moleküler biyolojide kullanılan yöntemler ı

MOLEKÜLER BİYOLOJİDE
KULLANILAN YÖNTEMLER
I
DNA&RNA
Moleküler biyoloji
• Moleküler düzeyde biyolojik olayları,
• çeşitli hücresel sistemler arasındaki etkileşimleri
inceler
• DNA, RNA, proteinler
• Arasındaki ilişkiler
• Etkileşimler
• Etkileşimlerin nasıl düzenlendiği
çalışma konularıdır.
Moleküler biyologlar
• Genetik
• Biyokimya
• Biyofizik
tekniklerini kullanırlar.
Bu farklı disiplinler iç içedir.
Moleküler biyoloji - diğer biyolojik
bilimler ilişkisi
işlev
Genetik
Biyokimya
proteinler
Moleküler
biyoloji
genler
1950-1960’lar
•Moleküler hücre bileşenlerinin
• Tanımlanması
• İzolasyonu
• Kullanımları
olası hale gelmiştir.
Moleküler hücre bileşenleri;
•DNA – genetik bilgi deposu
•RNA – transkripsiyon, translasyon
•Proteinler – yapısal ve enzimatik bileşenler
Moleküler hücre bileşenleri (DNA,RNA ve
Proteinler) ile moleküler çalışmalar
• Biyolojik olayların mekanizmalarının anlaşılması
• Biyoteknoloji
- Tıp
- Tarım & Hayvancılık
- Gıda
- Çevre & Enerji
Nükleik Asitlerin İzolasyonu
• Yapı ve işlevlerinin aydınlatılması
• Gen anlatımı
• Gen anlatımının düzenlenmesi
• Genetik mühendisliği
• Genomik ve proteomik çalışmaları
Bu amaçlar için öncelikle nükleik asitlerin yüksek
saflıkta izole edilmeleri gerekir.
DNA İzolasyonu
• DNA hücrede proteinler, katyonlar yardımıyla
yoğunlaşmış durumda bulunur.
• Proteinlerle ilişkisi işlevleri gereğidir.
• ÖR: gen anlatımı - düzenleyici proteinler
transkripsiyon - RNA polimerazlar
hasar onarımı - DNA polimeraz,
ligaz
bakteriyofaj - protein kılıf
DNA
DNA saflaştırılmasının temel
aşamaları
1) Hücre çeperi ve membranlarının parçalanarak yüksek
molekül ağırlıklı DNA’nın serbestleştirilmesi
2) Denatürasyon veya proteoliz yoluyla DNA-protein
kompleksinin çözülmesi
3) DNA’nın diğer moleküllerden ayrılması
Çalışma amacına (klonlama, dizi analizi vb.) bağlı
olarak ileri saflaştırma yöntemlerinin uygulanması
Farklı
DNA
moleküllerinin
(kromatografik,
spektrofotometrik
yöntemlerle)
fraksiyonlandırılması
Prokaryotik DNA İzolasyonu
Bakteri DNA’sı asal (kromozomal) ya da
ekstrakromozomal
(plazmit,
bakteriyofaj)
oluşuna bağlı olarak farklı yöntemlerle izole
edilir.
Prokaryotik kromozomal DNA
İzolasyonu
AŞAMA 1
Hücre duvarının zayıflatılması:
Fiziksel yöntem: dondurup-çözme
Kimyasal yöntem: lizozim uygulaması
kelatör (EDTA) kullanımı
Lizozim:
Kelatör: metal
iyonlarının
bağlanmasını artırarak
çökelmeyi hızlandıran
kimyasal ajanlar
Prokaryotik kromozomal DNA
İzolasyonu
AŞAMA 2
Hücre zarının parçalanması:
1. Fiziksel yöntemler:
• Homojenizasyon
• Ultrasonikasyon
• Ozmotik şok
Prokaryotik kromozomal DNA
İzolasyonu
AŞAMA 3
Hücre zarının parçalanması:
2. Kimyasal yöntemler:
• Deterjan kullanımı – SDS (sodyum dodesil sülfat)
SDS pH ve uygun iyon konsantrasyonunda
lipoproteinlerle birleşir, membranların
lipoprotein kısımlarını suda çözünür hale getirir
HÜCRE PARÇALANIR (LİZİZ)
Prokaryotik kromozomal DNA
İzolasyonu
AŞAMA 4
RNA’nın parçalanması için
RNAaz
Proteinlerin parçalanması için
Proteazlar
Kalan proteinler ve oligopeptitler için
fenolkloroform ekstraksiyonu
Prokaryotik kromozomal
DNA İzolasyonu
AŞAMA 5
DNA içeren fazın alkolle (Etanol) çöktürülmesi
DNA gözle görülebilir, cam
çubuğa sarılır !!!
