldu. Optimal amplifikasyon 2 farklı annealing ısısının kullanıldığı touchdown PZR ile elde edildi ve bu koşullar bütün PZR reaksiyonları için uygulandı (Çizelge 10, 11). Amplifiye olan ürünler ileriki çalışmalarda kullanılmak üzere +4 ºC de saklandı. 43 Çizelge 10: IL4 geni -590 C>T polimorfizmi için optimal amplifikasyonlarının gerçekleşmesinde kullanılan PCR reaksiyon koşulları. Kullanılan Miktar Final (µl) Konsantrasyonu 10 x PCR Tamponu 2,5 µl 1x PZR Tamponu dNTP 0,25 µl 25 mM Primer F 1 µl 10 pmol Primer R 1 µl 10 pmol Reaksiyon Karışımı Taq Polimeraz Enzimi 0,25 µl 0,05 U/ µl 4 µl 100-200 ng Genomik DNA (1/10) sulandırılmış Bidistile su 16 µl Toplam hacim 25 µl Çizelge 11. IL4 geni -590 C>T polimorfizmi için optimal amplifikasyonlarının gerçekleştiği PZR programı ısı döngüleri. Döngüler Sıcaklık 1 Sıcaklık 2 Süre 1 Süre 2 1.Ön Denatürasyon 94 ºC 94ºC 1 dk 3 dk 2.Denatürasyon 94 ºC 94 ºC 45 sn 1 dk 3.Yapışma(Annealing) 48 ºC 50 ºC 45 sn 45 sn 4.Sentez(Extension) 72 ºC 72 ºC 45 sn 45 sn 40 40 6.Final Uzama 72 ºC 72 ºC 5 dk 5 dk 7.Saklama 4 ºC 4 ºC Uzun Uzun süre süre 5. Toplam Döngü Sayısı (2. Döngüden itibaren) Örneklerin amplifikasyonu ve elde edilen bantların kontrolü 3.3.3’ te anlatıldığı gibi %2’ lik agaroz jelde yürütülerek kontrol edildi. 3.3.6. Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi (RFLP Restriction Lenght Fragment Polymorphism) Yönteminin Uygulanması Agaroz jel elektorforeziyle AT2R polimorfizmi ve IL4 geni -590 C>T polimorfizmi için amplifikasyon kontrolü yapılan örnekler HYP 188 III ve Ava II 44 restriksiyon endonükleaz enzimleri ile kesim reaksiyonuna alındı. Kesim reaksiyonları için çizelge 12’de belirlenen oranlarda reaksiyon bileşenleri hazırlandı. Çizelge 12: AT2R geni G1675A ve IL4 geni -590 C>T polimorfizmleri için RFLP reaksiyon koşulları. Reaksiyon Karışımı Kullanılan Miktar (µl) Tampon 2,5 µl Restriksiyon Enzimi 0,5µl Amplifiye ürün 10 µl (PCR ürünü) Steril Bidistile su 7 µl Toplam Hacim 20 µl Reaksiyon Isısı 37 ºC Reaksiyon Süresi 17 saat Amplifiye olmuş örneklerin kesim reaksiyonu HYP 188 III ve Ava II restriksiyon endonükleazlar ile çizelge 13’ te belirlenen ısı döngülerine göre gerçekleştirildi. Çizelge 13. AT2R geni G1675A ve IL4 geni -590 C>T polimorfizmleri için RFLP reaksiyonu ısı döngüleri. Döngüler Sıcaklık Süre 1.Kesim reaksiyonu 2.Enzim İnaktivasyonu 37 ºC 17 saat - 20 ºC 1 saat Enzim inaktivasyonundan sonra kesim ürünleri Bromfenol mavisi içeren 6X yükleme tamponu (EK 2.3) ile karıştırılarak agaroz ve poliakrilamid jellere uygulamaya hazır hale getirildi. Bunun için 6X yükleme tamponundan 1 µl alınıp 5 µl kesim ürünü ile karıştırıldı. 3.3.7. İstatiksel Analiz SPSS 11.5 Ki kare (χ2) testi kullanılarak analiz edilmiştir. 45 4. BULGULAR Yaptığımız çalışmada 131 preeklampsili gebe ve 86 sağlıklı gebeden Anjiyotensin 2 tip II Reseptör Geni A1675G polimorfizmi ve İnterlökin 4 Geni -590 C>T polimorfizmlerinin genotip dağılımları araştırıldı. Çalışmaya dahil edilen tüm gebelerde sistolik ve diastolik kan basıncı ve idrardaki protein miktarı ölçüldü. Ayrıca yapılan anketlerle hasta ve kontrol grubunun gebelik yaşı, gebelik haftası, gebelik sayısı ve ağırlıkları kaydedildi. Tüm gebelerden alınan kanlardan elde edilen DNA örnekleri PCR–RFLP yöntemi kullanılarak, araştırılan polimorfizmlerin genotip dağılımları belirlendi ve elde edilen verilerden istatistiksel analiz yapıldı. 4.1. Klinik Bulgular Çalışılan hasta grubunun belirlenmesinde; NHBPEP (National High Blood Pressure Education Program)’ ın çalışma raporlarına göre 20. gebelik haftasından sonra daha önce normal kan basıncına sahip kadınlarda, sistolik kan basıncının ≥140 mmHg, diastolik kan basıncının ≥ 90 mmHg olarak ölçülmesi ve 24 saatlik idrarda 300 mg ve üstü protein saptanması, 6 saatlik ara ile alınan en az 2 idrar örneğinde +1 ya da daha fazla protein olması şeklinde belirlenen kriterler dikkate alınmıştır. Ayrıca kronik hipertansiyonu olan hastalar çalışmaya dahil edilmemiştir. Hasta ve kontrol grubuna ait yaş, ağırlık, gebelik sayısı, gebelik haftası, sistolik ve diastolik kan basıncı değerlerinin ortalamaları alındı. Sağlıklı kontrol grubu ile preeklampsili gebe gruba ait klinik bulguların karşılaştırılmasında t-testi uygulandı. Analiz sonuçlarına göre gruplar arasında klinik bulgular açısından istatistiksel olarak farklılık olduğu saptandı (p<0,05, Çizelge-14). Hasta olan gruba ait kan basıncı değerleri preeklampsi kriterleri ile uyum göstermektedir. Hasta grubunda kontrol grubuna göre yaşın ve gebelik haftasının daha düşük olduğu, ağırlığın ise daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Gebelik sayısı açısından bir farklılık gözlenmemiştir. 46 Çizelge 14. Preeklampsili ve sağlıklı kontrol grubuna ait klinik özelliklerin ortalamaları ve p değerleri. Klinik Bulgular Preeklampsi (%) Kontrol (%) P değeri Yaş Ortalaması 30.12 32.82 <0.05 Ağırlık Ortalaması 81.03 77.03 <0.05 Gebelik Sayısı 2.59 2.33 >0.05 Gebelik Haftası 34.16 37.15 <0.05 Diastolik Kan Basıncı 100.27 77.02 <0.05 Sistolik Kan Basıncı 156.86 119.12 <0.05 4.2. Moleküler Bulgular 4.2.1 AT2R Geni A1675G Polimorfizmi İçin Moleküler Genetik Bulgular AT2R geni 1675 bölgesinin 310 baz çiftlik kısmı PZR yöntemi ile çoğaltıldı ve % 2’ lik agaroz jelde yürütüldü. Çalışılan hasta ve kontrollerden bazılarının PZR yöntemi ile çoğaltılmış AT2R geni intron 1 ve ekson 2 arasındaki 310 baz çifti uzunluğundaki bant görüntüleri şekil 8 ve 9’ da gösterilmiştir. Şekil 8. Kontrol grubuna ait bazı örneklerin, AT2R geni intron 1 ve ekson 2 arasında ki 310 bç. uzunluğunda ki bölgenin PZR yöntemi ile çoğaltılıp agaroz jelde yürütüldükten sonra oluşturdukları bant görüntüleri. M: Markır DNA, B: Blank. 47 Şekil 9. Hasta gruba ait bazı örneklerin, AT2R geni intron 1 ve ekson 2 arasında ki 310 bç. uzunluğunda ki bölgenin PZR yöntemi ile çoğaltılıp agaroz jelde yürütüldükten sonra oluşturdukları bant görüntüleri. M: Markır DNA, B: Blank, Bantlar 310 bp. büyüklüğündedir. AT2R geninin 1675 polimorfizmini içeren 310 bç.’ lik bölgesi PZR yöntemi kullanılarak çoğaltıldıktan sonra RFLP yöntemi kullanılarak HYP 188 III restriksiyon enzimi ile kesildi. Kesim reaksiyonu sonucunda adeninden guanine (A>G) nükleotit değişimi olmayan homozigot bireylerde (AA genotipli) 310 bç’ lik tek bant, tek allelinde nükleotit değişimi olan heterozigot bireylerde (AG genotipli) 310, 206, 104 bç’ lik üç bant, her iki allelinde nükleotit değişimi görülen bireylerde de (GG genotipli) 206, 104 bç’ lik 2 bant görülmüştür. (Şekil 10,11.) Şekil 10. Hasta ve kontrol gruplarına ait bazı örneklerin RFLP yöntemi ile (HYP 188 III enzimi ile) kesilip, agaroz jelde yürütüldükten sonra oluşturdukları bant görüntüleri. M: Markır DNA, AA, AG, GG: genotipler. 48 Şekil 11. Hasta ve kontrol gruplarına ait bazı örneklerin RFLP yöntemi ile (HYP 188 III enzimi ile) kesilip, agaroz jelde yürütüldükten sonra oluşturdukları bant görüntüleri. M: Markır DNA, AA, AG, GG: genotipler. 