Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir. ULUSAL MĠKROBĠYOLOJĠ STANDARTLARI (UMS) Kızamık ve SSPE’de (Subakut Sklerozan Panensefalit) Mikrobiyolojik Tanı Hazırlayan Birim Klinik Viroloji Tanı Standartları ÇalıĢma Grubu Onaylayan Birim Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Kategori Viroloji Bölüm Mikrobiyolojik Tanımlama Standart No V-MT-08 Sürüm No 1.1 Onay tarihi 01.01.2015 Geçerlilik tarihi 01.01.2018 Sürüm no Tarih Değişiklik Kızamık ve SSPE İÇİNDEKİLER KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3 KISALTMALAR VE TANIMLAR .............................................. 3 GENEL BĠLGĠ ................................................................... 3 Hastalığın önemi............................................................... 3 Virüsün özellikleri ............................................................. 4 Klinik özellikler ................................................................. 4 Laboratuvar tanısı............................................................. 5 TEKNĠK BĠLGĠLER ............................................................. 6 1 2 3 4 5 6 Hedef mikroorganizma .................................................. 6 Tanı için asgari laboratuvar gerekleri ............................... 6 Tanı teknikleri .............................................................. 8 Test sonuçlarının yorumu, raporlama, bildirim ................. 10 Olası sorunlar/kısıtlılıklar .............................................. 11 Referans Laboratuvar .................................................. 11 ĠLGĠLĠ DĠĞER UMS BELGELERĠ .......................................... 12 KAYNAKLAR ................................................................... 12 Sayfa 2 / 12 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / V-MT-08 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Viroloji Kızamık ve SSPE Kapsam ve Amaç Kızamık çok bulaĢıcı ve küçük çocuklarda ölüm oranları yüksek olabilen bir viral sistemik enfeksiyondur. SSPE ise santral sinir sisteminin kızamık virüsü ile persistan enfeksiyonu sonucu geliĢen nörodejeneratif bir komplikasyondur. Her iki klinik durumda da kesin tanı laboratuvar incelemesine dayanır. DSÖ 2000‟li yılların baĢlarından bu yana dünyada kızamığa bağlı ölüm ve komplikasyonları önlemek için bir Eliminasyon Programı yürütmektedir. Ülkemizde de bu Program kapsamında kızamığın tanısı ve doğrulama çalıĢmaları THSK Ulusal Kızamık/Kızamıkçık Referans Laboratuvarı ve bazı Bölge Halk Sağlığı Laboratuvarlarının oluĢturduğu bir ağ tarafından yürütülmektedir (1). Ağa dahil olmasalar da, klinik mikrobiyoloji laboratuvarları da -özellikle ayırıcı tanı gerekleri dolayısı ile- tanı panellerinde kızamık testlerine yer veriyor olabilirler; ancak eliminasyon programı nedeniyle Ģüpheli sonuçlarının teyidi için ulusal referans laboratuvarlar ile iĢbirliği yapma sorumlulukları vardır. Bu UMS belgesi, bu nedenlerle, kızamık ve SSPE‟de örnek yönetimi hususları ve tanıda kullanılan yöntemler hakkında özellikle klinik laboratuvarların güncel uygulamaya dair bilgilendirilmesini hedeflemektedir. Kısaltmalar ve Tanımlar SSPE Subakut sklerozan panensefalit URL Ulusal Referans Laboratuvarı Genel Bilgi Hastalığın önemi Kızamık çok bulaĢıcı, morbidite ve mortalitesi yüksek bir viral hastalıktır. Etkili ve ucuz bir aĢısının bulunmasına rağmen dünyada küçük çocuklarda önde gelen ölüm sebepleri arasında yer almaya devam etmektedir. Son on yılda kızamık aĢılama programlarının ölümleri %71 oranında azalttığı tahmin ediliyorsa da DSÖ verilerine göre 2011‟de dünya genelinde 158.000 kızamıktan ölüm kaydedilmiĢtir. Ölümlerin %95‟ten fazlasının düĢük gelirli, yetersiz sağlık altyapısına sahip ülkelerden olması dikkati çekmektedir (2). Ülkemizde, DSÖ‟nün Avrupa Bölgesinde 2015 yılına kadar kızamığın eliminasyonu hedefi kapsamında (ve kızamıkçık eliminasyonu ile entegre) bir program yürütülmektedir. 