tc selçuk ünġversġtesġ fen bġlġmlerġ enstġtüsü sığırlarda doku

advertisement
T.C.
SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ
FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
SIĞIRLARDA DOKU SPESĠFĠK GENLERĠN
MĠKROARRAY VERĠLERĠNĠN
KARġILAġTIRMALI ANALĠZĠYLE
BELĠRLENMESĠ
Selçuk KAPLAN
DOKTORA TEZĠ
Zootekni Anabilim Dalı
Temmuz-2013
KONYA
Her Hakkı Saklıdır
ÖZET
DOKTORA TEZĠ
SIĞIRLARDA DOKU SPESĠFĠK GENLERĠN
MĠKROARRAY VERĠLERĠNĠN
KARġILAġTIRMALI ANALĠZĠYLE BELĠRLENMESĠ
Selçuk KAPLAN
Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Zootekni Anabilim Dalı
DanıĢman: Prof. Dr. Saim BOZTEPE
2013, 62 Sayfa
Jüri
DanıĢman Prof. Dr. Saim BOZTEPE
Prof. Dr. Ramazan YETĠġĠR
Prof. Dr. Murat Soner BALCIOGLU
Prof. Dr. Birol DAĞ
Doç. Dr. Fulya ÖZDĠL
Doku spesifik genler geliĢim ve metabolizma da önemli roller oynamaktadır. Günümüzde, gen
bankasında farklı dokularla ilgili 3.363.628 GEO Profil ve 397.988 mikroarray verisi bulunmaktadır.
Bilim adamları için gen bankasında bu kadar çok faydalı veri bulunmasına rağmen, yeni doku spesifik
genlerin ortaya çıkarılması için bu verileri analiz edip kullanmaya yönelik bir strateji izlenmesiyle ilgili
eksiklikler bulunmaktadır. Bu çalıĢma, mikroarray ve mikroarraylerle iliĢkili GEO Profillerin kullanımı
ve analiziyle doku spesifik genlerin ortaya çıkarılmasına yönelik yeni bir metot ortaya koymaktadır.
Bu çalıĢmada, adipoz doku bu metodun doğrulanmasında hedef doku olarak seçilmiĢtir. Ġlk
olarak, insan ve fare mikroarray verileri karĢılaĢtırmalı olarak analiz edilmiĢtir. Mikroarray verilerini
desteklemek için, adipoz dokuyla ilgili GEO Profilleri gen bankasından seçilmiĢtir. Daha sonra, adipoz
dokuyla ilgili microarray ve GEO Profil verileri eĢ zamanlı olarak değerlendirilmiĢtir. Sonuç olarak bu
metot, Chordin-like 1 (Chrdl1) olarak isimlendirilen yeni bir adipoz spesifik geni hipotez etmiĢtir.
Hipotezin testi için sığır dokularında RT-PCR yapılmıĢtır. RT-PCR sonuçlarına göre, Chrdl1 diğer
dokulara göre adipoz dokuda yüksek derecede ekspresyon göstermiĢtir (P<0.05). Bu sonuç, kurulan
hipotezi desteklemiĢ ve bu çalıĢmada kullanılan metodun yeni doku spesifik genlerin belirlenmesinde
faydalı olabileceğini göstermiĢtir.
Anahtar Kelimeler: Adipoz doku, Adipoz spesifik gen, Atgl, Chrdl1, Fabp4, Mikroarray
iv
ABSTRACT
Ph.D THESIS
IDENTIFICATION OF TISSUE SPECIFIC GENES BY COMPARATIVE
ANALYSIS OF MICROARRAY DATA IN BOS TAURUS
Selçuk KAPLAN
THE GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCE OF
SELÇUK UNIVERSITY
THE DEGREE OF DOCTOR OF ANIMAL SCIENCE
IN AGRICULTURAL FACULTY
Advisor: Prof. Dr. Saim BOZTEPE
Year, 2013, 62
Jury
Advisor Prof. Dr. Saim BOZTEPE
Prof. Dr. Ramazan YETĠġĠR
Prof. Dr. Murat Soner BALCIOGLU
Prof. Dr. Birol DAĞ
Doç. Dr. Fulya ÖZDĠL
Tissue specific genes play important roles in development and metabolism. Currently, Gen Bank
has 3.363.628 GEO Profiles and 397.988 microarray data related to various tissues. Although huge
amounts of useful data are available to scientists in Gen Bank, there is a lack of a follow-up strategy to
analysis and use these data to identify new tissue specific genes. This study suggest a unique new method
to using and analyzing microarray and microarray related GEO Profiles to identify tissue specific genes.
In this study, adipose tissue sellected as a target tissue in order to validate the method. First, the
human and mouse microarray data were analyzed comparatively. To support the microarray data, adipose
tissue related GEO Profiles were selected from Gen Bank. Subsequently, adipose tissue related
microarray and GEO Profiles data were evaluated simultaneously. Finally, this method hypothesized a
novel adipose specific gene called Chordin-like 1 (Chrdl1). In order to test the hypothesis, RT-PCR was
performed for the bovine tissue distribution. According to the RT-PCR results, Chrdl1 was highly
expressed adipose tissue versus other tissues (P<0.05). This result was support the hypothesis and
demonstrated that a new method used in this study was useful in identification of new tissue specific
genes.
Keywords: Adipose tissue, Adipose specific gene, Atgl, Chrdl1, Fabp4, Microarray
v
ÖNSÖZ
Akademik hayatıma baĢladığım günden beri, mesleki ve kiĢisel geliĢimimde
büyük emeği olan ve tüm akademik çalıĢmalarımda ve doktora eğitimim süresince her
koĢulda bilgi birikimini ve insani desteğini esirgemeyen değerli danıĢman hocam sayın
Prof. Dr. Saim BOZTEPE’ye sonsuz teĢekkürlerimi sunuyorum.
ÇalıĢmanın belkide en kritik noktasında materyalin seçimi ve temini aĢamasında
yardımlarını esirgemeyen Dr. Ġbrahim AYTEKĠN, Uzman. Hüseyin BAYIR, Dr.
Mustafa Orhun DAYAN, ArĢ. Gör. Yasin ALTAY ve değerli öğrenci arkadaĢlarıma,
iĢletmelerini bize açan ve numunelerin alınmasına olanak sağlayan Yılet Entegre
Tesislerinin değerli çalıĢanlarına ayrı ayrı teĢekkür ediyorum. Bununla birlikte, hayvan
materyallerini bize sağlayan Selet Et Entegre Tesisleri adına Metin KÖRPE’ye ayrıca
teĢekkürü bir borç bilirim.
Doktora çalıĢmamın teorik kısmında yaptığı katkı, yönlendirme, teĢvik ve her
konuda yardımları için Ohio State Üniversitesi Zootekni bölümünden Prof. Dr. Michael
DAVIS’ e teĢekkürlerimi sunarım.
ÇalıĢmam boyunca beni her zaman sabırla destekleyen aileme, doğumuyla beni
dünyanın en mutlu insanı yapan biricik kızım Zeynep Naz KAPLAN’a ve çalıĢmanın
baĢlangıcından sonuçlanmasına kadar bana her koĢulda destek olan sevgili eĢim Nuray
KAPLAN’a bu çalıĢmayı atfederim.
Selçuk KAPLAN
KONYA-2013
vi
ĠÇĠNDEKĠLER
ÖZET .............................................................................................................................. iv
ABSTRACT ..................................................................................................................... v
ÖNSÖZ ........................................................................................................................... vi
ĠÇĠNDEKĠLER ............................................................................................................. vii
SĠMGELER VE KISALTMALAR .............................................................................. ix
1. GĠRĠġ ........................................................................................................................... 1
2. KAYNAK ARAġTIRMASI ....................................................................................... 4
2.1. Adipoz Doku .......................................................................................................... 4
2.2. Adipoz Spesifik Genler .......................................................................................... 7
2.2.1. Yağ asidi bağlayıcı protein (FABP4).............................................................. 7
2.2.2. Adipoz trigliserit lipaz (ATGL) ...................................................................... 8
2.2.3. Leptin .............................................................................................................. 9
2.2.4. Adipoz spesifik aday gen Chrdl1 (Chordin like-1) ....................................... 14
2.2.5. Farklı hayvan türlerinde mikroarray yöntemi kullanılarak yapılan çalıĢmalar
................................................................................................................................ 16
3. MATERYAL VE YÖNTEM.................................................................................... 18
3.1. Materyal ............................................................................................................... 18
3.1.1. Gen taraması ................................................................................................. 18
3.1.2. Doku örneklerinin alınması .......................................................................... 19
3.2. Yöntem................................................................................................................. 21
3.2.1. Havanların hazırlanması ............................................................................... 21
3.2.2. Sıvı azotla dokuların havanda ezilmesi ........................................................ 22
3.2.3. Dokulardan RNA izolasyonu ........................................................................ 22
3.2.4. RNA konsantrasyon saflıklarının belirlenmesi ............................................. 24
3.2.5. cDNA sentezi ................................................................................................ 29
3.2.6. Primer tasarımı .............................................................................................. 30
3.2.7. Real time pcr ................................................................................................. 30
3.2.8. Real time pcr sonuçlarının değerlendirilmesi ............................................... 32
3.2.9. Ġstatistik analizler .......................................................................................... 32
4. ARAġTIRMA SONUÇLARI VE TARTIġMA ...................................................... 33
4.1. Bilimsel hipotezin kurulması ............................................................................... 36
4.2. Hipotezin Real Time PCR ile Test Edilmesi ....................................................... 38
4.3. Yağ Asidi Bağlayıcı Protein 4 (FABP4).............................................................. 40
4.4. Adipoz Trigliserit Lipaz (ATGL) ........................................................................ 42
4.4. Chordin-like 1 (Chrdl1) ....................................................................................... 43
5. SONUÇLAR VE ÖNERĠLER ................................................................................. 44
vii
5.1. Sonuçlar ............................................................................................................... 44
5.2. Öneriler ................................................................................................................ 45
5.2.1. Ulusal karkas derecelendirme sisteminin kurulması .................................... 45
5.2.2. Markere dayalı seleksiyon yönteminin kullanılması .................................... 47
5.2.3. Sağlıklı beslenme konusunda toplumsal bilincin arttırılması ....................... 48
KAYNAKLAR .............................................................................................................. 51
ÖZGEÇMĠġ .................................................................................................................. 62
viii
SĠMGELER VE KISALTMALAR
DNA
DNase
RNA
RNase
cDNA
mRNA
dNTP
A
T
G
C
bç
GEO Profiles
GEO DataSets
g
kg
mg
μg
kDa
μl
ml
°C
dk
sn
SNP
PCR
RT-PCR
rpm
Chrdl1
FABP4
ATGL
BMP
HIF-1
TSE
TNFα
MCP-1
PAI-1
ASP
LPL
TSH
FABPs
Deoksiribonükleik asit
Deoksi Ribo Nükleaz
Ribonükleik asit
Ribo Nükleaz
Komplementer Deoksi Ribo Nükleik Asit
Haberci RNA
Deoksiribonükleozid trifosfat
Adenin nükleotid
Timin nükleotid
Guanin nükleotid
Sitozin nükleotid
Baz çifti
GeniĢ kapsamlı gen ekspresyon profilleri
Gen ekspresyon veri setleri
Gram
Kilogram
Miligram
Mikrogram
Kilo dalton
Mikro litre
Mili litre
Santigrat derece
Dakika
Saniye
Tek nükleotid polimorfizmi
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Ters transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu
(Rotate per minute) Dakikadaki devir sayısı
Chordin-like 1
Yağ asidi bağlayıcı protein 4
Adipose trigliserit lipaz
Bone morphogenetic protein
Hypoxia inducible factor-1α
Türk Standartları Enstitüsü
Tumor necrosis factor-alpha
Monocyte chemoattractant protein-1
Plasminogen activator inhibitor-1
Acylation stimulating protein
Lipoprotein lipaz
Thyroid stimulating hormone
Yağ asidi bağlayıcı proteinler
ix
1
1. GĠRĠġ
Adipoz doku son yıllarda araĢtırmacılar tarafından vücut homeostazisinde
önemli görevleri olan endokrin bir organ olarak gösterilmektedir (Galic ve ark., 2010).
Adipoz dokuda meydana gelen problemler insanlarda obezite ve obeziteye bağlı
metabolik rahatsızlıklara neden olurken çiftlik hayvanlarında ise yağlı karaciğer
sendromu gibi metabolik bozukluklara neden olmaktadır (Umucalılar ve GülĢen, 2005;
Maury ve Brichard, 2010). Bununla birlikte çiftlik hayvanlarında görülen aĢırı
yağlanma, yenilebilir et miktarını azaltıp karkas randımanını olumsuz yönde etkilemek
suretiyle ciddi ekonomik kayıplara neden olmaktadır (Anonim, 2013a). Söz konusu
nedenlerden dolayı son yıllarda adipoz dokunun insanlarda ve çiftlik hayvanlarında
vücut fonsiyonlarını ne yönde etkilediği büyük bir merak konusu olmuĢ; adipoz doku
geliĢiminin moleküler mekanizmasının aydınlatılmasına yönelik çalıĢmalar hız
kazanmıĢtır.
Mikroarray analizleri adipoz dokunun geliĢiminden sorumlu doku spesifik gen
ekspresyonlarının tespit edilmesinde kullanılan moleküler yöntemlerin baĢında
gelmektedir. 1995 yılında ilk keĢfedilmesinden bu yana mikroarray teknolojileri,
binlerce
genin
farklı
biyolojik
koĢullardaki
gen
ekspresyon
profillerinin
karĢılaĢtırılmasında baĢvurulan önemli bir moleküler yöntem olarak öne çıkmaktadır.
(Schena ve ark., 1995). Günümüzde, yüksek hacimli mikroarray teknolojileri içinde gen
ekspresyon çalıĢmaları, genotipleme, proteomiks, hücre biyolojisi, kanser biyolojisi,
farmakogenomik, bulaĢıcı hastalıkların tanımlanması, besin örneklerinin içindeki
patojen varlığının tespiti ve mikrobiyal izolatların tanımlanması gibi birçok uygulamaya
ev sahipliği yapmaktadır (Kumar, 2009).
Preadipozit hücrelerinin farklılaĢıp olgun adipozitlere dönüĢmesi sürecine
adipogenesis denilmektedir (Anonymous, 2010). Adipogenesis transkripsiyon faktörleri
ve hücre döngüsü proteinlerinin gen ekspresyonlarını regüle ederek adipozit geliĢimini
sağladığı birden çok aĢaması olan bir prosestir (Lefterova ve Lazar, 2009). Adipoz
geliĢiminin adipoz spesifik genler tarafından önemli derecede etkilendiği oldukça iyi
bilinmektedir. Son yirmi yıldır, bazı memeli türlerinde insan, fare (Cornelius ve ark.,
1994; Ntambi ve Cheul, 2000), domuz (Bai ve ark., 2008) ve sığırlarda (Fernyhough ve
ark., 2007; Taniguchi ve ark., 2008) yağ hücrelerinden yağ sentezlenmesi üzerine
doğrudan yada dolaylı olarak etkisi olduğu belirlenen bazı genler ortaya çıkarılmıĢtır.
Söz konusu genlerin kodladığı peroksisome proliferator activated receptor γ (PPARγ)
2
ve CCAAT/enhancer-binding protein γ (C/EBPγ) gibi transkripsiyon faktörlerinin canlı
ya da laboratuar ortamlarında yağ hücresi geliĢimini doğrudan etkilediği araĢtırmacılar
tarafından ortaya konmuĢtur (Rosen ve ark., 2000; Fernyhough ve ark., 2007). Bu
genler tarafından kodlanan ve genlerin ifadelerinin düzenlenmesinde görev alan
transkripsiyon faktörleri genel olarak yağ ve yağ asidi metabolizmasında görev
almaktadır. Bu faktörler tamamen bağımsız çalıĢmamaktadır, aksine bir çok önemli
yolla iĢlevsel olarak birbirleriyle etkileĢim halinde görev yapmaktadır (Kim ve ark.,
2006). Bu genler arasında PPARγ geni yağ hücrelerinin farklılaĢmasında görevli bir çok
genin (örneğin; yağ depolama ve metabolizmasında görevli AP2 ve lipoprotein lipaz
LPL gibi) ifadesini düzenleme görevini yürütmesinden dolayı yoğun olarak
araĢtırmacıların ilgisini çekmektedir (Rosen ve ark., 2000; Fernyhough ve ark., 2007).
Bütün bu geliĢmelere rağmen, yağ sentezinde merkezi görev alan transkripsiyon
faktörleri ve bu faktörleri kodlayan genlerle ilgili açıklığa kavuĢmamıĢ birçok nokta
bulunmaktadır. Bu durum söz konusu genlerle ilgili daha fazla araĢtırma yapılmasını
gerektirmektedir.
Günümüze kadar adipoz dokuda yüksek derecede ekspresyon gösterebilen 15
adipokin’in (adipoz spesifik genin) tespit edildiği gösterilmektedir (Piya ve ark., 2013).
Adipoz geliĢiminin tamamen ortaya çıkarılması için çok daha fazla adipoz spesifik
genin belirlenmesi ve bu genlerin adipoz dokunun geliĢimi üzerine etkilerinin ortaya
konulması gerekmektedir. Yeni adipoz spesifik genlerin keĢfedilmesi sayesinde adipoz
geliĢiminin genetik mekanizmasının ortaya çıkarılması, gerek insanlarda adipoz dokuya
bağlı obezite, tip 2 diyabet ve kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde gerekse çiftlik
hayvanlarında üretim verimliliğinin arttırılmasında önemli rol oynayacaktır. Bu amaçla,
adipoz spesifik genlerin bulunması ve fonksiyonlarının ortaya çıkarılması için yeni
metotların geliĢtirilmesi büyük önem arz etmektedir.
Günümüzde, gen bankasında adipoz doku ile ilgili olarak 1.346.912 GEO
Profiles (GeniĢ kapsamlı gen ekspresyon profilleri) ve 13.324 GEO DataSets (Gen
ekspresyon veri setleri) olmak üzere toplamda 1.360.236 mikroarray verisi
bulunmaktadır (Anonymous, 2013a; Anonymous, 2013b). Gen bankasında adipoz doku
ile ilgili bu kadar fazla mikroarray verisi olmasına rağmen bu verilerin karĢılaĢtırmalı
analizi yapılarak yeni adipoz spesifik genlerin ortaya çıkrarılmasına yönelik herhangi
bir çalıĢma bulunmamaktadır. Bu nedenle gerek mikroarray verilerinin karĢılaĢtırmalı
analizine yönelik yeterli çalıĢma olmaması gerekse adipoz dokunun sahip olduğu
3
biyolojik önemden dolayı bu çalıĢmada, doku spesifik genlerin ortaya çıkarılması için
geliĢtirilen yeni metodun uygulaması için adipoz doku hedef doku olarak belirlenmiĢtir.
Tümüyle değerlendirildiğinde bu çalıĢmanın amacı, sığırlarda doku spesifik
genlerin tespit edilmesine olanak sağlayan yeni bir metot geliĢtirmek ve söz konusu
metodun bilimsel araĢtırmalarda kullanılabilirliğini ortaya koymaktır.