Prokaryotik kromozomal DNA
İzolasyonu
İleri saflaştırmalar
• Diyaliz ile kalıntıların uzaklaştırılması
• CsCl2 derecelenme santrifügasyonu
• Kromatografik ayırım
Ekstrakromozomal DNA
İzolasyonu
Kromozomal DNA uzaklaştırılır !!!
Bakteriyofaj DNA’sı izolasyonu:
1. İnfekte olmuş bakteriden faj partiküllerinin
izolasyonu
ile
kromozomal
DNA’nın
eliminasyonu
2. Proteaz ve/veya fenol uygulaması
3. İleri saflaştırmalar
Ekstrakromozomal DNA
İzolasyonu
Plazmit DNA’sı izolasyonu:
Kromozomal DNA izolasyonuna benzer !
1. (Hücre çeperi ve membranlarının parçalanarak
yüksek
molekül
ağırlıklı
DNA’nın
serbestleştirilmesi) ve
2. (Denatürasyon veya proteoliz yoluyla DNAprotein kompleksinin çözülmesi) aşamalar
aynıdır.
Ekstrakromozomal DNA
İzolasyonu
Plazmit DNA’sı izolasyonu:
FARK;
kromozomal
ve
plazmit
DNA’sı
konfigürasyonlarının farkı nedeniyledir.
Plazmit DNA’sı: halkasal ve süper dönümlüdür.
Kromozomal
ve
plazmit
DNA’larının
denatürasyonlarını (yüksek sıcaklık, pH gibi)
takiben renatürasyon sürelerinin farkları ayırma
için kullanılır.
ÖR: pH 12-12.5’ plazmit DNA’sı denatüre olmaz.
Plazmit DNA’sı
Ökaryotik Kromozomal DNA
İzolasyonu
• Ökaryotlardan DNA izolasyonunun zorluğu: organel
(mitokondri, kloroplast) DNA’larının varlığı
• Total hücresel DNA izolasyonu için; modifiye alkali-lizis
yöntemi kullanılır.
(Alkali-lizis yöntemi: plazmit DNA’sı izolasyonu için kullanılır)
Ökaryotik Kromozomal DNA
İzolasyonu
1. Hücre zarının lizisi
2. Parçalanmamış organellerin izolasyonu
3. Boyut, yoğunluk, deterjan duyarlılık farklarına
göre nukleus ve organel DNA’larının ayrılması
4. Organeller için;
organel zarı lizisi
RNA ve proteinlerden
arındırma
(organel DNA’ları plazmit DNA’sı gibi halkasal,
kapalıdır ve izolasyonları plazmit DNA
izolasyonuna benzer)
Bitki Hücre DNA’sı izolasyonu
• İzolasyonda en önemli ayırıcı
özellik; kalın hücre çeperidir.
• Çeperin parçalanması için genellikle
• Homojenizasyon
• Sıvı nitrojenle dondurup parçalama
• Bunun dışındaki aşamalar diğer ökaryotik
hücrelerden DNA izolasyonuna benzer.
Sıvı Fazdan DNA’nın Saflaştırılması ve
Konsantre edilmesi Yöntemleri
• Fenol ekstraksiyonu, etanolle çöktürme:
Küçük hacimlerden (0.4 ml’den az) 1mg/ml’den az
konsantrasyonlarda DNA izolasyonu için
(çoğunlukla tercih edilen yöntem)
• İzopropanolle çöktürme:
DNA solusyonu ile eşit hacimde kullanılarak
çöktürme yapılır.
Sıvı Fazdan DNA’nın Saflaştırılması ve
Konsantre edilmesi Yöntemleri
• Cam boncukla saflaştırma:
Süspansion halindeki cam boncuklar DNA, RNA ve
protein çöktürmede hızlı ve etkin yöntemdir.