2001 yılında 30.000‟in üzerinde olan vaka sayısı 2009‟da tek haneli rakamlara düĢmüĢ olup kızamıkta eliminasyon aĢamasına gelindiği kabul edilmektedir ve Sağlık Bakanlığı kızamık sürveyans stratejilerini de buna göre yeniden düzenlemiĢtir (1). Ancak son dönemde Avrupa bölgesinde ve Irak, Suriye gibi komĢu ülkelerde yaĢanan salgınlar nedeniyle kızamık yeniden gündeme yükselmiĢtir. Salgınlar Türkiye‟ye de yansımıĢ olup vaka grupları incelendiğinde çocuklar kadar eriĢkinlerin de etkilendiği gözlenmektedir. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Viroloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / V-MT-08 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 3 / 12 Kızamık ve SSPE Virüsün özellikleri Kızamık etkeni (Measles virüs), Paramyxoviridae familyasının Morbillivirus cinsine ait, 150 nm boyunda, zarflı, tek sarmallı bir RNA virüsüdür. Hayvan rezervuarı ve vektörü yoktur (1,3,4). UV ıĢınlara, asit etkisine, ısıya ve kuruluğa duyarlıdır. Isı ile hızla inaktive olur. Havada, eĢyalarda veya yüzeylerde canlı kalma süresi oldukça kısadır (<2 saat). Patogenezde iki membran zarf proteini önemlidir. Bunlardan biri, hücrelere virüsün yapıĢmasından sorumlu olan H (hemaglütinin) protein, diğeri de virüsün konak hücre membranını delip hücre içine geçiĢinden sorumlu olan F (füzyon) proteindir (3,4). Kızamık virüsünün yalnızca bir antijenik tipi vardır. VahĢi virüs, viral genomun en değiĢken gen bölgeleri olan hemaglütinin (H) ve nükleoprotein (N) genlerinin sekanslanması temelinde, genotip olarak adlandırılan gruplara ayrılır. Salgınların araĢtırılması, dolaĢan vahĢi kökenlerin tanımlanması, aĢıya bağlı döküntülü reaksiyonlarda aĢı suĢunun ayırt edilmesi gibi durumlarda moleküler epidemiyolojik çalıĢmalar genotiplemeye dayanır. Bugüne kadar dünyada dolaĢan 20‟den fazla genotip tanımlanmıĢtır (A, B1, B2, B3, C1, C2, D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, E, F, G1, G2, G3, H1, H2) (5). Klinik özellikler Kızamık Kızamık sistemik bir enfeksiyondur. Primer enfeksiyon bölgesi nazofarinks epitelidir. Virüsün epitel hücrelerinde ve bölgesel lenf bezlerinde çoğalmasını 2-3 gün sonra bir primer viremi ve retiküloendotelyal sistemin enfeksiyonu takip eder. Viral replikasyonun devamı ile 5-7. günlerde ikinci viremi olur ve enfeksiyon solunum sistemine ve diğer organlara da yayılır (1,4). Ġnkübasyon süresi ortalama 10-12 gündür. Ġnkübasyonu takiben enfeksiyon, yüksek ateĢ, öksürük ve burun akıntısı ile seyreden 2-4 günlük bir prodrom dönem ile baĢlar. Sıklıkla konjonktivit ve bronĢit de görülür. Döküntü henüz yoktur. Hastanın virüs yaydığı bu dönem oldukça bulaĢıcıdır. Kuru öksürük, lenfadenopati, fotofobi, bazen de eklem ağrıları olabilir. Döküntüler ortaya çıkmadan önce hastaların %80‟inin ağız mukozasında Koplik lekeleri denilen kırmızı zeminde beyaz lekeler görülebilir. 