4
2. KAYNAK ARAġTIRMASI
2.1. Adipoz Doku
Geleneksel olarak, adipoz doku yağların muhafaza edildiği bir depo olarak
görülmekteydi. Günümüzde ise adipoz dokunun enerji metabolizmasında aktif rol
oynayan, bazı hormon ve sitokinlerin kaynağı olarak tüm vücut metabolizmasında görev
yapan bir doku olduğu belirtilmektedir. Adipozitlerin enerji metabolizmasındaki aktif
rolü leptinin keĢfedilmesiyle ortaya çıkmıĢtır. Leptin hemen hemen tamamen
adipozitlere özgü bir salgı ürünü olup hipotalamusta bulunan reseptörleri aracılığıyla
hormonal fonksiyon göstermektedir (Flier, 1998). Bu bulgular adipoz dokunun pasif bir
enerji deposu olduğu yönündeki düĢünceleri değiĢtirmiĢtir. Bu çalıĢmaların akabinde
bilim adamları adipoz dokunun adipokin adı verilen bir çok biyoaktif peptidi
salgıladığını ayrıca söz konusu adipokinlerin otokrin/parakrin ve sistemik (endokrin)
düzeyde iĢlev gösterdiklerini bildirmiĢlerdir (Çizelge 2.1) (Kershaw ve Flier, 2004).
Bunların ötesinde adipoz dokunun merkezi sinir sisteminde olduğu gibi hormonlardan
gelen sinyallere karĢılık olarak bir çok reseptörü eksprese ettiği görülmektedir (Çizelge
2.2) (Kershaw ve Flier, 2004).
Çizelge 2.1. Bazı adipozit türevi proteinler ve endokrin fonksiyonları (Kershaw ve Flier, 2004)
Sitokinler ve sitokinlerle iliĢkili proteinler
Diğer immun sistemle ilgili proteinler
Fibrinolitik sistemle ilgili proteinler
Komplement ve komplementle iliĢkili proteinler
Leptin
TNFα
IL-6
MCP-1
PAI-1
Doku faktör
Adipsin (komplement faktör D)
Komplement faktör B
ASP
Lipidler ve lipid metabolizması ya da taĢınması ile
ilgili proteinler
Steroid metabolizmasıyla ilgili enzimler
Adiponektin
Lipoprotein lipaz (LPL)
Kolesterol ester transfer protein
Apolipoprotein E
NEFA
Stokrom P450
17βHSD
17βHSD1
5
Çizelge 2.2. Adipoz dokuda eksprese olan bazı reseptörler (Kershaw ve Flier, 2004)
Geleneksel endokrin hormonları için reseptörler
Ġnsulin reseptör
Glucagon reseptör
GH reseptör
TSH reseptör
Gastrin/CCK-B reseptör
Glukagon benzeri peptid-1 reseptör
Anjiyotensin 2 reseptörleri tip 1 ve tip 2
Nükleer hormon reseptörleri
Glukokortikoid reseptör
Vitamin D reseptör
Tiroid hormon reseptör
Androjen reseptör
Estrojen reseptör
Progesteron reseptör
Leptin reseptör
IL-6 reseptör
TNFα reseptör
Katekolamin reseptörleri
β1, β2 ve β3 reseptörleri
α1 ve α2 reseptörleri
Adipoz dokuda meydana gelen anormal artıĢ ve azalmalar metabolik
problemlere neden olmaktadır. Öyleki adipoz dokudaki anormal artıĢ obezite ve
obeziteye bağlı insülin direnci, hiperglisemi, dislipidemi, kardiyovasküler ve
hipertansiyon gibi önemli rahatsızlıklara neden olmaktadır (Grundy ve ark., 2004).
Bununla birlikte deri altındaki adipoz dokudaki anormal azalmalar metabolizmanın
bozulmasına, derinin hızla yaĢlanmasına ve sonuç olarak lipodistrofi rahatsızlığına
neden olmaktadır (Anonim, 2013b).
Adipoz doku memelilerde beyaz adipoz doku ve kahverengi adipoz doku olarak
ikiye ayrılmaktadır (Cinti, 2005). Ruminantlarda doğumda adipoz dokunun büyük bir
çoğunluğu kahverengi adipoz dokudan oluĢurken doğum sonrasında bu dokuların büyük
bir çoğunluğu beyaz adipoz dokuya dönüĢmektedir. Yeni doğan buzağıların vücut
ağırlığının % 1.5 – 2.0’si kahverengi adipoz dokudan oluĢmaktadır. Memelilerde beyaz
adipoz doku böbreklere yakın bölgelerde, üreme organlarının çevresinde, perirenal
depolarda, omental ve mezentrik depolarda ve kas içi ve kas aralarında bulunmaktadır
(Mersmann ve Smith, 2004). Kahverengi adipoz doku ise memelilerde böbrek, kalp ve
aort çevresinde interkostal kaslar ve sternum boyunca, boyunun iç kısımlarında ve ana
arter ve damarların çevresinde görülmektedir (Stock ve Cinti, 2003).
Ruminant hayvan karkaslarında adipoz doku derialtı, kasarası ve kas içi olarak
yerleĢim göstermektedir (Öztürkcan ve ark., 1996).
Beyaz adipozit hücrelerinden oluĢan beyaz adipoz doku adipoz dokunun büyük
bir çoğunluğunu oluĢturmaktadır. Beyaz adipoz doku vücutta yerleĢim yerine bağlı
6
olarak viskeral (karın boĢluğu) ve subkutan (deri altı) olmak üzere isimlendirilmektedir
(Avram ve ark., 2005). Beyaz adipoz doku, diyetten gelen fazla enerjiyi trigliserit olarak
depolamaktadır. Açlık durumunda ise beyaz adipoz dokuda depo edilen trigliserit lipaz
aktivitesiyle yağ asidi ve gliserole parçalanarak vücudun enerji ihtiyacı karĢılanmaktadır
(Lieberman ve Marks, 2009). Bir yağ hücresinin çapı normalde 1-2 mikron arasında
değiĢmesine rağmen, yağ biriktirdiğinde bu çap 120 mikrona kadar artabilmektedir. Bu
durum yağ hücrelerinin yağ depolama kapasitesinin oldukça yüksek olduğunu açıkça
göstermektedir (Öztürkcan ve ark., 1996). Beyaz adipoz doku ayrıca leptininde içinde
bulunduğu biyoaktif peptid ve proteinleri (adipokinleri) sentezleyerek vücut
homeostazisini sağlamada merkezi rol oynamaktadır (Millo, 2004). Kahverengi adipoz
doku ise mitokondrice zengin bir dokudur. Kahverengi adipoz doku memelilerde vücut
soğuğa maruz kaldığında oksidatif fosforilasyon yoluyla vücut sıcaklığını dengede
tutmaktadır (Stock ve Cinti, 2003). Beyaz ve kahverengi adipoz dokunun elektron
mikroskobu altındaki görüntüleri ġekil 2.1 ve 2.2’de gösterilmektedir (Anonim, 2013c).
ġekil 2.1. Beyaz Adipoz Doku (Anonim, 2013c)
7
ġekil 2.2. Kahverengi Adipoz Doku (Anonim, 2013c)
2.2. Adipoz Spesifik Genler
2.2.1. Yağ asidi bağlayıcı protein (FABP4)
FABPs (Yağ asidi bağlayıcı proteinler) ilk olarak 1972 yılında keĢfedilmiĢtir
(Ockner ve ark., 1972). Yağ asidi bağlayıcı proteinler 14-15 kDa’luk proteinler olup
126-134 amino asitten oluĢmaktadır (Zimmerman ve Veerkamp, 2002). Yağ asidi
bağlayıcı proteinler ile ilgili bir çok çalıĢma yapılmasına rağmen ilgili proteinlerin farklı
dokulardaki fonksiyonları hala tam olarak anlaĢılamamıĢtır (Haunerland ve Spener,
2004). FABP4 (Yağ asidi bağlayıcı protein 4), yağ asidi bağlayıcı protein ailesinin en
iyi tanımlanmıĢ üyesidir (Furuhashi ve HotamıĢlıgil, 2008).
FABP4 geni hayvan türlerinde yoğun bir Ģekilde çalıĢılmaktadır. Cho ve ark.
(2008), FABP4 geni polimorfizmlerinin Kore yerli sığır karkaslarında kabuk yağı
kalınlığı üzerinde etkili olduğunu bildirmektedir.
Gerbens ve ark. (1998), FABP4 geninin Duroc domuzlarında kas içi yağ birikimi
üzerine etkileri olduğunu ifade etmektedir.
Hoashi ve ark. (2008), Japon siyah sığırlarında FABP4 I74V genotipi ve kas içi
yağ asidi kompozisyonu arasında önemli bir iliĢki olduğunu bildirmektedir (P<0.01).
Siyah Alaca sığırlarda et kalitesi SCD (Sterol-Koenzim A desaturaz) ve FABP4
genotipleri tarafından etkilenmektedir (Narukami ve ark., 2011).
8
FABP4 geni, karkaslarında yüksek mermerizasyon gösteren Hanwoo sığırlarında
düĢük mermerizasyon gösteren Hanwoo sığırlarına göre yüksek derecede ekspresyon
göstermektedir (Lee ve ark., 2008).
Xu ve ark. (2011), FABP4 AA genotipinin Çin yerli koyun ırklarında kas içi yağ
(P<0.05), gevreklik (P<0.05) ve kas mermerizasyon skoru (P<0.05) ile önemli derecede
iliĢki gösterdiğini bildirmektedir.
Li ve ark. (2008), FABP4 geninin Beijingyou ve Jingxing piliçlerinde kas içi yağ
yüzdesi üzerine önemli etkileri olduğunu ifade etmektedir.
Bilim adamları tarafından yapılmıĢ olan çalıĢmalar, FABP4 geninin çiftlik
hayvan karkaslarında mermerizasyon özelliğinin kontrol edilmesinde potansiyel bir
hedef marker olduğunu göstermektedir.
2.2.2. Adipoz trigliserit lipaz (ATGL)
Adipozitlerin lipolizinde 2004 yılına kadar sadece HSL (hormona duyarlı
lipaz)’ın görev aldığı düĢünülmekteydi. Daha sonraları farklı bilim adamları tarafından
yapılan çalıĢmalar HSL’ın olmadığı farelerin hala lipolitik aktivitelerini sürdürdüklerini
göstermektedir. Bu durum akıllara trigliserit moleküllerini parçalayan farklı lipazların
olabileceği düĢüncesini getirmiĢtir (Osuga ve ark., 2000; Wang ve ark., 2001; Holm,
2003). Daha sonra ATGL geninin trigliserit mobilizasyonunun ilk aĢamasında merkezi
bir rol oynadığı araĢtırmacılar tarafından ortaya konulmuĢtur (Zimmermann ve ark.,
2004)
ATGL geniyle ilgili, hayvanlar üzerinde yapılan çalıĢmalara bakıldığında;
Piliçlerde açlık durumunun ATGL gen ekspresyonunun hızla yükselmesine
neden olduğu belirtilmektedir (Serr ve ark., 2009; Oh ve ark., 2011)
Kosteli ve ark. (2010), farelerde kalori kısıtlamanın ATGL mRNA
ekspresyonunu önemli derecede yükselttiğini bildirmektedir.
Deiuliis ve ark. (2008), ATGL geninin kalori kısıtlaması yapılan domuzlarda
yüksek derecede ekspresyon gösterdiğini ifade etmiĢlerdir.
ATGL gen ekspresyonunun kuluçka sonrası açlık dönemindeki civcivlerin
adipoz dokusunda artıĢ gösterdiği belirtilmektedir (Lee ve ark., 2009).
Serr ve ark. (2011), ATGL gen ekspresyonunun, deksametazon enjeksiyonu
yapılan kanatlılarda salin enjeksiyonu yapılanlara göre önemli derecede fazla olduğunu
bildirmektedir.
9
Cui ve ark. (2011), ATGL geninin sığırlarda karkas ve et kalitesini belirlemede
bir genetik marker olarak kullanabileceğini ifade etmektedir.
Dai ve ark. (2011), domuzlardaki ATGL gen polimorfizmiyle (G/A392) iç
organlardaki adipoz doku, yağsız et yüzdesi, kabuk yağı kalınlığı ve göz kası gibi
karkas özellikleri arasında önemli bir iliĢki olduğunu bildirmektedir.
Shan ve ark. (2008) domuzlarda ATGL gen ekspresyon düzeyinin 20 kg vücut
ağırlığında (yaklaĢık 8 haftalık yaĢ) gözle görülür bir artıĢ gösterdiğini ve en yüksek
seviyesine 40 kg vücut ağırlığında (yaklaĢık 12 haftalık yaĢ) ulaĢtığını bildirmektedir.
ATGL
geni
ile
ilgili
olarak
hayvanlarda
yürütülen
çalıĢmalar
değerlendirildiğinde, kalori kısıtlamanın ATGL mRNA ekspresyonunu önemli derecede
arttırdığı ve ATGL geninin karkas özellikleri için genetik
marker olarak
kullanılabileceği sonucuna varılmaktadır.
2.2.3. Leptin
Friedman ve arkadaĢları ilk olarak 1994 yılında leptinin, obez (ob) geninin ürünü
olan bir hormon olduğunu keĢfetmiĢlerdir (Castracane ve Henson, 2007). Leptinin keĢfi,
uzun süreli besin alınımının regülasyonu, vücut ağırlığı, enerji harcama ve neroendokrin
fonksiyonları gibi obezitenin oluĢumuna neden olan faktörlerin aydınlatılması açısından
büyük önem taĢımaktadır (Millo, 2004). Leptin yapısal olarak sitokinlere benzerlik
gösteren 16 kDa’luk bir polipeptid olup, 167 amino asitten oluĢmaktadır (Chan ve ark.,
2000). Leptin özellikle farklılaĢma gösteren adipozitlerden eksprese olmaktadır.
Subkutan adipoz doku leptin üretiminin % 80’nini üstlenmektedir. Laboratuvar
koĢullarında yapılan hücre kültürü çalıĢmalarında, leptin üretiminin subkutan
adipozitlerde diğerlerine oranla daha yüksek miktarda üretildiği görülmektedir (Puente
ve ark., 2008). Leptinin öncelikli görevi vücut ağırlığı ve iĢtahı düzenlemektir. Leptin
besin alınımını azaltmasının yanında, metabolik hızı ve termogenesisi yükselterek enerji
tüketimini arttırmaktadır (Friedman ve Halaas, 1998; Webber, 2003). Leptinin enerji
homeostazisinde gösterdiği fonksiyonlar oldukça iyi ortaya koyulmuĢtur. Bu
fonksiyonların
çoğu
özellikle
hipotalamik
yollarla
gerçekleĢmektedir.
Diğer
fonksiyonları ise kas ve pankreas hücreleri gibi perriferal dokular üzerinde
gerçekleĢmektedir (Friedman ve Halaas, 1998; Bjorbaek ve Kahn, 2004). Leptin
seviyesinin sirküle edilmesi, adipoz dokuda depolanan enerji miktarını ve doğrudan
merkezi sinir sisteminin etkilenmesi sonucu enerji homeostazisi ve nöroendokrin
10
fonksiyonlarının düzenlenmesini etkilemektedir. Leptin hayvanlarda zayıflığa neden
olmakta, leptinden yoksun hayvanlarda obezite görülmektedir (Falcão ve ark., 2012).
Leptinin vücut ağırlığı homeostazisi üzerindeki rolü, 50 yıldan fazla bir süre önce
farelerde kendiliğinden oluĢan obezite geni (ob) mutasyonu sonucu ortaya çıkmıĢ olup
ob/ob genotipini taĢıyan fareler obezite gösterirken, OB/OB genotipini taĢıyan fareler
normal vücut kondüsyonunda olmaktadır (Ingalls ve ark., 1950). ġekil 2.3’te normal ve
obez fare bir arada gösterilmektedir (Anonymous, 2011a).
ġekil 2.3. Normal ve obez fare (Anonymous, 2011a)
Çiftlik hayvanları üreticileri için leptin ve yağlanma arasındaki iliĢki üretim
verimliliği
açısından
büyük
önem
taĢımaktadır.
Kandaki
leptin
hormonu
konsantrasyonları yağlı hayvanlarda daha yüksek olmaktadır. Öyleki yağlı koyunların
kanındaki leptin hormonu konsantrasyonunun yağsız koyunlardan 8 kat kadar fazla
olduğu bildirilmektedir (Wylie ve Newforge, 2007). ġekil 2.4’te normal ve obez koyun
birarada gösterilmektedir (Wylie ve Newforge, 2007).
11
ġekil 2.4. Normal ve obez koyun (Wylie ve Newforge, 2007)
Buchanan ve ark. (2003), leptin geninin SNP (tek nükleotid polimorfizm) ile süt
ve protein verimi arasındaki iliĢkileri araĢtırdıkları çalıĢmalarında, 416 adet Siyah Alaca
sığırın genotiplemesini yapıp laktasyon performanslarının karĢılaĢtırılması için karıĢık
model uygulaması yapmıĢlardır. AraĢtırma sonuçlarına göre, homozigot T alleline sahip
hayvanların CC genotipine sahip hayvanlara göre günlük 1.5 kg daha fazla süt
ürettiklerini ancak söz konusu farklılığın laktasyon süresi boyunca süt yağı ve süt
protein yüzdesini etkilemediğini bildirmiĢlerdir.
Chebel ve ark. (2008), leptin geninin R4C lokusu ekzon 2 bölgesinde SNP
analizi ile Siyah Alaca sığırlarda laktasyon performası ve sağlık üzerine etkilerini
araĢtırdıkları çalıĢmalarında, sığırlar günde 3 kez sağılmıĢ süt verimi ve süt
komponentleri her hayvan için aylık olarak kayıt edilmiĢtir. Sığırlarda görülebilecek
ayak sorunları, mastitis ve abomasum deplasmanı gibi rahatsızlıklar bireysel olarak
takip edilmiĢtir. AraĢtırma sonuçlarına göre, CT genotipini taĢıyan hayvanlar ilk 62
günlük sağım periyodunda (2.98 ± 0.02) vücut kondüsyon skoru göstererek CC (3.02 ±
0.02) ve TT (3.04 ± 0.03) genotipini taĢıyan hayvanlara göre daha düĢük vücut
kondüsyon skoru göstermiĢlerdir. Süt verimi ve komponentleri bakımından ise CC
genotipi CT ve TT genotiplerine göre daha düĢük bir grafik göstermiĢtir. 305 günlük
verime göre, % 3.5 yağa göre düzeltilmiĢ süt, süt yağı ve süt proteini bakımından CC
12
genotipli bireyler CT genotipli bireylere göre sırayla 258, 12 ve 10.7 kg daha az verime
sahiptir. TT genotipli bireylerde abomasum deplansmanı bakımından % 4.3’ lük bir
artıĢ görünmektedir.
Clempson ve ark. (2011), Siyah Alaca sığırlarda leptin geninde SNP analizi ile
üreme, büyüme ve süt verimi özellikleri arasındaki iliĢkileri araĢtırmıĢlardır. Elde edilen
SNP’lerin erken kas geliĢimi ile iliĢkili olduğunu, A1457G ve A59V genotiplerinin
sırasıyla kas boyu ve uzunluğuyla iliĢkili olduğu, UASMS1, UASMS2, A1457G ve
A59V genotiplerinin üreme ile ve A59V genotipinin süt üretimiyle iliĢkili olduğunu
tespit etmiĢlerdir.
DeVuyst ve ark. (2008), besi sığırlarında doğum ağırlığı ve leptin SNP’leri
arasındaki iliĢkileri araĢtırdıkları çalıĢmalarında CT ve TT genotipine sahip sığırların,
CC genotiplerine sahip sığırlara göre daha yüksek doğum ağırlığına sahip olduklarını
bildirmiĢlerdir.
