(YÜKSEK LİSANS TEZİ) Perihan Kendirci Gıda Mühendisliği
advertisement
i EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (YÜKSEK LİSANS TEZİ) KEFİR VE KEFİR TANESİNDE AFLATOKSİN M1 TAYİN YÖNTEMİNİN GELİŞTİRİLMESİ VE KONTAMİNE SÜTLERDEN KEFİRE VE KEFİR TANELERİNE AFLATOKSİN M1 GEÇİŞİNİN ARAŞTIRILMASI Perihan Kendirci Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu: 614.01.00 Sunuş Tarihi: 12/09/2002 Tez Danışmanı: Prof.Dr. Tomris ALTUĞ Bornova-İzmir ii iii Sayın Perihan KENDİRCİ tarafından YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak sunulan “Kefir ve Kefir Tanesinde Aflatoksin M1 Tayin Yönteminin Geliştirilmesi ve Kontamine Sütlerden Kefire ve Kefir Tanelerine Aflatoksin M1 Geçişinin Araştırılması” adlı bu çalışma, “Lisansüstü Eğitim ve Öğretim Yönetmeliği”nin 12 inci madde (c) ve (d) bentleri ve Enstitü yönergesinin ilgili hükümleri dikkate alınarak tarafımızdan değerlendirilmiş olup yapılan sözlü savunma sınavında aday oy birliği ile başarılı bulunmuştur. Bu nedenle Perihan KENDİRCİ’nin sunduğu metnin yüksek lisans tezi olarak kabulüne birliği ile karar verilmiştir. 12/09/2002 Adı Soyadı İmza Juri Başkanı ; Prof.Dr. Tomris ALTUĞ .................................... Raportör ; Doç.Dr. Şahika GÖNÜL .................................... Üye ; Yrd.Doç.Dr. Cem KARAGÖZLÜ ................................... Dr. Süleyman BORUZANLI Enstitü Sekreteri Prof. Dr. Emür Henden Enstitü Müdürü iv v ÖZET KEFİR VE KEFİR TANESİNDE AFLATOKSİN M1 TAYİN YÖNTEMİNİN GELİŞTİRİLMESİ VE KONTAMİNE SÜTLERDEN KEFİRE VE KEFİR TANELERİNE AFLATOKSİN M1 GEÇİŞİNİN ARAŞTIRILMASI KENDİRCİ, Perihan Yüksek Lisans Tezi, Gıda Mühendisliğ Bölümü Tez yöneticisi: Prof.Dr. Tomris ALTUĞ Eylül 2002, 67 Sayfa Bu tezde kefir ve kefir tanesinde Aflatoksin M1 tayini için uygun yöntem geliştirilmiş ve kontamine sütlerden kefire ve kefir tanelerine Aflatoksin M1 geçişi ve depolamanın etkisi araştırılmıştır. Ayrıca kefirden izole edilen iki bakterinin kültür ortamında Aflatoksin M1’e etkisi incelenmiştir. Kontamine edilmiş kefir ve kefir tanesinde Aflatoksin M1 analizi için yapılan denemeler sonucunda imünoafiniti kolon ile saflaştırmadan sonra YBSK analizi tekniğinin en doğru sonuç veren yöntem olduğu belirlenmiştir. Söz konusu yöntem kullanılarak kefir için %75, kefir tanesi için ise %65 geri kazanım değeri saptanmıştır. Aflatoksin M1 tayini için belirlenen yöntem kullanılarak laboratuvar koşullarında 0.1, 0.2 ve 0.5 µg/l düzeylerinde Aflatoksin M1 ile kontamine edilen sütlerden kefir eldesinde bu toksinin kefire ve kefir tanesine geçişi incelenmiştir. Kefire geçiş oranı sırasıyla %60, 60 ve 80; kefir tanesine geçiş oranı ise sırasıyla %1.6, 2.6 ve 2.6 olarak belirlenmiştir. Depolamanın kefirdeki Aflatoksin M1 üzerine etkisinin olmadığı belirlenmiştir. Kefirden izole edilen bakterilerin kültür ortamında Aflatoksin M1 üzerine etkisi ile ilgili kesin bulgular elde edilememiştir. Anahtar Sözcükler: sütten kefire ve kefir tanesine aflatoksin M1 geçişi, kefirde ve kefir tanesinde aflatoksin M1, Aflatoxin M1 için immunoassay teknik vi vii ABSTRACT DEVELOPMENT OF AFLATOXIN M1 ANALYSIS METHOD IN KEFIR AND KEFIR GRAIN AND INVESTIGATION OF THE CARRY-OVER OF THE AFLATOXIN M1 FROM CONTAMINATED MILK TO KEFIR AND KEFIR GRAIN KENDİRCİ, Perihan MSc in Food Engineering Supervisor: Prof.Dr. Tomris ALTUĞ September 2002, 67 Pages In this thesis, the appropriate method is developed for determination of Aflatoxin M1 in kefir and kefir grain and the carry-over of the Aflatoxin M1 from contaminated milk to kefir and kefir grain and changes that occur during storage are investigated. The effect of two bacteria isolated from kefir on Aflatoxin M1 is also observed in culture medium. As the result of the experiments conducted for analysis of Aflatoxin M1 in contaminated kefir and kefir grain, the application of immunoaffinity column with HPLC analysis technique were found as the most accurate method. The recovery values obtained by this method for kefir and kefir grain were found to be 75% and 65%, respectively. By using this method, the carry-over of Aflatoxin M1 from milk contaminated at 0.1, 0.2 and 0.5 µg/l levels in laboratory conditions to kefir and kefir grain was investigated. The carry-over ratio of Aflatoxin M1 to kefir in respect to the contamination levels (0.1, 0.2 and 0.5 µg/l) were found to be 60, 60 and 80%, whereas they were dedected as 1.6, 2.6 and 2.6% in kefir grain. It was also determined that there wasn’t any effect of storage of Aflatoxin M1 level in kefir. There weren’t precise results which indicate the effect of bacteria on Aflatoxin M1 in cultured medium. Key Words: carry-over of Aflatoxin M1 from milk to kefir and kefir grain, Aflatoxin M1 in kefir and kefir grain, immunoassay technique for Aflatoxin M1 viii ix TEŞEKKÜR Değerli önerileri ve yönlendirici katkılarıyla bu çalışmanın her aşamasında bana destek veren değerli hocam Sayın Prof. Dr. Tomris ALTUĞ’a , Vermiş oldukları maddi destek ile bu çalışmanın yürümesini sağlayan Araştırma Fon Saymanlığına, Bu çalışmada kullandığım immunoaffinity kolonları ve Aflatoksin M1 standardını ve konu ile ilgili her türlü yardımı sağlayan Sincer Dış Ticaret A.Ş.’ye, Kefir üretiminde hammadde olarak kullandığım kefir tanelerini sağlayan ve çalışmamın özellikle kefir ile ilgili bölümlerinde yardımlarını esirgemeyen Yrd. Doç. Dr. Cem KARAGÖZLÜ’ye, Gereksinim duyduğum her anda yanımda ve arkamda olduğu duygusunu uyandırarak manevi desteğini her zaman hissettiğim Yrd. Doç. Dr. Yeşim ELMACI’ya, Umutsuzluğa düştüğüm her an arkamda olan ve desteklerini esirgemeyen değerli hocam Yrd. Doç. Dr. Kemal DEMİRAĞ’a ve arkadaşım Murat ZORBA’ya, Tüm tez çalışmam boyunca bana vermiş oldukları sonsuz destek, özveri ve anlayış için sevgili aileme, içtenlikle teşekkürlerimi sunarım. Perihan KENDİRCİ x xi İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET.....................................................................................................v ABSTRACT....................................................................................... vii TEŞEKKÜR.........................................................................................ix ŞEKİLLER DİZİNİ........................................................................... xiii ÇİZELGELER DİZİNİ ......................................................................xiv KISALTMALAR DİZİNİ...................................................................xv 1 GİRİŞ................................................................................................1 2 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR................................................................7 2.1. Aflatoksin M1 İle İlgili Genel Bilgiler ......................................7 2.2. Kefir İle İlgili Genel Bilgiler...................................................10 2.3. Aflatoksin M1 Tayin Yöntemleri.............................................16 2.4. Süt ve Süt Ürünlerinde Aflatoksinler İle İlgili Çalışmalar......21 3 MATERYAL VE METOD ............................................................26 3.1. Materyal ..................................................................................26 3.2. Metod ......................................................................................26 3.2.1. Kefir üretimi ................................................................26 3.2.2. Sütte Aflatoksin M1 Tayini İçin Gerçekleştirilen Deneme........................................................................27 3.2.2.1. İmmunolojik yöntem ............................................27 3.2.3. Kefirde Aflatoksin M1 Tayininin Geliştirilmesi Amacıyla Yapılan Denemeler...............28 3.2.3.1. I. Yöntem..............................................................29 3.2.3.2. II. Yöntem ............................................................31 3.2.3.3. III. Yöntem ...........................................................33 3.2.3.4. IV. Yöntem...........................................................35 3.2.4. Kefir Tanesinde Aflatoksin M1 Tayininin Geliştirilmesi Amacıyla Yapılan Denemeler...............37 xii İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa 3.2.4.1. I.Yöntem .............................................................. 37 3.2.4.2. II. Yöntem ............................................................ 37 3.2.5. Sütten Kefire ve Kefir Tanesine Aflatoksin M1 Geçişinin Belirlenmesi Amacıyla Sütün Kontaminasyonu ......................................................... 38 3.2.6. Kefirin Depolanması ................................................... 38 3.2.7. Kefirden Elde Edilen Bakteri İzolatlarının Aflatoksin M1 İle Etkileşimlerinin Besiyerinde İncelenmesi ................................................................. 38 3.2.7.1. Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonu, Saflaştırılması, Etkili Laktik Asit Bakterilerinin Tanımlanması................................ 38 3.2.7.2. Laktik Asit Bakterilerinin Aflatoksin M1 İle Kontamine Olan Besiyerinde Geliştirilmesi ........................................................ 39 3.2.7.3. Aflatoksin M1 Analizi .......................................... 40 4 BULGULAR VE TARTIŞMA ...................................................... 41 4.1. Süt, Kefir ve Kefir Tanesinde Aflatoksin M1 Tayini İçin Uygun Yöntemin Belirlenmesi İle İlgili Bulgular .................. 41 4.2. Sütten Kefire ve Kefir Tanesine Aflatoksin M1 Geçişi........... 44 4.3. Depolama Denemeleri İle İlgili Bulgular................................ 46 4.4. Bakteri İzolatları İle Besiyerinde Gerçekleştirilen Analizler İle İlgili Bulgular ..................................................................... 47 5 SONUÇ .......................................................................................... 49 KAYNAKLAR DİZİNİ...................................................................... 52 EKLER................................................................................................ 59 ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................ 67 xiii ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil Sayfa 1.1 Aflatoksin B1, B2, G1, G2, M1 ve M2’nin kimyasal yapıları ........2 2.1 İmmunoaffinity kolonların çalışma ilkesi..................................18 xiv ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1.1 Sayfa Aflatoksin B1, B2, G1, G2, M1 ve M2’nin bazı fiziko-kimyasal Özellikleri.................................................................................... 2 1.2 Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliğine göre gıdalarda bulunmasına izin verilen aflatoksin miktarları ................................................ 3 1.3 Kefirin mikrobiyolojik yapısı...................................................... 5 2.1 Kefirin bileşimi.......................................................................... 12 2.2 Kefirin çeşitli hastalıklarda alternatif tedavi yöntemi olarak kullanımı ile ilgili öneriler.............................................. 15 4.1 Süt, kefir ve kefir tanesinde farklı analiz yöntemleri ile elde edilen geri kazanama değerleri.................................................. 41 4.2 0.1, 0.2 ve 0.5 ppb düzeyinde kontamine edilen sütten kefir üretiminde kefire ve kefir tanesine Aflatoksin M1 geçiş düzeyleri........................................................................... 44 4.3 Kontamine süt kullanılarak elde edilen kefirlerin buzdolabı koşullarında (+4 ˚C) 10 günlük depolanması süresince Aflatoksin M1 içeriklerinde gözlenen değişimler...................... 46 4.4 Besiyerinde gerçekleştirilen analizler ile ilgili bulgular............ 48 xv SİMGELER VE KISALTMALAR Simgeler Açıklama ˚C dk g kg l ml ppb ppm RSDR RSDr v/v µg µl Santigrad derece Dakika Gram Kilogram Litre Mililitre Milyarda bir kısım Milyonda bir kısım Yenilenebilirlik açısından relatif standard sapma Tekrarlanabilirlik açısından relatif standard sapma hacim/hacim Mikrogram Mikrolitre Kısaltmalar AT CMO E.Ü. ELISA IDF ISO İTK RIA TGKY TS TSE YBSK YPİTK Avrupa Topluluğu Karboksi Metil Oksim Ege Üniversitesi Enzim Bağlı Radyo İmmunosorbent Analiz Uluslararası Süt Federasyonu Uluslararası Standardizasyon Örgütü İnce Tabaka Kromatografisi Radyo İmmunoanaliz Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği Türk Standardı Türk Standardları Enstitüsü Yüksek Basınç Sıvı Kromatografisi Yüksek Performans İnce Tabaka Kromatografisi 1 GİRİŞ Aflatoksinler Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus adı verilen küflerin bazı suşları tarafından üretilen toksik maddeler olup uygun sıcaklık ve nem koşullarında pek çok gıda için kontaminasyon kaynağı oluşturmaktadırlar. Aflatoksinler ilk kez 1960 yılında İngiltere’deki bir çiftlikte yer fıstığı küspesi ile beslenen hindilerin ölümü ile keşfedilmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda yemlerde A. flavus küfü saptanmış ve bu küfün neden olduğu zehirlenmelerin önceleri “X Hastalığı” olarak bilinen hastalıkla aynı belirtileri gösterdiği belirlenmiştir. Söz konusu küfün oluşturduğu mikotoksinlere “Aflatoksin” adı verilmiştir (Goldblatt 1969;Yaygın ve Demiryol, 1980; Ueno, 1987). Gıdalardaki aflatoksinler mavi ve yeşil floresans verme özelliklerine göre B1, B2, G1 ve G2 olmak üzere dört temel bileşik halinde bulunurken aflatoksin B1 ve B2’nin vücuttaki metabolitleri olan aflatoksin M1 ve M2 “süt toksini” olarak bilinmektedirler. Şekil 1.1’de aflatoksinlerin kimyasal yapıları, Çizelge 1.1’de ise bazı fizikokimyasal özellikleri verilmektedir Aflatoksinlerin sıçanlarda karaciğer kanseri oluşturma potansiyeli en yüksek olan maddeler olduğu bilinmektedir. Bir kıyaslama yapmak gerekirse sıçanlar için kanserojen bir madde olan sakkarinin kanser oluşturma potansiyeli aflatoksin B1’den 50 milyon kat daha azdır (Jones, 1992). Aflatoksin B1 ile kontamine besinleri tüketen memeliler bu toksini 4-hidroksi metaboliti şekline dönüştürüp süt yolu ile vücutlarından uzaklaştırırlar. Söz konusu metabolit “süt toksini” veya Aflatoksin M1 olarak bilinmektedir. Aflatoksin B1’li yem tüketen hayvanların sütlerinde aflatoksin M1’e rastlanmış ve bu maddenin aflatoksin B1 ile benzer toksisite gösterdiği bulunmuştur. Hayvanın yemle aldığı aflatoksin B1’in yaklaşık % 0.35 ile %3 arasındaki düzeylerde sütte aflatoksin M1’e dönüştüğü bilinmektedir. Aflatoksin M1 süt ve süt ürünlerinde stabil olup pastörizasyondan etkilenmediği için bir kontaminasyon durumunda süt tüketen kişilerin ve özellikle bebeklerin sağlığı açısından riskli durumlar ortaya çıkabilmektedir (Galvano et al., 1996). 