• Oligonükleotidlerin ve trifosfatların etanolle
çöktürülerek uzaklaştırılması:
30 bç’den kısa oligonükleotidler ve nükleotidlerin
DNA solüsyonundan uzaklaştırılması için
amonyum asetat ile etanol çöktürmesi (2
aşamalı) uygulanır.
Anyon Değiştirici Kromatografi ile
DNA saflaştırması
• Seçici olarak nükleik asitlere bağlanan anyon değiştirici
reçine içeren kolon kullanılır
DNA’nın RNA, protein, karbohidrat ve metabolitlerden
hızlı olarak ayrılması sağlanır.
Kolon dolgu
maddesi
DNA örneklerinin saklanması :
İzole edilmiş DNA örnekleri, degredasyonun en aza
indirgenmesi amacıyla uygun koşullar altında
saklanmalıdır.
Uzun dönem saklamada, deamidasyon’u engellemek için,
DNA’nın içinde bulunduğu tamponun pH sı 8.5 dan
büyük olmalıdır ve en azından 0.15 M NaCl ve 10 mM
EDTA içermelidir.
Aşağıdaki faktörler saklama sırasında DNA ’ nın
parçalanmasına yol açabilirler.
DNaz kontaminasyonu:
DNaz kontaminasyonun ana kaynağı insan derisidir.
Bu tip kontaminasyon lastik eldiven kullanmak,
steril solüsyon ve tüpler kullanılmak suretiyle
önlenebilir. DNA cam yüzeylere kolayca absorbe
olabildiğinden dolayı saklama için sadece steril
plastik tüpler kullanılmalıdır.
Ağır metallerin varlığı:
Ağır metaller fosfodiester bağlarının kopmasını
kolaylaştırır. Bu nedenle uzun dönem saklamada
DNA tamponu 10 mM veya daha fazla EDTA
içermelidir.
Etidyum bromür varlığı: Moleküler oksijen
varlığında, etidyum bromür görünür ışıkla birlikte DNA
nın fotooksidasyonuna neden olur. Bu madde ile muamele
edilmiş DNA örneklerinden etidyum bromürün tamamen
uzaklaştırılması mümkün olmadığından, örnekler daima
karanlıkta saklanmalıdır.
Sıcaklık: Yüksek molekül ağırlıklı DNA’nın kısa dönem
saklanması için en uygun sıcaklık 4C ile 6C arasındadır.
Bu sıcaklıkta, DNA örnekleri DNA’nın parçalanmasına
sebep olan dondurma ve çözdürme işlemleri olmaksızın
saklanabilir. Uzun dönem saklamada ( 5 yıl veya daha
uzun), DNA -70C veya altında muhafaza edilmeli ve
dondurma ve çözdürme işlemi yapılmamalıdır. Dondurma
ve çözdürme işleminden kaçınmak için, DNA örnekleri
küçük hacimlerde ayrı tüplere paylaştırılmalıdır.
RNA İzolasyonu
• Bakteri hücresinin %6’sı
• Memeli hücresinin %1.1’i
RNA’dır
• Total 10-15mg RNA’nın
%80-85’i
rRNA
%15-20’si
tRNA ve
nukleusa
ait küçük
RNA’lar
%1-5’i
mRNA
RNA
• Protein translasyonu için geçici olarak bilgi iletir.
• Sinyalin işlevi bitince durdurulması kritik önem taşır.
• Riboz rezidüleri 2’ ve 3’ pozisyonunda halkasal grup
taşıdıklarından kimyasal olarak DNA’dan daha reaktiftir
ve Rnaz ile kolayca yıkılır.
RNA
• Rnaz tüm dokularda bulunup çevresel etkilere karşı çok
dayanıklıdır.
• Disülfit bağlarından dolayı uzun süre kaynatmaya,
denatüranlara dirençlidir ve denatüre olduğunda hızla
yenilenebilir.
• Aktivitesi için katyonlara gereksinim duymadığından
EDTA gibi şelatörlerle inhibe olmaz.
RNA İzolasyonu
• Gen anlatımı
• Gen anlatımının analizi
• Gen anlatımının düzenlenmesi
• İşlenme
• Klonlama
çalışmalarının önemli kısmı RNA izolasyonuna
dayanır.