Komisarek ve ark. (2007), leptin geni polimorfizmleriyle Jersey sığırlarında
üreme özellikleri arasındaki iliĢkileri araĢtırdıkları çalıĢmalarında leptin geninin R4C,
A59V ve C(-963)T mutasyonlarını 219 sığırda PCR-RFLP yöntemi kullanarak test
etmiĢlerdir. AraĢtırma sonuçlarına göre, allel frekansları R4C 0.80 (C) ve 0.20 (T),
A59V 0.67 (C) ve 0.33 (T) ve C(-963)T 0.83 (C) ve 0.17(T) olarak bulmuĢlardır. Üreme
özellikleriyle istatistik olarak önemli korelasyon gösteren sadece A59V mutasyonu
olmuĢtur (P<0.05). A59V mutasyonunda TT genotipine sahip sığırların buzağılama
aralığı ve servis periyodu, CT ve CC genotipini taĢıyan sığırlara göre daha kısa
olmuĢtur. Aynı zamanda TT genotipine sahip sığırların buzağı baĢına tohumlama sayısı,
CT ve CC genotipini taĢıyan sığırlara göre daha az olmaktadır.
Kulig ve ark. (2009), Limuzin sığırlarında leptin geni polimorfizmleriyle
büyüme özellikleri arasındaki iliĢkileri araĢtırmıĢlar. Toplam 129 Limuzin buzağıda,
leptin geni polimorfizmlerininin vücut ağırlığı, günlük canlı ağırlık artıĢı, sağrı
uzunluğu ve göğüs çevresi özellikleri üzerine etkilerini araĢtırmıĢlardır. A59V
polimorfizminin 210 günlük yaĢta vücut ağırlığını önemli derecede etkilediğini
(P<0.01) bildirmiĢlerdir. Bununla birlikte ayrıca A59V polimorfizminin 3 ile 210
günlük yaĢ arasında günlük canlı ağırlık artıĢını önemli derecede etkilediğini (P<0.05)
tespit etmiĢlerdir.
Lagonigro ve ark. (2003), sığırlarda yem tüketimiyle leptin genine ait 5 farklı
SNP noktası arasındaki iliĢkileri araĢtırmıĢlardır. Sonuç olarak leptin geni ekzon 2
bölgesinde bulunan polimorfizmine ait olan AT genotipini taĢıyan hayvanların AA
13
genotipini taĢıyan hayvanlara göre ortalama olarak % 19 daha fazla yem tüketimine
sahip olduklarını bildirmiĢlerdir.
Liefers ve ark. (2003), leptin konsantrasyonları bakımından gebeliğin son
döneminde ve laktasyon sırasında gözlenen dalgalanmaların, süt sığırlarında enerji
dengesi, besin alımı, canlı ağırlık ve östrüs özellikleri üzerine etkilerini araĢtırmıĢlardır.
Ġlkine gebe olan 304 Siyah Alaca sığırda ilk 80 günlük laktasyon süresince canlı ağırlık,
kuru madde tüketimi, enerji dengesi ve süt verimiyle ilgili ölçümler yapmıĢlardır.
Buzağılama sonrası 30 günle 80 gün arasındaki sürede leptin konsantrasyonlarının
ölçülmesi amacıyla sığırlardan 2 haftada bir günün aynı saatinde sağım sonrası
beslemeden önce kan örnekleri alınmıĢtır. AraĢtırmalarında leptin konsantrasyonlarının
gebelik süresince yüksek olduğunu, ancak doğum sonrasında bir düĢme gerçekleĢtiğini,
plazma leptin konsantrasyonlarının laktasyon sırasında negatif enerji tablosu
oluĢtuğunda azaldığını, bu durumda leptin konsantrasyonlarının enerji dengesi üzerinde
etkileri olabileceğini ve doğum sonrası leptin konsantrasyonlarının eski düzeyine
gelmesinin negatif enerji tablosunun Ģiddetine bağlı olduğunu bildirmiĢlerdir.
Besi sığırlarında büyüme özellikleri ve kabuk yağı ile leptin genine ait SNP
verileri arasındaki iliĢkilerin araĢtırıldığı çalıĢmada toplam 1653 sığırda leptin genine ait
UASMS2 ve R25C polimorfizmleri genotiplendirilmiĢtir. Besi baĢından besi sonuna
kadar dört kez vücut ağırlıkları ölçülmüĢ ve kabuk yağı ölçümleri de ultrason
kullanılarak yapılmıĢtır. AraĢtırma sonuçlarına göre, R25C polimorfizminin büyüme
özellikleri üzerine önemli bir etkisi olmadığı, UASMS2 polimorfizminin canlı ağırlık
üzerine önemli bir etkisi olduğu (P<0.001) belirlenmiĢtir. Bununla birlikte UASMS2
CC genotipinin besi baĢı ağırlığının en fazla olduğu; UASMS2 TT genotipli sığırların
en hızlı canlı ağırlık artıĢına sahip olduğunu tespit etmiĢlerdir. Ultrasonla yapılan kabuk
yağı ölçümlerinde her iki polimorfizm kombine olarak değerlendirilmiĢ olup R25CCC/UASMS2-TT genotipli sığırlarda kabuk yağının en az olduğu, R25C-CC/UASMS2TT genotipli sığırlar en hızlı kabuk yağı geliĢimine sahip olurken R25C-CC/UASMS2CC genotipli sığırlar en yavaĢ kabuk yağı geliĢimine sahip olduğu belirtilmektedir
(Lusk, 2007).
Schenkel ve ark. (2005), leptin geni tekli nükleotid polimorfizmleri ile karkas ve
et kalitesi özellikleri arasındaki iliĢkileri toplam 1111 sığır üzerinde araĢtırmıĢlardır.
Deneme sonuçlarına göre leptin geni E2JW ve E2FB polimorfizmlerinin yağ, yağsız et
verimi ve yağlanma derecesi ve göz kası alanındaki etin gevreklik özellikleri üzerine
sırasıyla (P<0.01, P<0.05 ve P<0.01) önem düzeyinde etkili olduğunu bildirmiĢlerdir.
14
TCAC, CCAT ve TTAC haplotiplerinin populasyonun % 88’ini oluĢturduğunu, CCTT
haplotipinin diğer haplotiplere göre yağsız et ve yağlanma derecesi üzerine (P<0.01)
önem düzeyinde daha etkili olduğunu; TTTT haplotipinin diğer haplotiplerden farklı
olarak göz kası alanında görülen gevreklik üzerine (P<0.03) önem düzeyinde etki
gösterdiğini ifade etmiĢlerdir.
Da Silva ve ark. (2012), leptin ve leptin reseptör genlerinin tekli nükleotid
polimorfizmlerinin büyüme ve ultrason karkas özellikleri üzerine olan iliĢkilerini 2162
Nellore sığırında incelemiĢlerdir. ÇalıĢmada E2FB markerinin ağırlık kazancı ve göz
kası alanı ve kabuk yağı özelllikleriyle önemli iliĢkiler gösterdiği, leptin promotor
bölgesi markerlerinden C963T ve UASMS1’in göz kası alanı ile önemli derecede
iliĢkisi olduğunu ve T945M markerinin ağırlık kazancıyla iliĢkisi olduğunu
bildirmiĢlerdir. Sonuç olarak araĢtırmacılar leptin ve leptin reseptör markerlerinin
büyüme ve karkas özelliklerinin geliĢtirilmesi için markere dayalı seleksiyon
kapsamında kullanılabileceklerini ifade etmiĢlerdir.
Woronuk ve ark. (2012), besi sığırlarında kabuk yağı ve canlı ağırlık özellikleri
ile leptin geninde sitozin ve timin nükleotidlerinin yer değiĢtirmesi (C/T) sonucu
meydana gelen tekli nükleotid polimorfizmi arasındaki iliĢkileri araĢtırdıkları
çalıĢmalarında kabuk yağı ve vücut ağırlığı ölçümleri için 136.286 sığırın
genotiplendirilmesini yapmıĢlardır. AraĢtırma sonuçlarına göre, T allelinin kabuk yağı
üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu (P<0.0001), TT, CT ve CC genotipli sığırların
sırasıyla 6.79 ± 0.02, 6.49 ± 0.01 ve 6.28 ± 0.01 mm kabuk yağına sahip olduğunu
belirlemiĢlerdir. Genotipin canlı ağırlık üzerine olan etkisi önemli bulunmuĢtur
(P<0.0001). TT, CT ve CC genotipli sığırların sırasıyla 484.2 ± 0.7, 488.0 ± 0.5 ve
487.3 ± 0.6 kg canlı ağırlığa sahip olduklarını bildirmiĢlerdir.
2.2.4. Adipoz spesifik aday gen Chrdl1 (Chordin like-1)
Chrdl1 sığırlarda X kromozomu üzerinde taĢınan 51.42 kDa’luk moleküler
ağırlığa sahip 453 amino asitten oluĢan protein kodlayan bir gendir (Anonymous,
2013c).
Chrdl1
geni
neurogenesin-1,
neuralin-1
ve
ventroptin
olarak
da
isimlendirilmektedir. Chrdl1 geni Chordin genine homoloji göstermektedir. Chordin
geni Noggin genine benzer olarak BMP (bone morphogenetic protein) gen ailesi
reseptörlerine bağlanarak aktivitelerini inhibe etmektedir (Piccolo ve ark., 1996;
Zimmerman ve ark., 1996; Nakayama ve ark., 2001). AraĢtırmacılar Chrdl1 geninin
15
Chordin genine benzer bir özellik gösterip, BMP gen ailesinden BMP2, BMP4 ve
BMP7 genlerinin aktivitesini inhibe ettiğini göstermektedir (Sakuta ve ark., 2001;
Takahashi ve ark., 2003; Larman ve ark., 2009). Chrdl1 CR1, CR2 ve CR3 olarak
isimlendirilen 3 tane sisteince zengin prokollojen tekrarlara sahip olup, CR1 ve CR3
BMP reseptörlerine bağlanmayı sağlamaktadır (Larrain ve ark., 2000).
Sakuta ve ark. (2001), Chrdl1 geninin ventral retinada yüksek derecede
ekspresyon gösterdiğini bildirmiĢlerdir.
Nakayama ve ark. (2001) Chrdl1 geninin farelerde mezenkima dokusundan
türev alan dermatom ve organ gözü mezenkiması, geliĢimin ileri evrelerinde geliĢim
gösteren iskelet kondrositlerinde, böbrek tübüllerinde, gastrointestinal bölgelerde ve
yetiĢkinlerde kemik stromal hücrelerinde yüksek derecede ekspresyon gösterdiğini
bildirmektedir.
Chrdl1 geninin farelerde aynı zamanda nöral katmanlarda, yumurtalık yüzeyi
epitelinde, geliĢen kıl foliküllerinde, gut ve dorsal sinir düğümü köklerinde ekspresyon
gösterdiği ifade edilmektedir (Coffinier ve ark., 2001; Bowen ve ark., 2009).
Zheng ve ark. (2010), Neurogenesin 1 geninin nöral kök hücrelerini aktive
ederek zarar gören nöronların tamirine katkıda bulunduğunu belirtmektedir.
Larman ve ark. (2009), Chrdl1 ve BMP7 genlerinin birbirine zıt hareket ettiğini
bildirmektedir. Sağlıklı proksimal tübüllerde Chrdl1 geni BMP7 geninin ekspresyonunu
baskılayarak kendi gen ekspresyonunu arttırmaktadır. BMP7 geni epitel hücrelerinin
yeniden farklılaĢmasında görev almaktadır. Hasar gören böbreğin iyileĢmesi için epitel
doku Chrdl1 gen ekspresyonunu azaltıp BMP7 gen ekspresyonunu arttırmaktadır.
Kane ve ark. (2008), HIF-1 (Hypoxia inducible factor-1α) geninin Chrdl1 gen
ekspresyonunu düzenlediğini bildirmektedir. Oksijen eksikliği görülen ortamlarda
(hypoxia) Chrdl1 gen ekspresyonunun insan retina perisitlerinde artıĢ gösterdiği ifade
edilmektedir. Bunun akabinde BMP4 gen sinyalini baskılayarak retinal anjiyogenesise
katkıda bulunduğu belirtilmektedir.
Chrdl1 geni ile ilgili literatür bildiriĢleri değerlendirildiğinde, Chrdl1 geninin
genel olarak BMP gen ailesiyle iliĢki halinde olduğu ve BMP gen ailesinin
fonksiyonlarının düzenlenmesinde merkezi rol oynadığı sonucuna varılmaktadır.
16
2.2.5. Farklı hayvan türlerinde mikroarray yöntemi kullanılarak yapılan
çalıĢmalar
Li ve ark. (2009), fare dokularında yağ geliĢimini etkileyen genleri araĢtırdıkları
çalıĢmalarında, ISG12b1 geninin adipoz dokuda diğer dokulara göre önemli derecede
fazla eksprese olduğunu bulmuĢlardır. AraĢtırmacılar, söz konusu genin ekspresyonu ile
dokudaki yağ geliĢimi arasında negatif bir iliĢkinin olduğunu ortaya koymuĢlardır.
ÇalıĢmada, soğuğa maruz bırakılan farelerin dokularında yağ üretimi artarken genin
ekspresyon seviyesinin hızla düĢtüğünü tespit etmiĢlerdir. Çevre Ģartları normale
döndüğünde ise genin ekspresyon seviyesinin yükseldiği ve yağ üretimini baskı altına
alarak durdurduğunu belirlemiĢlerdir.
Zhang ve ark. (2010), Qinchuan sığırlarında ette gevreklik üzerine etkili genleri
araĢtırdıkları çalıĢmalarında, diĢi ve erkek Qinchuan sığırlarında göz kası alanı
üzerinden alınan doku örneklerinde Sığır Genom Arrayleri kullanarak farklı düzeylerde
eksprese olan genleri tespit etmeye çalıĢmıĢlardır. AraĢtırma bulgularına göre arraylerde
bakılan 10.000 gen arasında 598 genin farklı düzeylerde eksprese olduğu tespit
edilmiĢtir. Bu genlerin öncelikli olarak hücre adhezyonu, kollejen fibril organizasyonu
ve sentezi, immun cevaplarda ve hücre matrix adhezyonunda görev aldığı
belirtilmektedir.
Yarru (2008), kanatlılarda aflotoksinli yem tüketiminin gen ekspresyon
seviyelerinde yaptığı değiĢiklikleri araĢtırdıkları çalıĢmasında, gruplardan birine 2 mg
AF/kg içeren yem vermiĢtir. Yapılan mikroarray analizi sonucunda aflotoksinli yem
tüketen grupla kontrol grubu arasında 177 genin farklı düzeyde eksprese olduğunu tespit
etmiĢtir. Bu genler arasında 97 genin yüksek düzeyde eksprese olduğu 80 genin ise
düĢük seviyede ekprese olduğunu ortaya koymuĢtur.
Hou ve ark. (2010), sığır meme dokusunda laktasyon sırasında farklı seviyelerde
eksprese olan genleri mikroarray yöntemi kullanarak araĢtırdıkları çalıĢmalarında,
laktasyon sırasında toplam 122 genin farklı seviyede ekspresyon gösterdiğini
belirlemiĢlerdir. Ayrıca laktasyondaki hayvanlarla düveler ve kuru dönemdeki
hayvanlar kıyaslandığında belirlenen 122 genden 79’unun yüksek düzeyde eksprese
olduğu 43’ünün ise düĢük seviyede ekprese olduğunu ortaya koymuĢlardır.
Wang ve ark. (2005), Siyah Alaca ve Japon Siyah sığırlarında göz kası
dokusunda gen ekspresyon farklılıklarını araĢtırdıkları çalıĢmalarında, 3 Siyah Alaca ve
3 Japon Siyah sığırının göz kası dokusundan biyopsiyle örnek almıĢlardır. Daha sonra
17
alınan örnekler üzerinde mikroarray teknolojisi kullanarak gen ekspresyon seviyelerini
araĢtırmıĢlardır. AraĢtırma bulgularına göre göz kası doku örneklerinde Japon Siyah
sığırlarında 17 genin, Siyah Alaca sığırlarında ise 7 genin yüksek düzeyde eksprese
olduğu tespit edilmiĢtir. Alınan sonuçları doğrulamak için Japon Siyah sığırlarında
tespit edilen 17 gen içinden 6 gene kantitatif Real Time PCR uygulaması yapılmıĢtır.
Sonuç olarak bu genlerin Japon Siyah sığırlarında yağ asidi sentezi ve yağ
depolanmasında görev alabileceğini ifade etmiĢlerdir.
Yamasaki ve ark. (2006) yaptıkları çalıĢmada, daha önce sığır kas içi yağ
dokusunda tespit etkileri pGPx geninin yağ üretimi üzerine olan etkilerini mikroarray
teknolojisi
kullanarak
araĢtırmıĢlardır.
Sonuç
olarak
yağ
sentezi
sırasında
transkripsiyonel faktör C/EBPδ ve pGPx geninin artıĢ gösterdiğini belirlemiĢlerdir.
Bununla birlikte pGPx geninin yağ sentezi sırasında böbrek ve karın boĢluğu yağ
dokusunda yoğun bir Ģekilde ekspresyon gösterdiğini tespit etmiĢlerdir.
Clark, (2008). sığır etlerinde mozaikleĢmeyi arttıran genleri mikroarray
teknolojisi kullanarak araĢtırdığı çalıĢmasında, kesilen 28 sığırdan göz kası doku
örnekleri almıĢtır. Daha sonra bu örnekleri mozaikleĢme derecesine göre iki gruba
ayırmıĢtır. Örnekler üzerinde ayrı ayrı yürütülen mikroarray analizleri sonucunda 9
genin farklı düzeylerde ekspresyon gösterdiğini tespit etmiĢtir. MozaikleĢme oranı fazla
olan örneklerde söz konusu 9 gen arasında bulunan MYH3, HOXD10, MXRA8 ve
CASQ2 genlerinin ekpresyonunun yüksek olduğu tespit edilmiĢtir. Bununla birlikte
mozaikleĢme oranı fazla olan örneklerde NPNT, MRC1, DNER ve CYPB4 genlerinin
düĢük seviyede ekspresyon gösterdiği belirtilmektedir. Geriye kalan ACTN2 geninin
fonksiyonunun tam olarak anlaĢılamadığını bildirmiĢlerdir.
18
3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1. Materyal
3.1.1. Gen taraması
Bu çalıĢmanın ana hedefini sığır dokularında daha önce literatürde bildiriĢi
olmayan adipoz spesifik aday genlerin tespiti oluĢturmaktadır. Söz konusu aday
genlerin tespiti konusunda gen bankasında derinlemesine analizler yapılmıĢtır. Aday
genlerle ilgili sonuçların desteklenmesi amacıyla çeĢitli biyoinformatik ve istatistik
programlarından yararlanılmıĢtır.