104 bç.’lik bant bu jel görüntüsünde, soluk olmasından dolayı görünmemektedir. Çalışmamızda yer alan 131 preeklampsili gebe kadının AT2R geni A1675G polimorfizmi açısından RFLP yöntemi ile analizi sonucunda 63’ ünün AG, 39’ nun AA, 28’nin GG genotipine sahip olduğu belirlenmiştir. Çalışılan hastalardan bir tanesinden ise sonuç elde edilememiştir. Çalışmamızda 86 normal gebeden oluşan kontrol grubunun ise 43’nün AG, 34’nün AA, 9’ nun GG genotipine sahip olduğu belirlenmiştir. Hasta ve kontrol grubuna ait bireylerin genotipleri çizelge 15 ve 16 ‘te verilmiştir. 49 Çizelge 15. Preeklamptik grubun AT2R geni 1675 bölgesi için Hyp 188 III enzimi ile kesimi sonucunda elde edilen genotip kodları. Hasta AT2R Hasta AT2R Hasta AT2R Hasta AT2R Hasta AT2R No 1675 No 1675 No 1675 No 1675 No 1675 P1 GG P27 AA P53 AA P79 AG P105 AA P2 AA P28 GG P54 AA P80 AG P106 AG P3 GG P29 AA P55 AA P81 GG P107 AA P4 AG P30 AG P56 AG P82 AG P108 AG P5 GG P31 AG P57 AA P83 AG P109 AG P6 AG P32 AG P58 AG P84 GG P110 AG P7 GG P33 AA P59 GG P85 AG P111 AG P8 GG P34 AG P60 AG P86 AG P112 AG P9 AG P35 AG P61 AA P87 AG P113 AG P10 AG P36 AG P62 AG P88 AG P114 GG P11 AG P37 AG P63 AA P89 AA P115 GG P12 AG P38 AG P64 AA P90 AA P116 AA P13 AA P39 AG P65 AA P91 AA P117 AG P14 GG P40 AG P66 AA P92 GG P118 AG P15 AG P41 AG P67 AA P93 AG P119 AG P16 GG P42 GG P68 GG P94 AA P120 AG P17 GG P43 AA P69 AG P95 GG P121 AG P18 GG P44 AA P70 AG P96 AA P122 AG P19 AA P45 GG P71 AA P97 AA P123 AG P20 GG P46 AA P72 AG P98 AA P124 AA P21 AA P47 AG P73 GG P99 AG P125 AG P22 AG P48 AG P74 AG P100 AG P126 GG P23 AA P49 AG P75 AG P101 AG P127 AA P24 AG P50 GG P76 AA P102 AA P128 GG P25 AA P51 AA P77 AG P103 AA P129 AG P26 AG P52 GG P78 GG P104 GG P130 AG 50 Çizelge 16. Kontrol grubunun AT2R geni 1675 bölgesi için Hyp 188 III enzimi ile kesimi sonucunda elde edilen genotip kodları. Hasta AT2R Hasta AT2R Hasta AT2R Hasta AT2R No 1675 No 1675 No 1675 No 1675 K1 AG K23 AG K45 AA K67 AA K2 AA K24 AG K46 GG K68 AG K3 AA K25 AA K47 AG K69 AG K4 AG K26 AA K48 AA K70 AG K5 AG K27 AG K49 AG K71 AA K6 AG K28 AG K50 AA K72 AG K7 AG K29 GG K51 AG K73 AG K8 AG K30 AG K52 AA K74 AG K9 AA K31 AA K53 AA K75 AG K10 GG K32 AG K54 AG K76 AG K11 AA K33 GG K55 AG K77 AG K12 GG K34 AG K56 AG K78 AA K13 AG K35 AA K57 AA K79 AG K14 AA K36 AG K58 AA K80 AA K15 AG K37 AA K59 AA K81 AA K16 AA K38 AA K60 AG K82 AA K17 AG K39 GG K61 AG K83 AG K18 AG K40 AG K62 AA K84 AG K19 AA K41 AA K63 GG K85 AG K20 AA K42 AA K64 AG K86 GG K21 AA K43 AG K65 AA K22 AA K44 AG K66 GG AT2R geni A1675G polimorfizminin genotip dağılımları ve allel frekansları SPSS 11.5 Ki kare (χ2) testi kullanılarak analiz edilmiştir. (Çizelge 17-18). Hasta ve kontrol grupları arasında genotip dağılımları açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır (p=0.07). Ancak AA ve AG genotipleri birlikte değerlendirildiğinde GG genotipine bakıldığında, hasta grupta kontrol grubuna göre anlamlı bir fark bulunmuştur (p=0.034). Allel frekansları karşılaştırıldığında ise, her iki grup arasında istatistiki olarak anlamlı bir fark bulunmuştur (p=0.033). G alleline preeklamptik grupta 51 kontrol grubuna kıyasla daha fazla rastlanması, G allelinin hastalığa yakalanma riski ile yakından ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Çizelge 17. AT2R geni 1675 bölgesi için hasta ve kontrol gruplarına ait genotip frekansları (n: birey sayısı) Genotip Frekansları Kodominant Model Dominant Resesif AG+GG AG+AA AA GG AA GG AG n n n n n % % % % % Preeklampsi 39 28 63 91 102 (n:130) 30 21.5 48.5 70 78.5 Kontrol 34 9 43 52 77 (n:86) 39.5 60.5 89.5 0.147 0.034 χ2 10.5 50 0.07 Testi Çizelge 18. AT2R geni 1675 bölgesi için hasta ve kontrol gruplarına ait allel frekansları (n: birey sayısı) Allel Frekansları A G n n % % Preeklampsi 141 119 (n:130) 54.2 45.8 Kontrol 111 61 (n:86) 64.5 35.5 χ2 0.033 Testi 52 4.2.2. IL4 Geni -590 C>T Polimorfizmi İçin Moleküler Genetik Bulgular IL4 geni -590 bölgesini içeren 196 baz çiftlik kısmı PZR yöntemi ile çoğaltıldı ve % 2’ lik agaroz jelde yürütüldü. Çalışılan hasta ve kontrollerden bazılarının PZR yöntemi ile çoğaltılmış IL-4 geni -590 bölgesine ait 196 baz çifti uzunluğunda ki bölgenin bant görüntüleri Şekil 12’ de gösterilmiştir. Şekil 12. Hasta gruba ait bazı örneklerin, IL4 geni -590 bölgesini içeren 196 baz çifti uzunluğundaki bölgenin PZR yöntemi ile çoğaltılıp agaroz jelde yürütüldükten sonra oluşturdukları bant görüntüleri. M: Markır DNA. IL4 geni -590 bölgesine ait 196 bç.’ lik bölge PZR yöntemi kullanılarak çoğaltıldıktan sonra RFLP yöntemi kullanılarak Ava II restriksiyon enzimi ile kesildi. Kesim reaksiyonu sonucunda sitozin timin (C>T) nükleotit değişimi olmayan homozigot bireylerde (CC genotipli) 174, 22 bç’ lik iki bant, tek allelinde nükleotit değişimi olan heterozigot bireylerde (CT genotipli) 196, 174, 22 bç’ lik üç bant, her iki allelinde nükleotit değişimi görülen bireylerde de (TT genotipli) 196 bç’ lik tek bant oluşmuştur. (Şekil 13,14) CT genotipli bireylerde 196 bç.’lik ve 174bç.’lik bantlar birbirine yakın olduğu için agaroz jelde ayrılmamalarından dolayı kesim ürünleri poliakrilamid jel elektroforezinde yürütülerek bant görüntüsü elde edildi. (Şekil 13,14) Ancak CT ve TT genotipli bireylerde görülmesi beklenen 22 bç.’lik bant, çok küçük olmasından dolayı, P92 numaralı hasta örneği haricinde diğer örneklerde (Şekil 13), hem poliakrilamid ve hem de agaroz jel görüntüsünde görülememiştir. (Şekil 13,14) 53 Şekil 13. Hasta ve kontrol gruplarına ait bazı örneklerin RFLP yöntemi ile (Ava II enzimi ile) kesilip, poliakrilamid jelde yürütüldükten sonra oluşturdukları bant görüntüleri. M: Markır DNA, CC, CT, TT: genotipler. Şekil 14. Hasta ve kontrol gruplarına ait bazı örneklerin RFLP yöntemi ile (Ava II enzimi ile) kesilip, poliakrilamid jelde yürütüldükten sonra oluşturdukları bant görüntüleri. M: Markır DNA, CC, CT, TT: genotipler. Çalışmamızda yer alan 131 preeklampsili gebe kadının IL-4 geni -590 C>T polimorfizmi açısından RFLP yöntemi ile analizi sonucunda 89’ unun CC, 34’ nün CT, 5’inin TT genotipine sahip olduğu belirlenmiştir. Çalışılan hastalardan üç tanesinden ise 54 sonuç elde edilememiştir. Çalışmamızda 86 normal gebeden oluşan kontrol grubunun ise 63’ünün CC, 21’ inin CT, birinin TT genotipine sahip olduğu belirlenmiştir. Preeklampsili gruptan P75, P119, P122 ve kontrol grubundan K26 numaralı örneklerden sonuç alınamamıştır. Hasta ve kontrol grubuna ait bireylerin genotipleri çizelge 19 ve 20‘ de verilmiştir. Çizelge 19. Preeklamptik grubun IL-4 geni -590 bölgesi için Ava II enzimi ile kesimi sonucunda elde edilen genotip kodları. Hasta IL-4 Hasta IL-4 Hasta IL-4 Hasta IL-4 Hasta IL-4 No -590 No -590 No -590 No -590 No -590 P1 CC P27 CT P54 CC P80 CT P106 CT P2 CC P28 CC P55 CT P81 CT P107 CT P3 CC P29 CC P56 CC P82 CC P108 CT P4 CC P30 CC P57 CC P83 CT P109 CC P5 CC P31 CC P58 CC P84 CC P110 CC P6 CT P32 CC P59 CC P85 CC P111 CT P7 CC P33 CC P60 CC P86 CC P112 CT P8 CC P34 CT P61 CT P87 CC P113 CC P9 CT P35 CC P62 CC P88 CC P114 CT P10 CC P36 CC P63 CC P89 CT P115 CC P11 CC P37 CC P64 CC P90 CT P116 CC P12 CT P38 CC P65 CC P91 CC P117 CC P13 CC P39 CT P66 CT P92 CT P118 