• Klonlama çalışmalarında cDNA kitaplığının
kurulması ve kitaplıktan istenen genin izolasyonu
için total RNA’dan mRNA izolasyonu gereklidir.
RNA Analizi
• Northern Analizi (Gen ekspresyonu için)
• cDNA kütüphanesi için kaynak
• RT-PCR
• RNase koruma metotları
Splicing defects
GEN EKSPRESYONU ANALİZİ
5’
3’
PROMOTOR
Reporter gene
analysis
hnRNA
exon 1
intron
exon 2
transcription
3
’
5
’
RNA processing
RNA analysis
mRNA
5
’
3
’
AAAAAA
m7GpppN
degradation
protein
RNA Ekstraksiyonu
• Hücre çeperi ve membranının parçalanması (LİZİS)
• Hücre lizatının santrifüjlenmesi (diğer makromoleküllerden
ayrılması)
Genomik DNA’dan ayrılması için asidik solüsyonlarla muamele
Trizol, Guanidinium HCl veya guanidinium tiyosiyanat (güçlü
denaturanlar) homojenatı, ile fenol:kloroform ekstraktı uygulanabilir.
Pürifikasyon
• RNA’nın yoğunlaştırılması
• Kalite ve saflığının tespiti
RNA
ekstraksiyonu
için
çok
sayıda
protokol ve ticari kit
mevcuttur.
Manuel RNA İzolasyonu
1. RNA Homojenizasyon bufferında hücrelerin
süspansiyonu (NaCl, MgCl2, Tris, Nonidet P-40, DTT,
RNase Inhibitor)
2. RNA ekstraksiyon bufferı eklenir (Tris pH 8, EDTA, NaCl,
SDS, Proteinase K
-37C/30min)
3. Fenol kloroform ekstraksiyonu
4. RNA’nın yoğunlaştırılması (presipitasyonu)
5. Dnaz I den free RNaz, Rnaz inhibatörü, MgCl2 ve DTT
(37C/60min) ekleyerek yeniden süspanse edilir.
6. 3-4 stepler tekrarlanır ve TE’de yeniden süspanse edilir.
RNA İzolasyonu
Örnek prosedür (bitki total RNA izolasyonu – Fenol yöntemi)
1)
2)
3)
4)
5)
6)
Homojenizasyon
Fenol-kloroform (proteinlerin uzaklaştırılması)
NaOAc ile nükleik asitlerin çöktürülmesi
NaOAc ile RNA’nın çöktürülmesi
Polisakkaritlerin uzaklaştırılması için CsCl2 derecelenme
santrifüjlemesi
mRNA izolasyonu için oligo dT / poli U sefaroz ile
kromatografi
(yüksek tuz konsantrasyonunuda poliA kuyruğu bağlanır,
tuz konsantrasyonu düşürüldüğünde mRNA kolonda elde
edilir)
RNA Extraksiyonu (Column)
• Total RNA kitleri (Qiagen ve Ambion)
• Hücreler guanidine tiyosiyanat ile muamele
edilerek lizat etanol ile dilüe edilir.
• RNA matrixi yada cama uygulanarak protein ve
diğer kontaminantlar uzaklaştırılır.
• Böylece Total RNA elde edilir.
RNA İzolasyonu
• BAŞARILI BİR RNA İZOLASYONU, diğer
moleküllerle kontamine olmamış ve yıkılmamış
RNA’ların saflaştırılması demektir
RNA saflaştırılmasının en güç yanı endojen
RNaz’ların RNA’yı parçalamalarıdır !!!
Endojen ve Eksojen RNaz ile Savaşı
Kazanım Yolları;
• Endojen RNaz için;
• Guanidinium isothiocyanate (GITC)
• RNAzol/Trizol/Ultraspec (14M GITC and urea salts)
• Qiagen RNeasy – kullanılmalı
• Eksojen RNaz profilaktik tedbirlerin
kullanılması ile ortadan kaldırılabilir.
• Eksojen Rnaz kontaminasyonu en sık;
- Kontamine bufferlar
- Otomatik pipet uçları ile olur.
dikkatli
Eksojen RNaz ile Savaşı Kazanım Yolları;
• Mutlaka eldiven (tam koruma??)