Adipoz spesifik genleri araĢtırmak için gen bankasında bulunan GEO
veritabanında “adipocyte” ve “adipose tissue” anahtar kelimeleri kullanılarak tarama
yapılmıĢtır (Anonymous, 2013a; Anonymous, 2013b). Yapılan taramalar neticesinde
GEO veritabanında söz konusu anahtar kelimelerle ilgili olarak farelerde GDS3142
various tissues (Mus musculus) ve insanlarda GDS596 Large-scale analysis of the
human transcriptome (HG-U133A) mikroarray verilerine ulaĢılmıĢtır. GDS3142
mikroarray verisi 10 – 12 haftalık yaĢtaki farelerden alınan 22 farklı dokudan elde
edilmiĢtir (Thorrez ve ark., 2008). GDS596 mikroarray verisi ise farklı kaynaklardan
alınan fizyolojik olarak normal olan 79 insan dokusundan elde edilmiĢtir (Su ve ark.,
2004). Her bir mikroarray ile ilgili veri seti GEO veritabanından indirilmiĢtir. GDS3142
veri seti dosyası farklı dokulardaki gen ekspresyon profillerinden oluĢmaktadır. 22
farklı doku içerisinden kas dokusu hariç diğer dokulardan 3 farklı biyolojik tekerrür
bulunmaktadır. Kas dokusu ise 4 farklı biyolojik tekerrürden oluĢmaktadır. Aday
genlerin belirlenmesinde kullanılacak yeni veri setini oluĢturmak amacıyla 7 farklı ana
dokunun biyolojik tekerrürü ile ilgili veriler; dalak (GSM252067, GSM252068,
GSM252069), kas (GSM252070, GSM252071, GSM252072, GSM252073), adipoz
(GSM252093,
GSM252094,
GSM252115),
akciğer
GSM252095),
(GSM252080,
kalp
(GSM252113,
GSM252081,
GSM252114,
GSM252082),
karaciğer
(GSM252074, GSM252075, GSM252076) ve böbrek (GSM252083, GSM252084,
GSM252085) ana veri setinden süzülerek yeni bir Excel dosyası formüle edilmiĢtir.
Daha sonra dokularla ilgili gen ekspresyonlarının ortalaması alınmıĢtır. Adipoz spesifik
genlerin tespiti için adipoz dokunun gen ekspresyonu diğer dokuların gen ekspresyon
değerlerine bölünmüĢtür. Dokularla ilgili ortak bir katsayının ortaya çıkarılması için
19
elde edilen verilerin yeniden ortalaması alınmıĢtır. Sonuç olarak diğer dokuların gen
ekspresyon değerlerinin adipoz dokuya göre oranını gösteren ortak bir katsayı
bulunmuĢtur.
GDS596 mikroarray ana veri setini oluĢturan 79 dokunun her biri 2 biyolojik
tekerrürden oluĢmaktadır. Aday genlerin belirlenmesinde kullanılacak yeni veri setini
oluĢturmak
GSM18950),
amacıyla
karaciğer
kalp
(GSM18951,
(GSM18953,
GSM18952),
GSM18954)
akciğer
adipozit
(GSM18949,
(adipoz
hücresi)
(GSM18975, GSM18976), iskelet kası (GSM19013, GSM19014), ve böbrek
(GSM18955, GSM18956) ile ilgili veriler ana veri setinden süzülerek yeni bir Excel
dosyası formüle edilmiĢtir. Daha sonra GDS3142 mikroarray veri setine uygulanan
iĢlemlerin benzeri bir iĢlem GDS596 mikroarray veri setine uygulanarak diğer dokuların
gen ekspresyon değerlerinin adipoz hücresine göre oranını gösteren ortak bir katsayı
bulunmuĢtur.
3.1.2. Doku örneklerinin alınması
Doku örneklerinin alınması aĢaması Konya’nın Sarayönü Ġlçesine bağlı Ladik
Kasabasında bulunan Yılet Et Entegre Tesisleri'nde gerçekleĢtirilmiĢtir (ġekil 3.1).
ġekil 3.1. Yılet Entegre Tesisinden bir görünüm (Anonim, 2012a)
20
ġekil 3.2. Angus Sığırları (Anonymous, 2012a)
ÇalıĢmada kullanılan hayvansal doku örnekleri, yapılan görüĢmeler sonucu Selet
et entegre tesislerinden gelen 5 farklı Angus sığırın yağ, kalp, karaciğer, dalak, böbrek,
kas ve akciğer olmak üzere 7 farklı doku bölgesinden alınmıĢtır. ġekil 3.2’de Angus
sığırları gösterilmektedir.
ÇalıĢmada doku spesifik aday genlerin belirlenmesi amaçlandığı için dokuların
birbirine karıĢma olasılığının ortadan kaldırılması gerekmektedir. Bu amaçla, dokuların
alınması sırasında kontaminasyonu önlemek amacıyla doku konusunda uzman
personelden yardım alınmıĢtır. ġekil 3.3’de kesim sonrasında angus sığırlarından alınan
yağ, kalp, karaciğer, akciğer, dalak, böbrek ve kas dokuları gösterilmektedir. Alınan
dokular derhal küçük parçalara ayrılıp, numaralandırılarak DNase-RNase free
mikrosantrifüj tüplerine konmuĢtur. RNA tek zincirli yapıya sahip olduğu için DNA’ya
göre çok daha hızlı degrede olmaktadır. Bunun yanında ortamda bulunan Ribo
Nükleazlar RNA’nın degrede olmasına katkı sağlamaktadır. Bu nedenle olası RNA
kayıplarını önlemek amacıyla dokular derhal kuru buz içine koyularak soğuk zincire
alınmıĢtır. Laboratuvara getirilen doku örnekleri gerekli kontroller yapıldıktan sonra
RNA izolasyonu yapılıncaya kadar -80 °C’ de tutulmuĢtur.
21
ġekil 3.3. Sığır doku örnekleri (Yağ, kalp, karaciğer, akciğer, dalak, böbrek ve kas)
3.2. Yöntem
3.2.1. Havanların hazırlanması
RNA izolasyonunda kullanılan havanlar ilgili solusyonlar kullanılarak özel
olarak dezenfekte edilmektedir. Dokuların havanda ezilmesi sırasında RNA
degredasyonunu engellemek için havanlar önceden alüminyum folyolere sarılarak 24
saat boyunca -80 °C’lik buzdolabında muhafaza edilmektedir. ġekil 3.4’te çalıĢmada
kullanılan porselen havan gösterilmektedir.
ġekil 3.4. Porselen havan (Anonim, 2011a)
22
3.2.2. Sıvı azotla dokuların havanda ezilmesi
Dokuların RNA izolasyonu sırasında homojen olarak çözünebilirliğini arttırmak
amacıyla tüplerden alınan doku örnekleri steril havan içinde sıvı azotta ezilip toz haline
getirilerek bir ön iĢleme tabi tutulmuĢtur.
ġekil 3.5. Sıvı azotun tanka doldurulması (Anonim, 2010a)
3.2.3. Dokulardan RNA izolasyonu
RNA izolasyonu için -80 °C’ de tutulan sığır doku örnekleri soğuk zincirde
laboratuvara getirilmiĢtir. Sıvı azotta ezilmek suretiyle ön iĢleme tabi tutulan doku
örneklerinden GF-1 Total RNA extraction kit (Vivantis) kiti kullanılarak RNA
izolasyonu iĢlemi yapılmıĢtır. Ġzolasyonda 2 farklı protokol kullanılmıĢtır. 1. Protokol
yağ, karaciğer, akciğer, böbrek ve dalak dokuları için kullanılmıĢtır. 2. Protokol RNA
izolasyonunun daha zor olduğu fibröz (kalp ve kas) dokularında kullanılmıĢtır.
Ġzolasyon aĢamaları aĢağıda verilmiĢtir.
1. Protokol
a) Hassas terazide 30 mg hayvansal doku tartılmıĢtır.
b) Tartılan doku derhal sıvı azotta ezilerek toz haline getirilmiĢtir.
23
c) Toz haline gelen doku örneği 2 ml’lik steril santrifüj tüpüne alındıktan sonra üzerine
700 μl Buffer TR çözeltisi (2-merkaptetanol önceden ilave edilmiĢ) eklenerek el
mikseri yardımıyla homojenizasyon yapılmıĢtır.
d) Örnekler maksimum hızda 3 dk santrifüj edilmiĢtir.
e) Tüplerin üzerinde biriken üst faz dikkatlice alınarak filtreli homojenizasyon
tüplerine aktarılmıĢtır.
f) Örnekler maksimum hızda 2 dk santrifüj edilmiĢtir.
g) Filtre alınarak aĢağıda biriken sıvı kısmın üzerine 650 μl 80%’ lik etanol ilave
edilmiĢtir. Pipetleme yoluyla karıĢtırma iĢlemi yapılmıĢtır.
h) OluĢan karıĢımın hepsi filtreli RNA bağlama tüplerine aktarılmıĢtır.
i) Örnekler 10.000 x g hızda 1 dk santrifüj edilmiĢtir.
j) Örneklerin üzerine 500 μl Wash Buffer çözeltisi ilave edilerek, 1 dk maksimum
hızda santrifüj edilmiĢtir.
k) RNA bağlama tüpünün üzerindeki filtre kaldırılarak aĢağıda biriken sıvı kısım
dökülmüĢtür.
l) RNA bağlama tüpünün içindeki membranın merkezine 70 μl DNase I Digestion Mix
eklenmiĢ 15 dk oda sıcaklığında inkübe edilmiĢtir.
m) Örneklerin üzerine 500 μl Inhibitor Removal Buffer eklenip 1 dk maksimum hızda
santrifüj edilmiĢtir. Altta kalan sıvı kısım dökülmüĢtür.
n) Örneklerin üzerine 500 μl Wash Buffer çözeltisi ilave edilerek 10.000 x g hızda, 1
dk santrifüj edilmiĢtir. Altta kalan sıvı kısım dökülmüĢtür.
o) Örneklerin üzerine 500 μl Wash Buffer çözeltisi ilave edilerek 10.000 x g hızda, 1
dk santrifüj edilmiĢtir. Altta kalan sıvı kısım dökülmüĢtür.
p) Örnekler 10.000 x g hızda, 1 dk santrifüj edilmiĢtir.
r) RNA bağlama tüpü 1.5 ml’lik yeni bir steril santrifüj tüpüne aktarılmıĢtır.
Örneklerin üzerine 60 μl RNase-free Water ilave edilerek, 1 dk inkübe edilmiĢtir.
Daha sonra örnekler 10.000 x g hızda 1 dk santrifüj edilmiĢtir.
s) Elde edilen RNA’lar kullanım zamanına kadar -80 °C’ de muhafaza edilmiĢtir.
2.
Protokol
a)
Hassas terazide 30 mg hayvansal doku tartılmıĢtır.
b) Tartılan doku derhal sıvı azotta ezilerek toz haline getirilmiĢtir.
24
c)
Toz haline gelen doku örneği 2 ml’lik steril santrifüj tüpüne alındıktan sonra
üzerine 300 μl Buffer TR çözeltisi (2-merkaptetanol önceden ilave edilmiĢ)
eklenerek el mikseri yardımıyla homojenizasyon yapılmıĢtır.
d) OluĢan lizat üzerine 590 μl su ilave edilmiĢ sonrasında da 10 μl Proteinaz K
çözeltisi ilave edilmiĢtir. Vorteks yoluyla karıĢtırma yapılmıĢtır. Örnekler 65 °C’ de
10 dk inkübe edilmiĢtir.
e)
Örnekler 10.000 rpm hızda 3 dk santrifüj edilmiĢtir.
f)
Lizat filtreli homojenizasyon tüplerine aktarılmıĢtır
g) 450 μl saf etanol ekleyip pipetleme yoluyla karıĢım sağlanmıĢtır.
h) OluĢan karıĢımın hepsi filtreli RNA bağlama tüplerine aktarılmıĢtır.
i)
Örnekler 10.000 x g hızda 1 dk santrifüj edilmiĢtir.
j) Örneklerin üzerine 500 μl Wash Buffer çözeltisi ilave edilerek, 1 dk 10.000 rpm
hızda santrifüj edilmiĢtir.
k) RNA bağlama tüpünün üzerindeki filtre kaldırılarak aĢağıda biriken sıvı kısım
dökülmüĢtür.
l)
RNA bağlama tüpünün içindeki membranın merkezine 70 μl DNase I Digestion
Mix eklenmiĢ 15 dk oda sıcaklığında inkübe edilmiĢtir.
m) Örneklerin üzerine 500 μl Inhibitor Removal Buffer eklenip, 1 dk 10.000 rpm hızda
santrifüj edilmiĢtir. Altta kalan sıvı kısım dökülmüĢtür.
n) Örneklerin üzerine 500 μl Wash Buffer çözeltisi ilave edilerek 10.000 x g hızda, 1
dk santrifüj edilmiĢtir. Altta kalan sıvı kısım dökülmüĢtür.
o) Örneklerin üzerine 500 μl Wash Buffer çözeltisi ilave edilerek 10.000 x g hızda, 1
dk santrifüj edilmiĢtir. Altta kalan sıvı kısım dökülmüĢtür.
p) Örnekler 10.000 x g hızda, 1 dk santrifüj edilmiĢtir.
r)
RNA bağlama tüpü 1.5 ml’lik yeni bir steril santrifüj tüpüne aktarılmıĢtır.
Örneklerin üzerine 60 μl RNase-free Water ilave edilerek 1 dk inkübe edilmiĢtir.
Daha sonra örnekler 10.000 x g hızda, 1 dk santrifüj edilmiĢtir.
s)
Elde edilen RNA’lar kullanım zamanına kadar -80 °C’ de muhafaza edilmiĢtir.
3.2.4. RNA konsantrasyon saflıklarının belirlenmesi
Ġzolasyonu tamamlanan RNA örneklerinin saflık ve miktarının belirlenmesi
amacıyla NanoDrop Spektrofotometre ND 1000 cihazıyla ölçümler yapılmıĢtır. 260 ve
280 nm dalga boyları genel olarak RNA saflığının belirlenmesinde kullanılan
25
parametrelerdir. 260 ve 280 nm dalga boylarının birbirine oranlanmasıyla elde edilen
katsayının ~ 2.0 civarında olması elde edilen RNA’nın saf olduğunu göstermektedir.
Bunun aksi durumunda kontaminasyon olduğu kabul edilmektedir (Anonymous,
2011b). Bazı doku örneklerinde yapılan NanoDrop ölçümlerinden elde edilen
diyagramlar gösterilmektedir (ġekil 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 3.10, 3.11, 3.12).
ġekil 3.6. Akciğer Dokusu NanoDrop Ölçümü
26
ġekil 3.7. Böbrek Dokusu NanoDrop Ölçümü
ġekil 3.8. Dalak Dokusu NanoDrop Ölçümü
27
ġekil 3.9. Kalp Dokusu NanoDrop Ölçümü
ġekil 3.10. Karaciğer Dokusu NanoDrop Ölçümü
28
ġekil 3.11. Kas Dokusu NanoDrop Ölçümü
ġekil 3.12. Yağ Dokusu NanoDrop Ölçümü
29
3.2.5. cDNA sentezi
cDNA sentezi 1 μg total RNA’dan 2-steps RT-PCR Kit (Vivantis) kiti
kullanılarak gerçekleĢtirilmiĢtir. cDNA sentezinde kullanılan karıĢımlar ve protokol
aĢağıda gösterilmektedir.
cDNA protokolü
a) RNA primer karıĢımı 0.2 ml’lik mikrosantrifüj tüplerine hazırlanmaktadır. KarıĢım
Çizelge 3.1’de gösterilmektedir.
Çizelge 3.1. RNA primer karıĢımı
BileĢenler
Miktar
Total RNA
1 μg
Oligo d(T) (40μM)
1μl
10mM dNTPs
1μl
Su ile hacim 10 μl’ye tamamlanır
b) KarıĢım hazırlandıktan sonra örnekler 65 °C’ de 5 dk inkübe edilir ve buz üzerinde 2
dk bekletilir.
c) Örnekler kısa süre santrifüj edilir. cDNA sentez aĢamasına geçilir. cDNA sentez
karıĢımı Çizelge 3.2’de gösterilmektedir.
Çizelge 3.2. cDNA sentez karıĢımı
BileĢenler
Miktar
10X Buffer M-MuLV
2 μl
M-MuLV Reverse Transcriptase
100 unit
Su ile hacim 10 μl’ye tamamlanır
d) Her bir RNA primer karıĢımına cDNA sentez karıĢımından 10 μl ilave edilmektedir.
e) Örnekler dikkatlice karıĢtırılıp 1 dk santrifüj yapılmaktadır.
f) PCR’da 42 °C’ de 60 dk inkübasyon.
g) Reaksiyon 85 °C’ de 5 dk inkübasyon ile sonlandırılıp örnekler 1 dk buz üzerinde
bekletilmektedir.
Sentezlenen cDNA direkt olarak PCR reaksiyonlarında kullanılabilmektedir.
30
3.2.6. Primer tasarımı
Primer tasarımı için, çalıĢmaya konu olan Chordin-like 1 (Chrdl1) ve çalıĢmada
housekeeping gen olarak kullanılan Cyclophilin genleriyle ilgili olarak NCBI (National
Center for Biotechnology Information) Gen Bankası’ndan sığırlara ait sekanslar
kullanılmıĢtır. AraĢtırma sonuçlarına göre Chordin-like 1 Bos taurus (Gene ID: 540275)
ve Cyclophilin Bos taurus (Gene ID: 281419) sekansları primer tasarımı için tespit
edilmiĢtir (Anonymous, 2013c). Primerlerin seçimi, sekansın baĢlat ve bitiĢ kodonları
arasındaki sekanstan yapılmıĢtır. Primer tasarımında Tm Calculator (Anonymous,
2012b) ve Vector NTI 5.0 (Anonymous, 2012c) programlarından yararlanılmıĢtır.
Chordin-like 1 (Chrdl1) ve Cyclophilin genleriyle ilgili tasarlanan primerler Çizelge
3.3’de gösterilmektedir.
Çizelge 3.3. Kullanılan PCR primerleri
Primer adı
Nükleotid dizisi
Erime sıcaklığı
(°C)
GC oranı (%)
Uzunluk (bç)
Chrdl1 F1
Chrdl1 R1
5`- ACTCCATCACTTCAAGCTGGTGA -3`
61,91
48
23
5`- TGCAGTCCAGCTGCAGCTT -3`
61,86
58
19
Cyclophilin F1
5`- TTCCATCGTGTGATCAAGGA -3`
58,43
45
20
Cyclophilin R1
5`- TTAAGCTTGAAGTTCTCATCGG -3`
57,24
41
22
3.2.7. Real time pcr
cDNA’ ların Real Time PCR ile çoğaltımında Qiagen firmasına ait Quantitect
SYBR PCR Mix kullanılmıĢtır. Aynı PCR Ģartlarına farklı kuyucuklarda Cyclophilin ve
Chordin-like 1 (Chrdl1) master mixleri hazırlanarak ayrı kuyucuklarda denemeler
gerçekleĢtirilmiĢtir. Cyclophilin ve Chordin-like 1 (Chrdl1) genleri için hazırlanan
master mixler Çizelge 3.4. ve Çizelge 3.5’de gösterilmektedir.
Çizelge 3.4. Chordin-like 1 (Chrdl1) master mix
BileĢenler
Miktar
SYBR PCR Mix
12.5 μl
Forward primer (5 μlM)
3 μl
Reverse primer (5 μlM)
3 μl
cDNA
2 μl
dH2O
4.5 μl
TOPLAM
25 μl
31
Çizelge 3.5. Cyclophilin master mix
BileĢenler
Miktar
SYBR PCR Mix
12.5 μl
Forward primer (5 μlM)
3 μl
Reverse primer (5 μlM)
3 μl
cDNA
2 μl
dH2O
4.5 μl
TOPLAM
25 μl
Real Time PCR denemesi (Fluorion Real-Time PCR Iontek, Turkey) cihazında
gerçekleĢtirilmiĢtir. PCR programı; 95 °C’de 15 dk sonrasında 50 döngü, 95 °C’de 30 s,
60 °C’de 35 s, 72 °C’de 40 s (Bu aĢamada floresan ölçüldü) ve son olarak da 60 °C’den
99 °C’ye kadar 0.5 derecelik artıĢla 99 °C’ye kadar çıkılarak erime sıcaklığı
ölçülmüĢtür. ġekil 3.13’te Fluorion Real-Time PCR Iontek cihazı gösterilmektedir.
