agaroz jel elektroforezi - Erzurum Teknik Üniversitesi
advertisement
DNA İZOLASYONU VE ANALİZİ ELİF SANCAR 130154015 ERZURUM TEKNİK ÜNİVERSİTESİ DNA ÇALIŞIRKEN GÖZ ÖNÜNDE BULUNDURMANIZ GEREKEN TEMEL ÖZELLİKLER 1-DNA basit bir moleküldür. Gerçekten Sadece A,T,C ve G nükleotidlerini içerir. Bu araştırma yaparken önceden tahmin edebilmek demektir. 2-DNA negatif yüklüdür. Elektronların büyük bir çoğunluğu oksijen gruplarının etrafında dolanırlar. 3- DNA çok sayıda halka yapısına sahiptir. Halka yapıları oldukça hidrofobiktir. 4-DNA çok dayanıklı bir moleküldür. Örnek tüpünüzü düşürdünüz mü? Muhtemelen bir sorun yoktur. Hafta sonu boyunca oda ısısında mı bıraktınız? Sorun değil Genellikle çalışılması en kolay olan makromoleküldür. 5-DNA çalışmaları pek çok ihtiyaç gerektirir. Bu molekülle ne çalıştığınıza bağlı olarak birçok şeye sahip olmalısınız. Bu şey bir prosedür ya da spesifik bir enzim yada techizat olabilir UNUTMAYIN!!! Bazı genel kurallar bütün DNA deneylerinde geçerlidir!!! • • • • • Deneyi iyi bilmek Örneği olabildiğince saf elde etmek Mümkün olduğunca her zaman dikkatli ve nazik olmak. Molekülün özelliğini çok iyi bilmek İhtiyaç olan malzemelerin miktarını dikkatlice düşünmek CANLI HÜCRELERDEN DNA’ NIN SAFLAŞTIRILMASI • Genetik materyal hücre içerisinde bulunduğu bölgede yoğunlaşmış bir kitle oluşturur. • Her insanın hücresinde bulunan DNA çözüldüğünde yaklaşık 183 cm uzunluğunda olacaktır. Her bir hücrenin küçücük çekirdeğinde şaşırtıcı miktarda materyal paketlenmiştir. Hücredeki bu olay kromozom organizasyonu ile açıklanmaktadır. • Bölünmemiş bir hücrede kromozomal DNA kromatin olarak isimlendirilen çözülmüş bir görünümdedir. • Elektron mikroskobuyla gözlendiğinde, histon proteinlerinin bir ipteki tespih tanesi görünümünü verecek şekilde DNA’ nın sıkı bir şekilde sarıldığı parçacıklar olarak görev yaptıkları anlaşılır. Hücre bölündüğünde kromotin sıkı iplikler ve sıkı kıvrımlı ilmikli yapılar halinde yoğunlaşır. Sonuçta bu sıkı kıvrımlı ilmikler, oldukça yoğun DNA demetinden oluşan tam bir kromozom oluşturmak için diğer proteinlerin yardımıyla birlikte sıkı bir şekilde paketlenir. • Bu paketlenmenin organizasyonu sırasında DNA, çeşitli katyonlar (iki değerlikli metaller) ile etkileşim halinde bulunur. Şekil -1: Kromozom organizasyonu Genetik olayların hücrede moleküler düzeydeki temeli; genetik mertaryal görevini yüklenen nükleik asitlerin yapı ve özelliklerine dayanır. Nükleik asitlerin iki türü (DNA ve RNA) nükleotidlerin polimerleridir. Bu nükleotid 3 kısımdan oluşur; 1- Heterosiklik hakla yapısı gösteren 5 karbonlu bir şeker (pentoz), 2Heterosiklik bir C halkası ve N atomları içeren organik baz ( pürin veya pirimidin ), 3- Bir fosfat grubu. Glikozidik Bağ Şekil-2: Nükleotid yapısı Nükleotid yapısında, bir glikozidik bağ ile birbirine bağlanmış baz ve pentoz kısmına nükleozid adı verilir. Nükleotidler birbirlerine bir nükleotidin pentozunun 5’ pozisyonundaki fosfat (PO4) grubu ile onu izleyen nükleotidin pentozunun 3’ pozisyonundaki hidroksil (OH) grubu arasında kovalent şekilde oluşan fosfodiester bağı ile bağlanır. Canlıların büyük çoğunluğunda çift zincirli olan DNA molekülünde iki polinükleotid zincir bazları arasında oluşan hidrojen bağları ile bir arada tutulur. Bazlar arasında H bağlarının oluşumunun özgüllüğü, iki polinükleotid zincirdeki fosfodiester bağlarının birbirine ters yönde olmasına yol açar. Bu nedenle iki zincir birbirine zıt yönde paraleldir. Şekil-3: Çift zincirli DNA yapısı • Bazı kimyasal maddeler ve enzimler ile canlı hücrelere ait hücre zarı veya canlı hücre duvarının yıkılıp DNA’ nın ortaya çıkarılmasına DNA izolasyonu denir. DNA izolasyonu moleküler biyolojinin en temel tekniklerinden birisidir. Neden DNA izolasyonu?? Yüksek molekül ağırlıklı DNA izolasyonu; DNA parmak izi analizi, DNA-protein etkileşiminin incelenmesi, RFLP ( Restriction Fragment Lenght Polymorphism), genomik kütüphane hazırlanması ve araştırma laboratuvarları ve endüstride PCR analizlerindeki artış ile çok önemli hale gelmiştir. • DNA izolasyonu aynı zamanda; • kompleks bir DNA populasyonu içindeki spesifik DNA dizilerinin çalışılmasında, • gen expresyonu ve • genom yapısının analizinde de ilk basamaktır. Doğadaki canlıların tümüne yakın kısmında genetik materyal DNA’dır. Bu nedenle, genetik materyalle yapılacak çeşitli çalışmalarda moleküler biyoloji tekniklerinin uygulanabilmesi için öncelikle yüksek molekül ağırlıklı DNA molekülünün saf bir şekilde elde edilmesi gerekmektedir. DNA İZOLASYONU Kromozomun DNA izolasyonu Organel DNA izolasyonu Plazmid DNA izolasyonu GENOMİK DNA İZOLASYONU Genomik DNA nedir? Profilleme/ Fingerprinting: Kan, sperm örneklerini karşılaştırmak adli bilimlerde kullanılan bir metottur. Yeni bir gen klonlamaya ilk adım Bir hücredeki ve/veya virüsteki bütün genleri içeren DNA örneği demektir. Genomik DNA bütün hücrelerde bulunur ve bu hücreler genomik DNA analizleri için kullanılabilir. Genomik DNA büyüktür, komplekstir ve sulu oramlarda viskoz görünür. Örneğin; prenatal tanı için amniyotik sıvıdaki fetal hücrelerden veya koryonik hücrelerden genomik DNA elde edilebilir. Erişkinlerde periferal kandaki lökositler en kolay ulaşılabilen DNA kaynağıdır. Neden genomik DNA elde ediyoruz? Karakterizasyon/ Tanımlama: Gen ifadesi ve regülasyonunu araştırmak. Örneğin; transgenik bir organizma yapıyorsunuz ve modifikasyonun gerçekleşip gerçekleşmediğini kontrol etmeniz gerekir. İlginç bir fenotip elde ettiniz ve daha derine bakmak istiyorsunuz. DNA izolasyonu metodunun seçiminde dikkat edilmesi gereken noktalar DNA’yı protein ve RNA gibi ana kontaminantlardan arındırmalı, Hücresel DNA’nın çoğunun izole edilebileceği bir metot olmalı, DNA’nın fiziksel ve kimyasal