CT P14 CC P40 CT P67 CC P93 TT P119 P15 CT P41 CC P68 CT P94 CC P120 CC P16 CC P42 CC P69 CC P95 TT P121 CT P17 CT P43 CC P70 CC P96 TT P122 P18 CC P44 CC P71 CC P97 CC P123 CC P19 CC P45 CC P72 CC P98 CC P124 CC P20 CT P46 CT P73 CC P99 CT P125 CC P21 CC P47 CC P74 CC P100 CC P126 CT P22 CC P48 CT P75 P101 TT P127 CC P23 CC P50 CC P76 CC P102 CC P128 CC P24 CC P51 CC P77 CC P103 CC P129 CC P25 CC P52 CT P78 CC P104 CC P130 CC P26 CC P53 TT P79 CC P105 CC P131 CT 55 Çizelge 20. Kontrol grubunun IL-4 geni -590 bölgesi için Ava II enzimi ile kesimi sonucunda elde edilen genotip kodları. Kontrol IL-4 Kontrol IL-4 Kontrol IL-4 Kontrol IL-4 No -590 No -590 No -590 No -590 K1 CC K23 CC K45 CC K67 CC K2 CT K24 CC K46 CC K68 CC K3 CT K25 CC K47 CT K69 CC K4 CC K26 K48 CC K70 CC K5 CC K27 CC K49 CT K71 CC K6 CC K28 CT K50 CC K72 CC K7 CT K29 CC K51 CC K73 CT K8 TT K30 CC K52 CC K74 CC K9 CC K31 CC K53 CC K75 CC K10 CC K32 CC K54 CT K76 CC K11 CT K33 CT K55 CT K77 CC K12 CT K34 CC K56 CC K78 CT K13 CC K35 CC K57 CC K79 CC K14 CC K36 CC K58 CC K80 CC K15 CC K37 CC K59 CC K81 CC K16 CT K38 CT K60 CC K82 CT K17 CC K39 CC K61 CC K83 CC K18 CC K40 CC K62 CT K84 CC K19 CC K41 CC K63 CC K85 CT K20 CC K42 CC K64 CC K86 CC K21 CC K43 CT K65 CC K22 CT K44 CT K66 CC IL-4 geni -590 C>T polimorfizminin genotip dağılımları ve allel frekansları SPSS 11.5 Ki kare (χ2) testi kullanılarak analiz edilmiştir. (Çizelge 21, 22). Hasta ve kontrol grupları arasında genotip dağılımları ve allel frekansları açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır (p>0.05). 56 Çizelge 21. IL-4 geni -590 bölgesi için hasta ve kontrol gruplarına ait genotip frekansları. birey sayısı) (n: Genotip Frekansları CT+CC CT+TT TT CC n n n % % % % 89 5 34 123 39 (n:128) 69.5 3.9 26.6 96.1 30.5 Kontrol 63 1 21 84 22 (n:85) 74.1 1.2 24.7 98.8 25.9 0.238 0.468 CC TT CT n n % Preeklampsi χ2 0.456 Testi Çizelge 22. IL-4 geni -590 bölgesi için hasta ve kontrol gruplarına ait allel frekansları. (n: birey sayısı) Allel Frekansları C T n n % % Preeklampsi 212 44 (n:128) 82.8 17.2 Kontrol 147 23 (n:85) 86.5 13.5 χ2 0.310 Testi 57 5. TARTIŞMA Preeklampsi, etiyolojisi ve patofizyolojisi hala bilinmeyen heterojen sebeplere dayalı bir hastalık olmasına rağmen, hastalığın etiyolojisini yönlendirecek önemli immün faktörler ve genetik bileşenlere sahiptir101. Asosiyasyon çalışmalarında 70’ ten fazla gen incelenmiş, ancak araştırmacılar biyolojik hipotezlere dayanarak ve preeklampsiye olan katkılarını değerlendirerek yaklaşık 7 gen belirlemişlerdir. Yapılan yeni çalışmalarda preeklampsiye sahip olan ve olmayan kadınlar incelenerek populasyonda yaygın olarak bulunan ve pereeklampsiye sebep olan alleller ve bu allelerdeki mutasyon sıklığı belirlenmeye çalışılmıştır79. Bu çalışmada fetomaternal dönemde meydana gelen sitokinlerden birisi olan IL-4 ve RAS’ın vazoaktif elementlerinden birisi olan AT2--R genlerinin genotip dağılımları ve allel frekansları incelenmiştir. Renin anjiyotensin sistemi (RAS); su-tuz dengesinin preeklampsinin patofizyolojisinin belirlenmesinde çok önemlidir 102 ayarlanmasında, . RAS’ın bütün önemli bileşenleri, plasenta ve uterusta mevcuttur. Ayrıca normal gebelikte damar direnci, kan basıncı, plazma volümü azaldığından dolayı RAS’ ın uyarısı sonucu plazma renin aktivitesi, anjiyotensin II (AngII) ve aldosteron seviyesinde artışa neden olur. Fakat preeklampsili gebeliklerde plazmada anjiyotensinojenin yüksek molekül ağırlıklı formu artarken, plazma seviyesinde AngII ve renin seviyesi azalır. RAS’ ın vazoaktif elementlerindeki bu değişiklikler PE’ nin patofizyolojisinde önemli bir rol oynar. RAS’ın son etkin maddesi anjiyotensin II’ dir103. AT2-R geni; anjiyotensin II’ nin reseptörlerinden birisi olup, büyümeyi inhibe edici, damar çapını arttırıcı, antihipertrofik ve proapoptotik etkileri mevcuttur. Normal feto-plasental gelişim, AT2-R ve anjiyotensin II’nin diğer alt tipi olan AT1-R genlerinin düzenli eksprese olmasını ve taşınmasını gerektirir. Pek çok çalışmada hipertansiyonlu gebeliklerde, AT1-R ve AT2R genlerinin ekspresyonunun tetiklenebileceği düşünülmektedir104. Çalışmamızda yer alan AT2-R geni A1675G polimorfizmi ile ilgili Türk populasyonuna ait başka bir çalışma bulunmayıp, literatüre girmiş diğer populasyonlara ait çeşitli çalışmalar bulunmaktadır. Literatürde, AT2R geni A1675G polimorfizmini preeklampsi ile ilişkilendiren bir çalışma bulunmaktadır. Bu çalışma Akbar102 ve arkadaşlarının 3 farklı 58 etnik gruptan (Afro- Karayip, Asya ve Kafkas) 236’ sı preeklampsili, 426’ sı sağlıklı toplam 662 gebe kadın ile yapılan çalışmadır. Bu çalışmaya göre Afro-Karayip populasyonuna ait örneklerde AT2R geni 1675 pozisyonunda GG genotipi ile preeklamptik gebelik arasında önemli bir ilişki bulunmuştur (p<0.05, Çizelge 23). Kafkas populasyonunda ise preeklampsili gebelerde GG genotipi frekansı normal gebelere göre yaklaşık 2 kat daha fazladır ancak bu farklılığın önemli olup olmadığını belirlemek için çalışılan hasta sayısı yeterli değildir. Asya populasyonuna ait normal ve preeklampsili gebelerde genotip dağılımları arasında önemli bir faklılık bulunamamıştır (p>0.05, Çizelge 23). Çalışmamızda da Akbar102 ve arkadaşlarının çalıştığı Asya ve Kafkas populasyonu ile uyumlu olarak genotip dağılımları bakımından hasta ve kontrol grubu arasında anlamlı bir farklılık bulunamamıştır (p>0.05, Çizelge 23). Çalışmamızdaki hastalar da dahil bu dört populasyona ait tüm elde edilen veriler toplandığında genotip dağılımı açısından önemli bir farklılık bulunmuştur (p=0.033, Çizelge 23). Asya ve Kafkas populasyonlarında allel frekansı açısından önemli bir farklılık bulunamamıştır (p>0.05, Çizelge 24). Afro-Karayip populasyonunda p değerinin 0.05’ e yakın olması nedeniyle (p=0.049, Çizelge 24) allel frekansı açısından anlamlı bir farklılık bulunmuştur. Çalışmamızda da Afro-Karayip populasyonu ile uyumlu olarak G allelinin preeklamptik grupta kontrol grubuna kıyasla daha yüksek frekansta bulunması ve p değerinin 0.05’ten küçük (p=0.033, Çizelge 24) olması nedeniyle allel frekansı bakımından önemli bir farklılık bulunmuştur. Bu durumda G alleline sahip olmanın, preeklampsiye yakalanma riskinde artışa neden olabileceği düşünülebilir. Çalışmamızda ki hastalar da dahil bu dört populasyona ait tüm elde edilen veriler toplandığında allel frekansı açısından önemli bir farklılık bulunamamıştır (p=0.149, Çizelge 24). Bu dört populasyonda genotip ve allel frekansları açısından farklılık olması preeklampsi ve AT2R geni arasında bölgesel ve etnik farklılıkların olabileceğini hatırlatmaktadır. Ayrıca hasta ve kontrol grubuna ait birey sayısının arttırılması, sonuçları güçlendirecektir. 