ġekil 3.13. Fluorion Real-Time PCR Iontek
32
3.2.8. Real time pcr sonuçlarının değerlendirilmesi
Real Time PCR sonuçlarının değerlendirilmesinde 2∆∆Ct Livak metodu
kullanılmıĢtır (Livak ve Schmittgen, 2001). Metodun uygulanması için validasyon
deneyleri dizayn edilmiĢtir. Validasyon deneyi için RNA izolasyonundan elde edilen
cDNA’lar 10 kat, 100 kat ve 1000 kat olmak üzere 3 log sulandırılmıĢtır. Cyclophilin ve
Chordin-like 1 (Chrdl1) mixleri ile her bir sulandırma üçer kez çalıĢılmıĢtır. Daha sonra
gen ekspresyonlarının belirlenmesinde aĢağıdaki aĢamalar izlenmiĢtir.
ΔCtyağ = Ctchordin - Ctcyclophilin bu değer, yağ dokusu için 2.28 bulunmuĢtur. Hedef
doku yağ doku olduğu için yağ doku karĢılaĢtırma dokusu olarak belirlenmiĢtir. Daha
sonra her doku için ayrı ayrı ΔCt değerleri bulunmuĢtur. Chrdl1 Ct değerinden
Cyclophilin Ct değeri çıkarılmıĢtır.
ΔΔCt değeri aĢağıdaki formülasyona göre hesaplanmıĢtır.
ΔΔCt= ΔCtdoku – ΔCtyağ
Daha sonra her doku için ayrı ayrı 2∆∆Ct değerleri hesaplanmıĢtır. Bulunan değer söz
konusu dokulardaki gen ekspresyonunun yağ dokudan ne kadar farklı olduğunu
göstermektedir.
3.2.9. Ġstatistik analizler
Gerek Real Time PCR verileri gerekse insan ve fare ile ilgili mikroarray veri
setlerinde bulunan farklı dokulardaki gen ekspresyon değerlerinin karĢılaĢtırmalı olarak
değerlendirilmesinde tek yönlü varyans analizi (one-way ANOVA) kullanılmıĢtır. Tüm
istatistik analizlerde SAS programının PROC GLM prosedürü kullanılmıĢtır
(Anonymous, 2013d). Tez çalıĢmasında istatistik analizlerde kullanılan matematik
model aĢağıda gösterilmektedir.
Yij = μ + αi + εij
Yij: i. dokuya ait j. gen ekspresyon değeri
μ: Dokulara ait gen ekspresyon ortalaması,
αi: i. dokunun etki miktarı,
εij:Hata etkisini ifade etmektedir.
33
4. ARAġTIRMA SONUÇLARI VE TARTIġMA
Günümüzde, mikroarray teknolojisi bilimsel araĢtırmalarda yoğun bir Ģekilde
kullanılmaktadır. Bu teknoloji binlerce genin farklı biyolojik koĢullarda eĢ zamanlı
olarak test edilmesine olanak sağlamaktadır. Bununla birlikte, burada zorlayıcı nokta
binlerce gen arasından hedef genlerin nasıl seçilmesi gerektiğidir. Bu çalıĢma
mikroarray ve GEO profil bilgilerinin etkin bir Ģekilde kullanılmasıyla, gerçek
laboratuvar deneyleri yapılmadan önce yeni doku spesifik genlerin tespit edilmesine
olanak sağlayan yeni bir metot sunmaktadır.
Bu amaçla, insan ve farelerle ilgili ham mikroarray verileri GEO veri tabanından
indirilmiĢtir (Anonymous, 2013a; Anonymous, 2013b). Aday genlerin belirlenmesi için
adipoz doku hedef doku olarak belirlenmiĢtir. Daha sonra insan ve fare mikroarrayleri
adipoz doku baz alınarak karĢılaĢtırmalı olarak analiz edilmiĢtir. Analiz sonuçları
Chordin-like 1 (Chrdl1) geninin adipoz dokuyla ilgili aday bir gen olabileceğini
göstermektedir. Bu sonucun bilimsel olarak desteklenmesi için insan ve fare mikroarray
verilerinde Chrdl1 geni ile birlikte daha önce literatürde gösterilmiĢ adipoz spesifik
genlerden FABP4 ve ATGL genleri ile ilgili istatistik analizler yapılmıĢtır. Sonuçlar
Çizelge 4.1 ve 4.2’de gösterilmektedir.
34
Çizelge 4.1. Chrdl1, FABP4 ve ATGL genlerinin fare mikroarrayinde farklı dokulardaki gen ekspresyonu
GEN
ADĠPOZ
KAS
KALP
AKCĠĞER
KARACĠĞER
BÖBREK
DALAK
P DEĞERĠ
FABP4
2924.9a
±
443.944
198.6b
±
5.956
296.9b
±
34.924
86.1b
±
7.790
82.3b
±
0.988
118.0b
±
16.043
74.7b
±
5.626
P<0.0001
ATGL
4526.4a
±
388.379
785.7bc
±
82.611
1165.2b
±
78.833
453.9bc
±
36.512
327.2c
±
37.410
410.2c
±
34.468
195.8c
±
8.908
P<0.0001
CHRDL1
825.27a
±
129.857
99.81b
±
6.960
76.72b
±
2.002
110.23b
±
6.825
64.90b
±
1.262
97.79b
±
12.003
92.89b
±
3.453
P<0.0001
GSM252093
GSM252094
GSM252095
GSM252070
GSM252071
GSM252072
GSM252073
GSM252113
GSM252114
GSM252115
GSM252080
GSM252081
GSM252081
GSM252074
GSM252075
GSM252076
GSM252083
GSM252084
GSM252085
GSM252067
GSM252068
GSM252069
GSM NO
GSM NO: adipoz, kas, kalp, akciğer, karaciğer, böbrek ve dalak dokularının biyolojik tekerrürlerini göstermektedir. Biyolojik tekerrürler adipoz, kalp, akciğer, karaciğer,
böbrek ve dalak dokuları için (n=3) ve kas dokusu için (n=4) olarak gösterilmektedir. Sonuçlar ortalama ± standart hata olarak gösterilmektedir. Aynı satırda farklı harflerle
gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (P<0.05).
35
Çizelge 4.2. Chrdl1, FABP4 ve ATGL genlerinin insan mikroarrayinde farklı dokulardaki gen ekspresyonu
GEN
FABP4
ATGL
CHRDL1
ADĠPOZĠT
KAS
KALP
AKCĠĞER
KARACĠĞER
BÖBREK
13.364.400a
±
503.100
2.838.150a
±
111.150
1.702.350a
±
86.950
446.400bc
±
130.800
367.800c
±
92.800
303.450b
±
191.450
317.400bc
±
153.700
853.150b
±
260.250
130.900b
±
80.600
1.099.850b
±
275.350
274.250c
±
54.750
315.400b
±
41.500
123.700c
±
74.000
299.600c
±
105.500
58.550b
±
27.050
189.500bc
±
58.100
357.850c
±
76.950
240.550b
±
24.550
GSM18975
GSM19013
GSM18951
GSM18949
GSM18953
GSM18955
GSM18976
GSM19014
GSM18952
GSM18950
GSM18954
GSM18956
P DEĞERĠ
P<0.0001
P<0.0001
P<0.0001
GSM NO
GSM NO: adipozit, kas, kalp, akciğer, karaciğer, böbrek ve dokularının biyolojik tekerrürlerini göstermektedir. Biyolojik tekerrürler adipozit, kas, kalp, akciğer, karaciğer,
böbrek (n=2) olarak gösterilmektedir. Sonuçlar ortalama ± standart hata olarak gösterilmektedir. Aynı satırda farklı harflerle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar
önemlidir (P<0.05).
36
4.1. Bilimsel hipotezin kurulması
Çizelge 4.1 ve Çizelge 4.2’ in incelenmesinden de anlaĢılabileceği gibi Chrdl1
geni insanlarda adipozitlerde ve farelerde adipoz dokuda iyi bilinen adipoz spesifik
genlere (FABP4 ve ATGL) benzer Ģekilde diğer dokulara göre adipoz dokuda önemli
derecede yüksek ekspresyon göstermektedir (P<0.0001). Gerek mikroarray verilerinin
karĢılaĢtırmalı analizi gerekse yapılan istatistik analizler Chrdl1 geninin adipoz spesifik
bir gen olma olasılığını güçlendirmektedir. Chrdl1 geninin türler arasındaki benzerliği
(homolojisi) gen bankasında bulunan BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)
programıyla araĢtırılmıĢtır. Chrdl1 geninin sığırlardaki sekansı farklı canlı türleriyle
karĢılaĢtırılmıĢtır. KarĢılaĢtırma sonuçlarına göre sığır Chrdl1 geni insan, fare ve
ratlarda sırasıyla %87, %88 ve %87.5 benzerlik (homoloji) göstermektedir
(Anonymous, 2013c). Bu durumda Chrdl1 geninin farklı canlı türlerinde aynı özelliği
göstermesi söz konusu genin türler arasında korunmuĢ bir gen olduğuna iĢaret
etmektedir. Elde edilen sonuçlar gen bankasında bulunan adipoz dokuyla ilgili farklı
GEO profillerden elde edilen bilgilerle desteklenmiĢtir (Anonymous, 2013a;
Anonymous, 2013b).
ÇalıĢmada
yararlanılan
GEO profilller Çizelge 4.3’de
gösterilmektedir. Tüm sonuçlar ve literatür bildiriĢleri değerlendirildiğinde Chrdl1
geninin adipoz spesifik bir gen olduğuyla ilgili bilimsel bir hipotez kurulmuĢtur.
Kurulan hipotez, Dünya’da mikroarray sonuçlarının doğrulanmasında kullanılan en
güvenilir moleküler yöntemlerin baĢında gelen Real Time PCR ile test edilmiĢtir. Tez
çalıĢmasında kullanılan metot ġekil 4.1’de Ģematize edilmiĢtir.
37
İnsan
Mikroarray Verisi
Fare
Mikroarray Verisi
GEO veritabanından ham
mikroarray verilerinin indirilmesi
Aday genlerin mikroarray verilerinin
karşılaştırmalı analiziyle belirlenmesi
Aday genlerin seçim
aşaması
Hipotezin
kurulması
Hipotezin GEO profillleri ve
literatür ile desteklenmesi
Hipotezin laboratuvar
denemeleriyle test edilmesi
Sonuç
ġekil 4.1. Tez çalıĢmasında izlenilen metot
38
Çizelge 4.3. Adipoz dokuyla ilgili GEO profiller
GEO PROFĠL AÇIKLAMA
GDS2818
Adipocytes vs. preadipocytes from subcutaneous and visceral fat depots
(Mouse)
GDS2659
Analysis of differentiating 3T3-L1 preadipocytes (Mouse)
GDS734
Thiazolidinedione treatment of 3T3-L1 adipocytes (Mouse)
GDS3688
Obese children: omental adipose tissue (Homo sapiens)
GDS2366
Preadipocytes from anatomically separate fat depots (HG-U133A) (Homo
sapiens)
GDS1298
Fibroblast adipogenesis induced by EBF-1 and PPARgamma2
overexpression (Mouse)
GDS2813
Comparison of brown and white adipose tissues (Mouse)
GDS3102
Analysis of hearts and white adipose tissues of 28 month old male animals
fed a calorie restricted diet since 4 months of age (Rattus norvegicus)
GDS2319
Analysis of inguinal adipose tissue from genetically identical inbred
C57BL/6J males exhibiting high or low weight gain after 4 weeks on a high
saturated fat diet (Mouse)
4.2. Hipotezin Real Time PCR ile Test Edilmesi
Bu çalıĢmada kullanılan metot, gerçek laboratuvar deneyleri yapılmadan önce
doku spesifik aday genlerin belirlenmesine yönelik bilimsel hipotez kurulmasına olanak
sağlamaktadır. Metodun son aĢamasını kurulan bilimsel hipotezin gerçek laboratuvar
deneyleriyle test edilmesi oluĢturmaktadır. Bu amaçla kurulan bilimsel hipotez,
Dünya’da mikroarray sonuçlarının doğrulanmasında kullanılan güvenilir ve tekrar
edilebilirliği en yüksek moleküler yöntemlerin baĢında gelen Real Time PCR ile test
edilmiĢtir. Farklı sığır dokularında Chrdl1 geniyle ilgili Real Time PCR’da yapılan gen
ekspresyon denemeleri sonucunda oluĢturulan grafik ġekil 4.2’de gösterilmektedir.
39
ġekil 4.2. Chrdl1 geninin farklı sığır dokularındaki gen ekspresyonu
Total RNA sığır adipoz, kalp, böbrek, akciğer, karaciğer, kas ve dalak dokularından izole edilmiĢtir. Chrdl1 geninin farklı sığır dokularındaki gen ekspresyon değerleri Real
Time PCR’da ölçülmüĢtür (n=5). Grafikte görülen barlar ortalama ± standart hatayı temsil etmektedir. (*) iĢareti tek yönlü varyans analizini takiben yapılan Duncan önemlilik
testinin sonuçlarına göre Chrdl1 geninin adipoz dokudaki ekspresyonunun diğer dokulara göre istatistik olarak önemli olduğunu göstermektedir (P<0.05).
40
ġekil 4.2’de gösterildiği üzere Chrdl1 geni adipoz dokuda diğer dokulara göre
önemli derecede yüksek ekspresyon göstermektedir (P<0.05). Chrdl1 geni kalp, akciğer
ve kas dokularında diğer dokulara göre biraz daha fazla ekspresyon göstermektedir.
Bununla birlikte Chrdl1 geninin böbrek, karaciğer ve dalak dokularındaki ekspresyonu
yok denecek kadar azdır. Elde edilen Real Time PCR sonuçları çalıĢma bünyesinde
uygulanan metoda göre oluĢturulan bilimsel hipotezi desteklemektedir.
Daha önce yapılan bilimsel çalıĢmalar Chrdl1 geninin geniĢ bir yelpazede farklı
dokularda ekspresyon gösterdiğini ifade etmektedir (Coffnier ve ark., 2001; Nakayama
ve ark., 2001; Sakuta ve ark.,. 2001; Bowen ve ark., 2009; Zheng ve ark., 2010).
Literatür ve gen bankası tarandığında Chrdl1 geninin adipoz dokuda spesifik olduğuna
dair hiç bir bulguya ve yayına rastlanılmamıĢtır. Tümüyle değerlendirildiğinde bu
çalıĢma, Chrdl1 geninin adipoz dokuda spesifik bir gen olduğunu ortaya koyan ilk
çalıĢmadır.
Bu çalıĢmada uygulanan metodla, Chrdl1 geniyle birlikte adipoz dokuda spesifik
yeni bir gen seti tespit edilmiĢtir. Bu genler arasında FABP4 (Yağ Asidi Bağlayıcı
Protein 4) ve ATGL (Adipoz Trigliserit Lipaz) gibi oldukça iyi bilinen adipoz spesifik
genler bulunmaktadır. Yapılan analizlere gore FABP4 ve ATGL genleri farelerde
adipoz dokuda diğer dokulara göre oldukça yüksek gen ekspresyonu göstermektedir
(Çizelge 4.1) (P<0.0001). Benzer Ģekilde FABP4 ve ATGL genleri insanlarda
adipozitlerde diğer dokulara göre oldukça yüksek gen ekspresyonu göstermektedir
(Çizelge 4.2) (P<0.0001). Bu çalıĢmada kullanılan metodun daha iyi anlaĢılabilmesi için
FABP4 ve ATGL ve Chrdl1 geniyle ilgili yapılan çalıĢmalar örneklerle açıklanacaktır.
4.3. Yağ Asidi Bağlayıcı Protein 4 (FABP4)
Gen bankasında FABP4 geni ile ilgili arama yapıldığında söz konusu gen ile
ilgili GEO veritabanında 4.906 veri bulunduğu görülmektedir (Anonymous, 2013a;
Anonymous, 2013b). Bu çalıĢmada, kullanılan metodla adipoz spesifik genlerin
belirlenmesi amaçlandığı için aramanın daha da derinleĢtirilmesi gerekmektedir. Bu
amaçla adipoz dokuyla ilgili “adipozit” ve “adipoz doku” anahtar kelimeleri gen
bankasında bulunan GEO veritabanında taranmıĢtır. Taramalar sonucunda adipozit ve
adipoz doku ile igili sırasıyla 2.786 ve 14.206 mikroarray verisi olduğu tespit edilmiĢtir.
Mikroarray verileriyle bağlantılı GEO profillerinden elde edilen bilgiler bu çalıĢmada
kullanılan metodun uygulanmasında önemli aĢamalardan biridir. Bu nedenle üzerinde
41
durulan genlerle ve hedef dokuyla ilgili ipuçlarını verecek GEO profillerin belirlenmesi
büyük önem taĢımaktadır. Bu amaçla Çizelge 4.3’deki adipoz dokuyla ilgili bazı GEO
profiller FABP4 geninin adipoz spesifik bir gen olduğunu açıklamak için
kullanılacaktır. Buna ilaveten literatürden elde edilen bilgilerle kullanılan GEO profiller
desteklenecektir.
GDS2659, FABP4 gen ekspresyonunun adipozit hücrelerinin farklılaĢması
sırasında artıĢ gösterdiğini ifade etmektedir (Cheung ve ark., 2007). Li ve ark. (2009),
FABP4 geninin 3T3-L1 adipozit hücrelerinin farklılaĢması sırasında yüksek derecede
ekspresyon gösterdiğini bildirmiĢtir. Bu bulgu aynı zamanda farklı araĢtırmacıların
yaptıkları çalıĢmalarla teyit edilmektedir (Spiegelman ve Green 1983; Hunt ve ark.,
1986; Samulin ve ark., 2008).
GDS2818, FABP4 geninin adipozit hücrelerinde preadipozit hücrelerine
(adipozit öncesi) göre daha fazla ekspresyon gösterdiğini ifade etmektedir (Gesta ve
ark., 2006). GDS2818’i destekleyici Ģekilde Shin ve ark. (2008) ve Lee ve ark. (2009),
yaptıkları çalıĢmalarda FABP4 geninin adipozit hücrelerinde preadipozit hücrelerine
göre daha fazla ekspresyon gösterdiğini bildirmiĢlerdir.
GDS3688, obez çocuklarda FABP4 geninin yüksek ekspresyon gösterdiğini
ifade etmektedir (Aguilera ve ark., 2007). Ma ve ark. (2009), FABP4 ve PPAR-γ
genlerinin obezite gösteren gruplarda obeziteye karĢı direnç gösteren gruplara göre
yüksek derecede ekspresyon gösterdiğini bildirmiĢlerdir.
GDS734, adipoz dokuda görev yapan transkripsiyonel faktörlerden PPAR-γ’nın
FABP4 geninin adipozit hücrelerindeki ekspresyonunu tetiklediğini göstermektedir
(Hsiao ve ark., 2004). Shin ve ark. (2009), PPAR-γ’nın FABP4 geninin promotoruna
bağlanarak transkripsiyonunu tetiklediğini bildirmiĢtir. Petrovic ve ark. (2008), PPAR-γ
reseptörüne bağlanan rosiglitazon ile muamele edilen kültürlerde FABP4 geninin
muamale edilmeyen kontrol kültürlerine göre daha önce ortaya çıktığını göstermiĢtir.
Genel olarak GEO profiller FABP4 geninin adipoz spesifik bir marker olduğunu
göstermektedir.