yapısını bozmamalı, Elde edilen DNA yüksek molekül ağırlıklı olmalı, (çok fazla kırık bulunmamalı) Hızlı ve kolay olmalı İzolasyonda Kullanılan Maddeler ve İşlevleri • Tris (tampon) • EDTA (Dnase aktivitesi için gerekli kofaktörleri tutar) • NaCl (proteinleri ayırır) • SDS (deterjandır; membranları denetüre eder, DNA çok dayanıklı olduğu için SDS muamelesinden etkilenmez) • Proteinaz K (DNA’ya bağlı olan proteinleri (ökromatin yapısındaki / histonlar vb) parçalayarak DNAnın serbest kalmasını sağlar. • Ribonükleaz (RNA’ların uzaklaştırılmasında) • Fenol/Kloroform /izoamil alkol • Protein denatürasyonu • Isopropanol veya ethanol • DNA Presipitasyon • Santrifüj / süpernatant uzaklaştır DNA İZOLASYONUNU AŞAMALARI DNA izolasyonunun amacı, bir hücrenin tüm genetik materyalini taşıyan DNA’nın hücrenin diğer bütün bileşenlerinden ayırmaktır. Günümüzde bir çok DNA izolasyon metodu geliştirilmiştir. Ancak kullanılan metot ne olursa olsun, bütün metotlar şu dört ana basamağı içerir: 1.Hücrelerin parçalanması (LİZİS) 2.Protein ve RNA’nın uzaklaştırılması (PÜRİFİKASYON) 3. DNA’nın yoğunlaştırılması (PRESİPİTASYON) 4. DNA’nın kalite ve saflığının tespiti. 1. Hücrelerin parçalanması (lizis): •fiziksel, •kimyasal ve •enzimatik yollar kullanılarak yapılabilir. •Sonikasyon, ezme, parçalama ve yüksek basınç uygulama gibi fiziksel olarak parçalama işlemleri DNA hazırlamak için tercih edilmemeli Çünkü bu işlemler DNA’nın küçük parçalara ayrılmasına neden olacak kuvvetli güçler uygular. •Hücreleri açmak ve bütün bir DNA elde etmek için en iyi yöntem kimyasal (deterjanlar) ve/veya enzimatik işlemler uygulamaktır. Deterjanlar hücre zarındaki lipitleri çözerek hücreyi DNA’sına zarar vermeden parçalarlar. Ayrıca hücresel DNaz enzimlerini inhibe ederler ve proteinlerin denatüre olmasına neden olurlar ki buda proteinlerin solüsyondan uzaklaştırılmasına yardımcı olur. Hayvan hücrelerinin parçalanması; •SDS (Sodium Deodecyl Sulfate) ve •Sarcosyl (N-laurylsarcosine, sodium salt) gibi anyonik deterjanların kullanılması ile gerçekleştirilir. 2. Protein ve RNA’nın uzaklaştırılması: Proteinlerin hücre lizatından uzaklaştırılması DNA izolasyonunun ikinci basamağını oluşturur. Bu işlem “deproteinizasyon” olarak adlandırılır. Proteinlerin DNA solüsyonundan uzaklaştırılması, nükleik asitlerin ve proteinlerin farklı fiziksel özelliklere sahip olması temeline dayanır. Nükleik asitler çoğunlukla hidrofilik moleküller olup, suda kolayca çözünürken proteinler içerdikleri hidrofobik kısımlar nedeniyle organik çözücülerde kısmen çözünürler. Fenol ve %4 izoamil alkol içeren kloroform bu amaçla kullanılan organik çözücüler arasında sayılabilir. Fenol / Kloroform Fenolde nükleik asitler çözünmez. Lipidler, proteinler ve polisakkaritler fenol fazına geçerler. Fenol bir denatüre edici olarak davranır, proteinler denatüre olarak çökelek oluştururlar ve ara fazda toplanırlar. **RNA’nın uzaklaştırılması: DNA preparatlarından RNA ’ nın uzaklaştırılması genellikle bir enzimatik işlemle gerçekleştirilir. Bu işlem RNA’nın tümünü uzaklaştırmasa da RNA kontaminasyonunun en az düzeye indirilmesini sağlar. Ribonükleaz A ve ribonükleaz T1 bu amaç için kullanılabilecek iki ucuz ve kolayca temin edilebilen ribonükleazdır. 3. DNA’nın yoğunlaştırılması: DNA saflaştırılmasının bu basamağının iki amacı vardır. •Birincisi, deproteinizasyon solusyonundan yüksek molekül ağırlıklı DNA’yı konsantre etmek, •ikincisi ise nükleotidleri, amino asitleri ve hücre parçalanmasından sonra kalan küçük molekül ağırlıklı atıkların uzaklaştırılmasını sağlamaktır. DNA alkol ile çöktürülür •Bu basamakta iki yol kullanılır diyaliz ile konsantre edilir •Etanol ve izopropanol DNA’nın çöktürülmesi için en yaygın olarak kullanılan alkollerdir. DNA ’ nın çöktürülmesi uygun konsantrasyondaki sodyum ve amonyum tuzlarının varlığında % 70 lik etanolde gerçekleştirilir. Diyaliz ile DNA’nın konsantre edilmesi: Alkol ile çöktürme kullanılarak 150 kb den daha büyük DNA elde etmek oldukça güçtür Bu nedenle bu metot 200 kb veya daha yüksek molekül ağırlıklı DNA elde edilmek istendiğinde kullanılan bir yöntemdir. 4. DNA’nın saflığının ve konsantrasyonunun tayini: DNA izolasyon işleminin en son basamağı sonuçların değerlendirilmesidir. DNA için bu değerlendirme şunları içerir: DNA konsantrasyonunun belirlenmesi DNA’nın saflığının değerlendirilmesi DNA miktarının belirlenmesi BAKTERİLERDEN TOTAL DNA İZOLASYONU DNA hazırlama esasları, ilk olarak bir bakteri hücresinin tüm DNA komplementini gerektiren DNA saflaştırma prosedürünün en basit tipini göz önüne almakla çok kolay bir şekilde anlaşılır. (Plazmid ve faj DNA’ sı hazırlamak için daha farklı yöntemler izlenecektir.) Bir bakteri hücre kültüründen total DNA hazırlamak için prosedür dört safhaya ayrılır. 1. Bir bakteri kültürü büyütülür ve sonra hücreler toplanır8sıvı ortamda ise çöktürülür) 2. Hücreler içeriklerini salıvermesi için parçalanır. 3. Bu hücre özütü DNA’dan başka tüm hücre bileşenlerini uzaklaştırmak için muamele edilir. 4. Elde edilen DNA çözeltisi yoğunlaştırılır. 5. DNA’nın saflığı ve kalitesi kontrol edilir. 