59 Çizelge 23. Afro-Karayip, Asya, Kafkas ve Türk populasyonlarına ait AT2R geni 1675 bölgesi için preeklampsi ve kontrol grubu genotip dağılımları. (n: birey sayısı) Preeklampsi n (%) n Afro- Asya Kafkas Türk Toplam Genotip Frekansı AA AG GG 9 67 Karayip 122 47 130 Kontrol n (%) 25 33 (13.4) 30 (37.3) (49.3) 64 28 (24.6) 7 (52.5) (23.0) 27 13 (14.9) 39 (57.4) (27.7) 63 28 (30) 85 (48.5) (21.5) 179 102 (23,2) (48.9) (27.8) 366 Genotip Frekansı n 119 AA AG GG 14 73 32 χ2 0.005 189 (11.8) (61.3) (26.9) 42 99 48 118 (22.2) (52.4) (25.4) 28 73 17 0.606 0.175 (23.5) (61.7) (14.8) 34 43 9 86 506 (39.5) 118 (50) 288 (10.5) 106 0.07 0.033 (23.3) (56.9) (20.9) Çizelge 24. Afro-Karayip, Asya, Kafkas ve Türk populasyonlarına ait AT2R geni 1675 bölgesi için preeklampsi ve kontrol grublarının allel frekansları. (n: birey sayısı) Preeklampsi n (%) n Afro- 67 Karayip Asya 122 Kafkas 47 Türk Toplam 130 366 Allel Frekansı A G Kontrol n (%) n 43 91 (32.1) 124 (67.9) 120 (50.8) (49.2) 41 53 (43.6) (56.4) 141 119 (54.2) (45.8) 349 383 (47.7) (52.3) 119 189 118 86 506 Allel Frekansı A G 101 137 (42.4) 183 (57.6) 195 (48.4) (51.6) 129 107 (54.7) (45.3) 111 61 (64.5) (35.5) 524 500 (51.2) (48.8) χ2 0.049 0.558 0.070 0.033 0.149 Takeda-Matsubara104 ve arkadaşları farelerin umblikal kord ve plasentalarındaki kan damarlarında hamilelik döneminde kan basıncının düzenlenmesinde AT2R geni ekspresyonunun önemli faktörlerden birisi olduğunu bildirmişlerdir. Nishimura ve arkadaşları111 yaptıkları çalışmada ekson 2 eksikliğinin düşük seviyedeki anormal mRNA splayzingine bağlı olduğunu bulmuşlardır. Bu olayda 1675G alleli taşıyıcısı 60 olmakla, AT2-R’ nin düşük seviyede eksprese olması ile ilişkili olduğu konusunda çıkarımda bulunmuşlardır. Wernecke ve arkadaşları112 ise tam tersi olarak bir mRNA splayzing kalıbı değişikliğinin AT2R 1675G polimorfizmi ile bağlantılı olmadığını ancak AT2R geni ekspresyon seviyesinin yükselmesi ile ilişki olduğunu bulmuşlardır. AT2R geni 1675. pozisyonda GG genotipi taşınması ile ilişkili AT2R geninin ekspresyonundaki değişiklik gebelik esnasında feto plasental ünitede birbirinin antagonisti olarak çalışan AT1-AT2 reseptörleri arasındaki dengeyi bozmaktadır. Bu yüzden gebeliğin ilk yarısında anjiyotensin II’ nin etkileri AT2 reseptörü aracılığı ile olmaktadır. AT2 reseptörü etkisi ile anjiyogenez ve hücre proliferasyonu azalır ve apoptozis artar. Bu olaylar da preekalmpside gözlenen hatalı plasentasyon ve spiral arterlerin yeniden oluşumunun tamamlanamamasına neden olur102. Çalışmamızda elde ettiğimiz sonuçlar, Wernecke ve arkadaşlarının112 elde ettiği sonuçlar ile uyumlu olup, G allelinin preeklampsiye yatkınlıkta belirleyici bir genetik faktör olduğunu düşündürmektedir. Sağlıklı bir gebelik annenin normal bir savunma mekanizmasına bağlıdır106. İnterlökin 4 (IL-4), fetomaternal dönemde anti-inflamatuvar sistemde yer alan sitokinlerden birisidir. Bu dönemde IL-4 seviyesinde artış söz konusudur. Düşük ile sonuçlanan gebelikler incelendiğinde, IL-4 seviyesinde azalma olduğu gözlemlenmiştir107. IL-4 seviyesi preeklampsi meydana gelmesinde risk artışına neden olabilir. Yapılan çalışmalarda, gebelik esnasında desidual hücrelerdeki IL4 ekspresyonunun azalması ile spontan düşükler meydana geldiği gözlenmiştir. IL4’ ün aşırı eksprese olması da fetüsün gelişimi için olumsuz koşullar yaratmaktadır. Çalışmamızda yer alan IL-4 geni -590 C/T polimorfizminin preeklampsi ile ilişkisi daha önce R. Fraser ve arkadaşları108 tarafından araştırılmıştır. Fraser ve arkadaşları, bu çalışmayı 146 sağlıklı, 117 preeklampsili toplam 263 gebe ile yapmışlardır. Bu çalışmanın sonuçlarına göre p değerinin 0.05’ e yakın olması nedeniyle, IL-4 geni -590 C/T tek nükleotid polimorfizmi ile preeklampsiye eğilim yönünde önemli bir ilişki bulunmuştur (p=0.055, Çizelge 25). Özellikle -590 pozisyonunda ki TT genotipi frekansının, preeklamptik grupta kontrol grubuna göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir (Çizelge 25). Çalışmamızda da -590 pozisyonunda TT genotipi oranı, Fraser ve arkadaşlarının yaptığı çalışma ile uyumlu olarak, preeklamptik grupta kontrol grubuna göre daha fazla bulunmuştur ancak istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık elde 61 edilememiştir (p=0.456, Çizelge 25). Bunun nedeni çalışmada yeterli sayıda hasta ve kontrol bulunmaması olabilir (Çizelge 25). Çalışmamızda, Fraser ve arkadaşlarının çalışması ile uyumlu olarak CC genotipi frekansının, preeklamptik grupta kontrol grubuna göre daha düşük olduğu belirlenmiştir. Ancak CT heterozigot genotipi oranı her iki grupta da birbirine yakın bulunmuştur. CC ve CT genotiplerinin preekalmpsiye yatkınlıkta veya korunmada rol oynamadığı düşünülmektedir. Hem çalışmamızda hem de Fraser ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada108 allel frekansı açısından önemli bir farklılık bulunamamıştır (p>0.05, Çizelge 25). Her iki çalışmada da allel frekansı oranları birbiri ile uyumlu olup, C alleli kontrol grubunda daha yüksek oranda gözlenirken, T allelinin preeklamptik gruptaki oranı daha yüksektir (Çizelge 25). Bu durum, T allelinin preeklampsiye yatkınlıkla ilişkisi olabileceğini düşündürmektedir. Çizelge 25. Çalışmamız ve R.Fraser ve arkadaşlarının yaptığı çalışmaya ait IL-4 geni -590 bölgesi C>T polimorfizmi için preeklampsi ve kontrol grubu genotip ve allel frekansları. (n: birey sayısı) Genotip Frekansı n (%) n Preeklampsi Çalışmamız Kontrol Çalışmamız Preeklampsi 128 85 117 Fraser Kontrol Fraser 146 CC CT TT 89 34 5 (69.5) (26.6) (3.9) 63 21 1 Allel Frekansı n (%) χ2 0.456 (74.1) (24.7) (1.2) 78 29 10 37 3 (72.6) (25.3) (2.1) T 212 44 χ2 (82.8) (17.2) 0.310 147 23 (86.5) (13.5) 185 (66.7) (24.8) (8.5) 106 C 49 (79.1) (20.9) 0.055 249 43 0.062 (85.3) (14.7) Fraser ve arkadaşlarının çalışmasına ait veriler ile çalışmamıza ait verileri birleştirip değerlendirdiğimizde preklamptik grup ile kontrol grubu arasında genotip oranları açısından istatistiksel olarak anlamlı bir sonuç elde edilmiştir (p=0.045, Çizelge 26). Her iki çalışmaya ait CC, CT ve TT genotip oranları toplamı hem çalışmamız hem de Fraser ve arkadaşlarının çalışma sonuçlarındaki genotip oranları ile uyumludur. Dolayısı ile bir çelişki bulunmamaktadır. Aynı şekilde her iki çalışmanın allel frekansı verilerinin toplamı değerlendirildiğinde, p değerinin 0.05’ e yakın olması nedeni ile anlamlı bir farklılık bulunmuştur (p=0.052, Çizelge 26). Her iki çalışma sonuçlarının birlikte değerlendirilmesi ile istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık bulunması, hasta ve 62 kontrol grubuna ait birey sayısının arttırılması ile sonuçların güçlenebileceğini düşündürmektedir. Çizelge 26. Çalışmamız ve R. Fraser ve arkadaşlarının yaptığı çalışmanın sonuçlarının toplamına ait IL-4 geni -590 bölgesi C>T polimorfizmi için preeklampsi ve kontrol grupları genotip ve allel frekansları. (n: birey sayısı) Genotip Frekansı n (%) n CC CT TT 167 63 Allel Frekansı n (%) χ2 C T 15 397 93 (6.1) (81) (19) χ2 Preeklampsi Çalışmamız + 245 (68.2) (25.7) Fraser 169 Çalışmamız + 0.052 0.045 Kontrol 231 58 (73.2) (25.1) 4 396 66 (1.7) (85.7) (14.3) Fraser 63 6. SONUÇ VE ÖNERİLER Bu çalışmada Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Doğum Ana Bilim Dalı polikliniklerinde takip edilen 131 preeklampsili gebe ve 86 sağlıklı gebe Anjiyotensin 2 tip II Reseptör Geni A1675G polimorfizmi ve İnterlökin 4 Geni -590 C>T polimorfizmleri açısından moleküler genetik yöntemlerle değerlendirildi ve genotip dağılımları belirlendi. Elde edilen sonuçlar aşağıda belirtilmiştir. 