42
4.4. Adipoz Trigliserit Lipaz (ATGL)
Günümüzde, ATGL geni ile ilgili GEO veritabanında 4.588 veri bulunduğu
görülmektedir (Anonymous, 2013a; Anonymous, 2013b). Bu veriler arasında ATGL
geninin adipoz dokuda spesifik bir gen olduğunu gösteren GEO profillere bakıldığında;
GDS2818, ATGL geninin adipozit hücrelerinde preadipozit hücrelerine göre daha fazla
ekspresyon gösterdiğini ifade etmektedir (Gesta ve ark., 2006). Bu bulgu daha önce
yapılmıĢ çalıĢmalarla doğrulanmaktadır. AraĢtırmacılar, ATGL geninin domuzlarda
adipozit hücrelerinde, hücre kültürünün preadipozitlerce zengin kısmı olan stroma
vaskular fraksiyona göre yüksek derecede ekspresyon gösterdiğini bildirmiĢlerdir.
Ayrıca araĢtırmacılar, ATGL geninin tavuklarda bölünmüĢ adipoz hücrelerinde stroma
vaskular fraksiyona kıyasla baskın bir Ģekilde yüksek ekspresyon gösterdiğini
bildirmiĢlerdir (Deiuliis ve ark., 2008; Oh ve ark., 2011; Serr ve ark., 2011).
GDS2366, ATGL gen ekspresyonunun adipoz hücrelerinin farklılaĢması
sırasında artıĢ göstermektedir (Tchkonia ve ark., 2007). Kim ve ark. (2006), ATGL gen
ekspresyonunun 3T3-L1 adipozit hücrelerinin farklılaĢması sırasında çarpıcı bir Ģekilde
artıĢ gösterdiğini bildirmektedir. Deiuliis ve ark. (2008), ATGL gen ekspresyonunun
domuz adipozit hücrelerinin farklılaĢması sırasında artıĢ gösterdiğini bildirmektedir.
GDS3688, obez çocukların düĢük ATGL gen ekspresyonuna sahip olduklarını
göstermektedir (Aguilera ve ark., 2007). Steinberg ve ark. (2007), obez örneklerin
ATGL mRNA ekspresyonunu önemli derecede azalttığını göstermektedir (P<0.05).
Jocken ve ark. (2007), insüline dirençli örneklerin ATGL mRNA ekspresyonunu
insüline duyarlı örneklere nazaran azalttığını bildirmektedir.
GDS1298, PPAR-γ (2)’nin fazla ekspresyon göstermesi durumunda NIH-3T3
embriyonik fibroblastların adipozitlere dönüĢmesi sırasında ATGL gen ekspresyonunu
aktive ettiğini göstermektedir (Akerblad ve ark., 2005). Kershaw ve ark. (2007),
yaptıkları araĢtırmalarda PPAR-γ’nın canlı ve laboratuvar ortamlarında ATGL mRNA
ekspresyonunu düzenlediğini bildirmiĢtir.
Sonuç olarak GEO profilleri, ATGL geninin adipoz spesifik olmasına ve ATGL
gen ekspresyonunun adipoz doku geliĢimi üzerine etkilerine dikkat çekmektedir.
43
4.4. Chordin-like 1 (Chrdl1)
GEO veri tabanına bakıldığında Chrdl1 ile ilgili 3.504 veri bulunduğu
görülmektedir
(Anonymous,
2013a;
Anonymous,
2013b).
Bu
veriler
değerlendirildiğinde Chrdl1 ve adipoz dokuyla ilgili sadece 31 GEO profil olduğu
görülmektedir. Bu GEO profillerden elde edilen bilgiler süzüldüğünde sayı daha da
azalmaktadır. Chrdl1 ve adipoz dokuyla ilgili GEO profiller değerlendirildiğinde;
GDS2813, Chrdl1 geninin beyaz adipoz dokuda kahverengi adipoz dokuya göre
ekspresyonunun daha fazla olduğunu göstermektedir (Seale ve ark., 2007).
GDS3102, diyetlerde kalorik kısıtlamanın Chrdl1 gen ekspresyonunu azalttığını
göstermektedir (Linford ve ark., 2007).
GDS2366, Chrdl1 gen ekspresyonunun bölünüp olgun adipozitlere dönüĢen
preadipozitlerde
bölünmeyen
preadipozitlere
göre
çok
daha
fazla
olduğunu
göstermektedir (Tchkonia ve ark., 2007).
GDS2319, yüksek ağırlık kazancı gösteren bireylerin düĢük ağırlık kazancı
gösteren bireylere göre yüksek Chrdl1 gen ekspresyonuna sahip olduklarını
göstermektedir (Koza ve ark., 2006).
Chrdl1 geni ile ilgili çalıĢmanın kaynak araĢtırması bölümünde belirtilen
literatürler ve GEO profiller değerlendirildiğinde Chrdl1 geni ve adipoz dokuyla ilgili
bazı ipuçlarına ulaĢılmaktadır. Bunun ötesinde daha öncede ifade edildiği gibi yapılan
istatistik analizler gerek insan gerekse fare mikroarray verilerinde Chrdl1 geninin
adipoz dokuda yüksek derecede ekspresyon gösterdiğini ortaya koymaktadır (P<0.001).
Chrdl1 geninin farklı dokularda ekspresyon gösterdiği bildirilmesine rağmen adipoz
dokudaki ekspresyonuyla ilgili herhangi bir bildiriĢ bulunmamaktadır. Bu çalıĢmada
kullanılan metot sayesinde Chrdl1 geninin adipoz dokuya spesifik bir gen olduğuyla
ilgili kurulan hipotez baĢarıyla test edilmiĢtir. Bunun ötesinde kullanılan metot
kapsamında yapılan karĢılaĢtırmalı mikroarray analizleri Chrdl1 geninin adipoz dokuda
Ģu ana kadar bildirilen bir çok adipoz spesifik genden (adipokin) daha fazla ekspresyon
gösterdiğini ortaya koymaktadır. Bu durumda Chrdl1 geninin, diğer adipoz spesifik
genler gibi adipoz dokuda önemli bir fonksiyon gösterme olasılığı oldukça yüksek
olmaktadır.
44
5. SONUÇLAR VE ÖNERĠLER
5.1. Sonuçlar
Bu çalıĢma, gen bankasında bulunan mikroarray verilerinin karĢılaĢtırmalı olarak
detaylı analizi yapılmak suretiyle doku spesifik aday genlerin ortaya çıkarılmasına
olanak sağlayan yeni bir metot sunmaktadır. Bu metot laboratuvar deneyleriyle baĢarılı
bir Ģekilde test edilerek uygulanabilirliği ispat edilmiĢtir. Bu metotun kullanılması
sayesinde literatüre katkı sağlıyacak yeni bir dizi adipoz spesifik aday gen
belirlenmiĢtir. Adipoz dokunun sahip olduğu biyolojik önem dikate alındığında
araĢtırma sonuçlarının önemli hedeflere ulaĢması beklenmektedir.
Bilim adamları gerek hayvanlarda gerekse insanlarda yaptıkları çalıĢmalarla
adipoz dokunun vücutta nasıl fonksiyon gösterdiğini ve burada ne tür moleküler
mekanizmaların devreye girdiğini ortaya çıkarmayı hedeflemektedir. Bu nedenle bu
çalıĢmada belirlenen adipoz spesifik gen ve diğer aday genlerle ilgili ileride yapılacak
olan çalıĢmalar adipoz doku geliĢiminin moleküler mekanizmasının aydınlatılmasında,
dolayısıyla adipoz dokunun vücutta gösterdiği fonksiyonların daha iyi anlaĢılması
bakımından büyük önem taĢımaktadır.
Son yıllarda yapılan çalıĢmalar neticesinde, adipoz dokuda meydana gelen
anormalliklerin insanlarda obezite, tip 2 diyabet, kalp hastalıkları ve bazı kanser
türleriyle iliĢkisi olduğu düĢünüldüğünde bu çalıĢmada tespit edilen adipoz spesifik gen
ve diğer aday genlerle ilgili ileride yapılacak olan çalıĢmaların söz konusu hastalıkların
tedavisine yardımcı olarak insan sağlığına önemli katkılar sağlaması kuvvetle
muhtemeldir.
Çiftlik hayvanlarında aĢırı yağlanma gerek önemli sağlık problemlerine gerekse
ekonomik bakımdan önemli kayıplara neden olmaktadır. Bu çalıĢmayı izleyen
araĢtırmalarda tespit edilen genlerin markere dayalı seleksiyon kriteri olarak kullanılıp
kullanılamayacağı ile ilgili yapılacak olan denemelerin olumlu sonuç vermesi
durumunda çiftlik hayvanlarında üretim kalitesinin arttırılması ve daha sağlıklı ve
ekonomik
üretim
yapılması
konularında
ciddi
mesafeler
kaydedilebileceği
düĢünülmektedir.
Bu çalıĢma, doku spesifik aday genlerin belirli bir strateji takip edilerek
belirlenmesine yönelik yeni bir metot sunmaktadır. Bu metotun sunduğu bazı önemli
avantajlar bulunmaktadır. Ġlk olarak bu metot gerçek laboratuvar deneyleri
45
yapılmaksızın aday genlerin tespitine olanak sağlamaktadır. Bu durum ciddi bir zaman
kaybını önlemektedir. Öne çıkan diğer bir avantaj ise bu metodun kullanılması
durumunda gereksiz yere yapılan araĢtırma harcamalarının önüne geçilmesidir. Öyleki
bilim adamlarının bu metodu izlemesi durumunda halihazırda gen bankasında daha
önce hazırlanmıĢ mikroarray verilerini kullanmaları sağlanarak bu çalıĢmaları gereksiz
yere tekrar edip para ve zaman kaybına uğramalarının önüne geçilebilecektir. Bu
çalıĢmanın sunduğu bir önemli avantaj ise gen bankasının etkili olarak kullanımı,
verilerin süzülmesi ve analizi ve sonuçların değerlendirilmesi konularında sağladığı
öğretici bilgilerdir.
Bu çalıĢmada, adipoz doku insanlar ve hayvanlar için sahip olduğu biyolojik
önemden dolayı hedef doku olarak metodun uygulanmasında kullanılmıĢtır. Bununla
birlikte bilim adamlarının aynı metodu farklı dokularda denemesi durumunda söz
konusu dokulara spesifik yeni genleri tespit edebilmesi kuvvetle muhtemeldir. Bu
metodun farklı dokularda denenmesi durumunda elde edilecek sonuçların literatüre
önemli katkılar sağlaması beklenmektedir.
5.2. Öneriler
Dünyada adipoz dokuyla ilgili yapılan bilimsel çalıĢmalara bakıldığında,
araĢtırmaların insan ve hayvanlarda sağlık, çiftlik hayvanlarında önemli verim
özelliklerinin geliĢtirilmesi ve bu özelliklerin moleküler mekanizmalarının ortaya
çıkarılmasına yönelik markere dayalı seleksiyon yöntemlerinin kullanılması konularında
yoğunlaĢtığı görülmektedir. Tez çalıĢması süresince yapılan araĢtırmalar, adipoz
dokuyla
ilgili
yapılan
bilimsel
çalıĢmaların
kapsamı
ve
ülke
koĢulları
değerlendirildiğinde öneriler kısmının, ulusal karkas derecelendirme sisteminin
kurulması, markere dayalı seleksiyon yöntemlerinin kullanılması ve sağlıklı beslenme
konusunda toplumsal bilincin arttırılması olarak 3 ana baĢlık altında toplanmasında
fayda görülmektedir.
5.2.1. Ulusal karkas derecelendirme sisteminin kurulması
Dünyada karkas özelliklerinin sınıflandırılması ve bu sınıflandırmaya göre
fiyatlandırılmasına yönelik ülkelerin uyguladıkları karkas derecelendirme sistemleri
incelendiğinde, uygulamada az da olsa farklılıklar olmasına rağmen karkas
46
derecelendirme sistemlerinin et verim derecesi (yield grade) ve kalite derecesi (quality
grade) olmak üzere iki önemli unsurdan oluĢtuğu görülmektedir. Et verim derecesi
karkastaki yağlanmaya bağlı olarak belirlenirken, kalite verim derecesi de ette görülen
mozaikleĢmeye bağlı olarak, etin gevreklik, sululuk ve tad özelliklerine göre
belirlenmektedir. Et verim derecesi ve kalite derecesinin birlikte değerlendirilmesi
sonucunda oluĢturulan skalaya göre ette fiyatlandırma yapılıp pazara sunulmaktadır
(ZoBell ve ark., 2005).
BaĢta ABD ve Avrupa Birliği ülkelerinde karkas derecelendirme sisteminin
kurulumu, yönetimi ve denetimini tarım bakanlığı üstlenmektedir. Türkiye de malesef
sığır karkaslarının sınıflandırılıp fiyatlandırılmasına yönelik bir karkas derecelendirme
sistemi bulunmamaktadır. Bu konuyla ilgili günümüze kadar yapılmıĢ çalıĢmalara
bakıldığında, Türk Standart Enstitüsünün 15.03.1988 tarihinde yürürlüğe giren TSE 383
nolu kasaplık sığır baĢlıklı standardı tamamen subjektif kriterlere göre yapılan bir
derecelendirme olarak ortaya konulmuĢtur. Öyleki söz konusu standarda göre karkastaki
etlilikle ilgili hususlar karkasın uzunluk ve derinliğine, butların yuvarlak, uzun ve
dolgun oluĢuna, omuzların kalın ve belirgin oluĢuna ve boyun ve bacakların kısalık ve
dolgunluğuna göre tam etli, etli ve az etli olarak üç grupta toplanmaktadır. Karkasta
yağlılık ise kabuk yağının yayılıĢ alanı, kalınlığı ve rengi, iç yağların yani göğüs, karın
ve leğen yağlarının kalınlığı ve salkım görüntüsü dikkate alınarak tam yağlı, yağlı ve az
yağlı olmak üzere üç grupta toplanmakta olup ancak gruplara yönelik herhangi bir
fiyatlandırma yapılmamıĢtır. (Anonim, 2011b) TSE 383 nolu standardın yürürlükten
kalkmasından 2007 yılına kadar Türk Standart Enstitüsünün "Sığır Gövde Etleri
(Karkas) Standardı (TS 668)” uygulanmıĢ söz konusu standartta 21.06.2007 yılında
yürürlükten kaldırılmıĢtır. Tarım ve KöyiĢleri Bakanlığınca yayınlanan "Kasaplık
Gövde Etlerinde Standart Uygulaması; Sığır Gövde Etleri (Karkas) Standardını (TS
668)” yeniden düzenleyerek 01.01.2010 tarihinden itibaren yapılan kesimlerde böbrek
yağları, pelvis boĢluğu yağları, salkım ve fıtık yağlarının sıcak tartıdan önce karkastan
uzaklaĢtırmasını öngörmektedir (Anonim, 2010b, Anonim, 2011c).
Karkas derecelendirme sisteminin getirdiği en büyük avantaj tüketiciyi aldığı
ürünle ilgili bilgilendirerek kalitesiz ürüne fazla ücret ödemesini önlemesidir. Türkiye
de bu Ģekilde bir uygulamanın olmamasından dolayı tüketici kaliteli ve kalitesiz ürüne
eĢit ücret ödemektedir. Örneğin 1.5 yaĢlı tosundan elde edilen biftek veya bonfile birim
fiyatı ile 4.5 yaĢlı boğadan veya sığırdan elde edilen aynıdır. Ücretlendirme herhangi bir
sınıflandırma olmaksızın biftek veya bonfile diye yapılmaktadır. Karkas derecelendirme
47
sisteminin getirdiği bir diğer önemli avantaj üreticiyi kaliteli üretim yapmaya teĢvik
etmesidir. Öyleki daha kaliteli üretim yapmak için çaba gösteren üretici karkas
derecelendirme sistemi sayesinde ürününün pazarda daha yüksek fiyata alıcı bulmasıyla
emeğinin karĢılığını almaktadır. Üreticiler söz konusu fiyat avantajından yararlanmak
amacıyla üretimlerinde geleneksel üretimi bir yana bırakıp profesyonel ekiplerin
nezaretinde daha modern ve bilimsel üretim yapma gayreti göstermektedir.
Karkas derecelendirme sisteminde fiyatlandırma karkasın yağlılık durumuna
göre değiĢmekte olup karkasta yağlanma arttıkça ters orantılı olarak karkasın
fiyatlandırma değeri düĢmektedir. Bu durum tüm dikkatleri yağ dokunun üzerine
çekerek bilimsel bir farkındalık oluĢturmaktadır. Öyleki karkastaki kabuk yağı, böbrek
üstü salkım yağları ve iç organlar etrafındaki ekonomik değeri olmayan yağ miktarı
azaltılırken karkasta ekonomik değeri olan mozaikleĢmeyi arttırıcı kas içi yağlar nasıl
arttırılabilir sorusu bilim adamlarının ısrarla üzerinde durduğu bir konu haline gelmiĢtir.
Genotip ve beslenme karkasta yağlanmayı arttıran iki önemli faktördür. Besi döneminde
aynı yaĢta, aynı ırkta ve aynı canlı ağırlıktaki hayvanların besi performansı farklı
olmaktadır. Aynı özelliklere sahip hayvanların aynı rasyonlarla beslenmesi durumunda
bazı hayvanlarda karkasta aĢırı yağlanma görülürken bazılarının vücut kondüsyonu
ideal seviyelerde olmaktadır. Burada öne çıkan özellik genotip olmaktadır. Yağ
dokunun oluĢmasının genetik mekanizmasının ortaya çıkarılması için bilim adamları
yağ
dokunun
geliĢmesini
etkileyen
genleri
araĢtırmaktadır.
Ulusal
karkas
derecelendirme sisteminin oluĢturulmasının yağ dokunun öneminin anlaĢılması adına
gerek üretici ve tüketici, gerekse bilimsel camiada bir farkındalık oluĢturması
beklenmektedir.
Tümüyle
değerlendirildiğinde,
Gıda,
Tarım
ve
Hayvancılık
Bakanlığı’nın Türkiye’deki üretici ve tüketici taleplerini göz önünde bulundurarak
ulusal karkas derecelendirme sisteminin oluĢturulmasına yönelik çalıĢmalara vakit
kaybetmeden baĢlaması ülke menfaatleri açısından önem taĢımaktadır.
5.2.2. Markere dayalı seleksiyon yönteminin kullanılması
Son yıllarda çiftlik hayvanlarında önemli verim özelliklerinin iyileĢtirilmesine
yönelik
markere
dayalı
seleksiyon
yöntemlerinin
kullanılması
giderek
yaygınlaĢmaktadır. Markere dayalı seleksiyon yönteminin kullanılması seleksiyonda
isabet derecesini arttırarak generasyonlar arası süreyi kısaltmaktadır. Bu yöntemde
baĢarı, üzerinde durulan özellikle ilgili doğru markerlerin tespit edilmesine bağlıdır.
48
Yağ dokunun geliĢmesi üzerinde etkili markerlerin belirlenmesi bu dokuyla ilgili
moleküler gizemin çözülmesine katkıda bulunacaktır. Yağ doku ile kas doku arasında
geliĢimsel olarak bir ters orantı bulunmaktadır. Daha açık bir ifadeyle karkasta yağlılık
arttıkça kaslılık o derecede azalmaktadır. Daha öncede ifade edildiği üzere kırmızı ette
kas içi yada kas arasında görülen yağlanma karkasın ekonomik değerini arttırırken
kabuk yağı, böbrek ve iç organların etrafındaki yağlar karkasın ekonomik değerini
düĢürmekle kalmayıp kesim sonrasında karkastan ayrılıp atılmalarından dolayı karkas
randımanını düĢürmektedir. Bu durumda karkasta yağlanmanın istenilen bölgelerde
arttırılması ekonomik açıdan önem taĢımaktadır.