1. Bir Bakteri Kültürünü Geliştirme Pek çok bakteri sıvı kültür ortamında çok fazla zorluk olmaksızın büyüyebilir. Kültür ortamı, Bakterilerin büyümesine ve etkili şekilde bölünmesine izin verecek derişimlerde esas besinlerin dengeli bir karışımını sağlamalıdır. İki tipik büyüme ortamı vardır. M9, tüm bileşenleri bilinen tanımlı ortama örnektir. Bu ortam azot, magnezyum ve kalsiyum gibi esas elementleri sağlamak için inorganik besinlerin bir karışımını hem de karbon ve enerji sağlamak için glikozu içerir. Pratikte daha önce bakteri büyümesini destekleyecek iz elementler ve vitaminler gibi ilave büyüme faktörleri M9’ ilave edilmelidir. (Bu ilaveler büyütülecek türe bağlıdır.) Tablo 1: Bakteri kültürlerinin büyümesi için iki tipik ortamın bileşeni • Luria-Bertani (LB) bileşenlerinin kesin kimliği ve miktari bilinmeyen, kompleks yada belirsiz ortamdır. • Bu, bilineyen kimyasal bileşenlerin karmaşık karışımları olan iki malzemeden (triptofan ve maya özütü) dolayıdır. LB gibi kültür ortamlarında ilaveye gerek duyulmaz ve geniş çapta bakteri büyümesini destekler. Tanımlı ortamlar, bakteri kültürü tam olarak kontrollü şartlar altında büyütülmek zorunda olduğu zaman kullanılmalıdır. Bununla beraber, kültür basitçe bir DNA kaynağı olarak büyütülüyorsa buna gerek yoktur ve bu şartlar altında kompleks bir ortam uygundur. • Bir hücre özütü hazırlamak için bakteriler, mümkün olduğu kadar küçük bir hacimde hazırlanmalıdır. • Harmanlama bu nedenden dolayı santrifüjleme ile yapılmaktadır. • Böylece kültür ortamdan uzaklaştırılacak, hücreler dipte topak oluşturacak. Örneğin; 37°C’ deki LB ortamında, bir döner platformda 150-250 rpm’de karıştırmakla havalandırılan E.coli hücreleri her 20 dakikada bir yada kültür 2-3 x 109) hücre/ml’lik maksimum bir yoğunluğa varıncaya kadar bölünür. Kültürün büyümesi bir OD birim 0.8x 109) hücre/ml’ye karşılık gelen 600nm dalga boyunda optik yoğunluk okunarak gözlenir. Şekil-5: Optik yoğunluk ölçümüyle bakteri hücre sayısının tahmini Şekil-4: Bir bakteri kültüründen total hücre DNA’sının hazırlanmasındaki temel basamaklar Şekil-6: Santrifüjleme ile bakteri harmanlama 2. Bir Hücre Özütünün Hazırlanması • Bakteri hücresi sitoplazmik zarla sarılıdır ve sert hücre duvarıyla çevrilmiştir (peptidoglikan). • E.coli’yi de kapsayan bazı türlerle, Hücre duvarının kendisi ikinci bir dış zarla çevrilebilir. Bu bariyerlerin hepsi hücre bileşenlerinin salınması için yıkılmalıdır. • Kullanılan kimyasallar kullanılan bakteri türüne bağlıdır. • E.coli gibi Gram(-) organizmalarda hücre zarını zayıflatma genellikle lizozim, etilendiamin tetraasetat (EDTA) yada her ikisinin bileşimiyle meydana getirilir. Lizozim, yumurta beyazı, gözyaşı ve tükürük gibi salgılarda bulunan, hücre duvarına katılığını veren polimerik bileşikleri sindiren bir enzimdir. EDTA hücre zarının bütünsel yapısını korumak için elzem olan magnezyum iyonlarını uzaklaştırır ve de DNA’ yı inhibe edecek enzimleri uzaklaştırır. Sodyum dodesil sülfat, lizozim ve EDTA uygulamasını yeterli olmadığı durumlarda ilave olarak kullanılır. Deterjanlar lipid moleküllerini uzaklaştırmakla liziz sürecine yardım eder. Şekil-7: Bir hücre özütünün hazırlanması 3. Bir Hücre Özütünden DNA’nın Saflaştırılması DNA’ya ilaveten, bir bakteri hücre özütü önemli miktarda protein ve RNA içerir. Saf DNA’yı bırakan çeşitli yöntemler, bu hücre kalıntılarından uzaklaştırmak için kullanılabilir. Bir yaklaşım saf bir DNA çözeltisi bırakan hücre kalıntılarını yıkan ajanlarla karışımı muamele etmektir. Diğer metodlar karışımı bileşenlerine ayırmak için iyon-değiştirme kromotografisini kullanır, böylece DNA özütteki proteinler ve RNA’dan uzaklaştırılır. Şekil-8: a) Saf bir DNA çözeltisi bırakıp,hücre kalıntılarını yıkan kimyasallarla karışımı muamele etmek b) Karışımı birisi saf DNA olan farklı fraksiyonlara ayırmak Organik özütleme ve enzim sindirimiyle hücre kalıntılarının uzaklaştırılması • Bir hücre özütünü proteinlerden ayırmak için standart yol fenol ya da 1:1 fenol ve kloroform ilave etmektir. Bu organik çözücüler proteinleri çöktürür fakat sulu çözeltide nükleik asitleri ( DNA, RNA) bırakır. • Eğer hücre özütü çözücüyle yavaşça karıştırılır ve tabakalar sonra santrifüjle ayrılırsa, sonuç çöken protein molekülleri sulu ve organik fazlar arasındaki arafaz da beyaz bir pıhtı kütlesi bırakmalıdır. • Sulu nükleik asit çözeltisi daha sonra bir pipetle uzaklaştırılır. • Bazı hücre özütlerinde protein içeriği o kadar çoktur ki tek bir fenol özütlemesi, nükleik asitleri tamamen saflaştırmak için yeterli değildir. • Bu problem, birbirini izleyen birkaç fenol özütlemesi gerçekleştirmekle çözülebilir. Ama bu her bir karıştırma ve santrifüjleme esnasında bir miktar DNA kırılması ile sonuçlanacağı için sakıncalıdır. ÇÖZÜM : Fenol özütlemesinden önce pronaz yada proteinaz K gibi bir proteazla hücre özütünü muamele etmektir. Bu enzimler proteinleri fenol tarafından daha kolay uzaklaştırılacak daha ufak polipeptitlere parçalar. Şekil-9: Fenol özütlemesiyle protein bulaşkanlarının uzaklaştırılması Bazı RNA molekülleri, özellikle elçi RNA (mRNA) fenol muamelesi ile uzaklaştırılır, fakat çoğu sulu fazda DNA ile birlikte kalacaktır. RNA’yı uzaklaştırmanın tek etkili yolu bu molekülleri ribonükleotid alt birimlerine hızlı bir şekilde yıkan ribonükleaz enzimiyledir. Bir hücre özütünden DNA’yı saflaştırmak için iyon - değiştirme kromotografisinin kullanımı Biyokimyacılar kimyasal karışımları farklı bileşenlerine ayırmada elektrik yüklerindeki farklılıkları kullanmak için çeşitli yöntemler geliştirdiler. Bu yöntemlerden biri, molekülleri bir kromotografi matriksi ya da rezinde bulunan elektriksel yüklü parçacıklara bağlanma sıklıklarına bağlı olarak ayıran iyondeğiştirme kromotografisidir. • DNA ve RNA’ nın her ikisi de bazı proteinler gibi negatif yüklüdür. Bu nedenle pozitif yüklü rezine bağlanırlar. • Elektriksel bağlantı tuz tarafından bozulur. Daha sıkı bağlanan moleküllerin uzaklaştırılması daha yüksek tuz derişimlerini gerektirir. • Tuz derişiminin kademeli olarak artırılmasıyla, molekülün farklı tipleri rezinden birer birer ayrılabilir. • İyon-değiştirme kromotografisini gerçekleştirmenin en basit yolu, rezini plastik veya cam bir kolona yerleştirmek ve daha sonra hücre özütünü en üste ilave etmektir. Özüt kolondan geçer. Bu özüt çok az tuz içerdiğinden, tüm negatif yüklü moleküller