• Özel pipet seti
• Mümkünse tüm kimyasallar, elektroforez tankları,
diğer tüm malzemeler sadece RNA çalışması için
kullanılmalı
• Tüm çözeltiler (DEPC=dietilpirokarbonat), cam ve
plastik eşyalar Rnaz aktivitesini yok etmek
amacıyla özel hazırlanmalı
**Tris DEPC’I inaktive ettiğinden Tris’li çözeltiler DEPC ile hazırlanmamalı
Eksojen RNaz ile Savaşı Kazanım Yolları;
• Bazı cam eşyalar %0.1 oranında çözünmüş DEPC
bulunan suda 2 h 37 C’de bekletilip steril dH2O ile
yıkanarak 15 d. otoklavlanır.
• Cam eşyalar 180 C’de 8 h, 300 C’de 4h veya
kloroform ile yıkanarakda Rnaz inaktive
edilebilir.
DEPC ciddi karsinojen maddedir!!
Başarılı RNA İzolasyonu için;
• Kelatörler (EDTA, EGTA)
• Deterjanlar (SDS)
• Guanidium izotiosiyanat
kullanılmalıdır.
RNaz
inhibitörleri
CAM EŞYA İÇİN;
• DEPC (dietilpirokarbonat)’ın %0.002’lik solusyonu
• DEPC’den geçişilmiş cam eşyanın otoklavlanması
• Çok temiz çalışma koşulları
(İzolasyon sırasında da solusyonlar için %0.005’lik DEPC
kullanılır)
RNA deterjan varlığında -20oC -80oC’ da saklanır.
NÜKLEİK ASİTLERİN SAFLIK
KONTROLÜ
İzole edilen DNA ve RNA’nın saflık kontrolü ve miktarının
belirlenmesi daha
sonra yapılacak çalışmalar için gereklidir !!!
Bu amaçla kullanılan iki temel yöntem:
1) Spektral yöntem
2) Elektroforetik yöntem
kullanılır.
Spektral Yöntem
DNA ve RNA miktarının
belirlenmesi için kullanılır.
ve
saflığının
Nükleotidlerin bazları UV ışığı 260 nm’de
maksimum
düzeyde
absorbe
etme
özelliğinden yaralanarak ölçüm yapılır.
Spektral Yöntem
A260 = 260nm’deki absorbsiyon değeri miktar belirlemede
kullanılır.
Çift zincirli DNA için 1 A260 = 50mg/ml
Tek zincirli DNA/RNA için 1 A260 = 40mg/ml
Spektral Yöntem
Miktar belirlemek için
Çift iplikli DNA (mg/ml)=A260 x sulandırım oranı x 50
Tek iplikli DNA ya da RNA (mg/ml)=A260 x sulandırım oranı x 40
Spektral Yöntem
Saflık belirlemek
yararlanılır.
için;
A260/A280
oranından
Proteinler UV ışığı 280nm’de maksimum absorbe ederler.
A260/A280=1.95 (saf DNA için), E.coli için
A260/A280=2 (saf RNA için)
Fenol, protein gibi safsızlıklar varlığında değerler
düşer.
Spektral Yöntem
spektrofotometre
Elektroforetik Yöntem
Avantajlar
• Basit
• Hızlı
• Güçlü
• Nükleik asit fragmentlerinin gösterilebilmesi
Elektroforetik Yöntem
Elektroforez;
çözünmüş
haldeki
yüklü moleküllerin elektriksel bir
alanda kitlelerine bağlı oranda
hareket etmeleri (göç) ve buna bağlı
olarak birbirlerinden ayrılmalarıdır.
_
+
Jel Elektroforezi
Elektrik akımı varlığında jele uygulanmış negatif
yüklü DNA nötral pH’da anoda doğru hareket
eder.
Jel Elektroforezi
• Nükleik asitleri ayırmada sıklıkla kullanılır.
• Nükleik asitler bir destek materyaline (matriks)
uygulanırlar.
• Matriks materyalleri
• Agaroz
• Poliakrilamid
• Nişasta
• Agaroz-poliakrilamid
Jel Elektroforezi
• Kullanılan matriks tipine göre
• Agaroz jel elektroforezi - DNA
• Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) - Protein
• Matriks konumuna göre
• Yatay elekroforez- DNA
• Dikey elektroforez - Protein
Jel Elektroforezi
• Jele uygulanmış nükleik asitler UV ışık altında
fluoresan veren boya etidyum bromid (EB)
varlığında gözle görülebilir (bant) parlak bantlar
halinde ayrılırlar.