2 Şekil 1.1: Aflatoksin B1, B2, G1, G2, M1 ve M2’nin kimyasal yapıları (Hussein ve Brasel, 2001) Çizelge 1.1: Aflatoksin B1, B2, G1, G2, M1 ve M2’nin bazı fizikokimyasal özellikleri (Bahar,1996) Aflatoksin Molekül formülü B1 Molekül ağırlığı Kristalleri Erime noktası (˚C) UV altında floresans özelliği C17H12O6 312 Soluk sarı 267 Mavi B2 C17H14O6 314 303-306 Mavi G1 C17H12O7 328 257-259 Yeşil G2 C17H14O7 330 237-240 Yeşil M1 C17H12O7 328 299 Mavi M2 C17H14O7 330 Beyaz, iğnesiz Renksiz, iğnesiz Renksiz, iğnesiz Renksiz, düzlem Renksiz, düzlem 293 Mavi 3 Aflatoksinler insanlar da dahil olmak üzere pek çok hayvan türünde kanserojenik, mutajenik ve teratojenik etki göstermektedirler. Aflatoksin B1 ile kontamine olan gıdaları tüketen süt sığırlarının sütleriyle bir miktar Aflatoksin M1 salgılanmaktadır. Avrupa Topluluğu (AT) sütteki yüksek Aflatoksin M1 kontaminasyonunun önlenmesi amacı ile gıdalardaki Aflatoksin B1 miktarı düzenlemişlerdir. AT tarafından yapılan düzenleme ile 1984 yılında hayvan yemlerinde bulunabilecek maksimum Aflatoksin B1 miktarı 10µg/kg olarak belirlenmiş olup, Aralık 1991’de bu miktar 5µg/kg’a düşürülmüştür. Aflatoksin B1 miktarı ile ilgili olarak yapılan bu düzenleme Aflatoksin B1’in Aflatoksin M1’e oransal dönüşümü göz önüne alınarak belirlenmiştir (Veldman et al., 1992). Ülkemizde 1990 yılına kadar aflatoksinlerin gıdalarda bulunma miktarları ile ilgili bir sınır belirtilmemiştir. 1990 yılında o dönem bakanlıklarından Tarım Orman Bakanlığının çıkardığı aflatoksin kontrolüne dair tebliğ ile gıda maddeleri, çocuk mamaları, tarım ürünleri ve hayvan yemleri için izin verilen maksimum aflatoksin miktarları belirlenmiştir (Altuğ ve Elmacı, 1995). 1997 yılında ise Türk Gıda Kodeksi ile gıdalarda bulunmasına izin verilen maksimum aflatoksin miktarları yeniden düzenlenmiş olup çizelge 1.2’de gösterilmektedir. Çizelge 1.2. Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliğine göre gıdalarda bulunmasına izin verilen aflatoksin miktarları (TGKY, 1997) Madde Gıda maddesi Aflatoksin B1 Aflatoksin B1 Aflatoksin B1 Aflatoksin B1 Aflatoksin M1 Aflatoksin M1 Aflatoksin M1 Baharatlar Hububatlar Hububat unları Tüm gıda maddeleri Peynir Süt ve süt ürünleri Bebek mamaları ve devam formülleri Bebek gıdaları ve hazır karışımlar Tüm gıda maddeleri Aflatoksinler (B1+B2+G1+G2) Aflatoksinler (B1+B2+G1+G2) Kabul edilebilir en yüksek değer (mg/kg) 0.005 0.002 0.002 0.005 0.00025 0.00005 0.00002 0.00001 0.010 4 Kefir çok eski bir geçmişi olan özellikle Kafkasya’da, bazı Orta Doğu ve Avrupa ülkelerinde üretilen hafif alkollü, ekşi ve köpüklü bir süt içkisidir. Söz konusu içeceğin sindiriminin kolaylığı, serinletici ve iştah açıcı niteliği, ve bazı hastalıkları iyileştirici etkisi hem tüketiminin artmasına neden olmuş hem de çok sayıda araştırıcının ilgisini üzerine toplamıştır (Ergüllü ve Üçüncü, 1993). Kefir yapımı basit olduğu gibi hammadde olarak her çeşit çiğ ya da pastörize süt (inek, koyun, keçi vb.) ve hatta peynir suyu kullanılabilmektedir (Kaptan,1982). Kefir üretiminde kullanılan kefir taneleri beyazımsı renkte, karnabahara benzer yapıda, bezelye ya da fındık büyüklüğündedir. Kefir taneleri kazein ve birbirleriyle ortaklaşa yaşayan mikroorganizmaların meydana getirdiği jelatinimsi kolonilerden oluşmuştur. Sütü fermente edici rol oynayan kefir taneleri basit olarak süt proteini, maya, küf, bakteri ve süt yağının bir bileşimidir. Tanenin en önemli özelliği fermantasyon sonunda süzülerek geri alınması ve tekrar tekrar kullanılabilmesidir Kefir tanesinde genel olarak bulunan mikroorganizmalar; laktik asit bakterileri, asetik asit bakterileri, laktozu fermente eden ve edemeyen çeşitli mayalardır. Mikroorganizmaların çeşit ve miktarları taneden taneye değişmekle beraber genel olarak bulunanlar; Lactococcus lactis, Lactobacillus brevis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus caucasicus, Leuconostoc kefir, Saccharomyces torulopsis, Saccharomyces carlbergensis, Saccharomyces kefir, Torula kefir ve Saccharomyces fragilis olarak sayılabilir (Karagözlü, 1990). Toklu (1999) ise kefirde bulunan mikroorganizmaları çizelge 1.3’de görüldüğü şekilde sınıflandırmaktadır. Kefir taneleri ıslak veya kuru saklanabilmektedir. Basit bir saklama yöntemi kefir üretiminde kullanılmış olan tanelerin su ile yıkanması ve oda sıcaklığında kurutulması olarak bildirilmektedir. Ancak bu yöntem tanelerin kontamine olmasına ve kommensal floranın değişmesine neden olabilmektedir. Dondurarak kurutma yöntemi çok daha iyi bir sistemdir. Kültür, toz veya küçük kristaller şeklinde saklanmakta iki üç ara kültür eldesinden sonra kefir taneleri ortamda gelişmeye başlamaktadırlar. Bunun dışında, yıkanan tanelerin steril bir ortamda süspansiyon halinde buzdolabı sıcaklığında birkaç ay aktivitelerini kaybetmeden saklanması mümkün olabilmektedir (Tamime, 1990). Sağlık açısından önemli yararları olan kefirin tüberküloz, hazım bozuklukları ve kanser üzerinde olumlu etkiler gösterdiği belirlenmiştir. 5 Mide iltihapları, depresyon, karaciğer ve safra hastalıkları, enfeksiyonlar, sarılık, iç ve dış urlar, kronik bağırsak iltihapları, egzama, atardamar problemleri, yüksek tansiyon, ishal ya da kabızlık gibi pek çok hastalığın tedavisinde diyet tamamlayıcı olarak kullanıldığında iyileştirme sürecini hızlandırdığı bilinmektedir (Koçak ve Gürsel, 1981). Çizelge 1.3: Kefirin mikrobiyolojik yapısı (Toklu,1999) Mikroorganizma Çoğunlukla bulunan türler Karakteristiği Lactobacilli Lb. brevis, Lb. kefir Lb. kefir içilecek kefirde 8x107 mo/g oranında iken tanede 9x107 mo/g oranında bulunur. Lb. paracasei subsp. Paracasei, Lb. plantarum, Lb. acidophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. kefiranofaciens Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis var. diacetylactis, Lc. lactis subsp. Cremoris Kefir tanesinde 109 mo/g oranında iken içecekte bu oran 2x107’dir. Lactococci Taneden ve içecekten değişik oranlarda (108-109 mo/g) izole edilmiştir. Inkübasyonun ilk 1. saatinde hızlı asitlik gelişimini sağlar. Yüksek asitlik değerlerinde inhibe olur. Leuconostoc Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides, Ln. mesenteroides subsp. dextranicum, Ln. mesenteroides subsp cremoris, Ln. lactis Lactococlarla birlikte anılırlar. Taneden ve içecekten izole edilmiştir. Tat ve aroma oluşumuna katkısı vardır. Streptococci Asetik asit bakterileri S. thermophilus, Acetobacter aceti, Acetobacter rasens Genellikle bulunur. Tane mikro florasında simbiyosis sağlar. Kefirin viskozitesini arttırır. Mayalar Laktozu fermente edemeyenler: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces unisporus Laktozu fermente edenler: Candida kefir, Kluyveromyces marxianus var. marxianus Tanede maya oranı 105-6x107 mo/g, içilecek kefirde maya oranı 2x104-7x105 mo/g dır. Mayaların çoğunluğu laktozu fermente edemeyen mayalardır. Simbiyosise katkısı vardır. CO2 oluşumundan sorumlu olduğu gibi kefirin karakteristik tat ve aromasını da verir. 6 Kefir içinde yer alan mikroorganizmalar ile kültür ortamında yapılan çalışmalar (Karunatre et al.. 1990; Luchese ve Harrigan 1990; Gourama ve Bullerman 1995; Pierides et al. 2000), bu mikroorganizmaların aflatoksin degradasyonuna neden olduğunu göstermiştir. Organizmaların besiyerinde gösterdikleri bu degrade edici özelliğin kefir tanesi içindeki simbiyoz yaşamda da sürebileceği, kefir eldesi sırasında sütte bulunan aflatoksinlerin inhibe edilebileceği düşünülmektedir. Bu nedenle çalışmamızda kontamine sütlerden kefire ve kefir tanelerine Aflatoksin M1 geçişinin araştırılması planlanmıştır. Bu amaçla Aflatoksin M1 ile kontamine edilmiş kefirde söz konusu toksinin analizi için çeşitli kimyasal yöntemler denenmiş ve geri kazanımlarına bakılarak en uygun yöntem belirlenmeye çalışılmıştır. Aflatoksin M1 tayini için uygun yöntemin belirlenmesinden sonra, laboratuvar koşullarında Aflatoksin M1 ile kontamine edilen sütten kefir eldesinde bu toksinin kefire ve kefir tanesine geçişi ve depolama sırasında değişimi incelenmiştir. Çalışmada ayrıca kefirden izole edilen iki bakterinin kültür ortamında Aflatoksin M1 üzerine etkisi de araştırılmıştır. 7 2 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1 Aflatoksin M1 İle İlgili Genel Bilgiler Mikotoksin ifadesi Yunanca’da küf anlamına gelen “mykes” ve latincede zehir anlamına gelen “toxicum” kelimelerinden türetilmiştir. Günümüzde mikotoksin terimi, bazı küf türleri tarafından üretilen ve tüketildiğinde insan ve hayvanlarda hastalıklara veya ölümlere neden olan maddeler olarak tanımlanmaktadır. Mikotoksinlerin tüketilmesi ile oluşan hastalıklara ise “mikotoksikosiz” adı verilmektedir. Mikotoksin oluşumu fungal gelişme ile yakından ve sıkı bir bağlantı içindedir. Vejetatif büyümeden oldukça sonra, küflerin ölümünün ardından toksinler ortamda kalmaya devam edebilirler. Mikotoksinler üremenin logaritmik fazın sonlarında veya duraklama fazının başlangıcında üretilen ikincil metabolitlerdir (Lang and Lang, 1973). Aflatoksin oluşumu daha çok yerfıstığı, Brezilya kestanesi, ceviz, badem, fındık, antep fıstığı, pamuk tohumu, sorgum (bir çeşit darı), milet (akdarı) ve incir gibi bitkisel ürünlerde gözlenmektedir. Hayvansal ürünlerde ise aflatoksin gelişimine daha az rastlanmaktadır. Hayvansal gıdalarda aflatoksin açısından ana kaynak hayvanın toksik yem tüketmesi durumunda kalıntının geçtiği süt ve hayvansal dokulardır. Bazı bitki ve baharatlar antifungal (küf gelişimini önleyici) özelliklere sahip olup mikotoksin üremesine izin vermezler, ancak çoğu gıda küf gelişimine ve mikotoksin oluşumuna olanak sağlamaktadır. Peynir, kürlenmiş et ürünleri ve soya fasulyesi gibi bazı gıdalar mikotoksin oluşumuna daha az olanak sağlamaktadır. Kuraklık etkisi, böcek hasarı ve kimyasal hasarlar A.flavus ve diğer küf türlerinin yer fıstığı, pamuk tohumu ve diğer tohumları kontamine etmesini kolaylaştırmakta ve hızlandırmaktadır. Sulama sistemleri ile kuraklığın önlemesi, böcek hasarlarının ve mekanik hasarların minimizasyonunu sağlanmak suretiyle bazı önlemler alınabilmektedir. Hasat öncesi A.flavus üremesine karşı dayanıklı yer fıstığı çeşitleri ve mısır hibritlerinin geliştirilmesi de kontrol yöntemi olarak önerilmektedir. Mikroorganizma rekabeti küf gelişiminin ve mikotoksin oluşumunun kısıtlanmasını sağlamaktadır. Oksijen konsantrasyonunun (<%1) düşürülmesi ve/veya diğer gazların konsantrasyonlarının arttırılması (örneğin >%90 CO2) küf gelişimini ve 8 mikotoksin oluşumunu zayıflatabilmektedir. Küf gelişimi ve mikotoksin oluşumunun kontrolünde antimikrobiyal maddeler de kullanılabilmektedir. Sorbik asit, potasyum sorbat, propiyonik asit ve propiyonatlar geniş bir spektrumda benzoatlardan daha etkili antimikrobiyal özellik göstermektedirler. Ayrıca sodyum diasetat ve BHA (bütillendirilmiş hidroksi anisol) gibi diğer maddeler de antifungal aktiviteye sahiptirler. Tarçın, karanfil ve hardal gibi bitki ve baharatlar, normal kullanım düzeylerinde katıldıklarında da yeterli antifungal aktivite sağlayabilmektedirler. Sodyum hipoklorit, potasyum permanganat, hidrojen peroksit ve sodyum perborat, amonyak, kükürt dioksit ve sülfitler gibi birçok oksidasyon ajanı aflatoksin ile reaksiyona girerek yapısını değiştirmektedirler (Bullerman et al., 1984; Ueno, 1987; Altuğ vd., 1990; İçibal ve Altuğ, 1992; Elmacı ve Altuğ, 1994; Altuğ ve Elmacı, 1995; Özer ve Altuğ, 1985). Gıdada aflatoksin oluşturan küflerden A.flavus’un üremesi için %85 bağıl nem (buğday mısır %18-18.5 nem, ayçiçeği tohumu %13.5 nem) ve 0.85 su aktivitesi gerekmektedir. Genelde küfler için optimum gelişme sıcaklığı 30 ºC olmasına karşın, A. flavus 45-50 ºC’a kadar üreyebilmektedir (Altuğ ve Elmacı, 1995). Aflatoksinin organizma üzerindeki etkisinin, hücre çekirdeğindeki DNA ile birleşip m-RNA oluşumunu etkilemesi olduğu bilinmektedir. Bunun sonucu olarak da 5-10 dakika içinde protein sentezi bloke edilmekte ve mitoz bölünme aşaması gerçekleşmediğinden hücre ölmektedir. Bazı hayvanlar aldıkları aflatoksini karaciğerlerinde metabolize ederek daha toksik maddelere dönüştürürler. Böyle hayvanların aflatoksine duyarlılığının fazla olduğu gözlenmiştir. Aflatoksin zehirlenmelerinde plazmadaki enzimlerin düzeylerinde artış olmasına karşın karaciğer enzimlerinin aktivitelerinde azalmalar olmaktadır. Aflatoksinler temel vitamin metabolizmasına da zarar verirler. A vitamininin depo edilmesini engellerler, kanda ise Mg, P ve Ca düzeylerinde azalmalara neden olurlar (Yaygın ve Demiryol, 1980). Aflatoksine doğrudan veya kontamine yem tüketmiş hayvanlardan elde edilen gıdaları tüketerek maruz kalan kişilerde hepatik ve ekstrahepatik kanserojen olgular gözlenmiştir. Ayrıca aflatoksinlerin çocuklarda protein enerji malnutrisyonu sonucu ortaya çıkan Kwashiorkor hastalığı ile de ilişkili olduğu bulunmuştur (Rustom,1997). Aflatoksinler deney hayvanlarında hepatokanserojen olarak iyi bilinmekte ve gıdaların aflatoksin ile kontaminasyonu insan ve hayvan sağlığında ciddi problemlere neden olmaktadır. A. flavus çoğu gıdanın ve 9 hayvan yeminin aflatoksin ile kontaminasyonundan sorumlu olsa da aslında yalnızca A. flavus’un bazı türleri bu toksik metaboliti üretmektedir (Ueno, 1987). Hayvanın yemle aldığı aflatoksin B1’in sütte aflatoksin M1’e dönüşüm oranı %0.35-3 arasında değişmektedir (Yaygın ve Demiryol, 1980). Aflatoksin M1 süt ve süt ürünlerinde stabil olup pastorizasyondan etkilenmediği için bir kontaminasyon durumunda süt tüketen kişilerin ve özellikle bebeklerin sağlığı açısından riskli durumlar ortaya çıkabilmektedir (Altuğ ve Elmacı, 1995; Galvano et al., 1996). Tüketilebilir hayvansal dokulardan insan diyetine geçen aflatoksin kalıntıları açısından en büyük potansiyele sahip olan süt ve süt ürünleri, bebek ve çocukların da ana besin kaynağı olduğundan bu ürünlerde aflatoksin M1 oluşumu büyük önem taşımaktadır (Galvano et al., 1998). Süt ürünlerinde mikotoksin; hayvanların tükettiği yemlerin kontaminasyonu (indirekt kontaminasyon), veya süt ürünlerinin küf ile kontaminasyonu sonucunda mikotoksin oluşumu (direkt kontaminasyon) sonucu bulunabilmektedir (Barrıos et al., 1996; Yaygın ve Demiryol, 1980). İndirekt kontaminasyonda Aflatoksin B1’in vücuda alımının ardından ilk 12-24 saatte sütte Aflatoksin M1 belirlenebilmektedir. Bir günlük ördek yavrularında LD50 değerleri Aflatoksin B1 için 0.24 mg/kg, Aflatoksin M1 için ise 0.32 mg/kg olduğu halde Aflatoksin M1 sıçanlarda ve ördek yavrularında Aflatoksin B1 kadar toksiktir. Söz konusu toksinlerin her ikisinin de alabalık karaciğerinde benzer kanserojen etki gösterdiği belirlenmiştir (Lopez, 2001; Sinhuber 1970’den). Rothschild (1992) Aflatoksin B1 ve Aflatoksin M1’i insan kanserojenleri arasında sırasıyla kanserojen ve olası kanserojen olarak sınıflandırmıştır. Ayrıca Aflatoksin M1’in Aflatoksin B1’den 10 kat daha az kanserojen olmasına karşın yüksek genotoksik aktiviteye sahip olduğu gözlenmiştir (Lopez, 2001). 