1. Hasta ve kontrol grubuna ait yaş, ağırlık, gebelik haftası, sistolik ve diastolik kan basıncı değerleri bakımından istatistiksel olarak farklılık olduğu saptandı (p<0.05). 2. AT2-R geni 1675 polimorfizminde genotip frekansları bakımından istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık bulunamamıştır (p=0.07). Ancak allel frekansları bakımından anlamlı bir farklılık elde edilmiştir (p=0.033). 3. Hasta ve kontrol grubu arasında GG genotipi frekansı açısından istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık bulunmamıştır. Ancak GG genotipi oranının preeklamptik grupta (% 21.5) kontrol grubuna (%10.5) kıyasla daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Bu durum GG genotipinin preeklampsi ile ilişkili olabileceğini düşündürebilir fakat çalışılan sayının arttırılması gerekir. 4. G alleli oranının preeklamptik grupta (%45.8) kontrol grubuna (%35.5) kıyasla daha yüksek bulunması ve istatistiksel olarak da anlamlı bir farklılık elde edilmesi, G allelinin hastalığa yakalanma riskiyle yakından ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. 5. Dominant modelde AG+GG, AA genotip frekansı preeklamptik grupta %70 iken, kontrol grubunda %60.5 olarak bulunmuştur. Bu modelde istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık saptanmamıştır (p=0.147). AG+AA toplamının, GG genotipi ile karşılaştırıldığı resesif modelde genotip frekansı preeklamptik grupta %78.5 iken, kontrol grubunda %89.5 olarak bulunmuştur. Resesif modelde hasta ve kontrol grubu arasında anlamlı bir farklılık saptanmıştır (p=0.034). 6. IL-4 geni -590 polimorfizminde genotip (p=0.456) ve allel (p=0.310) frekansları açısından istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık saptanmamıştır. 7. TT genotipi oranı genel olarak hem hasta grubunda hemde kontrol grubunda diğer genotiplere oranla (CT, CC) daha düşük olarak bulunmuştur. T alleline rastlanma 64 sıklığının, C alleline oranla daha düşük olduğu belirlenmiştir. Bu durum, Türk toplumunda C allel frekansı, T allel frekansına göre daha yüksektir şeklinde yorumlanabilir. 8. Dominant modelde CT+TT, CC genotip dağılımı hasta grubunda %30.5 iken, kontrol grubunda %25.9 olarak bulunmuştur. Resesif modelde CT+CC, TT genotip dağılımı hasta grubunda %96.1 iken, kontrol grubunda %98.8’ dir. Hasta ve kontrol grubu arasında dominant (p=0.468) ve resesif (p=0.238) modelde istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık saptanmamıştır. AT2-R geni 1675 ve IL-4 geni -590 C>T polimorfizmlerinin preeklampsi ile ilişkisi üzerine yapılan çalışmalarda genotip ve allel frekansları arasında populasyonlara özgü farklılıklar elde edilmiştir. Farklılıkların yanı sıra farklı populasyonlara ait birbirini destekleyen benzer bulgularda elde edilmiştir. Bizim çalışmamızda da diğer çalışmalarla uyumlu ve farklı sonuçlar bulunmuştur. Bu polimorfizmler ile preeklampsi arasındaki ilişki hakkında kesin bir yargıya varmak için örneklem sayısının daha geniş bir aralıkta olması gerekmektedir. 65 KAYNAKLAR 1. Eva ML, Smets A, Allerdien VA, Attie TJI, Go B, John MG, Van VB, Cees BM, Oudejans A. Novel biomarkers in preeclampsia. Clinica Chimica Acta, 2006; 364: 22 – 32 2. Brosens JJ, Pijnenborg R, Brosens IA. The myometrial junctional zone spiral arteries in normal and abnormal pregnancies. Am J Obst Gynecol 2002; 187: 16– 23. 3. Pijnenborg R, Roberston WB, Brosens I, Dixon G. Trophoblastic invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta 1981; 2: 71– 91. 4. Prefumo F, Sebire NJ, Thilaganathan B. Decreased endovascular trophoblast invasion in first trimester pregnancies with high-resistance uterine artery Doppler indices. Hum. Reprod 2004; 19: 206–9. 5. Pazarbaşi A, Kasap M, Güzel AI, Kasap H, Onbaşioğlu M, Ozbakir B, Demirkazik A, Ozgünen FT, Gürtunç E. Polymorphisms in the tumor necrosis factor-alpha gene in Turkish women with pre-eclampsia and eclampsia. Acta Med Okayama. 2007;61(3):153-60. 6. Bereketoğlu C, Kasap M, Pazarbaşı A. Studies on Angiotensin-converting enzyme insertion/deletion polymorphism and genotype distributions in Turkish preeclampsia patients. J Pregnancy. 2012;108-206. 7. Meekins JW, Pijnenborg R, Hanssens M, van Assche A, McFadyen IR. A study of placental bed spiral arteries and trophoblast invasion in normal and severe pre-eclamptic pregnancies. Brit J Obstet Gynaecol 1994; 101: 669–74. 8. Alexander BT, Bennett WA, Khalil RA, Granger JP. Preeclampsia: linking placental ischemia with cardiovascular–renal dysfunction. News Physiol Sci. 2001;16:282– 6. 9. Ökten F, Şen S. Gebelikte hipertansif hastalıklar, pre-eklampsi, eklampsi ve hellp sendoromu’nda obstetrik anestezi. Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Mecmuası, 2002; 55(1): 73-84 10. Gebelikte Hipertansiyon ve Preeklampsi Erişim: (http://www.gebelik.org/dosyalar/preeklampsi.html) 2012. Erişim Tarihi: 19.06.2012 11. Mandy J. Bell, A Historical Overview of Preeclampsia-Eclampsia. Journal of Obstetetric Gynecology Neonatal Nurs. 2010; 39(5): 510–518. 12. Sibai N, Caritis SN. Prevention of pre-eclampsia with low dose aspirin in healthy nulliparaus pregnant women. Eng J. Med, 1993; 329: 1213 13. Şen C, Madazlı R, Ocak V. Gebelikte Hipertansiyon/Tanım ve Sınıflandırma. Perinatoloji Dergisi. 1993; 1: 7-10, 14. Sibai BM, Lindheimer M, Hauth J, Caritis S, et al. Risk factors for preeclampsia, abrubtio placenta, and adverse neonatal outcomes among women with chronic hypertension. N Eng J Med 1998; 339-667. 15. Cunningham FG, Mac Donald PC, Gant NF, et al. Hypertensive Disorders in Pregnancy . Williams Obstetrics. 21th. Ed. Appleton & Lange , 2001 ; 567-618. 66 16. Schroeder BM. Practice Bulletin Diagnosis and management of preeclampsia and eclampsia. Am Fam Physician. 2002; 66(2): 330-331 17. Chobanian AV, Bakris GL, Black HR, Cushman WC, Green LA, Izzo Jr JL, Jones DW, Materson BJ, Oparil S, Wright Jr JT, Roccella EJ. Seventh Report of the Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure. Hypertension. 2003; 42: 1206-1252 18. Chesley LC. Hypertensive disorders in pregnancy. NY: Appleton-Century- Crofts .1978. 19. Sibai BM, Ewell M, Levine RJ, Klebanoff MA, Esterlitz J, Catalano PM, Goldenberg RL, Joffe G. Risk factors associated with nulliparous women preeclampsia in healthy. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 1997; 5(177): 1003-1010 20. Rinehart BK, Terrone DA, Lagoo-Deenadayalan S, Barber WH, Hale b EA, Martin Jr JN, Bennett WA. Expression of the placental cytokines tumor necrosis factor α, interleukin 1β, and interleukin 10 is increased in preeclampsia. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 1999; 4(185): 915-920 21. Sibai BM, Gordon T, Thorn E, Caritis SN, Klebanoff M, McNellis D. Risk factors for preeclampsia in healthy nulliparous women: a prospective multicenter study. American Journal of Obstetrics and Gynecology 1995;172: 642-8. 22. Hauth JC, Ewell MG, Levine RJ, Esterlitz JR, Sibai B, Curet LB, Catalan PM, Morris CD. Pregnancy outcomes in healthy nulliparas who developed hypertension. Obstetetric Gynecology 2000; 95: 24. 