rezine bağlanır ve kolonda tutulur. Şekil-10: İyon-değiştirme kromotografisi ile DNA saflaştırma 4. DNA numunelerinin derişimi Organik özütleme, çoğunlukla fazla derişik yapma gereği olmayan çok yoğun bir DNA çözeltisiyle sonuçlanır. Diğer saflaştırma metotları bazen daha seyreltik çözeltiler verebilir ve bu yüzden DNA derişimini artırıcı metotları düşünmek önemlidir. • En sık kullanılan derişim metodu etanol ile çöktürmedir. Tuzun varlığında (Na iyonları gibi monovalent katyonlar) ve -20°C yada daha düşük sıcaklıklarda mutlak etanol, polimerik nükleik asitleri etkili bir şekilde çöktürür. Yoğun bir DNA çözeltisiyle, etanol moleküllerin arafazda çökmesine yol açıp numunenin üst kısmında tabakalanabilir. • Harikulade bir marifet, DNA çözeltisindeki etanole bir cam çubuk sokmaktır. Çubuk geri çekilince, DNA molekülleri etrafına yapışır ve uzun bir lif şeklinde çözeltiden uzaklaştırılabilir. Şekil-11: Etanol çöktürmeyle DNA’yı toplama • Alternatif olarak, etanol seyreltik bir DNA çözeltisiyle karıştırılırsa, çözelti santrifüjle toplanabilir ve daha sonra uygun bir hacim suda yeniden çözünür. • Etanol çöktürmesi, kısa zincirli ve monomerik nükleik asit bileşenlerini çözeltide bırakan ek avantaja sahiptir. Ribonükleaz muamelesi sonucu oluşan ribonükleotidler bundan dolayı bu safhada kaybolacaktır. 5. DNA derişiminin ölçülmesi • Yapılan deneylerde çözeltide tam olarak ne kadar DNA’nın bulunduğunu bilmek önemlidir. DNA derişimleri ultraviyole(UV) absorbans spektrofotometresi ile hassas olarak ölçülebilir. DNA çözeltisi tarafından absorbe edilen ultraviyole ışınlarının miktarı, numunedeki DNA miktarıyla doğrudan orantılıdır. Genellikle absorbans, 1.0 absorbanslık ( A260) dalga boyu her ml’deki 50µg çift iplikli DNA’ ya yaklaşık gelen 260 nm’ de okunur. • Ultraviyole absorbansı hazırlanan DNA’ nın saflığını ölçmek için de kullanılabilir. Saf bir DNA numunesinin 260nm ve 280 nm (A260/A280)’deki absorbanslarının oranı 1.8 dir. 1.8 den daha düşük olanlar, hazırlanan DNA’nın fenol yada proteinle bulaşık olduğunu gösterir. Total Hücre DNA’sının Hazırlanması için Diğer Metotlar DNA’sına gerek duyulacak olan tek canlı bakteriler değildir. DNA’yı saflaştırmanın temel işlemleri hangi organizma olduğuna bakılmaksızın aynı ise de kullanılacak olan hücrelerin bazı özel yapıları dikkate alınarak bazı değişiklikler yapılabilir. Besbelli sıvı ortamda hücrelerin büyümesi sadece bakteriler, diğer mikroorganizmalar, bitki ve hayvan kültürleri için uygundur. Bununla beraber hücreyi parçalama safhasında ana modifikasyonlara ihtiyaç olması muhtemeldir. Bakteri hücrelerini parçalamak için kullanılan kimyasallar genellikle diğer canlılarda işlev görmez. Örneğin; lizozimin bitki hücreleri üzerinde etkisi yoktur. Pek çok hücre duvarı tipleri için spesifik enzimler vardır, ama çoğunlukla bir havan yada havanda donmuş materyali ögütme gibi fiziksel teknikler çok daha randımanlıdır. Hücre duvarı ihtiva etmeyen canlılarda bu işleme gerek yoktur ve sadece bir SDS ile muamele ederek liziz edilebilirler. Diğer önemli hususta DNA’nın özütlendiği hücrenin biyokimyasal içeriğidir. Pek çok bakteride, hücre özütünde var olan ana biyokimyasallar protein, DNA ve RNA’dır, bu yüzden ribonükleazla RNA’yı uzaklaştırdıktan sonra fenol özütleme ve / veya proteaz muamelesi saf bir DNA numunesi bırakır. Bitki dokuları, çoğunlukla fenol özütlemeyle uzaklaşmayan yoğun miktarda karbonhidrat içerdikleri için bu bakımdan özellikle zordur. Bunun yerine farlı bir yaklaşım kullanılmalıdır. DNA, DNA molekülleri ve silika arasındaki etkileşimi kararsız yapan, su eklenmesiyle yeniden kazanılır. Bir metod Nükleik asitlerle çözünmez bir kompleks oluşturan setiltrimetilamonyum bromür (CTAB) denilen bir deterjandan yararlanmaktır. CTAB bir bitki hücresi özütüne ilave edildiğinde, nükleik asit - CTAB kompleksi, süpernatantta karbonhidrat, protein ve diğer bulaşkanları bırakarak çökelir. Çözelti daha sonra santrifüjle toplanır ve kompleksin yıkılmasına neden olan 1 M sodyum klorürde yeniden çözündürülür. Nükleik asitler artık etanol çöktürmeyle deriştirilebilir ve RNA ribonükleaz muamelesi ile uzaklaştırılabilir. Şekil-12: Bitki DNA’sının saflaştırılması için CTAB metodu PLAZMİD DNA’SI İZOLASYONU • Nükleik asitler tüm organizmalardan ve hücre materyallerinden izole edilebilir. Nükleik asitler bulundukları organizmaya göre farklı yöntemlerle izole edilebilir. Genomik DNA veya RNA bitki, hayvan ve mantar hücrelerinden izole edilebilir. Plazmid DNA ise bakteri ve maya hücrelerinden hücre materyalinin miktarına bağlı olarak farklı şekillerde izole edilir. Plazmidlerin rekombinant DNA teknolojisi çalışmalarında taşıyıcı DNA (vektör) olarak geniş çapta kullanılması plazmid izolasyon yöntemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Plazmidler bakterinin üremesi için gerekli olan temel genleri taşımazlar. Buna karşılık; • Bakteriye uygun olmayan ortam koşullarında yaşayabilme • Çeşitli toksik maddeler üretme • Toksik maddeleri metabolize edebilme • Antibiyotiklere dirençlilik ve antibiyotik sentezleyebilme • Patojen özelliği kazandırma • Bazıları bakteriye eşey özelliği sağlayabilme gibi nitelikleri kazandıran genleri içerir. Hücre içerisinde boyutları ve kopya sayıları çeşitlilik gösteren birden fazla farklı tipte plazmid bulunabilir. PLAZMİD İZOLASYONU İÇİN GEREKLİ MALZEMELER 1. 