10 2.2 Kefir İle İlgili Genel Bilgiler Fermente süt ürünleri içerisinde bugün dünyada yoğurttan sonra en fazla tanınan kefir, çok eski çağlardan beri Kafkasya’da üretilen ve buradan dünyaya yayılan sindirimi kolay, serinletici, hafif alkollü, ekşi ve köpüklü bir süt ürünüdür (Toklu, 1999, Karagözlü ve Kavas, 2000). Kefirin ne zaman ve nasıl oluştuğu kesin olarak bilinmemekle beraber, ilk kez Kafkasya’da Elburus dağları eteklerinde bulunan “Gaucase” köyünde oluştuğu, burada yaşayan köylülerin sütleri deri tulumlar içerisinde fermentasyona bırakmaları ile “airan” adı verilen bir süt mamulünün elde edildiği ve yapımının gizli tutulduğu, ve Rusya’da yayınlanan “Kefir” kitabının 1884 yılında Almancaya çevrilmesiyle bu içeceğin Avrupa’ya yayıldığı görüşü hakimdir (Toklu, 1999; Ergüllü ve Üçüncü, 1983). Bir başka görüş ise kefirin kaynağının 1300’lerde Himalayalar’a (şimdiki Tibet) dayandığı yönündedir (Kroger, 1993). Halen dünyada kefir tüketimi özellikle Rusya ve SSCB’den ayrılan ülkeler, ABD, Macaristan, Polonya, Norveç, İsveç, İsviçre, Romanya, Finlandiya, Almanya, Brezilya, Fransa, İsrail, Lüksemburg’da oldukça önemli düzeylerdedir (Toklu, 1999; Kılıç vd., 1999, Karagözlü ve Kavas, 2000). Son yıllarda da İngiltere ve Japonya’da etnik bir içecek olarak önem kazanmıştır (Toklu, 1999). Ülkemizde endüstriyel boyutta kefir üretimi yapılmamaktadır. Ancak bu içecek geleneksel üretim yolu ile evlerde bireysel olarak üretilmekte ve tüketilmektedir (Kılıç vd., 1999). Kefirin bileşiminde %0.5-1.5 etil alkol, %0.6-0.8 süt asidi ve %50 CO2 (hacimsel olarak) bulunmaktadır. Sindiriminin kolaylığı, serinletici ve iştah açıcı niteliği ve bazı hastalıklardaki iyileştirici etkisi bu içeceğin hem tüketiminin artmasına neden olmuş, hem de çok sayıda araştırıcının ilgisini üzerinde toplamıştır (Ergüllü ve Üçüncü, 1983; Karagözlü ve Kavas, 2000). Kefirleri asit, alkol ve CO2 içeriklerine göre; zayıf kefir (asit, alkol ve CO2 açısından fakir), orta sert kefir, sert kefir ve çok sert kefir (asit ve alkolce zengin, CO2 miktarı fazla, dolayısıyla çok köpüklü) diye sınıflandırmak da mümkündür. Tatlı kefir 24 saatlik, orta sert kefir 48 saatlik, sert kefir 3 günlük, çok sert kefir de daha uzun süre fermantasyon sonucu yapılabilmektedir. Çok sert kefirde laktoz oranı %75 oranında azalma göstermektedir. Bu kefir türlerinin dışında ekşi süt kefiri, kefir sodası, glikozlu kefir ve peynir suyu kefiri gibi değişik özellikte ürünler de bulunmaktadır (Kaptan, 1982; Koçak ve Gürsel. 1981; Üçüncü, 1980). 11 Kefir üretiminde kültür olarak kullanılan kefir taneleri, Kafkasya’da keçi tulumu içinde, inek sütünün dana ve koyun şirdenleri ile pıhtılaştırılması sonucunda elde edilmektedir. Pıhtılaştırmanın yapıldığı tulumun iç yüzeyinde birkaç hafta sonra oluşan süngerimsi bir kabuk tabakası alınmakta ve bölünerek kurutulmaktadır. Kuruma sonunda oluşan küçük topaklar kefir taneleridir (Koçak ve Gürsel. 1981). Bazı Müslüman bölgelerde “Peygamber Darısı” olarak adlandırılan kefir taneleri; sarımtırak-beyaz renkte, çapı 1-2 mm’den 3-6 mm’ye kadar değişen karnabahar veya patlamış mısır görünümündedir. Yüzeyi pürüzlü ve helezonik yapıdaki kefir taneleri suda erimezler ancak süte atıldıkları zaman şişerler ve renkleri beyazlaşır. Kefir tanelerinin bulunduğu ortamın önemli bir bölümü suda çözünen ve kefiran olarak adlandırılan eşit miktarda glikoz ve galaktozdan oluşan polisakkarit bir tabaka ile kaplıdır. İyi bir kefir tanesi elastiki yapıda olmalı, yapışkan ve yumuşak olmamalıdır, ve tanenin polisakkaritten meydana gelmiş ve içerisinde bir miktar kazein ile yağ bulunduran bir özellik taşıması gerekmektedir. Tane içerisinde bulunan mikroorganizmalar simbiyoz bir yaşam sürdürmekte ve süt içerisine bırakılan taneden, immobilize bir sistemle süt içerisine mikroorganizmalar geçebilmektedir. Taneden süte geçen mikroorganizma türleri içinde süt asidi bakterileri, asetik asit bakterileri ile mayaların bulunduğu saptanmıştır. Laktozu fermente edemeyen mayalar tanenin daha iç kısımlarında, laktozu fermente edenler ise, tanenin daha yüzeyinde bulunmakta ve tane yüzeyinde de laktik asit bakterileri ile asetik asit bakterileri yer almaktadır. Ancak konuyla ilgili olarak yapılan farklı araştırmalarda, tane yapısında bulunan mikroorganizma türlerinin, birbirlerine olan oranlarıyla sayılarının, tanelerin orijinine ve kullanım şartlarına göre değiştiği belirlenmiştir (Karagözlü ve Kavas, 2000; Toklu, 1999; Kroger, 1993; Tavlaş, 1986; Liu ve Moon, 1983; Ergüllü ve Üçüncü, 1983; Koçak ve Gürsel, 1981; Üçüncü, 1980). Kefir, genellikle inek, koyun ve keçi sütlerinden üretilmektedir. Laktik asit ve alkol fermantasyonlarının bir arada yürümesi sonucunda oluşan kefir, sindirimi kolay, ferahlatıcı ve iştah açıcı özelliklerinin yanı sıra bazı hastalıklara da iyi gelen ve içerdiği CO2 nedeniyle de köpüren bir özelliğe sahip olan bir içecektir (Karagözlü ve Kavas, 2000). Tane içindeki mikroorganizmaların proteolitik aktiviteleri kefirin reolojik özellikleri ile çeşitli miktar ve türde tat ve aroma sağlamaktadır (Kılıç vd., 1999). Sütün içindeki tüm besleyici ögeleri içermesi nedeniyle yüksek beslenme değerine sahip olan kefirin bileşimi çizelge 2.1’de verilmektedir. 12 Çizelge 2.1: Kefirin bileşimi (Karagözlü, 1990) Bileşim Yüzde değeri Bileşim Yüzde değeri Kuru madde 11.63 Kül 0.69 Yağ 2.80 Asitlik (SH) 39.26 Protein 3.57 Alkol (ppm) 1365 Laktoz 3.35 Asetaldehit (ppm) 29.5 Kefir taneleri tercihen 18-22˚C’de süt içerisinde gelişimlerine izin verildiğinde, taneden süt içine dağılan mikroorganizmalar sütte asit, lezzet, diğer metabolitler ve ikincil yapısal değişimler oluştururlar. Böylece kefir tanelerinin kütlesi bir dereceye kadar artar ve daha fazla ana kültür eldesi için bölünebilirler. Tanelerden uzaklaştırılmış kefir inokulum olarak kullanılabilmekte, ancak mikroorganizmaların orijinal dengesi karıştığı için sonraki inokulasyonlarda kabul edilebilir bir ürün eldesinde başarılı olamamaktadır (Kroger, 1993). Kefir tanesinde farklı patojen mikroorganizmaların yaşamsal aktivitelerinin belirlenmesi ile ilgili olarak yapılan çalışmalarda, koliform grubu bakterilerinin doğal olarak kefir mikroflorası tarafından inhibe edildiği, ayrıca Shigella ve Salmonella gibi patojen mikroorganizmaların da kefir saf kültürü ile birlikte üreyemedikleri belirlenmiştir. Söz konusu patojenlerin üreyememeleri ile ilgili nedenlerin, kefir fermantasyonu sırasında meydana gelen biyokimyasal olaylar ile ilgili olduğu belirlenmiş ve söz konusu biyokimyasal olaylar araştırmacılar tarafından şu şekilde sıralanmıştır; - Laktozdan laktik asit oluşumu (laktik asit fermantasyonu) - Laktozdan etil alkol ve CO2 oluşumu (alkol fermantasyonu) - Kefire özgü tipik mayayı andırır kefir aroması oluşumu - Sınırlı ölçüde proteinin pepton ve aminoasitlerle parçalanması (yavaş proteoliz) (Karagözlü ve Kavas, 2000; Toklu, 1999). Geleneksel kefir üretiminde çiğ ya da pastörize süt kullanılmakta ve süt 5 dakika kaynatılarak 20-25 ˚C’ye soğutulmaktadır. Üretim paslanmaz çelik veya cam bir kavanozda yapılmakta, bakır ile alüminyum tencere gibi kapların kesinlikle üretimde kullanılmadıkları görülmektedir. Kaynatılmış ve belirli sıcaklığa kadar soğutulmuş süt 13 içerisine %3-5 oranında kefir tanesi ilave edilerek ağzı hava alacak ancak toz, sinek gibi kontaminasyon kaynakları bulaşmayacak şekilde kapatılmaktadır. 20-25 ˚C’de yaklaşık 18-24 saat süren fermantasyon sonucunda kefir oluşmakta ve bu sırada kefirin pH’sı 4.7 civarına ulaşmaktadır. Bu süre boyunca kefirin sık sık karıştırılması gerekmektedir. Fermantasyon sonunda kefir temiz bir süzgeç ile süzülmekte ve süzgeçte kalan kefir taneleri tekrar kullanılabilmektedir. Süzüntü bir süre buzdolabında bekletilip olgunlaştırılmakta ve daha sonra da tüketici tercihine göre soğuk olarak tüketilmektedir. Geleneksel yolla üretilen kefirlerin raf ömrü 3 gün kadardır (Karagözlü ve Kavas, 2000; Toklu, 1999). Süt endüstrisi ilerlemiş ülkelerde kefir üretimi bir endüstri niteliği taşımaktadır. Endüstriyel amaçlı kefir üretiminde, farklı yöntemler kullanılmakla birlikte, söz konusu yöntemlerin tümünde temel ilke aynı olup üretimin ilk basamağında yağlı veya yarım yağlı %8 kuru maddeli inek sütü homojenize edilmektedir. Üretimin ikinci aşamasında söz konusu süt 90-95 ˚C’de 5-10 dakikalık ısıl işleme tabi tutulmakta ve daha sonra da 18-24 ˚C’ye soğutulup %2-8 oranında kefir kültürü ile aşılanmaktadır. Aşılama işleminden sonra gerçekleşen inkübasyonun genellikle tankta yapıldığı ve inkübasyon süresinin 18-24 saat sürdüğü bildirilmektedir. İnkübasyon sonucunda oluşan pıhtı pompalar ile parçalanıp paketlenmektedir. Firmaların üretim proseslerine göre kefir bazen pakette 12-14˚C veya 3-10˚C’de 24 saat olgunlaştırıldıktan sonra buzdolabı koşullarında satışa sunulmaktadır (Karagözlü ve Kavas, 2000). İyi bir kefir akıcı kıvamda homojen ve parlak bir görünümde olmalıdır. Topaklı yapı kefir için kusur sayılmaktadır. Kefir içildiği zaman hafif maya tat ve aroması hissedilmeli, serinletici bir etki göstermelidir. Kefir, 1-2 hafta buzdolabında depolanabilmekte ve depolanma sırasında asitlik, CO2 ve alkol miktarı artmaktadır. Bu nedenle kefir; tatlı kefir, orta sert kefir, çok sert kefir olarak sınıflandırılmaktadır. Kefirin bileşimi ve kimyasal özellikleri yapımında kullanılan sütün niteliklerine, inkübasyon ve soğuk odada muhafaza süresine bağlı olarak değişmektedir.(Karagözlü ve Kavas, 2000; Toklu, 1999; Koçak ve Gürsel, 1981). Kefir, içerdiği protein, mineral maddeler ve yağ miktarı açısından içme sütüne benzer özellikler göstermesinin yanı sıra; serinletici ve ferahlatıcı tadı nedeni ile süt kürlerinde süte oranla daha kolay tüketilebilmektedir. Literatürlerde kefirin organizmayı genç ve kararlı durumda tuttuğu, bazı mide ve bağırsak rahatsızlıklarını iyileştirdiği 14 açıklanmıştır (Toklu, 1999). Yapılan çeşitli araştırmalarda kefir tüketimi ile uzun yaşam arasında bir bağ bulunmuştur (Tavlaş, 1986). Kefirin gençlik içkisi olarak tanındığı ve su yerine içildiği Kafkasya’da tüberküloz, kanser ve hazım bozukluğu gibi hastalıklara rastlanmaması ve ortalama insan ömrünün 110-130 seneye ulaşması dikkatleri çekmiştir. Yapılan araştırmalarda kefirin bu konuda önemli rol oynadığı saptanmış ve bazı hastalıkların tedavisinde başarılı bir şekilde kullanılabileceği görülmüştür. Mide iltihapları depresyon, karaciğer ve safra hastalıkları, enfeksiyon, sarılık, iç ve dış urlar, uzun süren ve kronik olan bağırsak iltihapları, egzama, kalbin atardamarları ile ilgili olan hastalıklar, yüksek tansiyon, ishal ve kabızlık bu hastalıklar arasındadır (Koçak ve Gürsel, 1981). Kefir tüketiminin beslenme sağlık açısından sağladığı yararlar arasında; bağırsak mikro florasının doğal dengesinin korunması, belirli besin ögelerinin sentezi, antikanserojenik (kanser önleyici) aktivite, laktoz intoleransının azaltılması ve serum-kolesterol seviyesinin düşürülmesi sayılabilmektedir. Bunların dışında kefirin sinirsel rahatsızlıklar, ülser, yüksek tansiyon, safra bozuklukları, bronşit ve astım gibi pek çok hastalıkta tedavi edici özelliği bilinmekte ve bu konuda klinik çalışmalar devam etmektedir (Toklu, 1999). Örneğin, dünyanın birçok yerinde kefir gastro-intestinal hastalıkların tedavisinde terapi katkısı olarak düşünülmektedir (Kroger, 1993). Kefirin ishale iyi gelmesi, Escherichia coli, Salmonella gibi patojen mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal bir etkiye sahip olmasından kaynaklanmaktadır (Tavlaş, 1986). İki günlük kefir, tereyağı ve kaba öğütülmüş buğday veya çavdardan yapılmış ekmek müzmin kabızlıkta geniş ölçüde kullanılmaktadır. Bazı ülkelerde ise kronik dizanteriden şikayet eden hastalara 3 günlük kefir reçeteleri yazılmaktadır (Üçüncü, 1980; Kaptan, 1982). Kefirin son yıllarda öne sürülen bazı yararları arasında daha iyi laktoz sindirimi, patojenik veya diğer istenilmeyen bağırsak mikroorganizmalarının kontrolü, kolon kanserinde azalma ve bağışıklık sisteminin enfeksiyonlara dayanıklılığının artması olarak sıralanabilir (Kroger, 1993). Kefirin çeşitli hastalıklarda kullanımı ile ilgili öneriler çizelge 2.2’de verilmiştir (Kaptan, 1982). Sağlığa yararları oldukça fazla olduğu bildirilen kefirin bir dezavantajı kalp hastalarının yüksek CO2 miktarı nedeniyle bu içkiyi tüketememeleri olarak ifade edilmektedir (Üçüncü, 1980). 15 Çizelge 2.2: Kefirin çeşitli hastalıklarda alternatif tedavi yöntemi olarak kullanımı ile ilgili öneriler(Kaptan, 1982) Önerilen miktar (litre) Not Sinirsel hastalıklar Her gün 1 litre 2-3 kere alınabilir Bronşit ve astım Her gün 1 litre Ağır vakalarda 1 yıl süreyle Hastalık hastalık süresince Kabızlık ve kan bozuklukları Her gün 1 litre Ağır vakalarda büyükler 2 litre Çıbanlar Her gün 1 litre Hastalık süresince Egzama Her gün ½ litre Ayrıca hastalıklı yerler çizilmeli ve çiziklere kefir akıtılmalı Mesane hastalıkları Her gün 1 litre --- Böbrek hastalıkları Her gün 1 litre --- Yüksek tansiyon Her gün 1 litre --- Enfeksiyonlar Her gün 1 litre --- Safra bozuklukları Her gün 1 litre --- Sarılık Her gün ½ litre 12 saatlik kefir kullanılmalı Yatağa girerken alınmalı 2-4 hafta kullanılmalı 16 2.3 Aflatoksin M1 Tayin Yöntemleri İnsan ve hayvan sağlığını tehdit eden mikotoksinlerin gıdalardan tamamen uzaklaştırılamayan doğal kontaminant maddeler olmaları nedeni ile halk sağlığı ile ilgili kurumlar söz konusu toksinlerin gıdalarda bulunma düzeyi hakkında düzenleyici kararlar almak zorunda kalmıştır. Ancak bu kararların verilebilmesi için tarama programları ve doğru sonuç veren analiz yöntemleri gerekmektedir. Bu nedenle tarama ve araştırma programlarında anahtar rolü analiz yöntemleri oynamaktadır. Mikotoksinlerin tarımsal ürünlerde ppb düzeylerinde bulunabilmeleri duyarlı ve doğru yöntemlerin geliştirilmesini zorunlu kılmıştır (Boyacıoğlu ve Gönül, 1986). Aflatoksinlerin analizi genel olarak toksinin ayrılması/ekstraksiyonu, temizleme işlemleri ve miktar belirleme aşamalarını içermektedir. “Ekstraksiyon işlemi” için önerilen yöntemlerin hemen hepsinde metanol-su (55:45 v/v), aseton-su (85:15), asetonitril-su (9:1), kloroform-su (kuru substratın %50’si) ve metilen di klorür-su (kuru substratın %50’si) gibi çözgen sistemleri kullanılmaktadır (Ueno, 1987). Aflatoksin ve gıdalarda bulunan diğer çevresel toksinlerin tayini için “temizleme işlemi” çok önemlidir. Çoğu kez lipidler tayinin son aşamalarında girişim yapıcı etkiye neden olan bileşenlerdir ve lipidlerin uzaklaştırılması için uygulanan işlemler aflatoksin ekstraksiyonunda kullanılan çözgenlere bağlıdır. Hidrofilik çözgen (metanol, aseton, asetonitril) kullanımı ile elde edilen ekstraktlardan yağ ayırma işlemi hegzan veya izooktan kullanılarak gerçekleştirilebilmektedir. Girişime neden olan maddelerin uzaklaştırılması için genellikle silikajel veya aluminyum içeren adsorbant kolonlardan yararlanılmaktadır. Florisil ve diğer adsorbantlar ise değişik yöntemlerde önerilmektedir. Bitkisel orijinli ekstraktlarda bulunan pigmentlerin analizde girişim yapması durumlarında kurşun asetat, çinko asetat ve kaprik karbonat gibi maddeler kullanılabilmektedir (Ueno, 1987). Temizlenmiş örneklerde “aflatoksin tayini” için yasal yöntemlerde