23. Dennis EJ, Mc Farland KF, Hester LL. The Preeclampsia- eclampsia Syndrome. Obstetrics and Gynecology. 4th. Ed. Philadelphia. 1982; 455-474. 24. Dekker G, Sukcharoen N. Etiology of Preeclampsia. J Med Assoc Thai. 2004; 87(3): S96-103 25. Hairong Xu, Shatenstein B, Luo ZC, Wei S, Fraser W. Role of nutirition in the risk of preeclampsia. Nutrition in clinic. 2009; 67(11): 639-657 26. Leduc L , Weeler JM, Kirshon B. Coagulation profile in severe preeclampsia. Obstet Gynecol. 1992; 79: 8 -14 27. Zhou Y, Damsky CH, Fisher SJ. Preeclampsia is associated with failure of human cytotrophoblasts. J Clin Invest. 1997; 99(9): 2152–2164 28. Lucilla P. Endothelial dysfunction in pre-eclampsia. Pharmacological reports. 2006; 58: 69-74 29. Redman CWG, Sargent IL. The pathogenesis of pre-eclampsia. Gynecol Obstet Fertil 2001; 29: 518-22 30. Zusterzeel PL,Rutten H , Roelofs HM, Peters WH, Steegers EA. Protein carbonyls in decidua and placenta of pre-eclamtic woman as markers for oxidative stree. Placenta 2001; 22: 213-219 31. Peterson H. Genetic studies of pre-eclampsia. Stockholm, Sweden, 2010. 32. Gary C, Norman FG, Kenneth JL, Larry CG, Jonh CH, Katharine DW. Williams Obstetrics, th 21 . Ed. 2001; 567-618. 33. Özdemir İ, Kemik Gül Ö, Yücel O. Preeklampsi, Eklampsi ve HELLP Sendromunda Maternal Morbidite ve Mortalite Nedenleri. Düzce Tıp Fakültesi Dergisi. 2003; 3: 5-9. 67 34. Sibai BM. Preeclampsia-Eclampsia. Current Problems in Obstetrics and Gynecology and Fertility. 1990; 13: 1-45. 35. Ray JG, Burrows RF, Burrows EA, Vermeulen MJ. Mos Hıp: McMaster outcome study of hypertension in pregnancy. Early Hum Dev. 2001; 64: 129-143 36. Magdy SM, Akolisa A, David G. Preeclampsia and antioxidant nutrients: Decreased plasma levels of reduced ascorbic acid, α-Tocopherol and betacarotene in women with preeclampsia. Am J Obstet Gynecol. 1994; 171:150-7. 37. Douglas KA, Redman CWG. Eclampsia in the United Kingdom. Br Med J 1994; 309: 1395. 38. Caughey A, Aaron B, Naomi E, A Eugene, Gabriel J. Maternal Ethnicity, Paternal Ethnicity, and Parental Ethnic Discordance: Predictors of Preeclampsia. Obstetrics Gynecology. 2005; 1(106): 156-161. 39. Duley L. The global impact of pre-eclampsia and eclampsia. Semin Perinatal. 2009; 33:130-137. 40. Lain KY, Roberts JM. Contemporary Preeclampsia. Jama. 2002; 287: 31-83. 41. Sağkan O. Gebelikte Hipertansiyon. Turkiye Klinikleri J Cardiology. 1996; 4: 9-165. 42. Van Pampus MG, Aarnoudse JG. Long-Term outcomes after preeclampsia. Clınıcal Obstetrıcs and Gynecology. 2005; 48(2 ) : 489-494. 43. Futagami S, Tatsuguchı A, Hıratsuka A, Shındo T, Horie A, Hamamoto T, Ueki N, Kusunoki M, Mıyake K, Gudıs K, Tsukuı T, Sakamato C. Monocyte chemoattractant protein 1 and CD40 ligation have a synergistic effect on vascular endothelial growth factor production through cylooxygenase 2 upregulation in gastric cancer. J Gastroenterol. 2008; 43: 216-224. 44. Nororiha IL, Niemir Z. Stein H, Waldher R. Cytokines and grawth factors in renal disease. Nephrol Dial Transplant. 1995; 10: 775-786. 45. Abbas AK, Lictman AH. Cellular and Moleculer Immunology. 5th. Ed. Saunders. 2003; 243-275. 46. Güner Y, Özmen D, Bayındır O. Sitokinler .T Klin J Med. 1997; 17 47. Robert V, Descotes HJ. Immunotoxicology, Pathology and Therapeutic Applications Cytokines in Human Health. France. 2007; 113-135 48. Selçuk Y, San A, Bakan E, Yiğitoğlu R. Plasma atrial natriuretic peptide and its relation to the renin-angiotensin-aldosterone system in patients with chronic renal failure. Nephrol Dial Transplant. 1991; 6: 557-561. 49. Matsubara H. Diseases Pathophysiological Role of Angiotensin II Type 2 Receptor in Cardiovascular and Renal. Journal of the American Heart Association. 1998; 83:1182-1191. Baudin B. Polymorphism in Angiotensin II Receptor Genes and Hypertension. Exp Physiol. 2005; 7: 277-282 50. Concepts of the Pathogenesis and Management of 51. Kizima K, Matsubara H, Murasawa S, Maruyama K, Ohkubo N, Mori Y, Inada M. Regulation of angiotensin II type 2 receptor gene by the protein kinase C–calcium pathway. Hypertension. 1996; 27: 529 –534. 52. Kizima K, Matsubara H, Murasawa S, Maruyama K, Mori Y, Inada M. Gene transcription of angiotensin II type 2 receptor is repressed by growth factors and glucocorticoids in PC12 cells. Biochem Biophys Res Commun. 1995; 216: 359 –366. 68 53. Murasawa S, Matsubara H, Kijima K, Maruyama K, Ohkubo N, Mori Y, lwasaka T, Inada M. Down-regulation by cAMP of angiotensin II type 2 receptor gene expression in PC12 cells. Hypertens Res. 1996;19: 271–279. 54. Ichiki T, Kambayashi Y, Inagami T. Multiple growth factors modulate mRNA expression of angiotensin II type-2 receptor in R3T3 cells. Circ Res. 1995; 77: 1070 –1076. 55. Dudley DT, Summerfelt RM. Characterization of angiotensin II (AT2) binding sites in R3T3 cells. Regul Pept. 1933; 44: 199 –206. 56. Kambayashi Y, Bardhan S, Inagami T. Peptide growth factors markedly decrease the ligand binding of angiotensin II type 2 receptor in rat cultured vascular smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 1993; 194: 478–482. 57. Ichiki T, Inagami T. Transcriptional regulation of the mouse angiotensin II type 2 receptor gene. Hypertension. 1995; 25: 720 –725. 58. Ichiki T, Kambayashi Y, Inagami T. Differential inducibility of angiotensin II AT2 receptor between SHR and WKY vascular smooth muscle cells. Kidney Int Suppl. 1996; 55: S14 –S17. 59. Kambayashi Y, Ichild T, Inagami T. Insulin and insulin-like growth factors induce expression of angiotensin type-2 receptor in vascular smooth muscle cells. Eur J Biochem. 1996;239:558 –565. 60. Bondy CA, Werner H, Roberts CT, LeRoith D. Cellular pattern of insulin-like growth factor-I and type I IGF receptor gene expression in early organogenesis: comparison with IGF-II gene expression. Mol Endocrinol. 1990; 4: 1386 –1398. 61. Horiuchi M, Koike J, Yamada T, Mukoyama M, Nakajima M, Dzau VJ. The growthdependent expression of angiotensin II type 2 receptor is regulated by transcription factors interferon regulatory factor-1 and -2. J Biol Chem. 1995; 270: 20225–20230. 62. Horiuchi M, Yamada T, Hayashida W, Dzau VJ. Interferon regulatory factor-1 up-regulates angiotensin II type 2 receptor and induces apoptosis. J Biol Chem. 1997; 272: 11952–11958. 63. Goto M, Mukoyama M, Suga S, Matsumoto T, Nakagawa M, Ishibashi R, Kasahara M, Sugawara A, Tanaka I, Nakao K. Growth-dependent induction of angiotensin II type 2 receptor in rat mesangial cells. Hypertension. 1997; 30: 358 –362. 64. Ward K and Lındheımer MD. Chesley’s Hypertensive Disorders in Pregnancy. Chapter 4 Genetic Factors in the Etiology of Preeclampsia/Eclampsia. 3th. Ed. 2009; 51-61. 65. Adams KM, Eschenbach DA. The genetic contribution towards preterm delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 2004; 9: 445–452. 66. Orsi NM, Gopichandran N, Simpson NA. Genetics of preterm labour. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2007; 21: 757–772. 