Karkasta mozaikleĢmeyi arttırıcı genetik markerlerin belirlenmesine yönelik
çalıĢmalar artarak devam etmektedir. Bu çalıĢmaların önemli bir çoğunluğu FABP4
geninin çiftlik hayvanlarında mozaikleĢme özelliğiyle ilgili genetik bir marker olarak
kullanılabileceğine iĢaret etmektedir. Bununla birlikte bugüne kadar yağ dokunun
genetik yapısı üzerine FABP4 geni gibi majör etkili yaklaĢık olarak sadece 20 gen tespit
edilebilmiĢtir. Yağ doku ile ilgili yapılan araĢtırmalarda markere dayalı seleksiyon
yöntemlerinin kapsamının geniĢ tutulması, çok daha fazla markerin tespit edilmesine
dolayısıyla yağ dokunun genetik yapısıyla ilgili daha fazla bilgiye ulaĢılmasını
sağlayacaktır.
5.2.3. Sağlıklı beslenme konusunda toplumsal bilincin arttırılması
Son yıllarda kırmızı et tüketiminin insan sağlığı üzerinde olumsuz etkileri
olduğu yönünde çıkan medya haberleri ve bilimsel çevrelerden yapılan bazı açıklamalar
toplumda kırmızı et tüketimine karĢı ciddi bir ön yargı oluĢturmuĢtur.
Kırmızı et tüketimiyle ilgili bu ön yargıyı kaldırmak için tüketicilerin kırmızı et
tüketimiyle ilgili doğru bilgilendirilmesi gerekmektedir. Kırmızı et vücudun ihtiyacı
olan esansiyel amino asitler, demir, çinko, B12 vitamini ve vücutta kolayca emilimi
sağlanan fosfor ve kalsiyumca zengin bir hayvansal besindir (Anonim, 2012b)‎.
Esansiyel amino asitler vücüt tarafından sentezlenemeyen ve mutlaka dıĢardan diyetle
alınması gereken amino asitler olarak tanımlanmaktadır (Türkmen, 2003). Esansiyel
amino asitler arasında arginin, histidin, izolösin, lösin, lizin, metiyonin, fenilalanin,
treonin, triptofan ve valin amino asitleri bulunmaktadır. Hayvansal protein kaynağı
olarak kırmızı et bütün bu esansiyel amino asitleri içermektedir (Anonim, 2013d).
49
YetiĢkin bir insanın ihtiyacı olan esansiyel amino asit miktarları Çizelge 5.1’de
gösterilmektedir (Kaya, 1996).
Çizelge 5.1. YetiĢkin bir insanın ihtiyacı olan esansiyel amino asit miktarları (Kaya, 1996)
Esansiyel amino
asidi
Lysine
Tryptophan
Phenylalanine
Threonine
Valine
Methionine
Leucine
Isolecine
Miktar
(g/gün)
0.8
1.4
1.1
0.5
0.8
1.1
1.1
0.7
Normal koĢullarda sağlıklı beslenen bir insanın her 1 kg canlı ağırlığına karĢılık
1g protein tüketmesi gerektiği ifade edilmektedir. Tüketilmesi gereken 1g protein’in %
42-50’lik kısmının hayvansal proteinden karĢılanması önem arz etmektedir. Kırmızı etin
esansiyel aminoasit içeriği ve yetiĢkin bir insanın günlük ihtiyaçları göz önünde
bulundurulduğunda günlük 150 g kırmızı et tüketimiyle günlük hayvansal protein
ihtiyacının karĢılanabileceği bildirilmektedir (Kaya, 1996).
Ne yazıkki kırmızı et son yıllarda biyolojik öneminden daha çok kolesterol, kalp
hastalıkları, obezite, hipertansiyon gibi rahatsızlıklara neden olduğu ile ilgili yapılan
haberlerle gündemde bulunmaktadır. Bu durum tüm dünya genelinde kırmızı et
tüketiminde azalmalara yol açmaktadır. Burada dikkat çekilmesi gereken esas nokta
dengeli beslenme olmalıdır. Vücut homeostazisinin korunması için bitkisel ve
hayvansal proteinlerin yeterli miktarda alınması gerekmektedir. Tek yönlü beslenmenin
önemli sağlık problemlerini getireceği göz ardı edilmemelidir. Öyleki çocuklarda
sadece tahıla dayalı beslenmenin kwashiorkor olarak bilinen bir protein eksikliğine
bağlı büyüme gecikmesi, apati, ödem, saç ağarması ve dökülmesi gibi sağlık sorunlarına
neden olduğu belirtilmektedir (Anonim, 2013d).
Üzerinde durulması gereken bir diğer konu ise kolesterol, kalp hastalıkları,
obezite, hipertansiyon gibi rahatsızlıklara neden olan etmenlerdir. Söz konusu
hastalıkların ortaya çıkmasında genetik yapı, dengesiz beslenme ve hareketsiz yaĢam
gibi etkili bir çok faktör bulunmaktadır. Kırmızı et tüketimiyle ilgili esas öne
çıkarılması gereken konu aĢırı yağlı kırmızı et tüketiminin sınırlandırılmasıdır. Az önce
ifade edilen kolesterol, kalp hastalıkları, obezite, hipertansiyon gibi rahatsızlıkların
50
oluĢumunda diğer faktörlerle birlikte yağ dokunun önemli etkisi vardır. Sonuç itibariyle
aĢırı yağlı kırmızı et tüketiminin söz konusu rahatsızlıklara neden olan faktörlerden biri
olduğu; bununla birlikte kırmızı etin diyette yeterli alınması durumunda herhangi bir
sağlık problemine neden olmadığı aksine vücut ihtiyaçlarının karĢılanması açısından
önem taĢıdığıyla ilgili toplumsal bilincin arttırılmasında fayda görülmektedir.
51
KAYNAKLAR
Anonim, 2010a, Üniversitemizde sıvı azot üretimi baĢladı, http://www.bolununsesi.com
[Ziyaret Tarihi: 30 Haziran 2010].
Anonim,
2010b,
Kasaplık
Gövde
Etlerinde
Standart
Uygulaması,
http://www.stb.org.tr/Duyuru-Detay/?id=73 [Ziyaret Tarihi: 04 Nisan 2012].
Anonim, 2011a, Porselen Havan, http://www.deneycell.com [Ziyaret Tarihi: 20 Nisan
2011].
Anonim, 2011b, TS 383 kasaplık sığır, https://intweb.tse.org.tr [Ziyaret Tarihi: 15 Nisan
2011].
Anonim, 2011c, TS 668 Kasaplık sığır gövde etleri (karkas), https://intweb.tse.org.tr
[Ziyaret Tarihi: 15 Nisan 2011].
Anonim, 2012a, ĠletiĢim, http://www.yilet.com/index-19.htm [Ziyaret Tarihi: 04 Nisan
2012].
Anonim,
2012b,
Kalp
Hastalarına
kurbanda
'kırmızı
et
uyarısı,
http://www.memurlar.net/haber/299161/ [Ziyaret Tarihi: 07 Nisan 2012].
Anonim, 2013a, Karkas Randımanını Etkileyen Faktörler,Yenilebilir Et Miktarını
Etkileyen Faktörler, http://zooteknik.blogspot.com/2013/05/karkas-randmannetkileyen.html [Ziyaret Tarihi: 01 ġubat 2013].
Anonim,
2013b,
Lipoatrofi
(lipodistrofi)
Nedir,
http://www.birdunyabilgi.org/lipoatrofi-lipodistrofi-nedir
[Ziyaret Tarihi: 10
Nisan 2013].
Anonim, 2013c, Yağ dokusu, http://tre.docdat.com/docs/5168/index-10535.html
[Ziyaret Tarihi: 10 Nisan 2013].
Anonim, 2013d, Proteinler, http://www.msxlabs.org/forum/saglikli-yasam/145726proteinler-ve-beslenmedeki-onemi.html [Ziyaret Tarihi: 10 Nisan 2013].
Anonymous, 2010, Adipogenesis, http://en.wikipedia.org/wiki/Adipogenesis [Ziyaret
Tarihi: 07 Temmuz 2010].
Anonymous, 2011a, Fatmouse, http://en.wikipedia.org/wiki/File:Fatmouse.jpg [Ziyaret
Tarihi: 10 ġubat 2011].
Anonymous, 2011b, ND-1000 Spectrophotometer T009‐Technıcal Bulletin,
https://bioscibatzerlab.biology.lsu.edu/Genomics/documentation/3130_NanoDrop
_tips.pdf [Ziyaret Tarihi: 29 Mart 2011].
Anonymous,
2012a,
Angus
cattle,
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Angus_cattle.jpg [Ziyaret Tarihi: 02
Mart 2012].
52
Anonymous,
2012b,
Tm
Calculator,
http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/ [Ziyaret Tarihi: 27
Nisan 2012].
Anonymous,
2012c,
Vector
NTI®
Software,
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and
Services/Applications/Cloning/vector-nti-software.html [Ziyaret Tarihi: 27 Nisan
2012].
Anonymous, 2013a, GEO profiles, www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/ [Ziyaret Tarihi:
12 Mayıs 2013].
Anonymous, 2013b, GEO DataSets, www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/ [Ziyaret
Tarihi: 12 Mayıs 2013].
Anonymous, 2013c, National Center for Biotechnology Information Database,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov [Ziyaret Tarihi: 3 Mart 2013].
Anonymous, 2013d, The GLM Procedure, http://support.sas.com [Ziyaret Tarihi: 15
Nisan 2013].
Aguilera, C. M, Tofe, I., Suarez, A., Gomez Llorente, C., Cañete, R. Gil, A., 2007,
Differential gene expression in omental adipose tissue from obese children,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE9624 [Ziyaret Tarihi: 05
Haziran 2011].
Akerblad, P., Mansson, R., Lagergren, A., Westerlund, S., Basta, B., Lind, U., Thelin,
A., Gisler, R., Liberg, D., Nelander, S., Bamberg, K. Sigvardsson, M., 2005, Gene
expression analysis suggests that EBF-1 and PPARgamma2 induce adipogenesis
of NIH-3T3 cells with similar efficiency and kinetics, Physiological Genomics,
23(2), 206-16.
Avram, A. S., Avram, M. M. and James, W. D., 2005, Journal of the American
Academy of Dermatology, 671-683.
Bai, L, Pang, W. J, Yang, Y. J. and Yang, G. S., 2008, Modulation of Sirt1 by
resveratrol and nicotinamide alters proliferation and differentiation of pig
preadipocytes, Molecular and Cellular Biochemistry, 307(1-2), 129-40.
Bjorbaek, C. and Kahn, B. B., 2004, Leptin signaling in the central nervous system and
the periphery, Recent Progress in Hormone Research, 59, 305-31.
Bowen, N. J., Walker, L. D., Matyunina, L. V., Logani, S., Totten, K. A., Benigno, B.
B. McDonald, J. F., 2009, Gene expression profiling supports the hypothesis that
human ovarian surface epithelia are multipotent and capable of serving as ovarian
cancer initiating cells, BMC Medical Genomics, 29, 2, 71.
53
Buchanan, F.C., Van Kessel A. G., Waldner C., Christensen, D. A., Laarveld, B.
Schmutz, S. M., 2003, Hot topic: an association between a leptin single nucleotide
polymorphism and milk and protein yield, Journal of Dairy Science, 86(10),
3164-6.
Castracane, V. D. and Henson, M. C., 2007, The Obese (ob/ob) Mouse and the
Discovery of Leptin, Endocrine Updates, 25, 1-9.
Chan, K.W., Lim, P. L., Tam, F. C. H., Li, E.T.S. Lim, B. L., 2000, Isolation of leptinbinding peptides from a random peptide phage library, Journal of Peptide
Research, 55, 318-324.
Chebel, R. C., Susca, F. Santos J. E., 2008, Leptin genotype is associated with lactation
performance and health of Holstein cows, Journal of Dairy Science, 91(7), 2893900.
Cheung, K. J, Tzameli, I., Pissios, P., Rovira, I., Gavrilova, O., Ohtsubo, T., Chen, Z.,
Finkel, T., Flier, J. S. Friedman, J. M., 2007, Xanthine oxidoreductase is a
regulator of adipogenesis and PPARgamma activity, Cell Metab, 5(2), 115-28.
Cho, S., Park, T. S., Yoon, D. H., Cheong, H. S., Namgoong, S., Park, B. L., Lee, H.
W., Han, C. S., Kim, E. M., Cheong, I. C,, Kim, H. Shin, H. D., 2008,
Identification of genetic polymorphisms in FABP3 and FABP4 and putative
association with back fat thickness in Korean native cattle, BMB reports Online,
41(1), 29-34.
Cinti, S., 2005, The adipose organ, Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty
Acids, 73, 9-15.
Clark, D. L., 2008, Transcription Profiles of Differentially Marbled Beef Cattle.
Graduate College of the University of Illinois at Urbana Champaign, Master
Thesis.
Clempson, A. M., Pollott, G. E., Brickell, J. S., Bourne, N. E, Munce, N. Wathes D. C.,
2011, Evidence that leptin genotype is associated with fertility, growth, and milk
production in Holstein cows, Journal of Dairy Science, 94(7), 3618-28.
Coffinier, C., Tran, U., Larrain, J. De Robertis, E. M., 2001, Neuralin-1 is a novel
Chordin-related molecule expressed in the mouse neural plate, Mechanisms of
Development, 100(1), 119-22.
Cornelius, P., MacDougald, O. A. and Lane, M. D., 1994, Regulation of adipocyte
development, Annual Review of Nutrition, 14: 99-129.
Cui, H., Meng, Q., Qu, Y., Liu, H., Feng, C., Wang, H., Liu, Y., Zan, L. Li, N. 2011,
Two novel missense mutations in bovine ATGL gene and their association with
economic traits in Qinchuan cattle, African Journal of Biotechnology, 10, 23532359.
54
Da Silva, R. C., Ferraz, J. B., Meirelles, F. V., Eler, J. P., Balieiro, J. C., Cucco, D. C.,
Mattos, E. C., Rezende, F. M. Silva, S. L., 2012, Association of single nucleotide
polymorphisms in the bovine leptin and leptin receptor genes with growth and
ultrasound carcass traits in Nellore cattle, Genetics and Molecular Research,
11(4), 3721-8.
Dai, L. H., Xiong, Y. Z., Jiang, S. W. Chen, J. F. 2011, Molecular characterization and
association analysis of porcine adipose triglyceride lipase (PNPLA2) gene,
Molecular Biology Reports, 38, 921-927.
Deiuliis, J. A., Shin, J., Bae, D., Azain, M. J., Barb, R. Lee, K., 2008, Developmental,
hormonal, and nutritional regulation of porcine adipose triglyceride lipase
(ATGL), Lipids, 43, 215-25.
DeVuyst, E. A., Bauer, M. L., Cheng, F. C., Mitchell, J. Larson, D., 2008, The impact
of a leptin gene SNP on beef calf weaning weights, Animal Genetics, 39(3), 2846.
Falcão Pires, I., Castro Chaves, P., Miranda Silva, D., Lourenço, A. P. Leite Moreira, A.
F., 2012, Physiological, pathological and potential therapeutic roles of adipokines,
Drug Discovery Today, 17(15-16), 880-9.
Fernyhough, M. E., E. Okine, G. Hausman, J. L. and Vierck, M. V. Dodson., 2007,
Invited review: PPAR-gamma and GLUT-4 expression as differentiation markers
for preadipocyte conversion to become an adipocyte, Domestic Animal
Endocrinology, 33, 367-378.
Flier, J. S., 1998, What’s in a Name? In Search of Leptin’s Physiologic Role, Journal of
Clinical Endocrinology and Metabolism, 83(5), 1407-1412.
Friedman, J. M. and Halaas, J. L., 1998, Leptin and the regulation of body weight in
mammals, Nature, 395, 764-770.
Furuhashi, M. and Hotamisligil, G. S., 2008, Fatty acid-binding proteins: role in
metabolic diseases and potential as drug targets, Nature Rev. Drug Discov, 7, 489503.
Galic, S., Oakhill, J. L. and Steinberg, G. R., 2010, Adipose tissue as an endocrine
organ, Molecular and Cellular Endocrinology, 316, 129-139.
Gerbens, F., Jansen, A., Van Erp, A. J. M., Harders, F., Meuwissen, T. H. E.,
Rettenberger, G., Veerkamp, J. H. and Te Pas, M. F.W., 1998, The adipocyte fatty
acid-binding protein locus: characterization and association with intramuscular fat
content in pigs, Mammalian Genome, 9, 1022-1026.
Gesta, S., Blüher, M., Yamamoto, Y., Norris, A. W., Berndt, J., Kralisch, S., Boucher,
J., Lewis, C. Kahn, C. R., 2006, Evidence for a role of developmental genes in the
origin of obesity and body fat distribution, Proceedings of the National Academy
of Sciences, 103(17), 6676-81.
55
Grundy, S. M., Brewer, H. B., Cleeman, J. J. I., Smith, S. C. and Lenfant, C., 2004,
Definition of Metabolic Syndrome, Arteriosclerosis Thrombosist Vascular
Biology, 24, e13-e18.
Haunerland, N. H. and Spener, F., 2004, Fatty acid-binding proteins insights from
genetic manipulations, Progress in Lipid Research, 43, 328-349.
Hoashi, S., Hinenoya. T., Tanaka, A., Ohsaki, H., Sasazaki, H., Taniguchi, M., Oyama,
K., Mukai, M. and Mannen. H., 2008, Association between fatty acid
compositions and genotypes of FABP4 and LXR-alpha in Japanese Black cattle,
BMC Genetics, 9, 84.
Holm, C., 2003, Molecular mechanisms regulating hormone-sensitive lipase and
lipolysis, Biochemical Society Transactions, 31, 6.
Hou, X, M., Li, Q, Z. and Huang, T, Y., 2010, Microarray analysis of gene expression
profiles in the bovine mammary gland during lactation, Science China Life
Sciences, 53(2), 248-256.
Hsiao, A., Worrall, D. S., Olefsky, J. M. Subramaniam, S., 2004, Variance-modeled
posterior inference of microarray data: detecting gene-expression changes in 3T3L1 adipocytes, Bioinformatics, 20(17), 3108-27.
Hunt, C. R., Ro, J. H., Dobson, D. E., Min, H. Y. Spiegelman, B. M., 1986, Adipocyte
P2 gene: developmental expression and homology of 5'-flanking sequences
among fat cell-specific genes, Proceedings of the National Academy of Sciences,
83(11), 3786-90.
Ingalls, A, M., Dıckie M. M. and Snell G. D., 1950, Obese, a new mutation in the house
mouse, Journal of Heredity, 41(12), 317-8.
Jocken, J. W., Langin, D., Smit, E., Saris, W. H., Valle, C., Hul, G. B., Holm, C., Arner,
P. Blaak, E. E., 2007, Adipose triglyceride lipase and hormone-sensitive lipase
protein expression is decreased in the obese insulin-resistant state, The Journal of
Clinical Endocrinology & Metabolism, 92(6), 2292-9.
Kane ,R., Godson, C. O'Brien, C., 2008, Chordin-like 1, a bone morphogenetic protein4 antagonist, is upregulated by hypoxia in human retinal pericytes and plays a role
in regulating angiogenesis, Molecular Vision, 14, 1138-48.