1-5 ml gece boyu büyüyen hücre kültürü 2. Santrifüj 3. Otoklavlanabilir bakteri atık kabı 4. Farklı deterjan ve tamponlar 5. Steril ependorf tüpleri 6. Buz içeren kap DENEYİN YAPILIŞI • Gece boyu büyüyen bakteri hücrelerinin toplanması için hücreler 4000 rpm’de 5 dakika santrifüj yapılır. • Santrifüj yapıldıktan sonra tüpün dibinde hücre peleti görülmelidir. • Süpernatant kısmı atık kabına atılır. • Süpernatant kısmı atıldıktan sonra tüp ters çevrilir ve tüpün içinde kalan süpernatantın uzaklaşması beklenir. • Bakteri hücrelerinin üzerine 250 μl süspansiyon tamponu eklenir. • Süspansiyon tamponu RNA fargmanlarının parçalanması için RNaz içermektedir. • Süspansiyon tamponu ile hücre peleti pipetaj yapılarak iyice karışması sağlanır. Hücre süspansiyonu küçük reaksiyon tüpüne aktarılır. • Süspansiye haldeki hücre peleti üzerine 250 μl liziz tamponu eklenir. • Liziz tamponu sodyum dodesilsülfat ve sodyumhidroksit içerir içerir. Sodyum dodesil sülfat hücre duvarını yıkar, sodyumhidroksit ise proteinleri ve genomik DNA’yı denature eder. • Liziz tamponu eklendikten sonra tüp yavaşça 5 kez ters çevrilir. • Oda sıcaklığında 5 dakika inkübasyon yapılır. PLAZMİD DNA’NIN HÜCRE DEBRİSİ VE GENOMİK DNA’DAN UZAKLAŞTIRILMASI • Hücre süspansiyonu üzerine 350 μl bağlanma tamponu eklenir. • Tüp 5 kez yavaşça ters çevrilir. • Bağlanma tamponu potasyum asetat içerir ve denature proteinlerin çökelmesini sağlar. • Tüp 5 dakika buz üzerinde bekletilir. • Buz üzerinde inkübasyon sonrası 13000 rpm’de 10 dakika santrifüj yapılır. • Santrifüj sonunda beyaz ve grimsi bir pellet oluşur. Bu pellet hücre debrisini ve genomik DNA kısmını içerir. • Tüpün içinden plazmid DNA içeren süpernatan dikkatlice alınarak filtreli tüpe aktarılır . • Toplama tüpü içinde bulunan filtreli tüp 13000 rpm’de 1 dakika santrifüj yapılIır. PLAZMİD DNA SAFLAŞTIRILMASI • Toplama kabındaki süpernatant kısmı uzaklaştırılır. • Filtreli tüp üzerine 500 μl yıkama solüsyonu I eklenir. • Yıkama solüsyonu, filtrede kalan tüm tuzları, proteinleri ve hücresel atıkları uzaklaştırır. • Daha sonra en yüksek hızda 1 dakika santrifüj yapılır. • Santrifüj sonunda toplama kabında bulunan süpernatant uzaklaştırılır. • 700 μl yıkama solüsyonu II eklenir. • Daha sonra en yüksek hızda 1 dakika santrifüj yapılır. • Toplama kabındaki süpernatan uzaklaştırılır. • Daha sonra tüp boş olarak en yüksek hızda 1 dakika santrifüj yapılır. SAFLAŞTIRILAN PLAZMİD DNA’NIN ELÜSYONU • Santrifüj sonunda toplama tüpünde kalan süpernatant uzaklaştırılır. • Filtreli tüpün üzerine filtreye değmeyecek şekilde 100 μl elüsyon tamponu eklenir. • En yüksek hızda 1 dakika santrifüj yapılır. • Santrifüj sonunda toplama tüpünde saflaştırılan plazmid DNA bulunur. ORGANEL DNA’SI İZOLASYONU • Ökaryotlarda nükleus DNA’sından • Boyutu değişi organizmalarda bağımsız kalıtım gösteren organel farklılık göstermektedir. hücrelerinde DNA’larının varlığı 1900’lü yılların • Hayvan mtDNA’sı yaklaşık 16.5 kb başlarında gösterilmiştir. • Mitokondri DNA’sı (mtDNA) ve büyüklüğünde, buna karşılık kloroplast DNA’sı (ctDNA) kendi maya hücrelerinde 17-84 kb değişmektedir. işlevleri için gerekli bütün RNA arasında türlerini ve bazı proteinleri Bitkilerde ise minumum 100 şifreleyen genetik bilgiyi kb’den başlamıştır. taşımaktadırlar. • Mitokondri DNA’sı çift zincirli halkasal bir moleküldür. (basit yapılı birkaç ökaryotta doğrusal olduğu saptanmışır.) • Kloroplast DNA’sı da mtDNA’sı gibi çift zincirli halkasal bir moleküldür. • Boyutu oldukça büyüktür. • Gelişmiş bitkilerde yaklaşık 140 kb iken basit yapılı olanlarda 200 kb’ ye kadar olabilmektedir. • Kloroplast genomunda bütün rRNAve tRNA türleri ile RNA polimerazı, bazı ribozomal proteinleri ve birkaç yapısal proteini şifreleyen yaklaşıl 50 kadar gen bulunmaktadır. Organel DNA’sı izolasyonlarında en önemli aşama öncelikle organelin parçalanmamış şekilde ayrılması olduğundan dolayı, bu olay 2 aşamada gerçekleştirilir. ***Organelin izolasyonu ***Organel DNA’sının izolasyonu Mitokondriyal DNA’nın saflaştırılması Mitokondri İzolasyonu Materyal: Somatik hibritlerin çeşitli bitki dokuları Taze dokular (yaprak, çiçek vb.) buzda soğutulmuş uygun tampon içinde parçalanır. Plastitlerin uzaklaşması için süpernatant 2600 ×g’de 15’ da 2 kez ve bir kez de 10’ santrifüj edilir.. mitokondrileri içeren çökelti buzda soğutulmuş uygun tampon içinde çözündürülür. Naylon bir membrandan (por çapı yaklaşık 10µm) filtre edildikten sonra büyük hücre parçalarının uzaklaştırılması için 500×g’de 10’ dakika santrifüj edilir. lizis olmuş nükleus içeren üst sıvı atılır ve mitokondrileri çöktürmek için 14.500 ×g’de 15’ santrifüj edilir. Mitokondri çökeltisi sıvı azotta dondurulduktan sonra -80°C saklanır yada doğrudan DNA izolasyonu yapılabilir. MİTOKONDRİ DNA İZOLASYONU 2. 1. MİTOKONDRİYAL VE DİĞER MEMBRANLARIN LİZİZ EDİLMESİ PROTEİNLERİN FENOL/KLOROFORM GİBİ ÇÖZELTİLERLE UZAKLAŞTIRILMASI 3. ETANOL İLE DNA’NIN ÇÖKTÜRÜLMESİ 4. DNA’NIN SAFLIĞI VE KALİTESİNİN TESPİTİ DNA ANALİZİ • Nükleik asitlerin nanogram veya mikrogram düzeyindeki miktarlarının belirlenmesi, moleküler biyoloji alanında çalışan araştırıcılar için temel noktalardan biridir. • Genellikle izole edilen DNA’ların miktar tayininde absorbsiyon temeline dayanan spektrofotometrik yöntemler kullanılır. • Nükleik asitlerin doğrudangörüntülenmesinde veya özgün dizilerde kesim yapan restriksiyon endonükleaz enzimlerinin etkisi sonucu oluşan farklı boyutlardaki DNA parçalarının saptanmasında elektroforetik yöntemler kullanılır. DNA ANALİZ YÖNTEMLERİ SPEKTRAL YÖNTEMLER ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER DNA’NIN ENZİMATİK KESİMİ SPEKTRAL YÖNTEMLER • Nükleotidlerin heterosiklik halkaları 260 nm dalga boyunda maksimum absorbsiyon özelliği gösterir. • Bu nedenle 260 nm’de ölçüler absorbsiyon değerleri (A260) oldukça saf olarak izole edilen nükleik asitlerin mikrogram düzeyinde miktarının belirlenmesinde kullanılır. • Çift zincirli DNA molekülleri için, 1 optik dansitenin (OD) 50µg/ml’ye karşılık geldiği bilinmektedir. Buna göre çift zincirli DNA belirlenmesinde aşağıdaki formül kullanılır. DNA (µg/ml) ₌ A260 x sulandırma oranı x 50 • 260 ve 280 nm dalga boylerında okunan değerler arasındaki oran nükleik asitlerin saflığı hakkında bilgi vermektedir. • Proteinlerde 280 nm de absorbans gösterirler. • Saflaştırılmış DNA’ da A260/280 oranı yaklaşık 1.75-1.8’in üzerinde olmalıdır. Bu nedenle 280 nm’de ölçülen bir değerdeki artış bu oranda düşmeye neden olur bu da safsızlığın bir karşılığıdır. ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER • Tüm laboratuvarlarda rutin olarak kullanılan en basit yöntemlerden biri jel elektroforezidir. • Yöntemin avantajları basit ve hızlı olması ve ayrıcadiğer yöntemlerle yeterli düzeyde ayrılmayan DNA fragmentlerinin ayrılabilmesini sağlamasıdır. • UV ışığı altında fluoresan etki gösteren etidyum bromür(EB) boyasının kullanımı ile çok düşük konsantrasyonlarda ( 1- 10 ng ) olsa bile, DNA’nın jel üzerindeki yerini belirlemek mümkündür. • DNA’nın elektroforetik analizinin temeli; bu molekülün elektriksel bir alanda jel üzerindeki göçüne dayanır. Bu göç hızı molekülün; büyüklüğüne, yapısına, jelde kullanılan maddenin konsantrasyonuna, iyonik kuvvete uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir. ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ PULSE FİELD JEL ELEKTROFOREZİ POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ İKİ BOYULTU ELEKTROFOREZ İZOELEKTRİK FOCUSİNG KILCAL ELEKTROFOREZ İMMÜNOELEKTROFOREZ AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ • Agaroz, bir kırmızı alg türü olan Agar agar’dan izole edilen doğrusal bir polisakkarittir. • Agaroz sıcak suda çözünür ve soğutulduğu zaman polimerde karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur. Bu oluşum geri dönüşümlüdür. • Agaroz konsantrasyonu % 0.5- 1.5 arasında değiştirilerek jelin por çapı ayarlanabilir. • Düşük DNA fragmentleri için yüksek, büyük DNA fragmentleri için düşük agaroz konsantrasyonu kullanılarak DNA’nın jelde uygun şekilde yürümesi sağlanabilir. • DNA’nın jelde görünğr hale gelebilmesi etidyum bromürün DNA bağları arasına bağlanarak 300-360 nm’de ışığı absorblaması sonucu fluoresan etki göstermesi ile olur (Bu etki DNA konsantrasyonuna bağlı değişebilir). İzole edilen DNA’nın genomik ya da plazmid DNA’sı omasına göre jeleki görünümleri farklılık gösterir. Genomik DNA keskin bir bant ile bu bandın aşağı ve yukarı kısmına doğru yayılan bir görüntü verir. Plazmid DNA’sının jeldeki görüntüsünde genellikle üç farklı biçimi gözlenir; 1. Süper sarmal biçim 2. Gevşek sarmal biçim 3. Doğrusal biçim • Doğrusal biçim izolasyon sırasındaki kırılmalardan dolayı oluşur. • Eğer saflaştırma işlemi doğru bir biçimde yapılmış ise jelde sadece süper sarmal ve gevşek sarmal formlar gözükecektir. • Molekül ağırlıkları aynı olmasına rağmen bu üç formun jeldeki göçleri farklıdır. Bu farklılık; agaroz konsantrasyonuna, uygulanan akıma, tamponun iyonik kuvvetine ve form I’in yoğunluğuna da bağlıdır. • Optimize olmuş koşullarda form I genellikle diğerlerine göre daha hızlı hareket eder. AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ Gerekli Malzemeler Agaroz TBE ( Tris- borat ) Tamponu TAE ( Tris – asetat ) Tamponu TE Tamponu Yükleme Tamponu ( sükroz, bromfenol mavisi, su ) Elektroforez Gereçleri Agaroz Jelin Hazırlanması Agaroz jeller toz halindeki agar ile tampon çözeltilerin uygun miktarda karıştırılması ile hazırlanır. Agaroz oda ısısında çözünmez. Kaynatma yolu ile ( mikrodalga, otoklavlama veya ateş üzerinde ) çözdürülür. Elle tutulabilecek sıcaklığa düştüğünde ( 55-50 °C ) 0.5 µg/ml etidyum bromür ilave edilir. Kenarları kapatılmış cam veya özel yüzeyler üzerine, sızıntı olmamasına dikkat edilerek dökülür. Cepleri oluşturacak tarak yerleştirilerek donması beklenir. Agaroz jel 30-35 dk polimerize olarak kullanıma hazır hale gelir Dikkatlice bantlar ve tarak çıkarılarak tanka yerleştirilir. Yükleme Örneklerinin Hazırlanması Jeldeki cebin büyüklüğüne göre izole edilen ve TE içinde bulunan DNA solüsyonundan alınır. üzerinde Bromophenol Blue (BB) eklenir. ( genellikle 1/6 hacimde ) 10 saniye mikrosantrifüjde sıvının tüp dibine toplanması sağlanır. Tüm sıvı mikropipet yardımıyla jele yüklenir. 5 V/cm olacak şekilde akım geçirilir. DNA fragmentlerinin yükleme tankındaki hareketi. Sürenin sonunda jel bir transilüminatör üzerine alınır ve UV ışığı altında fragmentlerin boyutları standartlarla karşılaştırılarak belirlenir. PULSE FİELD JEL ELEKTROFOREZİ • Yaklaşık 1 megabazdan (Mb) daha büyük doğrusal çift iplikli DNA molekülleri agaroz jelde aynı hızda göç ederler. Bunun nedeni, jelin por büyüklüğünün doğrusal DNA’nın jelde göç edebilmesi için yeterli olmamasıdır. • Bu problem 1984 yılında geliştirilen ve 5 Mb boyutundaki DNA parçalarınıda ayırabilen ‘’pulse field ‘’ jel elektroforez tekniği ile ortadan kaldırılmıştır. • Bu yöntemde DNA molekülleri belirli zaman aralıkları da birbirlerine farklı açıda iki elektriksel alan etkisinde bırakılır. • Küçük moleküller elektriksel alan değişimlerine daha çabuk uyum sağladıkları için daha hızlı hareket ederler. • Bu sistemde dikey elektrodların yanında farklı konfigürasyonlarda elektrodlar da kullanılmaktadır. • Bu yöntemde kromozomları jelde ayrı ayrı görebilmek mümkündür. DNA’NIN ENZİMATİK KESİMİ • DNA’nın enzimatik kesimi restriksiyon endonükleazları (RE) kullanımı ile yapılır. • RE enzimleri, kısa DNA dizilerini özgül olarak tanıyan ve bu dizilimlere yakın bölgelerden veya bu dizilimler içindeki spesifik bölgelerden DNA’yı kesen yapılardır. • Günümüzde 300’e yakın farklı DNA dizilimini tanıyan yaklaşık 3000’den fazla RE varlığından söz edilmektedir. RE enzimlerinin çok büyük bir kısmı bakterilerden, çok az bir kısmı da virüs ve ökaryotlardan izole edilmiştir. • RE’ların doğal biyolojik fonksiyonu, bakteriyel