67. Pennell CE, Jacobsson B, Williams SM, Buus RM, Muglia LJ, Dolan SM, Morken NH, Ozcelik H, Lye SJ. Genetic epidemiological studies of preterm birth: Guidelines for research. Am J Obstet Gynecol. 2007; 196(2): 107-18. 68. Nilsson E, Salonen Ros H, Cnattingius S, Lichtenstein P. The importance of genetic and enviromental effects for pre-eclampsia and gestational hypertansion: a family study. BJOG. 2004; 111(3): 6-200. 69 69. Chesley LC, Cooper DW. Genetics of hypertension in pregnancy: possible single gene control of pre-eclampsia and eclampsia in the descendants of eclamptic women. Br J Obstet Gynaecol, 1986; 93: 898-908. 70. Cooper DW, Liston WA. Genetic control of severe preeclampsia. J Med Genet. 1979; 16: 409– 416. 71. Sutherland A, Cooper DW, Howie PW, Liston WA, MacGillivray I. The indicence of severe pre-eclampsia amongst mothers and mothers-in-law of pre-eclamptics and controls. Br J Obstet Gynaecol. 1981; 88: 785–791. 72. Alexander BT. Prenatal influences and endothelial dysfunction: a link between reduced placental perfusion and preeclampsia. Hypertension. 2007; 49: 775–776. 73. O’Shaughnessy KM, Ferraro F, Fu B, Downing S, Morris NH. Identification of monozygotic twins that are concordant for preeclampsia. Am J Obstet Gynecol. 2000; 182: 1156–1157. 74. Treloar SA, Cooper DW, Brennecke SP, Grehan MM, Martin NG. An Australian twin study of the genetic basis of preeclampsia and eclampsia. Am J Obstet Gynecol. 2001;184: 374–381. 75. Chappell S, Morgan L. Searching for genetic clues to the causes of pre-eclampsia. Clin (Lond). 2006; 110: 443–458. 76. Artunç B. Preeaklampsi patolojisinde paternal etki. Uzmalık tezi, Zeynep Kamil Kadın ve Çocuk Hastalıkları Eğitim ve Araştırma Hastanesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Kliniği, İstanbul, 2009. 77. Ros HSS, Lichtenstein P, Lipworth L, Cnattingius S. Genetic effects on the liability of developing of preeclampsia and gestational hypertension. Am J Med Genet, 2000; 91: 256-60. 78. Vardar E. Obsesif Kompulsif Bozukluğun Genetiği. Klinik Psikofarmakoloji. 2000; 10(3): 153159. 79. Oudejans CB, van Dijk M, Oosterkamp M, Lachmeijer A, Blankenstein MA. Genetics of preeclampsia: paradigm shifts. Hum Genet. 2007; 120: 607–612. 80. Harrison GA, Humphrey KE, Jones N, Jones N, Badenhop R, Guo G, Elakis G, Kaye JA, Turner RJ, Grehan M, Wilton AN, Brennecke SP, Cooper DW. A genomewide linkage study of preeclampsia/eclampsia reveals evidence for a candidate region on 4q. Am J Hum Genet. 1997; 60: 1158–1167. 81. Arngrimsson R, Sigurardottir S, Frigge ML, Bjarnadóttir RI, Jónsson T, Stefánsson H, Baldursdóttir A, Einarsdóttir AS, Palsson B, Snorradóttir S, Lachmeijer AM, Nicolae D, Kong A, Bragason BT, Gulcher JR, Geirsson RT, Stefánsson K. A genomewide scan reveals a maternal susceptibility locus for preeclampsia on chromosome 2p13. Hum Mol Genet. 1999; 8: 1799–1805. 82. Moses EK, Lade JA, Guo G, Wilton AN, Grehan M, Freed K, Borg A, Terwilliger JD, North R, Cooper DW, Brennecke SP. A genome scan in families from Australia and New Zealand confirms the presence of a maternal susceptibility locus for pre-eclampsia, on chromosome2. Am J Hum Genet. 2000; 67: 1581–1585. 83. Lachmeijer AM, Arngrimsson R, Bastiaans EJ, Frigge ML, Pals G, Sigurdardóttir S, Stéfansson H, Pálsson B, Nicolae D, Kong A, Aarnoudse JG, Gulcher JR,Dekker GA, ten Kate LP, Stéfansson K. A genome- wide scan for preeclampsia in the Netherlands. Eur J Hum Genet. 2001; 9:758–764. 70 84. Laivuori H, Lahermo P, Ollikainen V, Laivuori H, Lahermo P, Ollikainen V, Widen E, Häivä-Mällinen L, Sundström H, Laitinen T, Kaaja R, Ylikorkala O, Kere J. Susceptibility loci for preeclampsia on chromosomes 2p25 and 9p13 in Finnish families. Am J Hum Genet. 2003; 72: 168–177. 85. Kalmyrzaev B, Aldashev A, Khalmatov M, Polupanov A, Jumagulova A, Mamanova L, Wilkins MR, Town M. Genomewide scan for premature hypertension supports linkage to chromosome 2 in a large Kyrgyz family. Hypertension. 2006; 48: 908–913. 86. Johnson MP, Fitzpatrick E, Dyer TD, Jowett JB, Brennecke SP, Blangero J, Moses EK. Identification of two novel quantitative trait loci for pre-eclampsia susceptibility on chromosomes 5q and 13q using a variance components- based linkage approach. Mol Hum Reprod. 2007; 13: 761. 87. Şizofreni ve Asosiyasyon Erişim:(http://zehirlenme.blogspot.com/2011/01/sizofreni-ve-asosiyasyon.html )2012. Erişim tarihi: 11.04.2012 88. Parimi N, Tromp G, Kuivaniemi H, Nien JK, Gomez R, Romero R, Goddard KA. Analytical approaches to detect maternal/fetal genotype incompatibilities that increase risk of pre-eclampsia. BMC Med Genet. 2008; 3; 9-60. 89. Romero R, Espinoza J, Gotsch F, Kusanovic JP, Friel LA, Erez O, Mazaki-Tovi S, Than NG, Hassan S, Tromp G. The use of highdimensional biology (genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics) to understand the preterm parturition syndrome. BJOG. 2006; 113(3): 118–135. 90. Esplin MS, Fausett MB, Fraser A, Kerber R, Mineau G, Carrillo J, Varner MW. Paternal and Maternal Components of the Predisposition to Preeclampsia N Engl J Med. 2001; 344:867-872. 91. Takimoto E, Ishida J, Sugiyama F, Horiguchi H, Murakami K, Fukamizu A. Hypertension induced in pregnant mice by placental renin and maternal angiotensinogen. Science. 1996; 274: 8995. 92. Lie RT, Rasmussen S, Brunborg H, Gjessing HK, Lie-Nielsen E, Irgens LM. Fetal and maternal contributions to risk of pre-eclampsia: population based study. BMJ. 1998; 316:7-1343. 93. Albert B, Johnson A, Levis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Hücrenin Moleküler Biyolojisi. 4. Baskı, Ankara: Tüba Yayınları, 2008. 94. Wang, JX, Knottnerus AM, Schuit G, Norman RJ, Chan A, Dekker GA. Surgically obtained sperm, and risk of gestational hypertension and pre-eclampsia. Lancet. 2002; 359: 673–674. 95. Kanayama N, Takahashi, K, Matsuura T, Sugimura, M, Kobayashi T, Moniwa N, Tomita M, Nakayama K. Deficiency in p57Kip2 expression induces preeclampsia-like symptoms in mice. Mol. Hum. Reprod. 2002; 8: 1129–1135. 96. Knox KS, Baker JC. Genome-wide expression profiling of placentas in the p57Kip2 model of pre-eclampsia. Mol. Hum. Reprod. 2007; 13: 251–263. 97. S.T. Chelbi, D. Vaiman. Genetic and epigenetic factors contribute to the onset of preeclampsia. Molecular and Cellular Endocrinology. 2008; 282: 120–129. 98. Chelbi ST, Mondon F, Jammes H, Buffat C, Mignot TM, Tost J, Busato F, Gut I, Rebourcet R, Laissue P, Tsatsaris V, Goffinet F, Rigourd V, Carbonne B, Ferre F, Vaiman D. Expressional and epigenetic alterations of placental serine protease inhibitors: SERPINA3 is a potential marker of preeclampsia. Hypertension. 2007; 49: 76–83. 71 99. Liang G, Salem CE, Yu MC, Nguyen HD, Gonzales FA, Nguyen TT, Nichols PW, Jones PA. DNA methylation differences associated with tumor tissues identified by genome scanning analysis. Genomics. 1998;53: 260–268. 100. Weber M, Davies JJ, Wittig D, Oakeley EJ, Haase M, Lam WL, Schubeler D. Chromosomewide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat. Genet. 