2-4 gün sonra önce kulak arkası ve yüzde olmak üzere tipik döküntü baĢlar. Döküntüyle birlikte ateĢ çok yükselir. Tipik olarak döküntü 3-7 günde deskuamasyonla ve baĢladığı sırayla sonlanır (1). Hastalık, kötü beslenen, özellikle yeterli A vitamini alamayan çocuklarda ve bağıĢıklık sistemi zayıflamıĢ kiĢilerde çok Ģiddetli seyredebilir (1). Kızamık vakalarının yaklaĢık %30‟unda bir veya daha fazla komplikasyon gözlenir. Komplikasyonlar en fazla 5 yaĢın altındaki çocuklarda ve 20 yaĢın üzerindeki bireylerde ortaya çıkmaktadır. En sık görülen komplikasyonlar ishal (%8), orta kulak iltihabı (%7), pnömoni (%6) olup daha az sıklıkla ensefalit (%0.1), nöbetler (%0.6-0.7) ve ölüm (%0.2) rapor edilmiĢtir (4). Pnömoni viral olabileceği gibi, bakteriyel sekonder enfeksiyon Ģeklinde de geliĢmiĢ olabilir ve kızamığın en öldürücü komplikasyonudur. Sayfa 4 / 12 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / V-MT-08 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Viroloji Kızamık ve SSPE SSPE SSPE santral sinir sisteminin kızamık virüsü ile persistan enfeksiyonu sonucu geliĢen nörodejeneratif bir komplikasyondur. GeliĢmiĢ ülkelerde, SSPE yaygın kızamık aĢılama programları nedeniyle nadir bir hastalık haline gelmiĢtir (6). SSPE, kızamık enfeksiyonu geçirildikten 4-10 yıllık bir latent dönem sonrası ilerleyici nörolojik bozukluklarla ortaya çıkar. Hastalık kırsal kesimde daha sık görülmekte olup olguların büyük kısmında 4 yaĢından önce kızamık enfeksiyonu öyküsü vardır. Kızamık enfeksiyonuna yakalanma yaĢı düĢtükçe SSPE geliĢme riski artmaktadır. Laboratuvar tanısı Kızamık Kızamık, eliminasyon öncesi dönemde karakteristik döküntü ve prodrom belirtiler temelinde klinik tanı konulan bir hastalık idi. DSÖ‟nün eliminasyon programı ile birlikte pek çok ülkede hastalığın görülme sıklığı (insidans) hızla azalmıĢtır. Ġnsidansın düĢmesiyle, klinik tanının pozitif tahmin değeri de düĢtüğü için; tek baĢına klinik belirtiler artık kızamık tanısı için güvenilir kabul edilmemektedir. Kızamığın tanısı laboratuvara dayalıdır (3). Özellikle eliminasyon fazında, etkili bir sürveyans için laboratuvar testleri ile Ģüpheli vakaların tanısı, salgınların doğrulanması ve dolaĢan virüslerin genotiplendirilmesi esastır. Kızamığın tanısı ve doğrulanması için laboratuvar faaliyetlerinin de DSÖ‟nün onayladığı ulusal referans laboratuvarlarca yürütülmesi hedeflenmiĢtir (1,3). Tanıda baĢlıca yöntemler virüsün klinik örneklerden izolasyonu, nükleik asitlerinin gösterilmesi ve oluĢan antikor yanıtının gösterilmesidir. Primer bağıĢıklık yanıtı sırasında kızamığa özgü IgM ve IgG antikorları yükselmeye baĢlar ve ELISA ile serumda saptanabilirler. Döküntülerin ortaya çıkmasından itibaren kızamık vakalarının %70‟inde ilk 2 gün, %90‟ında ise 3-5 gün içerisinde IgM pozitifliği saptanır. IgM antikorları 7-10 gün içinde pik yaptıktan sonra düĢmeye baĢlar, 6-8 haftanın sonunda ise artık nadiren saptanabilir. IgG antikor düzeyleri ise 3. haftada pik yaparak enfeksiyondan sonra uzun süre bulunmaya devam eder. Yanıt sırasında, serum ve sekretuvar IgA antikorları da oluĢmaktadır (3,4). DSÖ, kızamığın tanısında rutin uygulama için ELISA ile özgül IgM antikorlarının gösterilmesini önermektedir. Sıklıkla tanı için tek bir serum örneği yeterlidir. Akut enfeksiyonun tanısı amacıyla IgG antikorları incelenecekse -ilki döküntüler baĢladığında alınmıĢ olmak üzere- çift serum örneğinde titrelerin en az 4 kat arttığının gösterilmesi gerekir. Enfekte olmamıĢ bireylerde IgM negatif, IgG ise negatif veya pozitif bulunabilir. Klinik örneklerin kültürlerinden virüsün izolasyonu rutin tanı metodu olarak değil, daha ziyade izolatların elde edilmesi ve moleküler epidemiyolojik çalıĢmalarla dolaĢan suĢların tiplendirilmesi için kullanılmaktadır. Kızamık virüsü nazofaringeal aspirat, boğaz sürüntüsü, idrar, heparinize kan (mononükleer hücreler) gibi klinik örneklerden döküntülerin baĢlamasından itibaren ilk 4 gün boyunca izole edilebilir. RT-PCR ile de 7. güne kadar (ve bazen sonrasında) saptanabilir (3). Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Viroloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / V-MT-08 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 5 / 12 Kızamık ve SSPE ġüpheli vakalardan ilk karĢılaĢmada hemen serum örneği alınmalıdır. Ġdeal olarak serum örneği alınan bütün vakalardan mümkünse virüs kültürleri için de örnekler alınmalı ve gönderilmelidir. Boğaz, burun ve nazofarinks örnekleri döküntü tarihinden itibaren ilk 4 gün içinde, idrar ilk 7 gün içinde alınır. Birden fazla tip örnek alınması izolasyon Ģansını yükseltir. Kızamık IgM‟in pozitif bulunması veya çift serum örneğinde IgG antikorlarının arttığının görülmesi veya RT-PCR ile viral RNA saptanması veya virüsün kültürlerden izolasyonu “kesin tanı” koydurucudur (7). SSPE SSPE‟nin tanısı da laboratuvar incelemeleri ile konur. Tanı baĢlıca; ölüm öncesi veya sonrası alınmıĢ beyin doku örneklerinin histolojik incelemesinde kızamık inklüzyon cisimlerinin görülmesine ya da BOS‟da (intratekal) kızamık IgG antikorlarının üretilmekte olduğunun gösterilmesine dayanır (7,8,9,10). Teknik Bilgiler 1 Hedef mikroorganizma Measles virus (Kızamık virüsü) 2 Tanı için asgari laboratuvar gerekleri 2.1. Laboratuvar güvenliği Kızamık virüsü Risk Grubu 2 mikroorganizmadır ve Ģüpheli enfeksiyonlarının tanısı ile ilgili iĢlemler asgari BGD2 laboratuvar Ģartlarında gerçekleĢtirilmelidir. Bütün kültürler ve klinik örnekler enfeksiyöz kabul edilmeli, daima standart önlemler uygulanmalı ve önlemler risk değerlendirmesi ile de desteklenmelidir. Solunum yolu örneklerinin kültüre veya diğer iĢlemlere hazırlanması baĢta olmak üzere aerosol oluĢturması muhtemel tüm laboratuvar çalıĢmaları bir sertifikalı bir sınıf-IIA BGK içinde yapılmalıdır (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar Güvenliği Rehberi”). Serum ayırma ve testlerin çalıĢılması sırasında daima eldiven giyilmelidir. 2.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri Kızamık tanısı ve/veya doğrulaması ile uğraĢan laboratuvarların personeli asgari Ģu gerekleri karĢılar: (i) hastalığın tanısı için geçerli yöntem(ler)i uygulamadan önce, amaçlanan kullanım ile ilgili tüm eğitimleri almıĢ; (ii) laboratuvar güvenliği ve kalite gereklerine dair gerekli tüm eğitimleri almıĢ; (iii) Eliminasyon Programının önemine vakıf olmak. Hem güvenlik önlemlerine uyumun sağlanmasından hem de testlerin standart prosedürlere uygun yapılmasından ve tanının doğruluğu ve güvenilirliğinden Mikrobiyoloji Uzmanı sorumludur. Sayfa 6 / 12 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / V-MT-08 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Viroloji Kızamık ve SSPE 2.3. Örnek, Reaktif, Kit, Donanım İnceleme örneği Ġnceleme örneklerinin seçimi, özellikleri, alınması, gönderilmesi ve laboratuvara kabulü ile ilgili kriterler ve bilgi için “BulaĢıcı Hastalıkların Laboratuvar Tanısı için Saha Rehberi”ne ve „Daimi Genelge‟ye (1) baĢvurulmalıdır. Ayrıca bazı önemli noktalara aĢağıda tekrar dikkat çekilmiĢtir. Serum örneği – Salgın tanısı için örnek alınıyor olabileceği gibi sürveyans kapsamında -sporadik- bir vakanın tanısını koymak için