EB kanserojen !!!
UV göze zararlı !!!
Jel Elektroforezi
• 1-10 ng kadar az miktardaki DNA’nın jeldeki
• Yerini belirlemek
• Jelden kesip almak
mümkündür.
Jel Elektroforezi
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
Matriks materyali tarak yerleştirilmiş olan elektroforez
kasetine dökülür.
Matriks donduktan sonra tarak çıkarılır.
Örneklerin yükleneceği kuyucuklar oluşur.
Örnek yükleme işi kaset içinde elektroforez tamponu
bulunan tankta yapılır.
EB genellikle jel hazırlanırken eklenir.
Sistemin kapağı kapatılır.
Elektrodlar yerleştirilir.
Güç kaynağından istenen güçte akım geçirilir.
Jel Elektroforezi
AGAROZ JELLER
POLİAKRİLAMİD JELLER
• Hazırlaması kolay
• Genellikle yatay
• Çözünürlüğü düşük
• Ayırma alanı fazla
• Hazırlaması zor
• Genellikle dikey
• Çözünürlüğü yüksek
• 200bç – 50.000 bç
• 1bç’lik fark
• Ayırma alanı dar
• 5-500 bç
Agarozun DNA ayırım etkinliği
Agaroz miktarı
(% w/v)
Linear DNA’nın etkin bir
biçimde ayrılabileceği boyut
(kb)
0,3
0,6
0,7
0,9
1,2
1,5
2,0
5-60
1-20
0,8-10
0,5-7
0,4-6
0,2-3
0,1-2
Poliakrilamid jellerin DNA ayırma
etkinlikleri
Akrilamid
(% [w/v])a
Etkin Ayırma
Alanı (bp)
3,5
1000-2000
460
100
5,0
80-500
260
65
8,0
60-400
160
45
12,0
40-200
70
20
15,0
25-150
60
15
20,0
6-100
45
12
Ksilen
Siyanol
FFb
Bromofenol
mavisib
a) N,N' metilenbisakrilamid akrilamidin 1/30’u kadar
b) Boya ile birlikte göç eden çift iplikli DNA moleküllerinin baz çifti sayısı
Agaroz jel elektroforezi
Göç oranı çeşitli faktörlere bağlıdır.
1) DNA’nın molekül büyüklüğü
Büyük molekül yavaş hareket eder.
2) Agaroz konsantrasyonu
Yüksek agaroz konsantrasyonu küçük, düşük ise büyük
moleküllerin ayrılmasında kullanılır.
Agaroz jel elektroforezi
Süper
3) DNA konformasyonu
dönüm
DNA süper dönümler yapar
Aynı molekül ağırlığına sahip DNA
molekülünün
• süperdönümlü halkasal (form 1)
• Kesilmiş halkasal (form 2)
• Doğrusal (form 3)
formları agaroz jelde farklı hızda
hareket ederler.
Agaroz jel elektroforezi
1. DNA ağırlık standartı
2. Farklı plazmit formları
3. B. subtilis genomik
DNA’sı
Agaroz jel elektroforezi
• tamponun iyonik kuvveti,
• elektrik akımı,
• süper kıvrım yoğunluğuna
• EB’e
bağlı olarak bu formların birbirlerine göre
hareketlilikleri değişir.
Agaroz jel elektroforezi
4) Uygulanan voltaj
Düşük voltajda doğrusal DNA hareketi voltajla
doğru
orantılıdır,
güç
artışı
harekette
farkılaşmaya yol açar. 2kb’den büyük DNA için
5V/cm’den fazla olmalı
5)Elektrik alanının yönü
50-100 kb’lik DNA’lar için elektrik alan yönü aynı
kaldıkça DNA ayrılma oranı aynıdır, ama yön
değişirse DNA harekete karşı koyar (pulse field
jel elektroforez)
Agaroz jel elektroforezi
6) Baz içeriği ve temparatür
Poliakrilamid jel elektroforezinin aksine baz içeriği göçü
etkilemez. Oda sıcaklığında uygulanır.
%0.5’lik jel kullanımında 40C
Agaroz jel elektroforezi
7) Boya
EB baz çiftleri arasına yerleştiğinden DNA hareketini %15
azaltır.