genellikle İnce Tabaka Kromatografisi (İTK) ve Yüksek Basınç Sıvı Kromatografisi (YBSK) kullanılmaktadır. İTK’nin basit ve ekonomik bir ayırma yöntemi olması nedeniyle bu yöntem pek çok ülkede rutin aflatoksin analizlerinde kullanılmaktadır. Gıdalarda ve 17 biyolojik sıvılarda aflatoksin tayini için ise genellikle YBSK’den yararlanılmaktadır (Ueno, 1987). Süt ve süt ürünlerinde aflatoksin M1 tayini için uygulanabilen bir çok yöntem olmasına karşın günümüzde, pek çok laboratuvarda İTK yerine YBSK tercih edilmektedir. Bunun nedeni ikinci yöntemin daha duyarlı ve doğru sonuçlar vermesinden kaynaklanmaktadır. Özellikle zıt faz YBSK aflatoksin M1 tayininde en fazla kullanılan teknik olarak belirtilmektedir (Barrios et al., 1996). Daha kolay ve spesifik yöntemlerin araştırılmasında, poliklonal ve monoklonal antikorlar ile çeşitli immunokimyasal yöntemler aflatoksinleri de içine alan mikotoksinlerin tayini için geliştirilmiştir. Chu (1984) mikotoksinler uygulanan immünolojik analiz tekniğini gözden geçirmiş, Garner ve arkadaşları (1985) insan vücut sıvılarında aflatoksinlerin ve metabolitlerinin gözlenmesi amacı ile kullanılan verileri özetlemiştir (Ueno, 1987). Bir immünolojik analiz tekniğinin gelişimi en az dört aşama içermektedir. Bu aşamalar immünizasyon için mikotoksinlerin proteinlere bağlanması, mikotoksinlere karşı antikorların oluşumu, antikorların spesifikliğinin karakterizasyonu, ve genel tayin için spesifik antikorların uygulanması olarak sıralanabilmektedir. Mikotoksinlerin pek çoğu küçük organik moleküller olup taşıyıcı proteinlere bağlanmaları önemlidir. Bağlanma işlemi için genellikle suda çözünen karbodiimid veya karışık anhidrit yöntemi uygulanmaktadır. Aflatoksin B1 karboksil grubu içermekte ve proteine bağlandıktan sonra karboksimetil oksim (CMO) türevi oluşturmaktadır. Bu yöntemde CMO grubu Aflatoksin B1 ve Aflatoksin M1 halkasındaki karbonil grubuna girmektedir. Immunoanaliz teknolojisi kısaca radyoimmunoanaliz (RIA) veya enzim-bağlı immunosorbent analiz (ELISA) olarak ikiye ayrılabilir. RIA tekniğinin uygulanması için yüksek etiketli (highly laballed) aflatoksinlere gereksinim olmakta ve radyoaktif ligantın spesifik aktivitesi RIA’nın duyarlılığında çok önemli bir rol oynamaktadır. RIA’nın duyarlılığı test edilecek örneklerin ekstraksiyondan sonra basit bir temizleme işlemi ile arttırılabilmektedir. Genelde, mikotoksinler için ELISA’nın duyarlılığı saf mikotoksinler kullanıldığında RIA’ya göre yaklaşık 10-100 kat daha fazla olup bu yöntemde radyoaktif maddelerin kullanımı pratikte büyük avantaj sağlamaktadır (Ueno, 1987). 18 Günümüzde mikotoksin analizlerinde immunolojik yöntemlerden tayin öncesi saflaştırma ve ekstraksiyon aşamalarında yararlanılmaktadır. Bu amaçla geliştirilen imünoafiniti kolonlar genellikle monoklonal antikorlardan oluşmakta ve analiz edilen toksini bağlamaktadırlar. Kolondan geçirilen örnek içindeki toksin kolon içindeki antikorlar tarafından tutulmakta, daha sonra kolondan uygun bir çözgen geçirilerek geri alınabilmektedir. İmünoafiniti kolonların çalışma ilkesi şekil 2.1’de şematize edilmektedir. örnek yıkama elüsyon Yarı kantitatif Diğer YBSK Mikotoksinler İTK Diğer maddeler Şekil 2.1: İmünoafiniti kolonların çalışma ilkesi (Rhone Diagnostatics seminer notlarından) Hansen (1990) çiğ sütte bulunan Aflatoksin M1’in imünoafiniti kolon saflaştırmasından sonra direkt olarak floresans miktar tayini üzerinde çalışmıştır. Söz konusu çalışmada kontamine edilen sütün yağı uzaklaştırıldıktan sonra, süt Aflatoksin saflaştırması amacıyla doğrudan imünoafiniti kolondan geçirilmiştir. İşlem sonrasında kolon su ile yıkanmış ve metanol kullanılarak kolonda tutulmuş olan Aflatoksin M1 geri alınmıştır. Elde edilen ekstrakt florimetrede analizlenerek miktar belirlemesi yapılmıştır. Denemeler sonucunda 0.05-0.5 ppb düzeylerinde %97 geri kazanım elde edilmiştir. Düşük konsantrasyonda Aflatoksin M1 içeren sütlerde Aflatoksin M1’in tayini amacı ile Uluslararası Süt Federasyonu (IDF) laboratuvarlar arası bir çalışma yaparak YBSK yöntemini değerlendirmiştir. Bu çalışmaya 11 ülkeden 16 laboratuvar katılmıştır. Uygulanacak yöntem olarak hazırlık grubu tarafından çeşitli yöntemler incelendikten sonra temizleme aşamasında imünoafiniti kolon kullanımı seçilmiştir. Söz 19 konusu yöntemde, örnek kolondan geçerken kolonda bulunan antikorlar selektif olarak antijenleri olan Aflatoksin M1’i bağlarlar ve antikorantijen kompleksini oluştururlar. Örnek matriksi içinde yer alan tüm diğer maddeler su ile yıkanarak kolondan uzaklaştırıldıktan sonra asetonitril kullanılarak Aflatoksin M1 kolondan alınmaktadır. Tanımlama ve miktar belirleme aşamasında floresan dedektörlü zıt faz sıvı kromatografisi kullanılmıştır. İkisi kör deneme olmak üzere 24 örnek analizlenmiş ve uyarlık açısından relatif standard sapma (RSDR) değerleri %11-23 arasında bulunmuştur (80-600 ng Aflatoksin M1/kg süt tozu) (Tuinstra vd., 1993). Toyoda ve arkadaşları (1994) tarafından yapılan bir çalışmada, sütte aflatoksin M1 tayini için üç kromatografik yöntem; İTK, geleneksel YBSK ve imünoafiniti kolon ile birlikte YBSK kullanımı karşılaştırılmıştır. En duyarlı yöntemin imünoafiniti kolon ile desteklenmiş YBSK sistemi, en az duyarlı olanın da İTK yöntemi olduğu belirlenmiştir. İmünoafiniti kolon ile desteklenmiş YBSK sisteminin duyarlılığının geleneksel YBSK’ne göre %35.5, İTK’ne göre ise %65.3 daha fazla olduğu saptanmıştır. Dragacci ve ark (1995) peynirde aflatoksin M1 tayini için imünoafiniti kolonda saflaştırma yöntemi tanımlamışlardır. Diklorometan ile basit bir çözgen ekstraksiyonundan sonra n-hegzan ile yıkama yapılarak saflaştırılmış ekstrakt elde edilmiş ve Aflatoksin M1’in saflaştırılması ve konsantre edilmesinde kullanılan iki yöntem olan katı faz ekstraksiyon temizlemesi ve imünoafiniti kolon temizlemesi karşılaştırılmıştır. Aflatoksin M1’e karşı monoklonal antikor içeren imünoafiniti kolonda en iyi sonuç elde edilmiştir. Aflatoksin M1’in kantitatif tayini için floresans dedektörlü YBSK kullanılmıştır. Bu yöntem hem doğal kontamine hem de aflatoksin aşılanmış örneklerde başarılı olmuştur. Geri kazanımlar % 75 civarındadır. Tayin edilen toksin düzeyinin 0.020 µg afl. M1/ kg peynir olduğu belirtilmektedir. Çalışma sonucunda peynir gibi süt ürünlerinde aflatoksin M1 kontaminasyonunun belirlenmesinde bu yöntemin uygun olduğu ifade edilmektedir. Kaksuri ve arkadaşları (1995) yaptıkları diğer bir çalışmada sütteki aflatoksin M1’in immnunoafiniti kolon/YBSK tekniği ile tayinini değerlendirmişlerdir. Analiz sonunda geri kazanımların çok yüksek olduğu gözlenmiş ve kimyasal yöntemlere kıyasla daha hızlı, duyarlı ve seçici olan bu yöntemde herhangi bir girişim yapıcı maddenin pikinin gözlenmediği belirtilerek, söz konusu yöntem Aflatoksin M1 tayini için önerilmiştir. 20 Bu konuda gerçekleştirilen diğer bir çalışmada farklı peynir çeşitlerinde aflatoksin M1 analizi için imünoafiniti kolon kullanımının oldukça iyi geri kazanımlar verdiği belirlenmiştir. 0.200 µg/kg oranında Aflatoksin M1 ile kontamine edilen peynirlerde geri kazanma değerleri %63.1-114 arasında değişmekle birlikte çoğunlukla %70-100 civarında olduğu bulunmuştur. Hammadde olarak kullanılan sütün kaynağı veya peynir tipleri ile geri kazanma yüzdeleri arasında bir ilişki saptanmamıştır (Dragacci ve Fremy, 1996). Bir başka çalışma Dragacci ve arkadaşları (2001) tarafından Fransa’da gerçekleştirilmiştir. Düzenlenen laboratuvarlar arası çalışmada sütte Aflatoksin M1 tayini için imünoafiniti kolon kullanımı ile ekstraksiyon sonrasında YBSK ile miktar belirleme yöntemi incelenmiştir. Çalışmada sütün analize alınacak miktarı santrifüj edilmiş, süzülmüş ve imünoafiniti kolondan geçirilmiştir. Kolonda tutulan Aflatoksin M1, saf asetonitril yardımıyla elue edildikten sonra zıt faz sıvı kromatografisinde floresans dedektör yardımı ile analizlenmiştir. Doğal olarak kontamine olmuş ya da laboratuvar koşullarında 0.05 ng/ml düzeyinde Aflatoksin M1 katılması ile yapay olarak kontamine edilmiş olan dondurulmuş süt örnekleri 12 Avrupa ülkesinden 12 laboratuvara gönderilmiştir. Elde edilen sonuçlardan uyumsuz olan iki set ayrıldıktan sonra ortalama geri kazanımın %74 olduğu gözlenmiştir. Ayrıca hesaplamalar sonucunda tekrarlanabilirlik açısından bağıl standard sapmanın (RSDr) %8-18, uyarlık açısından bağıl standard sapmanın (RSDR) ise %21-31 arasında olduğu belirlenmiştir. Süt ve süt tozunda Aflatoksin M1 içeriğinin tayininde imünoafiniti kolon ile ekstraksiyon ve YBSK ile miktar tayini ile ilgili 1998 yılında yürürlüğe giren ISO 14501 sayılı uluslararası standard ülkemiz tarafından da kabul edilerek TS ISO 14501 adı altında kullanıma sunulmuştur (TSE, 2002). 21 2.4 Süt ve Süt Ürünlerinde Aflatoksinler İle İlgili Çalışmalar Pek çok çalışmada aflatoksin degradasyonu üzerine çeşitli mikroorganizmaların kültür ortamında etkileri araştırılmıştır. Bu çalışmaların birinde Karunatne ve arkadaşları (1990) Lactobacillus türlerinin Aspergillus flavus subs. parasiticus’un gelişimi ve aflatoksin oluşturması üzerindeki etkilerini araştırmışlardır. Bu çalışmaya göre laktik asit üreten bakterilerin varlığında inkübasyon süresi boyunca aflatoksin oluşumu gözlenmemiştir. Lb. acidophilus, Lb. bulgaricus ve Lb. plantarum’un etkileri incelenmiş ve Lb. acidophilus’un aflatoksin oluşumu inhibisyonunda en etkili mikroorganizma olduğu gözlenmiştir. Luchese ve Harrigan (1990) yaptıkları bir çalışmada farklı başlangıç pH değerlerinde, Lactococcus lactis veya laktik asit varlığında Aspergillus parasiticus gelişimi ve aflatoksin üretimi üzerinde çalışmışlardır. Söz konusu çalışmada A.parasiticus modifiye Lab-Lemco tripton broth’da tek kültür olarak ve Lactococcus lactis bakterisi ile birlikte geliştirilmiştir. Çalışma sonunda toplam aflatoksin (B1+G1) üretiminin bakteri varlığında daha yüksek olduğu, ve faklı besiyerleri, inokülasyon işlemleri, farklı ingrediyen kullanımlarında da sonucun aynı olduğu belirlenmiştir. Başlangıç pH’sı 4.2 olan besiyerinde nötral besiyerine göre aflatoksin üremesinde artış olduğu; hidroklorik asit ve/veya laktik asidin çok az etkiye sahip olduğu; besiyerinin karbon içeriğinin yarısının laktat ile sağlanması durumunda aflatoksin üretiminde 4.2 başlangıç pH’sında artış, 6.8 başlangıç pH’sında azalma olduğu elde edilen diğer bulgulardır. Gourama ve Bullerman (1995) Lactobacillus türlerinin aflatoksin üretimini inhibe ettiğini bulmuşlardır. Araştırıcılar, 24 saatlik Lactobacillus spp. kültürüne küf sporlarını enjekte ederek ve 4 günlük küf kültürlerine Lactobacillus hücrelerini ekleyerek yaptıkları iki farklı denemede aflatoksin B1’in sırayla %48 ve %72 oranında inhibe olduğunu belirlemişlerdir. Aflatoksin G1 için ise inhibisyon oranlarını sırayla %72 ve %91 olarak bulmuşlardır. Pierides ve arkadaşları (2000) süt ürünlerinde bulunan laktik asit bakterilerinin aflatoksin M1 içeren fosfat tamponlu salamuradaki aflatoksin M1’i degrade edebilme yetenekleri üzerinde çalışmışlardır. Bu amaçla 6 laktik asit bakterisi test edilmiştir. Kültür ortamında en iyi sonucu veren iki mikroorganizma (L. rhanmosus strain GG [LBGG], ve L. rhanmosus strain LC-705 [LC-705]) ile yavan ve tam yağlı sütte 22 çalışılmıştır. Sonuçta aflatoksin B1, B2, G1 ve G2’yi bağlayabilme yeteneğine sahip olan LBGG ve aflatoksin B1’i bağlayabilme yeteneğine sahip olan LC-705’in her ikisinin de aynı zamanda aflatoksin M1 miktarlarında belirgin bir azalmaya neden oldukları gözlenmiştir. Aynı çalışmada LB. lactis ssp. cremoris strain ARH74’den de aflatoksin M1 dekontaminasyon metodu olarak yararlanabileceği ifade edilmektedir. Aflatoksinlerin detoksifikasyonunda etkili olan işlemlerden biri de fermantasyondur. Bir grup araştırmacı tarafından yapılan bir çalışmada 200-1000 ng/g aflatoksin B1 içeren süte %2 yoğurt kültürü ilave edilerek 6 saat inkübasyona bırakılmış, sonuçta aflatoksin B1 sadece başlangıçta bu toksini 100 ng/g oranında içeren örnekte bulunmuş diğer örneklerde ise aflatoksin B1 saptanmamıştır (Megalla ve Hafez, 1982). Wiseman ve Marth (1983), yoğurt, yayıkaltı ve kefirde Aflatoksin M1’in bulunma durumları üzerinde çalışmışlardır. Yoğurt, yayıkaltı ve kefir doğal olarak Aflatoksin M1 ile kontamine sütlerden üretilmiştir. Aflatoksin M1 tayini için örnekler kolon kromatografisi yöntemi ile saflaştırılmış ve ekstraktlar İTK’ye uygulanarak miktar belirlemesine gidilmiştir. Çalışmada yoğurt, kaymağı alınmış süt veya %4 yağsız süt tozu katılan kaymağı alınmış süt kullanılarak üretilmiş ve 7 ˚C’de 6 hafta depolanmıştır. Yoğurttaki Aflatoksin M1 içeriğinin depolama boyunca değişim gösterdiği, ancak 6 haftadan sonra üretim yapılan sütteki başlangıç Aflatoksin M1 ile aynı düzeyde olduğu gözlenmiştir. Yayık altı, kaymağı alınmış sütten üretilmiş ve ilk denemede 7˚C’de 4 gün, ikinci denemede ise 2 hafta depolanmıştır. İlk denemede fermantasyon sonrasında Aflatoksin M1 içeriğinde artış gözlenmiştir, ve bu artış 4 gün boyunca devam etmiştir. İkinci denemede ise fermantasyon sonrasında Aflatoksin M1 miktarında artış olmamıştır. Bu denemelerde yayık altındaki Aflatoksin M1’in yoğurttaki gibi bir değişim gösterdiği belirlenmiştir. Aflatoksin M1 miktarı depolama boyunca varyasyon göstermiş, ancak 7˚C’de 2 hafta boyunca sabit kalmıştır. Kefir, düşük ısı (64˚C/30dk) veya yüksek ısıda (84˚C/30dk) pastörizasyon işlemi uygulanan kaymağı alınmış sütten üretilmiştir. Fermantasyon sonrasında Aflatoksin M1 miktarında azalma gözlenmiş ve bu miktarlar depolama boyunca ve depolama sonunda başlangıçtaki düzeyine geri dönmemiştir. Araştırıcılar analiz sonucunda buldukları Aflatoksin M1 miktarları veya % değişimlerine değinmemiş, grafik üzerinde genel yorumlar yapmışlardır. Van Egmond (1987) tarafından doğal olarak kontamine olmuş süt örneği ile yapılan bir çalışmada aflatoksin M1 miktarının yoğurtta 23 süttekine göre biraz daha fazla olduğu gözlenmiş ve Aflatoksin M1’in miktarının 7 gün boyunca 7°C’de depolamada değişmediği gözlenmiştir (Soylu ve Yaldız,1998). Blanco ve ark (1993) tarafından yapılan bir çalışmada yoğurdun üretimi ve depolanması sırasında aflatoksin B1, B2, G1, G2 ve M1’in davranışları incelenmiştir. Çalışma sırasında İTK yöntemi kullanılarak aflatoksin tayin limitinin 0.02 µl/lt ve geri kazanım yüzdesinin %90’ın üzerinde olduğu saptanmıştır. Kontaminasyondan önce örneklerde hiç aflatoksine rastlanmamış olup sütün kontamine edildikten sonra yoğurt yapımı ve depolanması sırasında aflatoksin miktarında bir değişme olmadığı, aflatoksinlerle kontamine olmuş sütün insan sağlığı için büyük bir risk taşıdığı ifade edilmiştir. Hassanin (1994) yoğurt, laktik peynir ve asidifiye süt üretiminde ve depolanmasında Aflatoksin M1’in stabilitesi üzerine yaptığı bir çalışmada pastörize, yarım yağlı ve doğal olarak kontamine süt kullanarak söz konusu ürünleri hazırlamış ve 4˚C’de 2 haftalık depolama boyunca Aflatoksin M1’deki değişimleri incelemiştir. Aflatoksin