de örnek alınıyor olabilir. Amaca göre Ģu hususlar önem kazanır: (a) Kızamık Ģüpheli bir vakadan öncelikle serum örneği alınır. (b) Serum örneği vaka ile ilk karĢılaĢıldığında (döküntülerin baĢlamasından sonraki 3-28 gün içinde) alınmalıdır. (c) Döküntüden sonraki ilk 3 gün içerisinde kızamık IgM antikoru saptanamayabilir. Bu nedenle ilk 3 gün içerisinde serum örneği alınmıĢ ancak IgM antikoru negatif veya ara değer olarak saptanmıĢ vakalardan mutlaka ikinci serum örneği alınmalıdır. Kültür için örnekler - (nazofarinks, boğaz, burun sürüntüsü, idrar) – virüsün izolasyonu için kullanılır. Bu örneklerden PCR da yapılabilir. Özellikle salgın durumunda sorumlu virüsün (kızamık veya kızamıkçık) kültürden izolasyonu hedeflenir. (a) Örneğin döküntünün ilk baĢladığı gün alınması izolasyon Ģansını artırır. Bu nedenle hasta ile ilk temasta serum alınırken kültür için de örnek alınması idealdir. (b) Bu örneklerinin alınması serumun yerine geçmez! Serum her durumda mutlaka alınmalıdır. (c) Nazofarinks örneği (aspirat veya sürüntü) alınması boğaz veya burun örneklerine göre daha zahmetlidir. Özel eküvyon veya aparey gerektirir ve hastaya daha fazla rahatsızlık verir. Eldeki imkanlara bakılarak –boğaz, burun örnekleri alınabilmiĢ isenazofarinks örneğinin alınıp alınmayacağına karar verilebilir. (d) Kızamık ve kızamıkçık virüsleri ısıya duyarlı oldukları için soğukta saklanmayan örneklerde enfektivite hızla düĢer. Bu nedenle örnekler laboratuvara olabildiğince çabuk ve soğuk zincirde gönderilmelidir. BOS örneği - SSPE tanısı için ilgili uzman doktor tarafından aseptik Ģartlarda 1-2 mL alınır. Özgül antikor indeksinin hesaplanması için mutlaka eĢ zamanlı olarak serum örneği de alınıp gönderilmelidir. Örneklerin gönderilmesinde paketleme ve taşıma biyolojik materyal taĢıma kurallarına uygun olmalıdır (11) (ayrıca bkz. UMS GEN-OY-01 Enfeksiyöz Maddelerin TaĢınması Rehberi). Reaktif / Kit Kızamık IgM ELISA Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Viroloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / V-MT-08 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 7 / 12 Kızamık ve SSPE Kızamık RT-PCR hazır ticari kitleri SSPE tanısı için - Kızamık IgG ELISA; BOS ve serum için ayrı tasarlanmıĢ olmalıdır. Total IgG nefelometre kitleri (BOS ve serum) Total albümin nefelometre kitleri (BOS ve serum) Seroloji gereç, donanım ELISA okuyucu, yıkayıcı Nefelometri cihazı Hücre kültürü laboratuvarı altyapısı ve donanımı Ġnvert mikroskop Biyogüvenlik kabini -80°C derin dondurucu, sıvı azot tankı PCR ve diğer moleküler testler için En az üç ayrı oda - nükleik asit ekstraksiyonu, PCR karıĢımının hazırlanması, amplifikasyonun ve sonuç gözetiminin yapılabileceği ayrı odalar. Ġdeal olarak PCR karıĢımı hazırlama odası (temiz oda) pozitif basınçlı, agaroz jel elektroforezi yapılan oda (kirli oda) negatif basınçlı havalandırmaya sahip olmalıdır. Cihazlar – biyogüvenlik kabini, soğutmalı mikrosantrifüj, hassas terazi, vorteks, su banyosu, yatay çalkalayıcı, mikrodalga fırın, otomatize / yarı otomatize nükleik asit ekstraksiyon sistemleri ve nükleik asit amplifikasyon cihazı, jel görüntüleme sistemi, elektroforez ünitesi vb. 2.4. Kalite kontrol Her testte iç kalite kontrol amacıyla en az bir pozitif ve bir negatif internal kalite kontrol serumu çalıĢmaya dahil edilir. Eksternal kalite kontrol testleri belirli aralıklarla çalıĢılarak sonuçları değerlendirilir. Ġnternal kontrol, nükleik asit testlerinde ekstraksiyonun ve amplifikasyonun verimliliği ve inhibitör olup olmadığının gösterilmesi için izolasyon basamağından itibaren hasta örneği ile birlikte aynı reaksiyon tüpünde amplifiye edilmelidir. 