savunma mekanizmasında oynadıkları roldür. Bakteriye giren yabancı DNA’ları da kesebildiklerinden, intrasellüler bakteriyel patojenleri inaktive edebilmekte ve bakteriyi virüslerden ve yabancı DNA’lardan korumaktadırlar. DNA’NIN ENZİMATİK KESİMİ • RE enzimleri, kısa DNA dizilerini özgül olarak tanıyan ve bu dizilimlere yakın bölgelerden veya bu dizilimler içindeki spesifik bölgelerden DNA’yı kesen yapılardır. • Günümüzde 300’e yakın farklı DNA dizilimini tanıyan yaklaşık 3000’den fazla RE varlığından söz edilmektedir. • RE enzimlerinin çok büyük bir kısmı bakterilerden, çok az bir kısmı da virüs ve ökaryotlardan izole edilmiştir. • 1970’li yıllardan sonra restriksiyon endonükleaz kullanımına bağlı olarak rekombinant DNA teknolojisi hızla gelişmiş ve bu gelişme seçilen bir genin çoğaltılmasını, genin kodladığı proteinin üretilmesini, genin diziliminin belirlenmesini vb., mümkün hale getirmiştir. Bu teknolojideki merkezi konumu nedeniyle, RE enzimleri özellikle klonlama çalışmaları yapan araştırma laboratuvarlarında sıklıkla kullanılmıştır. RE’lerin Kullanım Alanları Rekombinant DNA elde edilmesi DNA haritası çıkarılması Polimorfizmlerin belirlenmesi Probların hazırlanması DNA modifikasyon durumlarının analizi İSİMLENDİRME • İsimlendirmede önce enzimin elde edildiği bakteri cinsinin ilk harfi, daha sonra bakteri türünün ilk iki harfi ve son olarak da soya ait bir harf ile ilk izolasyondan başlayarak Romen rakamı ile enzimin izolasyon sırası belirtilir. • EcoR I E = genus Escherichia Hind III H = genus Haemophilus in = species influenzae d = strain Rd III = third RE to be isolated from this species • co = species coli • R = strain RY 13 • I = first RE to be isolated from this species RE’ların DNA’ya BAĞLANMA ve KESME MEKANİZMALARI • RE’lar DNA tanıma bölgesi ve katalitik alan olmak üzere iki fonksiyonel alt birimden oluşmaktadır. • DNA tanıma bölgesi spesifik bölgeyi tanır ve katalitik alanı buraya yerleştirir. • Tanıma sekansına yerleşen katalitik alan heliksin fosfodiester bağlarını kırar. • RE’lar, çift sarmal DNA’ya tanıma bölgelerinden bağlanabildikleri gibi, tanıma bölgeleri dışından da bağlanabilmektedirler. • Tanıma bölgeleri dışından bağlandıktan sonra bu enzimler, çizgisel DNA boyunca kaymaktadırlar. • Bu işlem esnasında DNA ile enzim arasını su molekülleri doldurmaktadır. Enzim tanıma bölgeleri bulunduğu zaman su moleküllerinin pek çoğu uzaklaştırılmaktadır. • Enzim-DNA kompleks formunda, hem enzimde hem DNA dizilerinde konformasyonel değişiklikler meydana gelmektedir. • RE’lar sadece bazlar arasında yatay konumda bulunan fosfodiester bağlarını kırarlar. • Karşılıklı iki baz arasındaki hidrojen bağlarının kesilmesinden sorumlu değildirler. • Hidrojen bağları, fosfodiester bağlarının kırılmasıyla ve çözeltideki termal hareketten doğan enerjinin etkisiyle kendiliğinden kırılırlar. • Farklı RE’lar aynı tanıma sekansına sahip olabilirler. Aynı sekansı tanıyan ve farklı organizmalardan elde edilmiş RE’lara izoşizomer denir. • İzoşizomerler sıklıkla farklı optimum reaksiyon koşullarına ve stabiliteye sahiptirler. • İzoşizomerler aynı sekansı tanımalarına karşın, kesimi sekansın farklı bölgelerinden de yapabilirler. Bunlara ise neoşizomerler denir. RE’ların TEPKİME ŞARTLARI • RE’lar gerek uzun süreli saklanırken, gerekse aktivite gösterirken uygun şartlara ihtiyaç duymaktadırlar. • Bir enzimden en iyi şekilde yararlanabilmesi için gerekli şartlar üretici firmalar tarafından kullanıcıya bildirilmelidir. RE’larla çalışırken, bu şartlara uyulmadığı takdirde sıkça problemlerle karşılaşılır. • Enzimlerin star aktiviteleri, DNA ve enzim konsantrasyonunun uygun olmaması, pH ve iyonik dengenin uygun olmaması, çalışılan enzimin diğer enzimlerle kontaminasyonu gibi problemler uygun olmayan kesimlere neden olabilmektedir. 1. Tampon kompozisyonu: Tampon çözeltisinin fonksiyonu yeterli iyonik gücü(tuz konsantrasyonu), major katyonları( sodyum, potasyum ) ve uygun pH ortamını oluşturmaktır. Pek çok RE genellikle pH8.0’de aktiftir. RE’ların çoğu 50-150 mM NaCl veya KCl ortamında kesim yapmaktadır. 2. Enzim kofaktörleri: Ticari olarak mevcut RE’lar kofaktörolarak sadece magnezyuma (Mg) ihtiyaç duymaktadır. Diğer divalentkatyonların varlığı problemlere neden olmaktadır. 3. Gliserol:RE’lar: -20°C’de saklanırken saklama tamponu içerisine gliserol(%50) katılmaktadır. Bu, enzimin donmasını engellemektedir. Böylece, enzimin dondurulup çözülmesi sırasında göreceği zarar önlenmektedir. Çoğu RE için çalışma sırasında son konsantrasyonda % 5’ten fazla gliserol istenmemektedir. 4. İnkübasyon sıcaklığı: Çoğu RE maksimum aktivitesini 37 °C’degöstermektedir. Fakat daha düşük veya daha yüksek sıcaklıklarda aktivitelerini gösteren RE’larda vardır. Ör: ApaI →30 °C, BclI →50 °C, TaqI →65 °C 5. Enzim konsantrasyonu: 1 aktivite ünitesi, 1μg DNA’yı 50 μL total reaksiyon hacmi içinde 1 saatte hidrolize edebilen enzim miktarıdır. Kullanılan enzim konsantrasyonları substrata göre ayarlanmakla birlikte, çok yüksek enzim konsantrasyonları star aktiviteye neden olabilmektedir. 