analizi için ekstrakte edilen örnekler kloroform fazında çözüldükten sonra İTK ve florodensimetre kullanılarak miktar tayini yapılmıştır. Üretimin hemen ardından yoğurtta %83’e düşen Aflatoksin M1 depolama boyunca da azalmaya devam etmiş ve 13 gün sonunda yoğurttaki Aflatoksin M1 %41 olarak saptanmıştır. Asitlendirilmiş sütte de benzer bir durum gözlenmiştir. İlk gün %88 olan Aflatoksin M1 düzeyi 13. gün sonunda %34’e kadar düşmüştür. Laktik peynirde ise ilk gün diğer iki ürünle benzer olarak %88’e düşen Aflatoksin M1 depolama boyunca çok düşük miktarda azalmaya devam etmiş ve 13 gün sonunda diğerlerine göre oldukça yüksek olan %71 Aflatoksin M1 tayin edilmiştir. Laktik peynirde Aflatoksin M1’in daha stabil olmasının kazein ile olan ilişkisinden kaynaklandığı düşünülmektedir. Diğer iki ürün arasında ise pH’nın azalması ve titre edilebilir asitliğin artmasının Aflatoksin M1’de azalmaya neden olduğu ayrıca yoğurtta bulunan mikroorganizmaların da bu azalmayı etkilediği düşünülmektedir. Barrios ve arkadaşları (1996) yaptıkları bir çalışmada Güney İspanya’da farklı tip sütlerden (inek, koyun, keçi ve çeşitli türlerin sütlerinin karışımları) üretilen 9 taze, 9 yarı olgunlaşmış ve 17 olgunlaşmış olmak üzere 35 ticari peyniri Aflatoksin M1 varlığını belirlemek amacıyla YBSK kullanarak analizlemişler ve örneklerin 16’sında (%45.71) 20-200 ng/g arasında değişen konsantrasyonlarda Aflatoksin M1 saptamışlardır. Aflatoksin M1 saptanan örneklerde 24 ortalama Aflatoksin M1 miktarı olgunlaşmış peynirler için 105.33 ng/g, yarı olgunlaşmış peynirler için 73.80 ng/g, ve taze peynirler için 42.60 ng/g olarak belirlenmiştir . Saitanu (1997), Tayland süt ürünlerinde Aflatoksin M1 oluşumunu incelemek amacıyla toplam 270 çiğ süt ve marketlerden sağlanan süt ürünü örneklerini radyoimmunoanaliz tekniğinden yararlanarak analizlemiştir. Süt ürünlerinin büyük çoğunluğunda ve ithal edilen süt tozlarında Aflatoksin M1 saptanmıştır. Analizlenen örneklerin %18’inde (çiğ süt 17/67, pastörize süt 20/63, UHT süt 7/60, sterilize süt 3/60, süt tozu tableti 1/7) Aflatoksin M1 miktarı 0.5 ppb’nin üzerinde olarak belirlenmiştir. İki örnek dışındaki tüm süttozu örneklerinin Aflatoksin M1 açısından negatif olduğu, Aflatoksin M1 saptanan iki örnekte ise Aflatoksin M1 düzeyinin 0.1 ppb’nin altında olduğu gözlenmiştir. Soylu ve Yaldız (1998) tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada farklı iki starter kültür (CHR Hansen firmasına ait St-36 ve Lb-12 kodlu liyofilize, termofilik laktik kültür, ve Pınar Süt San. A.Ş. tarafından sağlanan ve günlük üretim için hazırlanan sıvı kültür) kullanarak yoğurt üretilmiş ve yoğurda aflatoksin geçiş düzeyleri ile yoğurdun 4°C’de 1 hafta süreyle depolanması sonucunda aflatoksin düzeylerindeki değişimler incelenmiştir. 1. tip starter kullanılarak elde edilen yoğurtta aflatoksin düzeylerinde aflatoksin B1 için %14 civarında, aflatoksin M1 için ise %20 civarında bir artış gözlenmiştir. 2. tip starter kültür kullanıldığında ise her iki aflatoksin çeşidi için de %50 oranında bir azalma olduğu gözlenmiştir. Depolama sonucunda her iki tip yoğurtta da aflatoksin düzeylerinde azalma belirlenmiştir. Azalma oranının 1. tip yoğurt için %20, 2. tip yoğurt için ise %21 olduğu bulunmuştur. Lopez ve arkadaşları (2001), kontamine sütlerden peynir eldesinde Aflatoksin M1’in durumunu belirlemek amacıyla yaptıkları çalışmada 1.7-2.0 µg/l aralığında Aflatoksin M1 ile kontamine ettikleri sütleri laboratuvar ölçekli peynir üretiminde kullanmışlardır. Elde edilen peynir ve peyniraltı suyunda enzimatik immunoanaliz tekniği kullanılarak Aflatoksin M1 analizi yapılmış ve toksinin %60’ının peyniraltı suyunda kaldığı ve %40’ının da peynire geçtiği belirlenmiştir. Türkiye’nin Van yöresinde yapılan bir çalışmada 100. Yıl Üniversitesi, Ziraat Fakültesi süt üretim tesislerinden alınan çiğ süt ve işlem görmüş süt ürünlerinde Aflatoksin M1 tayini yapılmıştır. Analizlenen 90 çiğ süt örneğinin 79’unda (%87.77) Aflatoksin M1 saptanmıştır. Aflatoksin M1 saptanan örneklerin 35’inde (%44.30) Aflatoksin M1 miktarının izin verilen yasal sınırın (0.05ppb) üzerinde 25 olduğu belirlenmiştir. Yapılan istatistiksel değerlendirmeler Aflatoksin M1 düzeyi ile sütün toplandığı aylar arasında ilişki olduğunu göstermiştir. Mart-Nisan ve Mart-Mayıs dönemleri arasında alınan örneklerde anlamlı farklılıklar saptanırken Nisan-Haziran ve Mayıs-Haziran dönemlerinde istatistiksel açıdan farklılık (p<0.01) bulunamamıştır. Süt ürünlerine Aflatoksin M1 geçişi ve bu ürünlerdeki durumunun belirlenmesi amacıyla ise toplam 93 örnek incelenmiş, elde edilen sonuçlar pastörize süt, yağsız süt, yoğurt, yayıkaltı ve peyniraltı suyunda bulunan Aflatoksin M1 ile çiğ sütteki Aflatoksin M1 arasında istatistiksel açıdan fark olmadığını gösterirken beyaz peynir ve kaşar peynirinde çiğ süte göre artış, krema ve tereyağında ise azalma olduğu belirlenmiştir (Bakırcı, 2001). 26 3 MATERYAL VE METOD 3.1 Materyal Bu çalışmada materyal olarak İzmir bölgesindeki bir firmaya ait, 4 ay raf ömrüne sahip, 1 litrelik karton ambalajlarda satışa sunulan, aynı üretim hattından alındığı seri numaraları ile belirlenen, 10 kutu, UHT sterilize süt kullanılmıştır. Kefir üretimi amacıyla E.Ü. Ziraat Fakültesi, Süt Ürünleri Bölümünden sağlanan kefir taneleri kullanılmıştır. Taneler üretim için gereken miktarlarda parti parti alınmış ve kısa süreli depolama gerektiğinde buzdolabı koşullarında (+4˚C) saklanmıştır. Kefir yapımında kullanılacak sütün kontaminasyonu amacıyla kullanılan Aflatoksin M1 standardı, ve analizlerin ekstraksiyon aşamalarında kullanılan imünoafiniti kolonlar “Rhone-diagnostics Technologies” laboratuvarlarından Sincer Dış Ticaret aracılığı ile sağlanmıştır. Toz halinde gelen standard asetonitril içinde çözülerek –18 ºC’de, kolonlar ise +4 ºC’de saklanmışlardır. 3.2 Metod 3.2.1 Kefir üretimi Kefir üretiminde aşağıda gösterilen yöntem izlenmiştir; Buzdolabından çıkarılan sütün oda sıcaklığına (20-25 ºC) getirilmesi ↓ Süte %3-5 oranında kefir tanesinin ilavesi ↓ Sütün 20-25 °C’de 18-24 saat pıhtılaştırılması ↓ Süzme işleminin yapılarak Kefir İçeceğinin eldesi Kefir tanesi 27 3.2.2 Sütte Aflatoksin M1 Tayini İçin Gerçekleştirilen Deneme Sütte Aflatoksin M1 tayininin geliştirilmesi amacı ile gerçekleştirilen geri kazanma denemelerinde immunolojik yöntemden yararlanılmıştır. İmmonuafiniti kolonların etkinliğinin belirlenmesi amacıyla 0.25 µg/ml konsantrasyondaki Aflatoksin M1 çalışma çözeltisinden 40 µl, 100 ml süte katılarak 0.1 µg/l konsantrasyonunda kontamine edilmiştir. Kontamine edilen süt, Rhone-diagnostics Technologies Ltd. tarafından önerilen analiz yöntemi kullanılarak ve iki tekrar olacak şekilde analizlenmiştir. Yöntemde kullanılan reaktifler: - Aflatoksin M1 standardı (Rhone-diagnostatics Technologies Stok çözelti: 0.5µg/ml asetonitril, Çalışma çözeltisi: 0.25µg/ml asetonitril) - Metanol (Riedel-de Haen, %99.7 saflıkta) - Asetonitril (Riedel-de Haen, %99 saflıkta) - Kloroform (J.T. Baker, %99 saflıkta) Yöntemde kullanılan aygıtlar: - YBSK ; Hewlett Packard Series 1050 - Mobil faz: su-asetonitril-metanol (50-30-20) - Akış hızı: 1 ml/dk - Enjeksiyon hacmi: 15,100 µl - Kolon: C18 µ Bondapak (3.9*300mm, 125 Å, 10 µm) (Waters, Chromatograph Division/Millipore Corporation) - Sıcaklık: 25˚C - Dedektör: floresans dedektör (Em: 430nm, Ex: 360nm) (Waters 470 scanning flourescence dedector, ) - Santrifüj (MSE Mistral 1000) - Karıştırıcı (Elektro-mag M16) - Azot tüpü 28 Analiz yöntemi: Süt 37 ºC’ye ısıtılır ↓ Whatman No. 4 filtre kağıdından süzülür veya 4000 rpm/15 dk santrifüjlenir ↓ En az 50 ml süt toplanır ↓ İmünoafiniti kolondan yaklaşık 2-3 ml/dk hızla geçirilir ↓ Kolon iki kez 10 ml su ile yıkanır (akış hızı 5 ml/dk olacak şekilde) ↓ 1.25 ml metanol:asetonitril (20:30) ile kolondaki Aflatoksin M1 geri alınır ↓ Azot altında kuruluğa buharlaştırılıp, 100 µl kloroformda çözüldükten (enjeksiyon hacmi, 10/15 µl) veya doğrudan ekstrakt üzerine 1.25 ml saf su katıldıktan (enjeksiyon hacmi, 100 µl) sonra YBSK’de analizlenir Not: enjeksiyon öncesinde karıştırıcı ile ekstrakt iyice karıştırılmaktadır. 3.2.3 Kefirde Aflatoksin M1 Tayininin Geliştirilmesi Amacıyla Yapılan Denemeler Kefirde Aflatoksin M1 tayini için en uygun yöntemin belirlenmesi amacıyla farklı analiz yöntemleri kullanılarak geri kazanma denemeleri gerçekleştirilmiştir. Bu denemelerde kullanılan kefir örnekleri 0.1 ve 0.2 µg/l düzeylerinde Aflatoksin M1 ile kontamine edilmiştir. Bu amaçla 0.25 µg/l konsantrasyonlu çalışma çözeltisinden 50 ml kefire sırasıyla 20 ve 40 µl katılmıştır. Analizler iki tekrar olarak gerçekleştirilmiştir ve uygulanan yöntemler aşağıda belirtilmektedir. 29 3.2.3.1 I. Yöntem; AOAC (1995) tarafından gıdalarda aflatoksin tayinleri için önerilen ve Romer yöntemi olarak bilinen analiz yöntemi kullanılarak kefirde geri kazanma denemeleri gerçekleştirilmiştir. Yöntemde kullanılan reaktifler: - Aflatoksin M1 standardı (Rhone-diagnostatics Technologies Stok çözelti: 0.5µg/ml asetonitril, Çalışma çözeltisi: 0.25µg/ml asetonitril) - Aseton (Merck, %99.8 saflıkta) - Sodyum hidroksit (Riedel-de Haen, %99-100.5 saflıkta) (0.2 M çözelti hazırlanmıştır) - Demir (III) klorür (Merck, %99 saflıkta) ) (0.41 M çözelti hazırlanmıştır) - Sülfürik asit (Smyras, %98 saflıkta) (%0.03’lük çözelti hazırlanmıştır) - Kloroform (J.T. Baker, %99.8 saflıkta) - Susuz sodyum sülfat (Riedel-de Haen, %99 saflıkta) Yöntemde kullanılan aygıtlar: - YBSK; Hewlett Packard Series 1050 - Mobil faz: su-asetonitril-metanol (50-30-20) - Akış hızı: 1 ml/dk - Enjeksiyon hacmi: 15 µl - Kolon: C18 µ Bondapak (3.9*300mm, 125 Å, 10 µm) (Waters, Chromatograph Division/Millipore Corporation) - Sıcaklık: 25˚C - Dedektör: floresans dedektör (Ex: 360nm, Em: 430nm) (Waters 470 Scanning Flourescence Dedector) - İTK; - geliştirme tankı - yürütme çözgeni: aseton-su (90-10) - plaka (Merck, 20x20 cm silica gel 60, hazır alüminyum plaka) 30 - - dedektör (Camag UV-Cabinet II, dedeksiyon dalga boyu 366) Blender (Waring Commercial Blendor) Dönerli buharlaştırıcı (Büchi Rotavapor R110) Karıştırıcı (Elektro-mag M16) Azot tüpü Analiz yöntemi; 50 ml kefir 10 ml su ve 250 ml aseton ilave edilerek blenderda 2 dk süre ile karıştırılır ↓ 32 cm’lik Whatman No.2V filtre kağıdından 250 ml’lik bir mezüre süzülerek 200 ml filtrat toplanır ↓ Biriktirilen 200 ml filtrat 500 ml’lik balona alınır ↓ 170 ml sodyum hidroksit çözeltisi ve 30 ml 0.41 M demir klorür çözeltisi 500 ml’lik balona ilave edilerek iyice karıştırılır ve hemen 200 ml filtratın bulunduğu balona boşaltılır. Çözelti iyice karıştırılır ve 2 dk süreyle arada bir karıştırılarak bekletildikten sonra 32 cm’lik Whatman 2V filtre kağıdından süzülerek 250 ml süzüntü biriktirilir ↓ 250 ml süzüntü içinde 250 ml %0.03’lük sülfürik asit çözeltisi 10 ml kloroform içeren 500 ml’lik bir ayırma hunisine aktarılarak 1 dk kuvvetle çalkalanır. Fazlar ayrıldıktan sonra alttaki kloroform tabakası susuz sodyum sülfattan süzülerek 100 ml’lik bir balon içinde toplanır. Ayırma hunisindeki ekstraksiyon üç defa 10’ar ml kloroform ilavesi ile tekrarlanarak alttaki kloroform fazları aynı 100 ml’lik balonda toplanır. Ayırma hunisi üç defa 2’şer ml kloroform ile yıkanır, sodyum sülfat ise 2 ml kloroform ile yıkanır ve bu süzüntülerin hepsi 100 ml’lik balona ilave edilir. Balonun içindekiler dönerli buharlaştırıcıda hemen hemen kuruluğa kadar buharlaştırıldıktan sonra kalan çözelti kloroform ilavesi ile küçük bir şişeye aktarılır ve azot altında kuruluğa buharlaştırılır ↓ Kalıntı 100 µl kloroformda çözülür ↓ ↓ İTK’de analizlenir YBSK’de analizlenir Not: enjeksiyon öncesinde karıştırıcı ile ekstrakt iyice karıştırılmaktadır. 31 3.2.3.2 II. Yöntem; Rhone-Diagnostics Technologies Ltd. tarafından süt için önerilen analiz yönteminde, kefir için uygun modifikasyonlar yapılarak kefirde geri kazanma denemeleri gerçekleştirilmiştir. Yöntemde kullanılan reaktifler: - Aflatoksin M1 standardı (Rhone-diagnostatics Technologies Stok çözelti: 0.5µg/ml asetonitril, Çalışma çözeltisi: 0.25µg/ml asetonitril) - Metanol (Riedel-de Haen, %99.7 saflıkta) - Asetonitril (Riedel-de Haen, %99 saflıkta) - Kloroform (J.T. Baker, %99.8 saflıkta) Yöntemde kullanılan aygıtlar: - YBSK; Hewlett Packard Series 1050 - Mobil faz: su-asetonitril-metanol (50-30-20) - Akış hızı: 1 ml/dk - Enjeksiyon hacmi: 15,100 µl - Kolon: C18 µ Bondapak (3.9*300mm, 125 Å, 10 µm) (Waters, Chromatograph Division/Millipore Corporation) - Sıcaklık: 25˚C - Dedektör: floresans dedektör (Ex: 360nm, Em: 430nm) (Waters 470 scanning flourescence dedector) - İTK; - geliştirme tankı: - yürütme çözgeni: aseton-su (90-10) - plaka (Merck, 20x20 cm silica gel 60, hazır alüminyum plaka) - dedektör (Camag UV-Cabinet II, dedeksiyon dalga boyu 366) - Santrifüj (MSE Mistral 1000) - Blender (Waring Commercial Blendor) - Dönerli buharlaştırıcı (Büchi rotavapor R110) - Karıştırıcı (Elektro-mag M16) - Azot tüpü 32 Analiz yöntemi: 50 ml kefir 37 ºC’ye ısıtılır ↓ 4000 rpm/15 dk santrifüjlenir ↓ Santrifüj sonrasında sıvı kısım herhangi bir katı partikülün geçişini önlemek amacıyla Whatman No. 4 filtre kağıdından süzülür ↓ Toplanan sıvı kısım imünoafiniti kolondan yaklaşık 2-3 ml/dk hızla geçirilir ↓ Kolon iki kez 10 ml su ile yıkanır (akış hızı 5 ml/dk olacak şekilde) ↓ 1.25 ml metanol:asetonitril (20:30) ile kolondaki Aflatoksin M1 geri alınır ↓ ↓ Azot altında kuruluğa buharlaştırıldıktan sonra 100 µl kloroformda çözülür ve İTK’de analizlenir Azot altında kuruluğa buharlaştırılıp 100 µl kloroformda çözüldükten (enjeksiyon hacmi, 10/15 µl) veya doğrudan ekstrakt üzerine 1.25 ml saf su ilave edildikten (enjeksiyon hacmi, 100 µl) sonra YBSK’de analizlenir Not: enjeksiyon öncesinde karıştırıcı ile ekstrakt iyice karıştırılmaktadır. 