8) Elektroforez tampon kompozisyonu
Tamponunu iyonik kuvveti göçü etkiler.
İyon kuvveti az/yok
göç yavaş/yok
İyon kuvveti çok
ısınma, erime
Elektroforez tamponları
Tris-asetat (TAE) pH 8.0
Tris-fosfat (TPE) pH 8.0
Tris-borat (TBE) pH 8.0
Alkalin pH 8.0
Jel yükleme tamponu
DNA örneği kuyuya yüklenmede önce tamponla
karıştırılır.
Kullanım amaçları:
1. Kuyuya çökmeyi sağlar.
2. Örneği boyar, görünür yapar.
3. Yürüme yerini belirler.
Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)
• Akrilamid polimeri
• Hazırlanması agarozdan güç
• Hazırlamada hassasiyet ve deneyim gerekli
Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)
İki cam arası kullanım
Dikey kullanım
Jel boyu 10-100cm
Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)
Agaroza üstünlükleri
1) Ayırma gücü yüksek
1bç bakımından farklı DNA’ları
birbirinden ayırır.
2) Daha fazla miktarda DNA (10mg’dan
fazla) uygulanabilir.
3) Jelden geri kazanılan DNA daha saftır
ÖR: fare embriyosuna enjekte
edilebilir.
Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)
Poliakrilamid jellerin moleküler biyolojide iki tipi
kullanılır.
1) Non-denatüre poliakrilamid jeller:
Çift iplikli DNA’nın ayrılması ve saflaştırılması
için kullanılır.
Jel düşük voltajda (1-8V/cm) yürütüldüğünden çift
ipliğin açılması engellenir.
Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)
2) Denatüre poliakrilamid jeller:
Tek iplikli DNA parçalarının ayrılması ve saflaştırılması için
kullanılır
Jeller hazırlanırken eklenen üre/formamid;
Nükleik asitlerin baz çifti oluşturmasını engeller
Pulse Field Jel Elektroforezi
(PFGE)
• Büyük DNA moleküllerinin ayrılması için kullanılır.
• 2Mb büyüklüğündeki DNA’lar (kromozomlar) bile
ayrılabilir.
• Elektrik akımının yönü periyodik olarak değiştirilerek
uygulanır.
• Genom projesinde kullanımı çok yararlı olmuştur.
Pulse Field Jel Elektroforezi
(PFGE)
PFGE
Shigella sonnei’ nin XbaI kesiminin PFGE analizi
DNA’nın Jelden Geri Kazanılması
Jel elektroforezi ile ayrılıp, saflaştırılmış DNA’nın,
çeşitli amaçlar için (klonlama, dizi analizi vb.)
jelden geri kazanılması gerekebilir.
DNA’nın Jelden Geri Kazanılması
JELDEN GERİ KAZANMADA KARŞILAŞILAN
GÜÇLÜKLER:
1. Agarozun daha sonraki işlemler için istenmeyen
maddeler içermesi
(saf agaroz kullanımı sorunu ortadan
kaldırır)
2. Büyük DNA moleküllerinin etkin biçimde geri
kazanılamaması
(5kb’den büyük DNA moleküllerinin geri
kazanımı zordur)
DNA’nın Jelden Geri Kazanılması
JELDEN GERİ KAZANMADA KARŞILAŞILAN
GÜÇLÜKLER:
3. Az miktardaki DNA’nın etkin biçimde geri
kazanılamaması
(500ng’dan daha aza miktarlar geri kazanım
için yeterli değildir)
4. Farklı DNA moleküllerinin aynı anda geri
kazanımlarının güçlüğü
DNA’nın Jelden Geri Kazanılması
Yöntemleri
•
DEAE-selüloz membran üzerinde elektroforez
1. Jel parçalarının kolona yüklenmesi
2. Elüsyon tamponu ile kolondan DNA’nın alınması
•
Diyaliz tüpünde elektroelüsyon
1. Yürütme tamponu içeren diyaliz tüpüne jel parçasının
konması
2. DNA’nın jelden tüp içindeki dilüsyon tamponuna geçişi
•
“Low melting temperature” agoroz jel
kullanımı
65oC’nin altında eriyebilen agaroz jeller kullanarak
erimeden sonra DNA’nın saflaştırılması