3 Tanı teknikleri 3.1. Kızamık IgM ELISA Akut enfeksiyonun tanısında ilk tercih IgM saptayan ELISA testleridir. IgM-capture ELISA veya özgül IgM-indirekt EIA formatındaki kitler kullanılabilir (3). El ile çalıĢılan, yıkama ve okuma iĢlemleri cihaz ile yapılan hazır ticari kitler olduğu gibi, yüksek test sayıları söz konusu olduğunda otomatize Sayfa 8 / 12 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / V-MT-08 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Viroloji Kızamık ve SSPE cihazlarla çalıĢılan makro- veya mikro ELISA kitleri de mevcuttur. ELISA testi ile saptanan IgM pozitifliği tanı koydurucudur ve her Ģüpheli vakada IgM ELISA testinin yapılması hedeflenir. Kızamık IgM testi sıklıkla döküntünün görüldüğü günden itibaren pozitif bulunur; ancak %20 kadar vakada 72 saate kadar negatif sonuç verebildiği için, kızamık Ģüphesinin devam ettiği olgularda testin birkaç gün sonra tekrarlanması gerekebilir (3,4) 3.2. Kızamık IgG ELISA IgG antikorları enfeksiyonun ileri evrelerinde veya aĢılamadan sonra ortaya çıkar. Akut enfeksiyonun tanısı amacıyla IgG antikorları incelenecekse serokonversiyonun gösterilmesi gerekir! Bunun için -ilki döküntüler baĢladığında olmak üzere- en az 3 hafta ara ile alınmıĢ iki serum örneğinin eĢ zamanlı çalıĢılması ve titrelerin en az 4 kat arttığının gösterilmesi gerekir. El ile çalıĢılan, yıkama ve okuma iĢlemleri cihaz ile yapılan hazır ticari kitler olduğu gibi, yüksek test sayıları söz konusu olduğunda otomatize cihazlarla çalıĢılan makro- veya mikro ELISA kitleri de mevcuttur. Tek serum örneğinde pozitif sonuç geçirilmiĢ enfeksiyon veya aĢıya bağlı bağıĢıklık düĢündürür. SSPE tanısı için BOS ve serum örnekleri birlikte çalıĢılır. Sonuçların değerlendirilmesi indeks hesaplamalarına göre yapılır (bkz. sayfa 10). 3.3. Moleküler tanı Gerçek zamanlı RT-PCR hazır ticari kitleri ile kızamık virüs RNA saptanabilmektedir. Konvansiyonel yöntemlerle de hedef bölgelere yönelik PCR çalıĢmaları yapılabilir. URL‟de kızamık için moleküler tanı testleri uygulanabilmekte ve moleküler tiplendirme (sekans analizi) yapılabilmektedir (adres ve iletiĢim bilgileri için bkz. sayfa 11). 3.4. Hücre kültürü Hücre kültüründen virüsün izolasyonu çok güvenilir bir yöntemdir ve URL‟de gerçekleĢtirilmektedir. Dünya Sağlık Örgütü, DSÖ Laboratuvar Ağı‟na dahil laboratuvarlarda hem kızamık hem de kızamıkçık virüs izolasyonları için Vero/SLAM hücre hattını önermektedir. Bu hücre hattı ticari olarak üretilen bir ürün değildir ve piyasadan temin edilemez (3). Vero/SLAM hücre hattının kızamık virüsüne duyarlılığı B95 hücrelerine eĢdeğer kabul edilir; B95‟e üstünlüğü ise Epstein-Barr virüs ile enfekte olmayıĢı nedeniyle laboratuvar güvenliği açısından uygun olmasıdır. Vero/SLAM hücre hattında üreme sitopatik etkinin gözlenmesi ve „syncytium‟ oluĢumu ile değerlendirilmektedir. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Viroloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / V-MT-08 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 9 / 12 Kızamık ve SSPE 4 Test sonuçlarının yorumu, raporlama, bildirim 4.1. Serolojik testler Son 3 ay içinde aĢılanma öyküsü olmayan bireyde IgM pozitif ise birey kızamık vakasıdır. Son 3 ay içinde aĢılanma öyküsü olmayan bireyde IgM “ara değer” bulunmuş ise 7-10 gün sonra 2. serum örneği alınıp incelenmelidir ve antikor titresi (IgG titre artıĢı olup olmadığı) takip edilmelidir. Son 3 ay içinde kızamık aĢı uygulaması varsa IgM pozitif veya ara değer pozitif bulunması durumu aĢıya bağlı pozitiflik olarak değerlendirilir. 