33 3.2.3.3 III. Yöntem; Dragacci ve arkadaşları (1995) tarafından peynirde aflatoksin M1 tayini için geliştirilen imünoafiniti kolonda saflaştırma yöntemi kefir için modifiye edilerek geri kazanma denemeleri gerçekleştirilmiştir. Yöntemde kullanılan reaktifler: - Aflatoksin M1 standardı (Rhone-diagnostatics Technologies Stok çözelti: 0.5µg/ml asetonitril, Çalışma çözeltisi: 0.25µg/ml asetonitril) - Diklorometan (Merck, %99.5 saflıkta) - Hyflo-supercel diatome toprağı (Aldrich Chem. Company) - Metanol (Riedel-de Haen, %99.7 saflıkta) - Asetonitril (Riedel-de Haen, %99 saflıkta) - Hegzan (Kimetsan) - Kloroform (J.T. Baker, %99.8 saflıkta) Yöntemde kullanılan aygıtlar: - YBSK; Hewlett Packard Series 1050 - Mobil faz: su-asetonitril-metanol (50-30-20) - Akış hızı: 1 ml/dk - Enjeksiyon hacmi: 100 µl - Kolon: C18 µ Bondapak (3.9*300mm, 125 Å, 10 µm) (Waters, Chromatograph Division/Millipore Corporation) - Sıcaklık: 25˚C - Dedektör: floresans dedektör (Ex:360nm, Em:430nm) (Waters 470 scanning flourescence dedector) - İTK; - geliştirme tankı: - yürütme çözgeni: aseton-su (90-10) - plaka (Merck, 20x20 cm silica gel 60, hazır alüminyum plaka) - dedektör (Camag UV-Cabinet II, dedeksiyon dalga boyu 366) - Blender (Waring Commercial Blendor) - Dönerli buharlaştırıcı (Büchi Rotavapor R110) 34 - Karıştırıcı (Elektro-mag M16) Azot tüpü Analiz yöntemi: 50 ml kefir üzerine 80 ml diklorometan ve 5-10 g hyflo-supercel eklenerek blenderda 2 dk süre ile karıştırılır ↓ 40 ml daha diklorometan ile yıkanır ↓ Süzülür ↓ Döner buharlaştırıcıda 35-40 ˚C’de kuruluğa buharlaştırılır ↓ Kalıntı 1 ml metanol, 30 ml saf su ve 50 ml hegzan eklenerek çözülür ↓ Çözelti ayırma hunisine aktarılır, alttaki sulu faz bir beherde toplanır ↓ Ayırma hunisi iki kez 10’ar ml su ile yıkanır ve sulu fazlar toplanır ↓ Toplanan sulu fazlar birleştirilir ve imünoafiniti kolondan yaklaşık 2-3 ml/dk hızla geçirilir ↓ Kolon iki kez 10 ml su ile yıkanır (akış hızı 5 ml/dk olacak şekilde) ↓ 1.25 ml metanol:asetonitril (20:30) ile kolondaki Aflatoksin M1 geri alınır ↓ ↓ Azot altında kuruluğa Ekstrakt üzerine 1.25 ml saf su buharlaştırıldıktan sonra 100 µl katıldıktan (enjeksiyon hacmi, kloroformda çözülür ve İTK’de 100 µl) sonra YBSK’de analizlenir analizlenir Not: enjeksiyon öncesinde karıştırıcı ile ekstrakt iyice karıştırılmaktadır. 35 3.2.3.4 IV. Yöntem; Kefirde II.yöntem uygulandığında santrifüj sonrası çok fazla katı madde kaybı olması ve bu durumun geri kazanım değerini düşürmesi nedeni ile II. ve III. yöntemler birleştirilerek geliştirilen analiz yöntemi ile kefirde geri kazanma denemeleri gerçekleştirilmiştir. Yöntemde kullanılan reaktifler: - Aflatoksin M1 standardı (Rhone-diagnostatics Technologies Stok çözelti: 0.5µg/ml asetonitril, Çalışma çözeltisi: 0.25µg/ml asetonitril) - Metanol (Riedel-de Haen, %99.7 saflıkta) - Asetonitril (Riedel-de Haen, %99 saflıkta) - Kloroform (J.T. Baker, %99.8 saflıkta) - Diklorometan (Meck, %99.5 saflıkta) - Hyflo-supercel diatome toprağı (Aldrich Chem. Company) - Hegzan (Kimetsan) Yöntemde kullanılan aygıtlar: - YBSK; Hewlett Packard Series 1050 - Mobil faz: su-asetonitril-metanol (50-30-20) - Akış hızı: 1 ml/dk - Enjeksiyon hacmi: 100 µl - Kolon: C18 µ Bondapak (3.9*300mm, 125 Å, 10 µm) (Waters, Chromatograph Division/Millipore Corporation) - Sıcaklık: 25˚C - Dedektör: floresans dedektör (Ex:360nm, Em:430nm) (Waters 470 scanning flourescence dedector) - Santrifüj (MSE Mistral 1000) - Homojenizatör (Edmund Bühler 7400 Tübingen H04) - Dönerli buharlaştırıcı (Büchi Rotavapor R110) - Karıştırıcı (Elektro-mag M16) - Azot tüpü 36 Analiz Yöntemi: 50 ml kefir 37 ºC’ye ısıtıldıktan sonra 4000 rpm/15 dk santrifüjlenir ↓ Santrifüj sonrasında elde edilen sıvı kısım imünoafiniti kolon aşamasına kadar II. Yöntem kullanılarak analizlenir ↓ Santrifüj tüpünde kalan katı kısım imünoafiniti kolon aşamasına kadar III. Yöntem kullanılarak analizlenir (blender yerine homojenizatör kullanılarak) ↓ ↓ Her iki yöntem ile elde edilen sulu fazla birleştirilir ve imünoafiniti kolondan yaklaşık 2-3 ml/dk hızla geçirilir ↓ Kolon iki kez 10 ml su ile yıkanır (akış hızı 5 ml/dk olacak şekilde) ↓ 1.25 ml metanol:asetonitril (20:30) ile kolondaki Aflatoksin M1 geri alınır ↓ Azot altında kuruluğa buharlaştırılıp 100 µl kloroformda çözüldükten (enjeksiyon hacmi, 10/15 µl) veya doğrudan ekstrakt üzerine 1.25 ml saf su ilave edildikten (enjeksiyon hacmi, 100 µl) sonra YBSK’de analizlenir Not: enjeksiyon öncesinde karıştırıcı ile ekstrakt iyice karıştırılmaktadır. 37 3.2.4 Kefir Tanesinde Aflatoksin M1 Tayininin Geliştirilmesi Amacıyla Yapılan Denemeler Kefir tanesinde uygun yöntemin belirlenmesi amacıyla, AOAC (1995), ve Dragacci ve arkadaşları’ın (1995) peynirler için önerdiği imünoafiniti kolon kullanımı olmak üzere iki farklı analiz yöntemi kullanılarak geri kazanma denemeleri gerçekleştirilmiştir. Bu denemelerde kullanılan kefir taneleri 0.1 ve 0.2 µg/l düzeylerinde Aflatoksin M1 ile kontamine edilmiştir. Bu amaçla 0.025 µg/l konsantrasyonlu çalışma çözeltisinden 10 g kefir tanesine sırasıyla 40 ve 80 µl katılmıştır. Analizler iki tekrar olarak gerçekleştirilmiştir ve uygulanan yöntemler aşağıda belirtilmektedir. 3.2.4.1 I.Yöntem; Genel olarak gıdalarda aflatoksin tayinleri için Romer tarafından geliştirilen analiz yöntemi kullanılarak kefir tanesinde geri kazanma denemeleri gerçekleştirilmiştir (AOAC, 1995). Uygulanan yöntem madde 3.2.3.1’de anlatılan yöntem olup örnek olarak 50 ml kefir yerine 10 g kefir tanesi kullanılmıştır. 3.2.4.2 II. Yöntem: Dragacci ve arkadaşları’ın (1995) yaptıkları bir çalışmada tanımladıkları peynirde aflatoksin M1 tayini için imünoafiniti kolonda saflaştırma yöntemi kullanılarak kefir tanesinde geri kazanma denemeleri gerçekleştirilmiştir. Söz konusu yöntem madde 3.2.3.3’de açıklanmaktadır. Ancak örnek olarak 50 ml kefir yerine 10 g kefir tanesi kullanılmıştır. 38 3.2.5 Sütten Kefire ve Kefir Tanesine Aflatoksin M1 Geçişinin Belirlenmesi Amacıyla Sütün Kontaminasyonu Sütten kefire ve kefir tanesine Aflatoksin M1 geçişinin belirlenmesi amacıyla yapılan analizlerde hammadde olarak kullanılan süt 0.1, 0.2 ve 0.5 µg/l düzeylerinde kontamine edilmiştir. Bu amaçla 0.25 µg/l konsantrasyonlu çalışma çözeltisinden 250 ml süte sırasıyla 100, 200 ve 500 µg/l katılmıştır. 3.2.1’de anlatıldığı şekilde kefir elde edilmiştir. Kefir üretildikten hemen sonra kefir tanesi 3.2.4.2’de anlatılan yöntemle, kefir ise 3.2.3.4’de anlatılan yöntem ile analizlenmiştir. Analizler iki tekrar olarak gerçekleştirilmiştir. 3.2.6 Kefirin Depolanması 0.1, 0.2 ve 0.5 µg/l düzeylerinde kontamine edilmiş sütlerden elde edilen kefir +4ºC’de 10 gün depolanmış ve depolamanın 0., 5. ve 10. Günlerinde analize alınmıştır, analizler iki tekrar olarak gerçekleştirilmiştir. 3.2.7 Kefirden Elde Edilen Bakteri İzolatlarının Aflatoksin M1 İle Etkileşimlerinin Besiyerinde İncelenmesi Kefirde bulunan mikroorganizmaların kültür ortamında Aflatoksin M1’ degrade edici özelliklerinin belirlenmesi amacıyla kefirden izole edilen iki tür laktik asit bakterisi kontamine besiyerinde geliştirildikten sonra iki tekrar olacak şekilde Aflatoksin M1 analizi uygulanmıştır. Söz konusu çalışma E.Ü. Gıda Mühendisliği Bölümü, Mikrobiyoloji Bilim dalı ile ortak olarak gerçekleştirilmiştir. 39 3.2.7.1 Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonu, Saflaştırılması, Etkili Laktik Asit Bakterilerinin Tanımlanması Bu bölümde açıklanan işlemler E.Ü., Gıda Mühendisliği Bilim Dalı tarafından gerçekleştirilmiştir. İzlenen yöntem kısaca anlatılmaktadır. İzolasyon amacı ile10 ml kefir örneği alınıp 90 ml %0.1’lik peptonlu (Oxoid L37) suya aktarılarak 10-1’lik dilüsyon elde edilmiştir. Aynı seyreltme sıvısı kullanılarak desimal dilüsyonlar hazırlanmıştır. Uygun dilüsyonlardan çift tabaka dökme plak yöntemine göre besiyeri olarak Man Rogosa ve Sharpe Agar (MRS, Merck) kullanılarak paralel ekimler yapılmıştır. 30 ˚C’de 48-72 saat inkübasyon süresini tamamlayan petrilerde laktik asit bakteri sayımı gerçekleştirilmiştir (Sharpe vd.,1966; Kandler ve Weiss, 1984). Sayımı yapılabilen petrilerde oluşan kolonilerden her örnek için onar adet koloni rast gele olarak seçilmiş ve elde edilen izolatlar MRS Agar plaklarında çizgi ekim tekniği ile tek koloni düşürmek suretiyle saflaştırılmıştır. İzolatların saflıkları gram boyama yapılarak mikroskobik inceleme ile kontrol edildikten sonra gram pozitif izolatların laktik asit bakterisi olduğundan emin olmak için katalaz testi uygulanmıştır. Böylece gram pozitif ve katalaz negatif örnekler Aflatoksin M1 analizinde kullanılmak üzere süttozu besiyerinde (%0.3 maya ekstraktıOxoid L21, %1 CaCO3, %1 glikoz-Oxoid, %10 yağsız süttozu-Pınar A.Ş.) stoğa alınmışlardır. Uygun aralıklarda transfer edilerek +4 ˚C’de saklanmışlardır (Hardie, 1986). Son aşamada saflaştırılan laktik asit bakterilerinden küflere karşı etki gösterenlerin tanımlanmasına geçilmiştir. İlk önce gram boyama ve katalaz testi ile laktik asit bakterisi olduğu doğrulanan izolatlara daha sonra ana ayrım olan heterofermantatif ve homofermantatif laktik asit bakteri gruplarının belirlenmesi için glikozdan gaz oluşturma testi yapılmıştır. Belirlenen bu ana gruba göre gerekli tanımlama testleri uygulanmıştır. Söz konusu tanımlama testlerinde Schillinger ve Lücke (1987), Hammes ve Vogel (1995) ve Teuber (1995)’in belirttiği kriterler esas alınmıştır. 40 3.2.7.2 Laktik Asit Bakterilerinin Aflatoksin M1 İle Kontamine Olan Besiyerinde Geliştirilmesi Süttozu besiyerinde depolanan bakterilerden 1’er ml alınarak MRS sıvı besiyerine aktarılmış ve 30 ˚C’de 24 saat süre ile geliştirildikten sonra 1’er ml’leri Aflatoksin M1 ile kontamine edilen LTB (Lablemco Tryptone Broth) besiyeri içine aktarılmış ve 30 ˚C’de 6 gün süre ile inkübe edilmiştir. LTB sıvı besiyeri 0.5 µg/l düzeyinde kontamine edilmiştir.Bu amaçla 0.25 µg/l konsantrasyonlu çalışma çözeltisinden 100 ml besiyerine 100 µl katılmıştır. Geri kazanma denemesi amacıyla yine aynı miktarda toksin ile kontamine edilen besiyeri ve steril besiyerine de Aflatoksin M1 analizleri uygulanmıştır. Çalışma şartlarının standardize edilebilmesi için kontamine besiyeri de inkübasyona tabi tutulmuştur. 3.2.7.3 Aflatoksin M1 Analizi Besiyerinin sıvı ve homojen olması nedeni ile sütte Aflatoksin M1 analizinde uygulanan yöntem besiyerlerinin analizi için denenerek % geri kazanım hesaplandıktan sonra madde 3.2.2’de verilen yöntem uygulanarak temiz besiyerinde, kontamine besiyerinde ve kefirden izole edilen iki laktik asit bakterisinin ayrı ayrı geliştirildiği besiyerlerinde Aflatoksin M1 analizleri gerçekleştirilmiştir. 41 4 BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1 Süt, Kefir ve Kefir Tanesinde Aflatoksin M1 Tayini İçin Uygun Yöntemin Belirlenmesi İle İlgili Bulgular Süt, kefir ve kefir tanesine Aflatoksin M1 tayini için uygun yöntemin belirlenmesi amacı ile gerçekleştirilen geri kazanma denemeleri ile ilgili bulgular çizelge 4.1’de verilmektedir. Çizelge 4.1: Süt, kefir ve kefir tanesinde farklı analiz yöntemleri ile elde edilen geri kazanama değerleri Örnek Süt Kefir Uygulanan Analiz Yöntemi (15 µl enjeksiyon) (100 µl enjeksiyon) I.Yöntem-İTK I.Yöntem-YBSK (15 µl enjeksiyon) II.Yöntem-İTK II.Yöntem-YBSK (15 µl enjeksiyon) II.Yöntem-YBSK (100 µl enjeksiyon) III.Yöntem-İTK Kefir Tanesi III.Yöntem-YBSK (100 µl enjeksiyon) IV.Yöntem-YBSK (100 µl enjeksiyon) I. yöntem-İTK I. yöntem-YBSK II. Yöntem-İTK II.Yöntem-YBSK (100 µl enjeksiyon) Aflatoksin M1 Geri Kazanım Yüzdesi (%) 30 100 Çok düşük floresans oluşumu nedeniyle değerlendirme yapılamamıştır Girişim yapan maddeler nedeniyle sonuç alınamamıştır Çok düşük floresans oluşumu nedeniyle değerlendirme yapılamamıştır 25 58 Çok düşük floresans oluşumu nedeniyle değerlendirme yapılamamıştır 51 75 Floresans gözlenememiştir Girişim yapan maddeler nedeniyle değerlendirme yapılamamıştır Floresans gözlenememiştir 65 42 Çizelge 4.1’de görüldüğü gibi sütte immunolojik analizin etkinliğinin belirlenmesi amacı ile yapılan denemelerde analiz sonunda kurutma ve tekrar çözündürme işlemleri uygulandığında %30 geri kazanım elde edilirken kurutma işlemi yapılmadan YBSK’ne doğrudan enjeksiyon ile %100 geri kazanım elde edilmiştir. Çizelge 4.1’den kefirde I. Yöntem ile ekstraksiyon ve İTK ile miktar tayini yapıldığında, örnek içerisindeki Aflatoksin M1 miktarı çok düşük olduğundan verdiği floresansın da çok düşük olduğu ve değerlendirme yapılamadığı gözlenmektedir. I. Yöntem ile ekstraksiyon ve YBSK ile miktar tayini yapıldığında ise YBSK’de girişim yapan maddelerin varlığı nedeni ile sonuç alınamamıştır. II. Yöntem ile ekstraksiyon işlemi uygulandığında, miktar belirleme aşamasında İTK’den yararlanıldığında toksin miktarının düşük olması ve düşük floresans nedeniyle değerlendirme yapılamamıştır. Ekstraksiyon sonrasında kuruluğa buharlaştırma ve tekrar çözerek YBSK’de 15 µl enjeksiyon ile analiz gerçekleştirildiğinde geri kazanım yalnızca %25 iken kurutma işlemi uygulanmadan 100 µl enjeksiyon hacmi ile YBSK’de analizlendiğinde geri kazanımın %58’e çıktığı gözlenmiştir. III. Yöntem ile ekstraksiyon işlemi uygulandığında, miktar belirleme aşamasında İTK’den yararlanıldığı zaman toksin miktarının düşük olması ve düşük floresans nedeniyle değerlendirme yapılamamıştır. Ekstraksiyon sonrasında YBSK yardımı ile miktar belirlemesi yapıldığında ise %51 geri kazanım elde edilmiştir. Geri kazanımların düşük olması nedeni ile bu iki yöntem birleştirilerek (IV. Yöntem) kefirde Aflatoksin M1 analizi için kullanılmıştır. YBSK’de 100 µl enjeksiyon ile miktar tayinine gidildiğinde %75 geri kazanım elde edilmiş ve denenen yöntemler arasında en doğru sonuç veren yöntem olarak kefir analizlerinde bu yöntemin uygulanmasına karar verilmiştir. Çizelge 4.1’de görüldüğü gibi kefir tanesinde yapılan geri kazanım denemelerinde ekstraksiyon aşamasında I. Yöntem kullanılarak miktar belirleme aşamasında İTK’den yararlanıldığında plakada floresans gözlenememiştir. I. Yöntem YBSK analizi kullanılarak gerçekleştirildiğinde ise girişim yapan maddeler nedeniyle miktar tayini yapılamamıştır. II. Yöntem ile ekstraksiyon ve İTK ile miktar tayini yapıldığında, İTK plakası üzerinde yine floresans gözlenememiştir. II. yöntemde YBSK analizi kullanıldığında ise %65 geri kazanım elde edilmiştir. Kefir ve kefir tanesinde uygun yöntemin belirlenebilmesi için yapılan geri kazanma denemelerinde İTK yöntemi iyi sonuç vermediği ve 43 düşük floresans şiddeti nedeni ile kefirde konsantrasyon farklılıklarının saptanamadığı kefir tanesinde ise konsantrasyonun çok düşük olması nedeniyle floresans gözlenemediği anlaşılmaktadır. Nitekim aflatoksin analizlerinde İTK tekniği ile doğru sonuç elde edilmesi miktar tayininin görsel olarak yapıldığı durumlarda analizcinin deneyimine bağlı olmaktadır. Analizcinin konsantrasyon farklılıklarından kaynaklanan floresans şiddetini görsel olarak tahmin edebilecek kadar iyi yetişmiş ve deneyimli olması gerekmektedir. İTK analizinde floresans şiddetinin tayininde YPİTK (Yüksek Performans İnce Tabaka Kromatografisi) tekniği kullanıldığında ise kullanılan yoğunluk ölçer aygıtlarla analizler daha doğru olarak gerçekleştirilebilmektedir. YBSK ile miktar tayininde, YBSK, İTK’ne göre çok daha duyarlı olduğundan, düşük konsantrasyonlarda bile iyi sonuçlar alınmıştır (YBSK kromatogramları EK-1’de gösterilmektedir). Söz konusu bulgu literatür verileri ile de uyum sağlamaktadır. Toyoda ve arkadaşları (1994) çalışmalarında YBSK’nin duyarlılığının İTK’ne göre %65 daha fazla olduğunu bildirmektedirler. Ayrıca Tuinstra ve ark (1993), Kaksuri ve arkadaşları (1995), Dragacci ve arkadaşları (1995) da yaptıkları çalışmalarda Aflatoksin M1 analizi için en uygun yöntemin imünoafiniti kolon kullanımı ile saflaştırma aşamasının ardından YBSK ile miktar tayini olduğunu belirtmektedirler. Literatürün ışığı altında ve elde edilen bulgular sonucunda analizin miktar belirleme aşamasında YBSK kullanımının uygun olacağı anlaşılmaktadır. YBSK ile analiz aşamasında 100 µl’lik enjeksiyon bloğu elimizde olmadığından 10-20 µl enjeksiyon yapma zorunluluğu doğmuştur. Ancak ekstraktlardaki Aflatoksin M1 miktarı çok düşük oluğundan kolondan elde edilen ekstrakt önce azot altında kurutulmuş daha sonra 100 µl mobil fazda (su-asetonitril-metanol) çözülerek YBSK’ne 15 µl enjeksiyon yapılmıştır. Bu durumda azot altında kurutma aşamasında tahminen vial çeperlerine yapışma olduğundan ya da toksin azottan etkilendiğinden kayda değer geri kazanımlar elde edilememiştir. Tez çalışması devam ederken YBSK için 100 µl’lik enjeksiyon bloğunun sağlanması nedeni ile azot altında kurutma işlemi iptal edilmiş ve orijinal yöntemde önerildiği şekilde 1.25 ml asetonitril-metanol ile kolondan geçirilen Aflatoksin M1 ekstraktının üzerine 1.25 ml saf su eklenerek karıştırılmış ve bu karışımdan YBSK’ne 100 µl’lik enjeksiyon yapılmıştır. Çizelge 4.1’den görüldüğü gibi 100 µl enjeksiyon gerçekleştirilmesi ile süt, kefir ve kefir tanesi denemelerinde Aflatoksin M1 geri kazanım değerleri yükselmiştir. 