2005; 37: 853–862. 101. Ros HS, Lichtenstein P, Lipworth L, Cnattingius S. Genetic effects on the liability of developing pre-eclampsia and gestational hypertension. Am J Med Genet. 2000;/91:/ 60 -256. 102. Akbar SA, Khawaja NP, Brown PR, Tayyeb R, Bamfo J, Nicolaides KH. Angiotensin II type 1 and 2 receptors gene polymorphisms in pre-eclampsia and normal pregnancy in three different populations. Acta Obstet Gynecol Scand. 2009;88(5): 11 -606. 103. Renin Anjiyotensin Sistemi Erişim:(http://tr.wikipedia.org/wiki/Renin-anjiotensin_sistemi)2012 Erişim Tarihi: 09.10.2012 104. Takeda-Matsubara Y, Iwai M, Cui T, Shiuchi T, Liu H, Okumura M, Ito M, Horiuchi M. Roles of angiotensin type 1 and 2 receptors in pregnancy-associated blood pressure change. Am J Hypertens. 2004;17: 49-68. 105. David Z.I. Cherney, Vesta Lai, Judith A. Miller, James W. Scholey and Heather N. The angiotensin II receptor type 2 polymorphism influences haemodynamic function and circulating RAS mediators in normotensive humans Reich Nephrol Dial Transplant. 2010; 12: 6-4093. 106. Lachmeijer AMA, Dekker GA, Pals G, Aarnoudse JG, ten Kate LP, Argrinmsson R. Searching for preeclampsia genes: the current position. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2002; 105: 94–113. 107. Piccinni MP, Beloni L, Livi C, Maggi E, Scarselli G, Romagnani S. Defective production of both leukaemia inhibitory factor and type 2 T-helper cytokines by decidual T cells in unexplained recurrent abortions. Nat Med. 1998; 4: 4–1020. 108. Fraser R, Walker JJ, Ekbote UV, Martin KL, McShane P, Orsi NM. Interleukin-4 -590 (C>T), toll-like receptor-2 +2258 (G>A) and matrix metalloproteinase-9 -1562 (C>T) polymorphisms in pre-eclampsia. BJOG. 2008; 115(8): 6-1052. 109. de Guia RM, Ramos JD. -590C/T IL4 single-nucleotide polymorphism as a genetic factor of atopic allergy. Int J Mol Epidemiol Genet. 2010; 1(1): 67-73. 110. Amirzargar AA, Movahedi M, Rezaei N, Moradi B, Dorkhosh S, Mahloji M, Mahdaviani SA. Polymorphisms in IL4 and IL4RA Confer Susceptibility to Asthma J Investig Allergol Clin Immunol 2009; 19(6): 433-438. 111. Nishimura H, Yerkes E, Hohenfeliner K, Miyazaki YMa J, Hunley T, Yoshida H, Ichiki T, Threadgill D, Hogan BM, Fogo A, Inagami T, Ichikawa I. Tole of the angiotensin type 2 receptor gene in congenital anomalies of the kidney and urinary tract, CAKUT of mice and men. Molecular Cell. 1999;3:110. 112. Warnecke C, Mugrauer P, Surder D, Erdmann J, Schubert C, Regitz-Zagrosek V. Intronic ANG II type 2 receptor gene polymorphism 1675 G/A modulates receptor protein expression but not mRNA splicing. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2005; 289:35-1729. 72 EKLER ÇALIŞMALARDA KULLANILAN KİMYASAL VE SOLÜSYONLARIN HAZIRLANMASI Kullanılan kimyasal ve solüsyonların hazırlanmasında kaynak olarak “Molecular Cloning”140 esas alınmıştır. Hazırlanan solüsyonlar genel olarak konsantre stoklar halindedir. Çalışma konsantrasyonlarını elde etmek için stoklardan belli oranlarda alınarak seyreltilir. Konsantrasyon dönüştürmelerinde basitçe şu formülden yararlanılabilir. M1 X V1 = M2 X V2 M1 = Hazırlanan stok konsantrasyon (M, N veya %) V1 = Stoktan alınması gereken miktar (v) M2 = Çalışma (son) konsantrasyonu (M, N veya %) V2 = Hazırlanacak olan çözelti (çalışma çözeltisi) miktarı (v) 73 EK-1. DNA Eldesi Solüsyonları 1.1 Eritrosit Lizis Tamponu (pH=7,5) 1 Litre için; 0,32 M Sükroz Sükroz = 109,563 gr 10 mM Tris-HCl (pH=7,5) Tris-HCl = 1,211 gr 5mM MgCl2 MgCl2 = 1,015 gr %1 Triton X 100 Triton X 100 = 10 gr 1 litre için gereken malzemeler belirtilen oranlarda tartılıp, son hacim 1000 ml olacak şekilde bidistile su ile çözdürülüp otoklavlandı. pH = 7,5 olarak ayarlandı. Triton X otoklavlanmadan sonra ilave edildi. 1.2. Fizyolojik Tampon (pH=7,5) 1 Litre için 0,075 M NaCl NaCl = 4,383 gr 0,025 M EDTA EDTA = 9,305 gr 1 litre için gereken malzemeler belirtilen oranlarda tartılıp, son hacim 1000 ml olacak şekilde bidistile su ile çözdürülüp otoklavlandı. pH = 7,5 olarak ayarlandı 1.3. TE-9 (pH=9) 1 Litre için 500 mM Tris baz Tris baz = 60,5 gr 20 mM EDTA EDTA = 7,44 gr 10 mM NaCl NaCl = 0,58 gr 1 litre için gereken malzemeler belirtilen oranlarda tartılıp, son hacim 1000 ml olacak şekilde bidistile su ile çözdürülüp otoklavlandı. pH = 9 olarak ayarlandı. 1.4. %10’luk SDS 20 ml için; 2 gr SDS tartılıp, üzerine bir miktar (20 ml’den az) saf su ilave edilip iyice çözdürüldü. Son hacim 20 ml olacak şekilde ayarlandı. 1.5. Proteinaz-K (10mg/ml) 100 ml için; 74 10 gr PK tartılır, üzerine bir miktar (100 ml’den az) saf su ilave edilip iyice çözdürüldü. Son hacim 100 ml olacak şekilde ayarlandı. 1.6. 6 M NaCl 1 litre için; 321.4 gr NaCI tartılıp, üzerine bir miktar (1000 ml’den az) bidistile su ilave edilip iyice çözdürülüp son hacim 1000 ml olacak şekilde ayarlandı. 1.7. % 70 Etil Alkol 100 ml için; 70 ml etil alkol (absolut) ve 30 ml bidistile su ilave edildi. 1.8. TE tamponu (Tris/EDTA) (pH= 8 ) 10 mM Tris-Cl (pH=8) 0,1 mM EDTA (pH=8) 1 litre için gereken malzemeler belirtilen oranlarda tartılıp, son hacim 1000 ml olacak şekilde bidistile su ile çözdürülüp otoklavlandı. pH = 8 olarak ayarlandı. 75 EK-2. Elektroforez Analiz Solüsyonları 2.1. 1 X TBE (1 litre için) 100 ml 10 X TBE stok solüsyonu 900 ml bidistile su 2.2. Etidyum bromid solüsyonu (10 mg/ml) 0,1 gr etidyum bromid 10 ml bidistile su içinde çözünüp ışık almayan bir cam içinde buzdolabında muhafaza edildi. 2.3. DNA Yükleme Tamponu (Loading dye) (6X) 40 gr sükroz 0,25 gr bromfenol mavisi 100 ml olacak şekilde bidistile su içinde çözündü. Ependorf tüplerine paylaştırılarak buzdolabında muhafaza edildi. 76 EK-3 Elektroforez Analiz Solüsyonları 3.3. %40 (29:1) Stok Akrilamid / bisakrilamid solüsyonu 38,6 gr Akrilamid 1,4 gr bisakrilamid Tartılıp bir miktar bidistile su ile çözdürülüp üzeri 100 ml ye tamamlandı. 3.4. %25 Amonyum persülfat 0,25 gr APS 1 ml olacak şekilde bidistile su içinde çözündü. Buzdolabında saklandı. 3.5. 10 X TBE (Tris-Borik asit-EDTA) Stok solüsyonu 108 gr Tris baz ( 890 mM ) 55 gr borik asit ( 890 mM) 40 ml 0,5 M EDTA, pH 8.0 (20 mM) Bir miktar bidistile su içinde çözündükten sonra pH 8.0 olarak ayarlanıp solüsyon 1 litreye tamamlandı. 77 ÖZGEÇMİŞ 1986’da Kayseri’de doğdu. İlk, orta ve lise öğretimini Kayseri’ de tamamladı. Lisans eğitimini 2005-2009 yılları arasında Çukurova Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji bölümünde tamamladı. 2009 yılında Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı yüksek lisans programına başladı. 30 Mayıs - 7 Haziran 2011 tarihinde Çukurova Üniversitesi TIBDAM’ın düzenlediği ‘’Deney Hayvanları Kullanımı’’ kursuna katıldı. 4 - 8 Haziran 2012 tarihinde TÜBİTAK MAM GMBE tarafından düzenlenen " Embriyonik Kök Hücre Kültürü Uygulamalı Eğitimi’’ kursuna katıldı. 13-16 Eylül 2012 tarihinde Eskişehir Anadolu Üniversitesi Eczacılık Fakültesinin düzenlediği ‘’1st International Certificate Program on Predictive and Personalized Medicine Healthcare in Daily Modern Medicine and Pharmacy’’ isimli sertifika programına katıldı. 78