4.2. RT-PCR PCR sonucu pozitif ise birey kızamık vakasıdır. Negatif sonuçlar hastalığı dıĢlamaz. Çünkü örneğin alınma zamanı sonucu belirler. Geç dönemde alınmıĢ örneklerde sonuç negatif olabilir. 4.3. Hücre kültürü Hücre kültürlerinde üreme “kesin tanı” bulgusudur. Negatif sonuçlar hastalığı dıĢlamaz. Kültür sonuçları örneğin alınma zamanı, taĢıma ve saklama Ģartlarından etkilenmiĢ olabilir. 4.4. SSPE tanısında test sonuçlarının yorumu SSPE vakalarında BOS‟da kızamık IgG titresi yükselir ve 1:40 ile 1:1280 arası ölçülebilir. Özgül kızamık IgG antikorlarının BOS ve serum düzeylerinin birbirine oranının BOS lehine yükselmesi ise esas tanı koydurucu bulgudur. (a) Normalde bu oranın (kızamık IgG BOS / kızamık IgG serum) 1/200 ila 1/500 arasında olması beklenir. (b) SSPE‟de bu oran BOS lehine yükselmektedir; 1/5 ila 1/50 arasında bulunması SSPE tanısı açısından anlamlıdır. Ġntratekal antikor yapımının gösterilmesinde nefelometrik yöntem ile total IgG ölçümleri de kullanılır. Bu amaçla BOS IgG ve serum IgG değerleri ölçülerek, aĢağıdaki formül ile özgül indeks hesaplanır. Özgül indeks = BOS kızamık IgG/Serum kızamık IgG BOS IgG/Serum IgG (a) Özgül IgG indeksi normalde <1.5‟dur (0.69). (b) Özgül indeks ≥1.5 olursa intratekal özgül antikor sentezi göstergesi olarak değerlendirilir (10). Sayfa 10 / 12 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / V-MT-08 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Viroloji Kızamık ve SSPE Albümin indeksi bir diğer göstergedir. Normal albümin indeksi (BOS albümin/ serum albümin) 0.0018- 0.0074‟dir. 5 Olası sorunlar/kısıtlılıklar Viral kültür veya moleküler testler için örnek alırken her zaman sentetik (dakron ya da rayon uçlu) eküvyonlar tercih edilmelidir. Kalsiyum aljinatlı, pamuklu ve ahĢap saplı eküvyon kullanılmamalıdır. Virüsler inaktive olabilir, PCR‟da inhibitör etki yapabilirler. Doğru zamanda alınmamıĢ örneklerde pozitif sonuç elde edilmesinde sorun yaĢanabilir. Örneklerin uygun zamanda alınması önemlidir. Örnekler aseptik Ģartlarda alınmalıdır, sonuçlar etkilenebilir. Soğuk zincir Ģartlarında gönderilmeyen örnekler de test için uygun değildir. Hücre kültüründen izolasyon uzun zaman alması, laboratuvar güvenliği sorunları ve uygulama zorluğu gibi nedenlerle rutin tanı yöntemleri arasında yer almamaktadır. RT-PCR testleri pahalı olması, kontaminasyon riski nedeniyle özel çalıĢma ortamları ve tecrübe gerektirmesi gibi nedenlerle daha çok referans laboratuvarlarda doğrulayıcı testler olarak kullanılmaktadır. Serolojik yöntemler hızlı sonuç alınabilmesi, uzun süreli tecrübe gerektirmemesi, otomatize cihazlar geliĢtirilmiĢ olması, örnek alma ve taĢınmasının kolaylığı ve ucuz yöntemler olmaları gibi nedenlerle tanıda en çok tercih edilen yöntemlerdir. Ancak hatalı pozitiflik ve hatalı negatiflikleri nedeniyle, özellikle klinik uyumsuz vakalarda doğrulama testlerine ihtiyaç duyulabilmektedir. Hemolizli veya lipemik serum örnekleri antikor titrelerinin hatalı okunmasına neden olabilir. IgG antikorları anne kaynaklı olabileceği için 6-8 aya kadar hatalı pozitifliğe yol açabilir. Akut enfeksiyonda bağıĢıklık sistemi baskılanmıĢ hastada serolojik testler ile negatif veya düĢük pozitif sonuçlar alınabilir. Bellek B lenfositlerin poliklonal aktivasyonuna bağlı hatalı pozitiflikler saptanabilir. 