Kaya, A., 1996, Kırmızı et, Ege üniversitesi tarımsal uygulama ve araĢtırma merkezi,
Teknik Bülten, 28.
Kershaw, E. E. and Flier, J. S., 2004, Adipose Tissue as an Endocrine Organ, Journal of
Clinical Endocrinology and Metabolism, 89(6), 2548–2556.
Kershaw, E. E., Schupp, M., Guan, H. P., Gardner, N. P., Lazar, M. A. Flier, J. S., 2007,
PPARgamma regulates adipose triglyceride lipase in adipocytes in vitro and in
vivo, Endocrinology and Metabolism, American Journal of Physiology, 293(6),
E1736-45.
56
Kim, H. B., Kong, M., Kim, T. M., Suh, Y. H., Kim, W. H., Lim, J. H., Song, J. H., and
Jung, M. H., 2006, NFATc4 and ATF3 negatively regulate adiponectin gene
expression in 3T3-L1 adipocytes, Diabetes, 55:1342-52.
Komisarek, J. and Antkowiak, I., 2007, The relationship between leptin gene
polymorphisms and reproductive traits in Jersey cows, Polish Journal of
Veterinary Sciences, 10(4),193-7.
Kosteli, A., Sugaru, E., Haemmerle, G., Martin, J. F., Lei, J., Zechner, R., Jr, A. W. F.,
2010, Weight loss and lipolysis promote a dynamic immune response in murine
adipose tissue, The Journal of Clinical Investigation, 120(10):3466-3479.
Koza, R. A., Nikonova, L., Hogan, J., Rim, J. S., Mendoza, T., Faulk, C., Skaf, J.
Kozak, L. P., 2006, Changes in gene expression foreshadow diet-induced obesity
in genetically identical mice, PLOS Genetics, 2(5), e81.
Kulig, H. Kmieć M., 2009, Association between leptin gene polymorphisms and growth
traits in Limousin cattle, Genetika, 45(6), 838-41.
Kumar, R. M., 2009, The Widely Used Diagnostics “DNA Microarray”-A Review,
American Journal of Infectious Diseases 5(3), 214-225.
Larman, B. W., Karolak, M. J., Adams, D. C. Oxburgh, L., 2009, Chordin-like 1 and
twisted gastrulation 1 regulate BMP signaling following kidney injury, Journal of
the American Society of Nephrology, 20(5),1020-31.
Lagonigro, R., Wiener, P., Pilla, F., Woolliams, J. A. Williams, J. L., 2003, A new
mutation in the coding region of the bovine leptin gene associated with feed
intake, Animal Genetics, 34(5), 371-4.
Larrain, J., Bachiller, D., Lu, B., Agius, E., Piccolo, S. De Robertis E. M., 2000, BMP
binding modules in chordin: a model for signalling regulation in the extracellular
space, Development, 127(4), 821-30.
Lee, S. H., Cho, Y. M., Kim, B., Kim, N., Choy, Y., Kim, K., Yoon, D., Im, S., Oh, S.
Park, E., 2008, Identification of marbling-related candidate genes in M.
longissimus dorsi of high and low marbled Hanwoo (Korean Native Cattle) steers,
BMB rep, 41, 846.
Lee, K., Shin, J., Latshaw, J. D., Suh, Y. Serr, J., 2009, Cloning of adipose triglyceride
lipase in poultry and expression of adipose triglyceride lipase during development
of adipose in chickens, Poultry. Science, 88, 620-630.
Lefterova, M. I. and Lazar, M. A., 2009, New developments in adipogenesis, Trends in
Endocrinology and Metabolism, 20 (3), 108-114.
Li, W. J., Li, H. B., Chen, J. L., Zhao, G. P., Zheng, M. Wen Q. J., 2008, Gene
expression of Heart and Adipocyte Fatty Acid Binding Protein and correlation
with intramuscular fat in Chinese Chickens, Animal Biotechnology, 19, 190-194.
57
Li, B., Shin, J. and Lee, K., 2009, Interferon-Stimulated Gene ISG12b1 Inhibits
Adipogenic Differentiation and Mitochondrial Biogenesis in 3T3-L1 Cells,
Endocrinology, 150, 1217–1224.
Lieberman, M. and Marks, A. D., 2009, Basic medical biochemistry a clınical approach
third edition, http://books.google.com.tr/books, [Ziyaret Tarihi: 12 Mayıs 2013].
Liefers, S. C., Veerkamp, R. F., Te Pas M. F., Delavaud, C., Chilliard, Y. Van Der
Lende T., 2003, Leptin concentrations in relation to energy balance, milk yield,
intake, live weight, and estrus in dairy cows, Journal of Dairy Science, 86(3),
799-807.
Linford, N. J., Beyer, R. P., Gollahon, K., Krajcik, R. A., Malloy, V. L., Demas, V.,
Burmer, G, C. Rabinovitch, P. S, 2007, Transcriptional response to aging and
caloric restriction in heart and adipose tissue, Aging Cell, 6(5), 673-88.
Livak, K. J. and Schmittgen, T. D., 2001, Analysis of relative gene expression data
using real-time quantitative PCR and the 2-∆∆CT method, Methods, 25, 402-408.
Lusk, J. L., 2007, Association of single nucleotide polymorphisms in the leptin gene
with body weight and backfat growth curve parameters for beef cattle, Journal of
Animal Science, 85, 1865-1872.
Ma, S., Liui L., Li, Y. Ren, Y., 2009, Study on PPARgamma and aP2 mRNA
expression of adipose tissues in obesity and obesity resistant rats, Wei Sheng Yan
Jiu, 38(2), 163-5.
Maury, E. and Brichard, S. M., 2010, Adipokine dysregulation, adipose tissue
inflammation and metabolic syndrome, Molecular and Cellular Endocrinology
314, 1–16.
Mersmann, H. J. and Smith, S. B., 2004, Adipose Tissue Development, Encyclopedia of
Meat Sciences, 530-538.
Millo, M. G., 2004, Adipose tissue and adipokines: for better or worse, Diabetes
Metabolism, 30, 13-19.
Nakayama, N., Han, C. E., Scully, S., Nishinakamura, R., He, C., Zeni, L., Yamane, H.,
Chang, D., Yu, D., Yokota, T. Wen D., 2001, A novel chordin-like protein
inhibitor for bone morphogenetic proteins expressed preferentially in
mesenchymal cell lineages, Developmental Biology, 232(2), 372-87.
Narukami, T., Sasazaki, S., Oyama, K., Nogi, T., Taniguchi, M. and Mannen, H., 2011,
Effect of DNA polymorphisms related to fatty acid composition in adipose tissue
of Holstein cattle, Journal of Animal Science, 82 (3), 406-11.
Ntambi, J. M. and Young-Cheul, K, 2000, Adipocyte differentiation and gene
expression, Journal of Nutrition, 130(12), 3122-3126.
58
Ockner, R. K., Manning, J, A., Poppenhausen R. B. and Ho WK, 1972, A binding
protein for fatty acids in cytosol of intestinal mucosa, liver, myocardium, and
other tissues, Science, 177, 56-58.
Oh, S. A., Suh, Y. M., Pang, G. Lee, K., 2011, Cloning of avian G(0)/G(1) switch gene
2 (G0S2) genes and developmental and nutritional regulation of G0S2 in chicken
adipose tissue, Journal of Animal Science, 89, 367-375.
Osuga, J. I., Ishibashi, S., Oka, T., Yagyu, H., Tozawa, R., Fujimoto, A., Shionoiri, F.,
Yahagi, N., Kraemer, F. B., Tsutsumi, O. and Yamada, N., 2000, Targeted
disruption of hormone-sensitive lipase results in male sterility and adipocyte
hypertrophy, but not in obesity, Proceedings of the National Academy of Sciences,
97, 787-792.
Öztürkcan, O., Demir E. ve Görgülü M 1996, Çiftlik Hayvanlarında Yaglanma,
Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Genel Yayın No:136, Yardımcı Ders
Kitapları Yayın No:12, Adana.
Petrovic, N., Shabalina, I. G., Timmons, J. A., Cannon, B. Nedergaard, J., 2008,
Thermogenically competent nonadrenergic recruitment in brown preadipocytes by
a PPARgamma agonist, Endocrinology and Metabolism, American Journal of
Physiology, 295(2), E287-96.
Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B. De Robertis E. M., 1996, Dorsoventral patterning in
Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4,
Cell, 86(4), 589-98.
Piya, M. K., McTernan, P. G. and Kumar, S., 2013, Adipokine inflammation and insulin
resistance: the role of glucose, lipidsand endotoxin, Journal of Endocrinology,
216 (1), T1-T15.
Puente, B. A., Feve, B., Fellahi, S. Bastard, J. P., 2008, Adipokines: The missing link
between insulin resistance and obesity, Diabetes and Metabolism, 34, 2-11.
Rosen, E. D., Walkey, C. J., Puigserver, P. and Spiegelman, B. M., 2000,
Transcriptional regulation of adipogenesis, Genes and Development, 14, 12931307.
Sakuta, H., Suzuki, R., Takahashi, H., Kato, A., Shintani, T., Iemura, Si., Yamamoto, T.
S., Ueno, N. Noda, M., 2001, Ventroptin: a BMP-4 antagonist expressed in a
double-gradient pattern in the retina, Science, 293(5527), 111-5.
Samulin, J., Berget, I., Lien, S. Sundvold, H., 2008, Differential gene expression of fatty
acid binding proteins during porcine adipogenesis, Comparative Biochemistry and
Physiology Part B, Biochemistry and Molecular Biology, 151(2), 147-52.
Schena, M., Shalon, D., Davis R. W. and Brown P. O., 1995, Quantitative Monitoring
of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray, Science,
270 (5235), 467-470.
59
Schenkel, F. S., Miller, S. P., Ye, X., Moore, S. S., Nkrumah, J. D., Li, C., Yu, J.,
Mandell, I. B., Wilton, J. W. Williams, J. L., 2005, Association of single
nucleotide polymorphisms in the leptin gene with carcass and meat quality traits
of beef cattle, Journal of Animal Science, 83(9), 2009-20.
Seale, P., Kajimura, S., Yang, W., Chin, S., Rohas, L. M., Uldry, M., Tavernier, G.,
Langin, D. Spiegelman, B. M., 2007, Transcriptional control of brown fat
determination by PRDM16, Cell Metabolism, 6(1), 38-54.
Serr, J., Suh, Y. and Lee, K., 2009, Regulation of adipose triglyceride lipase by fasting
and refeeding in avian species, Poultry Science, 88, 2585-91.
Serr J., Suh, Y. S., Oh, Shin, A. S., Kim, M. S., Latshaw, J. D. and Lee, K., 2011, Acute
up-regulation of adipose triglyceride lipase and release of non-esterified fatty
acids by dexamethasone in chicken adipose tissue, Lipids, 46, 813-820.
Shan T., Wang, Y., Wu, T., Guo, J., Liu, J., Feng, J. Xu, Z., 2008. Porcine adipose
triglyceride lipase complementary deoxyribonucleic acid clone, expression
pattern, and regulation by resveratrol, Journal of Animal Science, 86, 1781-1788.
Shin, J., Lim, S., Latshaw, J. D. Lee, K., 2008, Cloning and expression of delta-like
protein 1 messenger ribonucleic acid during development of adipose and muscle
tissues in chickens, Poultry Science, 87(12), 2636-46.
Shin, J., Li, B., Davis, M. E., Suh, Y. Lee, K., 2009, Comparative analysis of fatty acidbinding protein 4 promoters: conservation of peroxisome proliferator-activated
receptor binding sites, Journal of Animal Science, 87(12), 3923-34.
Spiegelman, B. M., Frank, M. Green, H., 1983, Molecular cloning of mRNA from 3T3
adipocytes. Regulation of mRNA content for glycerophosphate dehydrogenase
and other differentiation-dependent proteins during adipocyte development, The
Journal of Biological Chemistry, 258(16), 10083-9.
Steinberg, G. R., Kemp, B. E. Watt, M. J., 2007, Adipocyte triglyceride lipase
expression in human obesity, Endocrinology and Metabolism, American Journal
of Physiology, 293(4), E958-64.
Stock, M. J. and Cinti, S., 2003, Structure and Function of Brown Adipose Tissue,
Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition (Second Edition), 29-34.
Su, A. I., Wiltshire, T., Batalov, S., Lapp, H., Ching, K. A., Block, D., Zhang, J., Soden,
R., Hayakawa, M., Kreiman, G., Cooke, M. P, Walker, J. R. Hogenesch, J. B.,
2004, A gene atlas of the mouse and human protein encoding transcriptomes,
Proceedings of the National Academy of Sciences, 101(16), 6062-7.
60
Takahashi, H., Shintani, T., Sakuta, H. Noda, M., 2003, CBF1 controls the retinotectal
topographical map along the anteroposterior axis through multiple mechanisms,
Development, 130(21),5203-15.
Taniguchi, M., Guan, L. L., Zhang, B., Dodson, M. V., Okine, E., Moore, S. S., 2008,
Gene expression patterns of bovine perimuscular preadipocytes during
adipogenesis, Biochemical and Biophysical Research Communications, 366, 346351.
Tchkonia, T., Lenburg, M., Thomou, T., Giorgadze, N., Frampton, G., Pirtskhalava, T.,
Cartwright, A., Cartwright, M., Flanagan, J., Karagiannides, I., Gerry, N., Forse,
R. A., Tchoukalova, Y., Jensen, M. D., Pothoulakis, C. Kirkland, J. L., 2007,
Identification of depot-specific human fat cell progenitors through distinct
expression profiles and developmental gene patterns, Endocrinology and
Metabolism: American Journal of Physiology, 292(1), E298-307.
Thorrez, L., Van Deun, K., Tranchevent, L. C., Van Lommel, L., Engelen, K., Marchal,
K., Moreau, Y., Van Mechelen, I. Schuit, F., 2008, Using ribosomal protein genes
as reference: a tale of caution, PLoS One, 3(3), e1854.
Türkmen, Y. E., 2003, Esansiyel Amino Asitler, www.kimyasanal.net/konugoster.php
[Ziyaret Tarihi: 01 ġubat 2013].
Umucalılar, H. D. ve GülĢen N., 2005, Çiftlik Hayvanlarında Beslenme Hastalıkları.
S.Ü. Basımevi, Konya.
Wang H. B., Li, H., Wang, Q. G., Zhang, X. Y., Wang, S. Z., Wang, Y. X., Wang, X.
P., Wang, S. P., Laurin, N., Himms Hagen, J., Rudnicki, M. A., Levy, E., Robert,
M. F., Pan, Oligny, L. L. and Mitchell, G. A., 2001, The adipose tissue phenotype
of hormone-sensitive lipase deficiency in mice, Obesity Research, 9, 119-128.
Wang, Y. H., Byrne, K. B., Reverter, A., Harper, G. S., Taniguchi, M., McWilliam, S.
M., Manen, H., Oyama, K. and Lehnert, S. A., 2005, Transcriptional profiling of
skeletal muscle tissue from two breeds of cattle, Mammalian Genome, 16(3), 201210.
Webber, J., 2003, Energy balance in obesity, Proceedings of the Nutrition Society,
62(2), 539-43.
Woronuk, G. N., Marquess, F. L., James, S. T., Palmer, J., Berryere, T., Deobald, H.,
Howie, S. Kononoff, P. J., 2012, Association of leptin genotypes with beef cattle
characteristics, Animal Genetics, 43(5), 608-10.
Wylie, A. and Newforge, A. F. B. I., 2007, Leptin where’s the beef ?,
http://www.afbini.gov.uk [Ziyaret Tarihi: 10 Nisan 2013].
Xu, Q. L., Tang, G. W., Zhang, Q. L., Huang, Y. K., Liu, Y. X., Quan, K., Zhu, K. Y.
Zhang, C. X., 2011, The FABP4 gene polymorphism is associated with meat
tenderness in three Chinese native sheep breeds, Czech Journal of Animal
Science, 1, 1-6.
61
Yamasaki, T., Tahara, K., Takano, S., Murayama, M. I., Rose, M. T., Minashima, T.,
Aso, H. and Ito, S., 2006, Mechanism of plasma glutathione peroxidase
production in bovine adipocytes, Cell and Tissue Research, 326, 139-147.
Yarru, L, P., 2008, Effects of Aflatoxin on Hepatic Gene Expression in A Poultry
Model, Faculty of the Graduate School University of Missouri Columbia, Master
Thesis.
Zhang, Y, Y., Zan, L. and Wang, H., 2010, Screening candidate genes related to
tenderness trait in Qinchuan cattle by genome array, Molecular Biology Reports,
38(3), 2007-14.
Zheng, Z., Yin, Z., Gao, W., Zhang, H., Hu, Y. Zhang, S., 2010, Effects of
neurogenesin 1 gene on functional recovery of spinal cord injury in rats and its
mechanism, Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi, 24(4), 410-4.
Zimmerman, L. B., De Jesús Escobar, J. M. Harland, R. M., 1996, The Spemann
organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4, Cell,
86(4), 599-606.
Zimmerman A.W. and Veerkamp J. H., 2002, New insights into the structure and
function of fatty acid-binding proteins, Cellular and Molecular Life Sciences, 59,
1096-1116.
Zimmermann, R., Strauss, J. G., Haemmerle, G., Schoiswohl, G., R. Gruenberger, B.,
Riederer, M., Lass, A., Neuberger, G., Eisenhaber, F., Hermetter, A. Zechner, R.,
2004. Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose triglyceride
lipase, Science, 306, 1383-1386.
ZoBell D. R., Whittier, D. and Holmgren, L., 2005, Beef quality and yield grading,
extension.usu.edu/cyberlivestock/.../beef3.pdf [Ziyaret Tarihi: 05 Haziran 2013].
62
ÖZGEÇMĠġ
KĠġĠSEL BĠLGĠLER
Adı Soyadı
Uyruğu
Doğum Yeri ve Tarihi
Telefon
Faks
e-mail
:
:
:
:
:
:
Selçuk KAPLAN
Türkiye Cumhuriyeti
Erzurum/Merkez- 12.09.1979
0 332 223 36 37
0 332 241 01 08
[email protected]
EĞĠTĠM
Derece
Lise
:
Üniversite
:
Yüksek Lisans :
Doktora
:
Adı, Ġlçe, Ġl
Atatürk Lisesi, Kırklareli
Adnan Menderes Üniversitesi, Aydın
Selçuk Üniversitesi, Konya
Selçuk Üniversitesi, Konya
Bitirme Yılı
1997
2005
2010
Devam ediyor
Ġġ DENEYĠMLERĠ
Yıl
2008
Kurum
S.Ü. Ziraat Fakültesi
Görevi
AraĢtırma Görevlisi
YABANCI DĠLLER: Ġngilizce
YAYINLAR
Kaplan, S. and Boztepe, S., 2010, The Determination of Prolactin Gene Polymorphism
Using PCR-RFLP Method within Indigenous AnatolianWater Buffalo and Brown
Swiss, 2nd International Symposium on SustainableDevelopment. 8-9 June 2010,
Saraybosna (Yüksek Lisans tezinden hazırlanmıĢtır).
Aytekin, Ġ. ve Kaplan, S., 2010, Koyunlarda vücut kondüsyon puanlaması ve
yetiĢtiricilikte önemi, Hasad‎Hayvancılık, 303, 42-45.
Kaplan, S. ve Boztepe S., 2011, Çiftlik Hayvanlarında Refah, Konya Ticaret Borsası
Yayını, Adım Matbacılık, Konya.
Download