44 4.2 Sütten Kefire ve Kefir Tanesine Aflatoksin M1 Geçişi Kontamine sütten kefire ve kefir tanesine aflatoksin M1 geçişinin belirlenmesi amacıyla 0.1, 0.2 ve 0.5 µg/l düzeyinde kontamine edilen sütten kefir elde edilmiş ve kefir ve kefir tanesinde Aflatoksin M1 analizi yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar çizelge 4.2’de verilmektedir. Çizelge 4.2: 0.1, 0.2 ve 0.5 ppb düzeyinde kontamine edilen sütten kefir üretiminde kefire ve kefir tanesine Aflatoksin M1 geçiş düzeyleri Aflatoksin 250ml Kefir eldesi Kefir 250 ml Taneye Kefire Kefir ve M1 süte sonrası tanesindeki kefirdeki Aflatok Aflatoksin taneye kontami- eklenen süzme ile Aflatoksin Aflatoksi sin M1 M1 geçiş geçen nasyon Aflatoksin geri alınan M1 miktarı n M1 geçiş yüzdesi (%) toplam düzeyi M1 miktarı kefir tanesi (µg) miktarı yüzdesi Aflatoksin (ppb) (µg) miktarı (g) (µg) (%) M1 yüzdesi (%) 0.1 0.025 8.1 0.0004 0.015 1.6 60 61.6 0.2 0.050 8.6 0.0013 0.03 2.6 60 62.6 0.5 0.125 7.0 0.0033 0.1 2.6 80 82.6 Çizelge 4.1’de görüldüğü gibi 0.1 µg/l düzeyinde kontamine edilen süt kullanılarak elde edilen kefir sonrası süzme ile geri alınan kefir tanesi 8.1 g’dır, ve söz konusu tanede yapılan analiz sonucunda tanede 0.0004 µg Aflatoksin M1 tespit edilmiştir, dolayısıyla sütten taneye Aflatoksin M1 geçişinin %1.6 olduğu belirlenmiştir. Elde edilen 250 ml kefirde yapılan analiz sonucunda ise 0.015 µg Aflatoksin M1 tespit edilmiştir, dolayısıyla sütteki Aflatoksin M1’in kefire geçiş oranı %60 olarak belirlenmiştir. 0.1 µg/l kontaminasyondaki sütten kefir ve kefir tanesine toplam Aflatoksin M1 geçişi %61.6 olarak ifade edilebilir. 0.2 µg/l kontaminasyon düzeyinde tanede (8.6g) tespit edilen Aflatoksin M1 miktarı 0.0013, kefirde (250 ml) tespit edilen Aflatoksin M1 miktarı ise 0.03 µg olarak tespit edilmiştir. Söz konusu sonuçlar doğrultusunda sütten kefir tanesine ve kefire Aflatoksin M1 geçiş oranı sırasıyla %2.6 ve %60 olarak belirlenmiştir. 0.2 µg/l kontaminasyondaki 45 sütten kefir ve kefir tanesine toplam Aflatoksin M1 geçişi %62.6 olarak ifade edilebilir. 0.5 µg/l kontaminasyon düzeyinde ise tanede (7.0) ve kefirde (250 ml) tespit edilen Aflatoksin M1 miktarı sırasıyla 0.0033 ve 0.1 µg’dır. Sütten taneye Aflatoksin M1 geçiş düzeyleri ise sırasıyla %2.6 ve 80 olarak hesaplanmıştır. Söz konusu bulgular doğrultusunda 0.5 µg/l düzeyine kontamine sütte bulunan Aflatoksin M1’in %82.6’sının kefir ve kefir tanesine geçtiği gözlenmiştir. Elde edilen sonuçlardan kontamine sütten kefir eldesinde, kefirdeki Aflatoksin M1 miktarının süte kıyasla yaklaşık olarak %40 (0.1 ve 0.2 µg/l kontaminasyon düzeyinde) ve %20 (0.5 µg/l kontaminasyon düzeyinde) oranlarında azaldığı belirlenmiştir. Tespit edilen söz konusu azalmaların kefir ve kefir tanesinde bulunan mikroorganizmaların faaliyeti sonucunda oluştuğu düşünülmektedir. 0.1 ve 0.2 µg/l kontaminasyondaki sütlerden kefire geçiş oranın 0.5 µg/l kontaminasyona göre düşük olmasının nedeninin süt içinde bulunan Aflatoksin M1 konsantrasyonunun daha düşük olması nedeni ile kefir içindeki organizmaların degradasyonda daha etkili olabilmeleri olduğu düşünülmektedir. Kefir tanesinde yapılan analiz sonuçlarına bakıldığında yukarıda açıklanan neden dolayısıyla taneye Aflatoksin M1 geçiş yüzdesinin konsantrasyon arttıkça artması beklenmektedir. 0.1 ve 0.2 µg/l kontaminasyondaki sütlerden alınan tanelerde bu durum gözlenirken 0.5 µg/l kontaminasyonda 0.2 µg/l ile taneye Aflatoksin M1 geçiş yüzdesinin aynı olduğu saptanmıştır. Söz konusu bulgunun kaynağınınsa kefir üretimi sonrasında kefirden geriye süzülen tane miktarının ilk iki konsantrasyona göre düşük olmasından kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Literatürde yoğurt, peynir gibi diğer fermente süt ürünleri ile ilgili birçok araştırma bulunmaktadır. Söz konusu araştırmaların bazılarında (örneğin Magella ve Hafez. 1982; Lopez vd., 2001; Hassanin, 1994) fermantasyon sonrasında ve depolama boyunca Aflatoksin M1 de azalmalar saptandığı, diğer bazı çalışmalarda fermantasyon işleminin Aflatoksin M1 miktarına etkisinin olmadığı (örneğin Blanco vd., 1993) hatta artış gözlendiği (Van Egmond, 1987; Soylu ve Yaldız’dan 1998) belirtilmektedir. Kefirde Aflatoksin M1 analizi ile ilgili olarak ise literatürde ulaşılabilen tek çalışma Wiseman ve Marth (1983) tarafından yapılan çalışmadır. Söz konusu çalışmada araştırıcılar doğal olarak Aflatoksin M1 ile kontamine olmuş sütü hammadde olarak kullanıp kefir üretmiş ve 46 kefirde Aflatoksin M1 varlığı üzerine çalışmışlardır. Elde ettikleri sonuçları rakamsal olarak ifade etmemişler ancak vermiş oldukları grafiklerden ve açıklamalardan kefirde aflatoksin M1 düzeyinde düşme olduğu ve depolama boyunca yapılan analizlerin sonuçlarının kesin olmadığı gözlenmektedir. Her ne kadar sütteki kontaminasyon düzeyine geri dönülmemişse de depolama boyunca aflatoksin M1 içeriklerinde belirgin dalgalanmalar olmuştur. Elde edilen bulgular ışığında, Wiseman ve arkadaşları (1983) elde ettiği sonuçlara benzer şekilde, kefirin Aflatoksin M1 miktarında azalmalara neden olduğu gözlenmektedir. Çalışmanın çeşitli üretim merkezlerinden sağlanacak kefir taneleri ve kefir kullanımı ile tekrarlanmasının sonuçların güvenilirliğini arttıracağı düşünülmektedir. 4.3 Depolama Denemeleri İle İlgili Bulgular 0.1, 0.2 ve 0.5 µg/l düzeylerinde kontamine edilen sütlerin hammadde olarak kullanılması sonucunda elde edilen kefirler 10 gün boyunca +4 ˚C’de depolanmış ve depolanın 0.,5. ve 10. günlerinde Aflatoksin M1 analizleri gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlar çizelge 4.3’de verilmektedir. Çizelge 4.3: Kontamine süt kullanılarak elde edilen kefirlerin buzdolabı koşullarında (+4 ˚C) 10 günlük depolanması süresince Aflatoksin M1 içeriklerinde gözlenen değişimler Süt için kontaminasyon düzeyi (µg/l) 0.1 0.2 0.5 250 ml sütte bulunan Aflatoksin M1 miktarı (µg) Depolama boyunca 250 ml kefirde gözlenen Aflatoksin M1 miktarı (µg) 0.0025 0.050 0.125 0. gün 0.015 0.03 0.1 5. gün 0.015 0.03 0.1 10. gün 0.015 0.03 0.1 Çizelge 4.3’de görüldüğü gibi 0.1 ve 0.2 µg/l kontaminasyon düzeylerinde 0. Günde sütte bulunan Aflatoksin M1 %60’ı kefire geçmiştir ve bu düzeyler 10 günlük depolama boyunca sabit kalmış, 47 Aflatoksin M1 düzeyinde herhangi bir değişim olmamıştır. 0.5 µg/l kontaminasyon düzeyinde ise 0. günde tayin edilen Aflatoksin M1 içeriği sütteki miktarın %80’ı kadardır ve diğer iki kontaminasyon düzeyinde olduğu gibi depolanmadan etkilenmemiş ve bu düzey depolama süresince sabit kalmıştır. Söz konusu verilerin ışığı altında kefir eldesi sonrasında tayin edilen Aflatoksin M1 miktarının depolama boyunca değişmediği görülmektedir. Kefir eldesi sonrasında tanenin süzülerek ayrılması sonucunda mikroflora konsantrasyonunun düşmesi ve bu düşük konsantrasyonun Aflatoksin M1 degradasyonunda etkisiz kaldığı düşünülmektedir. 4.4 Bakteri İzolatları İle Besiyerinde Analizler İle İlgili Bulgular Gerçekleştirilen Bakteri izolatları ile besiyerinde gerçekleştirilen analizlerde steril besiyeri doğrudan, 0.5 µg/l Aflatoksin M1 içerecek şekilde kontamine edildikten sonra bakteri geliştirilmeden ve izole edilen iki laktik asit bakterisi kontamine besiyerinde ayrı ayrı geliştirildikten sonra analizlenmiştir. Steril besiyerine uygulanan kör deneme sonucunda Aflatoksin M1 ile kontamine edilmeyen besiyerinde bulunan bir maddenin YBSK analizinde Aflatoksin M1’in alıkonma zamanında düşük de olsa bir pik verdiği ve söz konusu pikin 0.0027 µg Aflatoksin M1 miktarı büyüklüğünde olduğu gözlenmektedir. Kontamine edilen besiyeri analizlendiğinde 50 ml besiyerinde 0.0133 µg Aflatoksin M1 gözlenmiştir. Girişime neden olan madde miktarı bu değerden çıkarıldığında 0.0106 µg aflatoksin M1 hesaplanmıştır ve bu değere göre geri kazanım %42.4 olarak hesaplanmıştır. Aflatoksin M1 ile kontamine edilen ancak bakteri katılmayan besiyeri ve iki farklı bakteri izolatının katıldığı kontamine besiyerlerinde gerçekleştirilen Aflatoksin M1 analizlerine ait bulgular çizelge 4.4’de verilmektedir. İzole edilen iki laktik asit bakterisi ile yapılan yapılan çalışmalar sonucunda elde edilen Aflatoksin M1 miktarları Çizelge 4.4’de görüldüğü gibi 0.016 ve 0.0142 µg olarak hesaplanmıştır. Söz konusu değerler izolat 48 geliştirilmeyen kontamine besiyerinde analizlenen Aflatoksin M1 miktarından (0.0106 µg) yüksek çıkmıştır. Laktik asit bakterilerinin, gelişmeleri sırasında toksin gibi davranan bir madde ürettikleri düşünülebilir ancak literatürlerde Lactobacillus cinsi mikroorganizmaların bu tür etkilerinden hiç söz edilmemiş olup, yapılan hemen tüm çalışmalarda söz konusu bakterilerin küfleri ve ürettikleri aflatoksinleri degrade edici etkileri belirlenmiştir (Karunatre vd., 1990; Gourama ve Bullerman, 1995; Pierides vd. 2000). Çizelge 4.4: Besiyerinde gerçekleştirilen analizler ile ilgili bulgular Kontamine besiyeri I. Lactobacillus II. Lactobacillu Besiyerinin başlangıçta Aflatoksin M1 ile kontaminasyon düzeyi (µg/l) 50 ml besiyerine eklenen Aflatoksin M1 miktarı (µg) 50 ml besiyerinde gözlenen Aflatoksin M1 miktarı (µg) % Geri kazanım 0.5 0.025 0.0106 %42.4 0.5 0.5 0.025 0.025 0.016 0.0142 İzolatların analizi sonucunda daha yüksek Aflatoksin M1 miktarı gözlenmesinin nedeni olarak geri kazanımlarda artış olma olasılığı düşünülmektedir. Bakteri gelişimi sırasında besiyerinde olan bazı değişiklikler toksinin daha kolay ekstrakte edilebilmesine neden olmuş olabileceği gibi, bir başka olasılığın da Aflatoksin M1 gibi pik veren besiyeri bileşeninin bu bakteri gelişimi sonucunda artması veya serbest hale geçmesi olduğu düşünülmektedir. Söz konusu iki izolatın yapılan tanımlamalar sonucunda Lactobacillus cinsi olduğu belirlenmiştir. Aynı cins bakterilerin genel olarak aynı özelliklere sahip olduğu düşünülecek olursa söz konusu iki bakterinin besiyerini benzer şekilde kullandıkları öngörülebilir. 49 5 SONUÇ Bu araştırmada kefir ve kefir tanesinde en uygun Aflatoksin M1 tayini yöntemi geliştirilmeye çalışılmış ve kontamine sütlerden kefire ve kefir tanelerine Aflatoksin M1 geçiş durumu araştırılmıştır. Bu amaçla Aflatoksin M1 ile kontamine edilmiş kefirde bu toksinin analizi için dört, kefir tanesinde ise iki farklı analiz yöntemi denenmiş ve geri kazanımlarına bakılarak en uygun yöntem belirlenmeye çalışılmıştır. Aflatoksin M1 tayini için uygun yöntemin belirlenmesinden sonra, laboratuvar koşullarında Aflatoksin M1 ile kontamine edilen sütten kefir eldesinde bu toksinin kefire ve kefir tanesine geçişi incelenmiştir. Çalışmada ayrıca kefirden izole edilen iki bakterinin kültür ortamında Aflatoksin M1 üzerine etkisi de araştırılmıştır. Sütte yapılan geri kazanma denemelerinde ekstraksiyon sonrasında azot gazı altında kuruluğu buharlaştırıldıktan sonra 100 µl çözgen ile çözülerek YBSK ile miktar tayini yapıldığında %30 geri kazanım elde edilirken, kurutma işlemi uygulanmadan doğrudan YBSK’de analizlendiğinde %100 geri kazanıma ulaşılmıştır. Bu nedenle imünoafiniti kolon kullanımı ve 100 µl enjeksiyon hacmi ile YBSK analizinin sütte Aflatoksin M1 tayini için doğru yöntem olduğu anlaşılmıştır. Kefir ve kefir tanesinde yapılan geri kazanma denemelerinde genel olarak İTK yönteminin yetersiz kaldığı, analizlenen örnek içerisindeki Aflatoksin M1 miktarı çok düşük olduğu için verdiği floresansın rahat gözlenemediği ve sonuç alınamadığı belirlenmiştir. Miktar belirleme aşamasında YBSK’den yararlanılmasına karar verilmiştir. Örneklerden Aflatoksin M1’in ekstraksiyonu sonrasında YBSK ile miktar belirleme çalışmalarında YBSK’ne enjeksiyon öncesinde ekstraktın azot gazı altında kuruluğa buharlaştırıldıktan sonra 100 µl çözgen ile çözülmesi işlemi uygulandığında geri kazanımların çok düşük olduğu gözlenmiş, bu nedenle kurutma işlemi uygulanmadan YBSK’ne doğrudan enjeksiyon yapılmıştır. Kefirde dört farklı analiz yöntemi ile ekstraksiyon ve YBSK ile miktar belirleme denemelerinde elde edilen geri kazanma değerleri, II. Yöntem (Rhone-Diagnostics Technologies Ltd. tarafından süt için önerilen imünoafiniti kolon kullanımı ile ekstraksiyon ve YBSK ile miktar belirlenmesi) için %58, III. Yöntem (Dragacci vd., 1995) için %51, IV. Yöntem (I ve II. yöntemlerin bir arada kullanılması ile 50 geliştirilen yöntem) için ise %75 olarak belirlenerek söz konusu yöntemin en uygun yöntem olduğu saptanmıştır. I. Yöntemin (AOAC, 1995) ekstraksiyon aşamasının çok uzun ve verimsiz olması nedeni ile (azot gazı altında buharlaştırma sonrasında YBKS analizinde girişim yapan maddeler nedeniyle sonuç alınamamıştır) bu yöntemde tekrar denemeler yapılmamıştır. Kefir tanesinde iki analiz yöntemi uygulanarak geri kazanma denemeleri gerçekleştirilmiştir. Söz konusu denemelerin birinde AOAC (1995) yöntemi (I. Yöntem), diğerinde ise Dragacci ve arkadaşları’ın (1995) önerdiği yöntem kullanılmıştır. I. Yöntemde YBSK ile analiz aşamasında girişim yapan maddeler nedeni ile sonuç alınamamış, II. yöntemde ise %65 geri kazanım elde edilmiştir. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda kefir tanesinde Aflatoksin M1 analizi için II. yöntemin kullanılmasının uygun olduğu belirlenmiştir. Uygun analiz yönteminin belirlenmesinin ardından 0.1, 0.2 ve 0.5 µg/l düzeyinde Aflatoksin M1 ile kontamine edilen UHT sütler kefir üretiminde hammadde olarak kullanılmış, kefir eldesi sonunda kefire ve kefir tanesine Aflatoksin M1 geçiş düzeyi belirlenmeye çalışılmıştır. Elde edilen bulgulardan 0.1 µg/l düzeyinde kontamine sütte bulunan Aflatoksin M1’in % 1.6’sının kefir tanesine, %60’ının kefire geçtiği belirlenmiştir. Söz konusu değerler 0.2 ve 0.5 µg/l kontaminasyon düzeylerinde sırasıyla %2.6, %2.6 (taneye geçiş oranı) ve %60, %80 (kefire geçiş oranı) olarak belirlenmiştir. Kefirlerin 10 gün boyunca +4 ˚C’de depolanmasının Aflatoksin M1 miktarında azalmaya neden olmadığı, depolama boyunca kefirde bulunan Aflatoksin M1 düzeyinin sabit kaldığı belirlenmiştir. Araştırmada son olarak kefirden izole edilen iki laktik asit bakterisinin kültür ortamında Aflatoksin M1’e etkisi incelenmiştir. Aflatoksin M1 ile kontamine edilmeyen ve bakteri aşılanmayan besiyerinde yapılan Aflatoksin M1 analizi sonucunda besiyerinde bulunan bir maddenin YBSK ile miktar belirlenmesi aşamasında Aflatoksin M1 ile aynı alıkonma süresinde bir pik verdiği belirlenmiştir. Besiyerinin kontamine edildikten sonra analizlenmesi sonucunda elde edilen geri kazanma değeri %42.4 olarak hesaplanmıştır. Besiyerlerine bakteri izolatlarının eklenmesi ve 30˚C / 6 gün inkübasyonunun ardından yapılan analizlerde bulunan Aflatoksin M1 miktarının, bakteri aşılanmamış kontamine besiyerinde belirlenen düzeyin üzerinde bulunmuştur. 