6. Substrat konsantrasyonu: Substrat olarak kullanılan DNA’nın miktarı RE kesimini etkilemektedir. Az bir hacim içerisinde çok miktarda DNA bulunması enzimin difüzyonunu engellemekte ve etkinliğini düşürmektedir. Çok düşük DNA konsantrasyonları da kesimin verimini etkilemektedir. VİDEO STAR AKTİVİTE • RE’ların özelliklerinden en dikkate değer olanı, bu enzimlerin optimal şartlarda özgül DNA’yı en yakın dizilimden kesebilme başarılarının optimal olmayan şartlarda oldukça değişmesidir. Optimal olmayan şartlarda enzimin tanıma sekansına olan spesifitesi değişmektedir. Örneğin; BamHI enzimi için tanıma sekansı (G↓GATCC) iken, optimalolmayan şartlarda (G↓GATCN) veya (G↓RATCC) şeklinde benzer bölgelerden de kesim yapabilmektedir. Bu duruma “star aktivite”veya “relaxedspecificity”denilmektedir. • Bu durum, çalışmalarda oldukça önemli olmakta ve çalışmanın başarısında belirleyici konuma gelebilmektedir. Bu nedenle, kullanılan RE’ların star aktiviteye sahip olup olmadıkları bilinmeli, Star aktiviteye neden olan durumlar Yüksek gliserol konsantrasyonu ( > % 5 v/v ) Çok yüksek enzim konsantrasyonu (genellikle > 100 U/μg DNA ) Düşük iyonik güç ( < 25 mM ) Yüksek pH ( genellikle > 8.0 ) Organik maddelerin varlığı (DMSO, etanol, dimetilasetamid vb.) Kofaktör Mg’un yerine diğer divalent katyonların varlığı ( Mn+2,Cu+2 vb.) RE’ların SINIFLANDIRILMASI RE’lar; metilaz aktivitelerine, alt ünite yapılarına, kesim özgüllüklerine ve kofaktöri htiyaçlarına göre sınıflandırılmışlardır. Tip I RE’lar: Endonükleaz aktiviteleri için ATP, S-adenozilmetionin ve Mg+2’a ihtiyaç duyarlar. • Bilinen tüm tip I RE’lartanıma sekansındaki adenin rezidülerini metilasyona uğratmaktadır. • Bu enzimler tanıma sekanslarına bağlanmalarına rağmen, kesimleri sekans dışında tesadüfi olarak gerçekleştirmektedirler. 3 alt üniteden oluşurlar. Birincisi, tanıma sekansını tanır; ikincisi, adenin rezidülerini metiller; üçüncüsü ise kesimden sorumludur. Tip II RE’lar: RE’lar denildiğinde ilk akla gelen ve en çok çalışılan gruptur. İzole edilen RE’ların çok büyük kısmı bu gruptadır. Çünkü tip II RE’lar, tam hedef nükleotitten veya çok yakınından kesim yapma özellikleri nedeniyle araştırmalar için ideal enzimlerdir. • Mg+2 iyonlarının varlığında çift zincir DNA üzerindeki palindromiksekansları tanır ve bu sekans içindeki özel bölgeden kesim yaparlar. • Kesimleri ATP’ye bağlı değildir. • Restriksiyon fragmanları ve jelde bandpaternleri oluşturmaları bakımından diğer tip RE’lara göre çok üstündürler ve hemen hemen sadece bu grup RE’larla çalışılmaktadır. Tip III RE’lar: Tip I RE’lar gibi metilasyon modifikasyon fonksiyonuna sahip olup, Mg+2 ve ATP’ye bağlı kesim gerçekleştirirler. • Çok altüniteli enzimlerdir ve tam bir kesim yapma özellikleri zayıftır. • DNA’ya tanıma sekanslarından bağlanmalarına rağmen, kesimi tanıma bölgesinden farklı bir yerden gerçekleştirirler. Homing endonükleazlar: Protein yapıları bakımından diğer RE’lardan farklılık gösteren, uzun ve asimetrik bölgeleri tanıyıp kesen, aktivitesi için protein ve RNA’ya ihtiyaç duyan enzim grubudur. • Daha az tanıma özgüllüğü göstermekte ve tanıma bölgelerindeki tek baz değişimlerini tolere edebilmektedirler. Nicking endonükleazlar: RE’lar çift zincir DNA’ya bağlanıp kesim yaparlar. Tek zincire bağlanıp endonükleaz aktivitesi gösteren enzim grubuna da “nicking” endonükleazlar denilmektedir. DNA’nın Kısmi Kesilmesi • Bu yöntem özellikle genom kitaplığı kurulması sırasında veya istenilen boyuttaki DNA fragmentlerini elde etmek amacıyla kullanılır. • Kısmi kesilme, bir RE’nin bir DNA molekülündeki az sayıda hedef noktalarını tanıması ile sağlanır. • İstenen boyuttaki DNA fragmentlerini verecek enzim dozu ya enzim konsantrasyonu sabit tutularak inkübasyon süresinin, ya da inkübasyon süresi sabit tutularak enzim konsantrasyonunun değiştirilmesi ile belirlenir. DNA’nın Jelden Geri Alınması DNA’nın jelden geri kazanılmasına yönelik oldukça farklı yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemlerle istenilen boyuttaki DNA fragmentlerini saf olarak elde etmek veya DNA’yı herhangi bir aşamada saflaştırmak olasıdır. Bunula beraber uygulamada başarılı sonuç alınmasını güçleştiren bazı noktalar vardır. Bu olumsuzluklar aşağıda açıklanmıştır. 1. Saf olmayan agaroz kullanımı. DNA’nın jelden geri kazanılması sırasında agaroz içindeki yabancı maddelerin DNA solüsyonunda bulunması sonaki asamalarda kullanılacak olan enzimleri inhibe etmektedir. 2. Büyük fragmentlerin jelden geri kazanılmasındaki güçlük. Genellikle 5 kb’den daha küçük fragmentlerin geri kazanımı başarılı olurken büyük fragmentler aynı başarı ile izole edilemezler. 3. Düşük konsantrasyonda DNA kullanımı. Eğer az miktarda DNA jele yüklenmişse geri kazanım sırasında önemli kayıplar olabileceğinden 500 ng’dan az miktardaki DNA ile işleme başlamamak yararlı olur. DNA’nın geri kazanılmasına yönelik geliştirilmiş yöntemler şu şekilde sıralanabilir: 1. Ticari olarak üretilen küçük ‘‘sepharacyl’’ seferasil kolonlarla yapılan saflaştırma. Üretici firmanın önerdiği tamponlar kullanılarak istenilen boyuttaki DNA’yı içeren jel parçaları kolona yüklenir ve DNA’nın kolona bağlanması sağlanır. Daha sonra elüsyon tamponu kullanılarak DNA kolondan geri alınır. 2. Düşük sıcaklıkta eriyebilen agaroz kullanılarak saflaştırma. Agaroza hidroksietil grupları sokularak yaklaşık 30°C’da donması ve 65°C’ın altında erimesi sağlanır. Bu özellikle agaroz kullanılarakistenen DNA’yı içeren jel parcası kesilip eritildikten sonra fenol/kloroform ekstraksiyonu ve etanol çöktürmesi sonucunda DNA saf olarak elde edilir. 3. Elektroelüsyon. DNA fragmentlerini içeren agaroz parçası, içinde yürütme tamponu bulunan diyaliz tüpüne konur ve elektriksel alana bırakılır. DNA’nın jelden ayrılıp tampona geçmesi bir süre beklenir. DNA’nın tamamının tampona geçip geçmediği UV ışığı altında kontrol edilir. Etidyum bromürün izoamil alkol kullanılarak uzaklaştırılmasını izleyen çöktürmeden sonra DNA saf olarak elde edilir.(video) 4. Gene Clean yöntemiyle DNA’nın geri kazanılması. Oldukça başarılı geri kazanımın yapıldığı bu yöntemde, DNA’nın içinde bulunduğu agaroz jel eritilir ve toz halinde cam boncuk solüsyonu ‘’glass milk’’ örneğe eklenir. DNA cam boncuklara yapışır, diğer maddeler santrifüjleme ile uzaklaştırılır. DNA elüsyon tamponu veya distile su kullanılarak cam boncuklardan ayrılır ve etanol ile çöktürülür.