6 Referans Laboratuvar Türkiye Halk Sağlığı Kurumu, Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarları Daire BaĢkanlığı Ulusal Kızamık/Kızamıkçık Referans Laboratuvarı Sağlık Mahallesi, Adnan Saygun Caddesi, No: 55, F Blok 1.kat 06100 – Sıhhiye/ANKARA Tel: 0312 565 5552 / 5340 www.thsk.gov.tr Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Viroloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / V-MT-08 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 11 / 12 Kızamık ve SSPE İlgili diğer UMS belgeleri Bu prosedür belgesi (Kızamıkçık Enfeksiyonunda ve Konjenital Kızamıkçık Sendromunda Mikrobiyolojik Tanı) ayrıca aĢağıda listelenen UMS belgeleriyle de ilgilidir ve ilave bilgi için bu belgelere de bakılması önerilir: UMS, V-MT-06 Kabakulak enfeksiyonunun mikrobiyolojik tanısı UMS, V-MT-07 Kızamıkçık ve Konjenital Kızamıkçık Sendromunun mikrobiyolojik tanısı UMS, GEN-ÖY-01 Enfeksiyöz maddelerin taĢınması rehberi Kaynaklar 1 Kızamık, Kızamıkçık ve Konjenital Kızamıkçık Sendromu Sürveyansı, Daimi Genelgesi. Sağlık Bakanlığı, Temel Sağlık Hizmetleri Genel Müdürlüğü, 2010/20. 2 WHO. Measles and rubella: Eliminating measles and rubella and preventing congenital rubella infection. http://www.euro.who.int/__data/assets/pdf_file/0008/79028/E87772.pdf (son eriĢim tarihi: 18.12.2013) 3 WHO. Manual for the laboratory diagnosis of measles and rubella virus infection. 2nd ed., World Health Organization. Expanded Programme on Immunization (EPI) team of the Department of Immunization, Vaccines and Biologicals, WHO/IVB/07.01, 2007. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/70211/1/WHO_IVB_07.01_eng.pdf (son eriĢim tarihi: 06.01.2014) 4 CDC. Measles. Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases. The Pink Book: Course Textbook - 12th edition, Second printing, May 2012. http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/pinkbook/meas.html#epi (son eriĢim tarihi: 06.01.2014) 5 CDC. Measles (Rubeola): Genetic analysis of measles viruses. http://www.cdc.gov/measles/labtools/genetic-analysis.html (son eriĢim tarihi: 06.01.2014) 6 BulaĢıcı Hastalıkların Ġhbarı ve Bildirim Sistemi, Standart Tanı, Sürveyans ve Laboratuvar Rehberi, Sağlık Bakanlığı Ankara. 2004. http://www.shsm.gov.tr/public/documents/legislation/bhkp/asi/bhibs/BulHastBilSistStanSurveL abReh.pdf (eriĢim tarihi: 18.12.2013) 7 BulaĢıcı Hastalıklar Sürveyans ve Kontrol Esasları Yönetmeliğinde DeğiĢiklik Yapılmasına Dair Yönetmelik. Resmi Gazete; 02.04.2011 – 27893. http://www.resmigazete.gov.tr/eskiler/2011/04/20110402-3.htm (son eriĢim tarihi: 06.01.2014) 8 Koppel BS. Subacute sclerosing panencephalitis: an update. Develop Med Child Neurology 2010;52:901–907 9 Dorta-Contreras AJ. Polyspecific response in the central nervous system. Use of antibody indeks. Rev Neurol 2000;31(11):1070-3. 10 Jacobi C, Lange P, Reiber H. Quantitation of intrathecal antibodies in cerebrospinal fluid of subacute sclerosing panencephalitis, herpes simplex encephalitis and multiple sclerosis: discrimination between microorganism-driven and poly specific immune response. J Neuroimmunol 2007;187:139-46. 11 Enfeksiyöz madde ile enfeksiyöz tanı ve klinik örneği taĢıma yönetmeliği. Sağlık Bakanlığı, Ankara. Resmî Gazete 25.09.2010 – 27710. Sayfa 12 / 12 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / V-MT-08 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Viroloji