51 Sonuç olarak; - Kefir ve kefir tanesinde uygulanan Aflatoksin M1 tayin yöntemi üzerinde daha fazla çalışma yapılarak % geri kazanma değerlerinin arttırılması ve tekrarlanabilirliğin araştırılması gerekmektedir. - Kontamine sütlerden kefir eldesinde kefirde bulunan Aflatoksin M1 miktarında sütte başlangıçtaki kontaminasyon miktarına kıyasla %40 (0.1 ve 0.2 µg/l kontaminasyon düzeyinde) ve %20 (0.5 µg/l kontaminasyon düzeyinde) oranında düşük düzeyde Aflatoksin M1 belirlenmiştir. Düşük kontaminasyon düzeylerinde daha fazla azalmanın gözlenmesi Aflatoksin M1 kontaminasyonu açısında sınırda veya sınırın biraz üzerindeki sütlerin kefir üretiminde değerlendirilebilecekleri düşünülmektedir. Ancak bu konu üzerinde tekrar denemeler yapılarak sonuçların kesinliğinin belirlenmesi gerekmektedir. - Kültür ortamında gerçekleştirilen analizler sonucunda besiyeri için uygun analiz yönteminin belirlenebilmesi açısından daha fazla çalışma yapılması gerektiği düşünülmektedir. Besiyerinde bulunan ve Aflatoksin M1 gibi davranan maddenin belirlenmesi, deneme sayısının arttırılarak ve gerektiğinde modifikasyon yapılarak analiz yönteminin doğruluk ve tekrarlanabilirliğinin arttırılması ayrıca elde edilen izolatların miktarlarının arttırılması ve tür bazında tanımlanmalarının ardından besiyeri çalışmalarında tüm izolatların tek tek ve bir arada Aflatoksin M1 üzerine etkilerinin araştırılması gerekmektedir. 52 KAYNAKLAR DİZİNİ Altuğ, T., Yousef, A.E., Marth, E.H., 1990, Degradation of Aflatoxin B1 in Dried Figs by Sodium Bisulfite with or without Heat, Ultraviolet Energy or Hydrogen Peroxide, Journal of Food Protection, 53(7), 581-582. Altuğ, T., Elmacı,Y., 1995, Aflatoksinler ve Gıdalarda Bulunan Diğer Mikotoksinler, Kimya Mühendisleri Odası, Ege Bölgesi Bülteni, yıl.2, sayı.9, İzmir, 12-14. AOAC, 1995, Aflatoxins in Food and Feeds-Romer Minicolumn Method, Sec.975.36, Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, Cunniff, P. (Ed.), 16th Ed., Vol.2, Ch.49, Washington D.C. USA, 5-6. Bahar, M.B., 1996, Kontamine Kuru İncirlerden İki Farklı Teknikle Elde Edilen İncir Pekmezlerine Aflatoksin Geçiş Düzeylerinin İncelenmesi,Yüksek Lisans Tezi, E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı, 77s. Bakırcı, I., 2001, A study on the Occurrence of Aflatoxin M1 in Milk and Milk Products Produced in Van Province of Turkey, Food Control, Vol.12, Issue.1, 47-51. Barrıos, M.,J., Gualda, M.,J., Cabanas, J.,M., Medina, L.,M., Jordano, R., 1996, Occurrence of Aflatoksin M1 in Cheeses from the South of Spain, Journal of Food Protection, Vol.59, No.8, 898900. Blanco, J.L., Carrian, B.A., Liria, N., Diaz, S., Garcia, M.E., Dominguez, L., Suarez, G., 1983, Behavior of Aflatoxins During Manufacture and Storage of Yoghurt, Milchwissenschaft, 40 (7) 1000. Boyacıoğlu, D., Gönül, M., 1986, Mikotoksin Tayin Metodolojisi, E.Ü. Mühendislik Fakültesi Dergisi, Seri: B Gıda Mühendisliği, Cilt.4, Sayı.2, 87-95. Bullerman, L.B., Schroeder, L.L., Park, K.Y., 1984, Formation and Control of Mycotoxins in Food, Journal of Food Protection, vol.47, no.8, 637-646 53 Dragacci, S., Gleizes, E., Fremy, J.M., Candlish, A.A.G., 1995, Use of Immunoaffinity Chromatography as a Purification Step for the Determination of Aflatoxin M1 in Cheeses, Food Additives and Contaminants, Vol.12, No.1, 59-65. Dragacci, S., Fremy, J.M., 1996, Application of Immunoaffinity Column Cleanup to Aflatoxin M1 Determination and Survey in Cheese, Journal of Food Protection, Vol.59, No. 9, 1011-1013. Dragacci, S., Grosso, F., Gilbert, J., 2001, Immunoaffinity Column Cleanup With Liquid Choromatography for Determination of Aflatoxin M1 in Liquid Milk: Collaborative Study, Journal of AOAC International, Vol. 84, Issue 2, 437-443. Elmacı, Y., Altuğ, T., 1994, Aflatoxin Degradation in Dried Figs on Industrial Scale by Using Sulphur Dioxide Gas Alone and Together with Heat, Hydrogen Peroxide or Washing Treatments, Bioactive Substances in Food of Plant Origin, Vol.2, Kozlowska, H., Fornal, J. (Eds.), Centrum Agrotechnologii Weterynarii Polska Akademia Nouk, 290-296. Ergüllü, E., Üçüncü, M., 1983, Kefir Mikroflorası Üzerinde Araştırma, E.Ü. Ziraat Fakültesi Dergisi, yıl.8, sayı.1 , 3-11. Galvano, F., Galofaro, V.,Galvano, G., 1996, Occurrence and Stability of Aflatoksin M1 in Milk and Milk Products: A Worldwide Review, Journal of Food Protection, Vol. 59, No.10, 1079-1090. Galvano, F., Vittorio, G., De Angelis, A., Galvano, M., Bognanno, M., Galvano, G., 1998, Survey of Occurrence of Aflatoxin M1 in Dairy Products Marketed in Italy, Journal of Food Protection, Vol.61, No.6, 738-741. Goldblatt, L.A., 1969, Introduction, 1-10, Aflatoxin, Goldblatt, L.A. (Ed.), Academic Press, Newyork and London, 472p Gourama, H., Bullerman, L.B., 1995. Inhibition of Growth and Aflatoxin Production of Aspergillus flavus by Lactobacillus species, Journal of Food Protection, vol.58, no.11, 1249-1256. Hammes, W.P. and Vogel, R.F., 1995, The Genus Lactobacillus, the Genera of Lactic Acid Bacteria, Vol. 2, Wood, B.J.B. and Holzapfel, W.H. (Eds.), Blackie Academic & Professional, London, 19-49p. 54 Hansen, T.J., 1990, Affinity Column Cleanup and Direct Fluorescence Measurement of Aflatoxin M1 in Raw Milk, Journal of Food Protection, Vol.53, No.1, 75-77 Hardie, J.M., 1986, Genus Streptococcus, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2, Sneath, P.H.A., Mair, N.S., Sharpe, M.E. and Holt, (Eds.), Williams and Wilkins, USA, 10431071p. Hassanin, N.I., 1994, Stability of Aflatoxin M1 During Manufacture and Storage of Yoghurt, Yoghurt-Cheese and Acidified Milk, J Sci Food Agric, 65, 31-34. Hussein, H.S., Brasel, J.M., 2001, Toxicity, Metabolism and Impact of Mycotoxins on Humans and Animals, Toxicology, Vol.167, Issue2, 101-134. ISO, 1998, Milk and Milk Powder-Determination of Aflatoxin M1 Content-Cleanup by Immunoaffinity Chromatography and Determination by High Performance Liquid Chromatography, International Organization for Standardization, Ref.No. ISO 14501, Switzerland. İçibal, N., Altuğ, T., 1992, Degradation of Aflatoxins in Dried Figs by Sulphur Dioxide Alone and in Combination with Heat, Ultraviolet Energy and Hydrogen Peroxide, Lebensm. Wiss. Technol., 25, 294296. Jones, J.M., 1992, Food Safety, Aegean Press, Minnesota, 147. Kaksuri, I.E., Christodouliadow, M., Christou, E., Constantinidov, E., 1995, Immunoaffinity column/HPLC Determination of Aflatoxin M1 in Milk, Food and Agricultural Immunology, 7 (2), 131-137 Kandler, O. and Weiss, N., 1984, Regular Non-Sporing Gram-Positive Rods, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2, Sneath, P.H.A., Mair, N.S., Sharpe, M.E. and Holt, J.G. (Eds.), Williams and Wilkins, USA, 1208-1219p. Kaptan, N., 1982, Toplum Sağlığında Kefirin Önemi, Bilim ve Teknik Dergisi, 176 (33), 33-35. 55 Karagözlü, C., 1990, Farklı Isıl İşlem Uygulanmış İnek Sütlerinden Kefir Kültürü ve Kefir Tanesi ile Üretilen Kefirlerin Dayanıklılığı ve Nitelikleri Üzerine Araştırmalar, Yüksek Lisans Tezi, E.Ü., Fen Bilimleri Enstitüsü, Tarım Ürünleri Teknolojisi Anabilim Dalı, Bornova. Karagözlü, C., Kavas G., 2000, Alkollü Fermente Süt İçecekleri: Kefir ve Kımızın Özellikleri İle İnsan Beslenmesindeki Önemi, Dünya Yayınları Gıda Dergisi, Yıl.6, Sayı.2000-07, 86-93. Karunatre, A., Wezenberg, E., Bullerman, L.B., 1990, Inhibition of Mold Growth and Aflatoxin Production by Lactobacillus spp, Journal of Food Protection, Vol.53, No.3, 230-236. Kılıç, S., Uysal, H., Akbulut, N., Kavas, G., Kesenkaş, H., 1999, Kefir Danesi ve Starter Kültürle Yapılan Kefirlerin Olgunlaşması Sırasında Kimyasal, Mikrobiyolojik ve Duyusal Özelliklerindeki Değişimlerin İncelenmesi, E.Ü. Ziraat Fakültesi Dergisi, Cilt.36, Sayı.1-2-3, 111-118. Koçak, C., Gürsel, A., 1981. Kefir, A.Ü. Ziraat Fakültesi, Süt Teknolojisi Bölümü, Ankara, sayı.4, 11-14. Kroger, M., 1993, Kefir, Cultured Dairy Products Journal, Vol. 28, No.2, 26-29. Lang, F., Lang, A., 1973, Symposium on New Technology of Fermented Milk Products and Milk Specialisties, The Milk Industry, 17-18. Liu, J.,A.,P., Moon, N.,J., 1983, Kefir- A ‘New’ Fermented Milk Product, Cultured Dairy Products Journal, 11-12 Lopez, C., Ramos, L., Ramadan, S., Bulacio, L., Perez, J., 2001, Distribution of Aflatoxin M1 in Cheese Obtained from Milk Artificially Contaminated, International Journal of Food Microbiology 64, 211-215. Luchese, R.H., Harrigan, W.F., 1990, Growth of, and Aflatoxin production by Aspergillus parasiticus when in the Presence of Either Lactococcus lactis or Lactic Acid at Different Initial pH Values, Journal of Applied Bacteriology, 69, 512-519. Megalla, E.S., Hafez, A.H., 1982, Detoxification of Aflatoxin B1 by Acidogenous Yoghurt, Mycopathologia 77, 89-91. 56 Özer, Ç., Altuğ, T., 1995. Aflatoksinlerin Detoksifikasyonu Amacıyla Geliştirilen Teknikler. E.Ü. Mühendislik Fakültesi Dergisi, cilt.13, sayı.1, 119-139. Pierides, M., El-Nezami, H., Peltonen, K., Salminen, S., Ahduos, J., 2000. Ability of Dairy Strains of Lactic Acid Bacteria to Bind Aflatoxin M1 in a Food Model, Journal of Food Protection, Vol.63, No.5, 645-650. Rustom, I.,Y.,S., 1997, Aflatoxin in Food and Feed: Occurrence, Legislation and Inactivation by Physical Methods, Food Chemistry, Vol.59, 57-67. Saitanu, K., 1997, Incidence of Aflatoxin M1 in Thai Milk Products, Journal of Food Protection, Vol.60, No.8, 1010-1012. Schillinger, U. ve Lücke, F.K., 1987, Identification of Lactobacilli from Meat and Meat Products, Food Microbiology, 4: 199-208. Sharpe, M.E., Fryer, E. and Smith, D.G., 1966, Identification of Lactic Acid Bacteria, Identification Method for Microbiologist - Part A, Gibbs, B.M. and Skinner, F.A. (Eds.), London Academic Press, 6579p. Soylu, Ö., Yaldız, S., 1998, Kontamine Edilmiş Sütlerden Yoğurda Aflatoksin Geçiş Düzeylerinin İncelenmesi, İzmir Fen Lisesi Projesi (Yöneten, Altuğ,T., Elmacı, Y.,). Tamime, A.Y., 1990, Microbiology of ‘Starter Cultures’, 131-175 Dairy Microbiology Vol.2, The Microbiology of Milk Products, 2ed, Robinson R.K. (Ed.), Department of Food Science and Technology, University of Reading, UK, Tavlaş, B., 1986, Kefir ve Yararları, Sütçülük, Yıl.1, Sayı.2, 12 Teuber,M., 1995, The genus Lactococcus, The Genera of Lactic Acid Bacteria, Vol. 2, Wood, B.J.B. and Holzapfel, W.H. (Eds.), Blackie Academic & Professional, London, 173-230p. TGKY, 1997, Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği, T.C. Resmi gazete No.23172, Ankara, 198. Toklu, G.Ş., 1999, Süt Şampanyası; Kefir, Tübitak MAM Gıda Bilimi ve Teknolojisi Araştırma Enstitüsü, Gebze,Dünya Gıda Dergisi, 5153. 57 Toyoda, M., Saisha, K., Aoki, G., Koboyashi, A., Baito, Y., Martines, M.U., 1994, Repeated Use of A Single Immunoaffinity Column for Sample Cleanup in the HPLC Determination of Aflatoxin M1 in Powdered Milk, International Dairy Journal 4(4), 369-375. TSE, 2002, Süt ve Süt Tozu-Aflatoksin M1 Muhtevası Tayiniİmunoafiniti Kromatografi ile Temizleme ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi ile Tayin, Türk Standardları Enstitüsü, Ankara Tuinstra, L.G.M., Roos, A.H., Van Trijp, J.M.P., 1993, Liquid Chromatographic Determination of Aflatoxin M1 in Milk Powder Using Immunoaffinity Columns for Cleanup: Interlaboratory Study, Journal of AOAC İnternational, Vol.76, No.6, 1248-1254. Ueno, Y., 1987, Mycotoxins, 163-185, Toxicological Aspects of Food, Miller, K. (Ed.), Elsevier Applied Science Publishers Ltd., London. Üçüncü, M., 1980. Süt İçkilerin Toplum Sağlığı ve Türkiye Sütçülüğündeki Yeri ve Önemi. E.Ü. Gıda Fakültesi Dergisi, cilt.1, sayı. 1 (1980’den ayrı basım), 249-257. Veldman, A., Meijist, J.A.C., Borggreve, G.,J., Heeres-van der Tol, J.,J., 1992, Carry-Over of Aflatoxin from Cow’s Food to Milk, British Society of Animal Production, 55: 163-168. Wiseman, D.W., Marth, E.H., 1983, Behavior of Aflatoxin M1 in Yoghurt, Buttermilk and Kefir, Journal of Food Protection, Vol.46, No.2, 115-118. Yaygın, H., Demiryol, I., 1980, Süt ve Mamüllerinde Aflatoksin, E.Ü. Ziraat Fakültesi Dergisi, 17/3, 99-111. 58 59 EKLER Ek 1. Aflatoksin M1 standardının YBSK kromatogramı Ek 2. Immunoaffinity kolon ile ekstrakte edilen sütün YBSK kromatogramı Ek 3. I. Yöntem ile kromatogramı Ek 4. IV. Yöntem kromatogramı Ek 5. I. Yöntem ile ekstrakte edilen kefir tanesinin YBSK kromatogramı Ek 6. II. Yöntem ile ekstrakte edilen kefir tanesinin YBSK kromatogramı ile esktrakte ekstrakte edilen kefirin YBSK edilen kefirin YBSK 60 Ek 1. Aflatoksin M1 standardının YBSK kromatogramı * 0.25 µg/ml’lik çalışma çözeltisinden 100 µl enjeksiyon ile elde edilen YBSK kromatogramı 61 Ek 2. Immunoaffinity kolon ile ekstrakte edilen sütün YBSK kromatogramı * 0.1 µg/ml düzeyinde kontamine edilen sütün analizlenmesi ve YBSK’ya 100 µl enjeksiyonu sonucunda elde edilen kromatogram 62 Ek 3. I. Yöntem ile esktrakte edilen kefirin YBSK kromatogramı * 0.5 µg/ml düzeyinde kontamine edilen kefirin I. yöntem (AOAC yöntemi) ile analizlenmesi ve YBSK’ya 100 µl enjeksiyonu sonucunda elde edilen kromatogramdan da görüldüğü gibi söz konusu yöntemde düzgün girişim yapan madde varlığı nedeni ile kabul edilebilir bir kromatogram elde edilememektedir. 63 Ek 4. IV. yöntem ile estrakte edilen kefirin YBSK kromatogramı * 0.1 µg/ml düzeyinde kontamine edilen kefirin IV. yöntem ile analizlenmesi ve YBSK’ya 100 µl enjeksiyonu sonucunda elde edilen kromatogram 64 Ek 5. I. Yöntem ile ekstrakte edilen kefir tanesinin YBSK kromatogramı * 0.5 µg/ml düzeyinde kontamine edilen kefirin II. yöntem ile analizlenmesi ve YBSK’ya 100 µl enjeksiyonu sonucunda elde edilen kromatogram 65 Ek 6. II. Yöntem ile ekstrakte edilen kefir tanesinin YBSK kromatogramı * 0.5 µg/ml düzeyinde kontamine edilen kefirin II. yöntem ile analizlenmesi ve YBSK’ya 100 µl enjeksiyonu sonucunda elde edilen kromatogram ÖZGEÇMİŞ 1977 yılında Gaziantep’te doğdu. İzmir Eşrefpaşa Lisesi’nden 1994 yılında mezun oldu. Aynı yıl Ege Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümü’ne girdi. 1999 yılında mezun olduktan sonra aynı yıl E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı, Gıda Bilimleri Bilim Dalı’nda yüksek lisansa başladı. 28 Aralık 1999 tarihinde Gıda Mühendisliği Bölümüne “Tahsisli Araştırma Görevlisi” olarak girdi.
